CN1973901A - 乳酸－羟乙酸共聚物复合微球制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种乳酸－羟乙酸共聚物复合微球制剂，由药物、海藻酸钙、壳聚糖、乙交酯丙交酯共聚物、乳化剂、药用敷料组成。在含药物的内水相中添加低浓度的海藻酸钠溶液，与含PLGA的有机相形成初乳后，注入添加了壳聚糖和氯化钙的PVA溶液中形成复乳，经减压旋蒸固化后，水洗、冷冻干燥获得。本发明方法简便易行，不影响微球的粒径，不改变蛋白的包封率，使包囊在PLGA复合微球中的蛋白有一个相对亲水的微环境，很好地保护蛋白药物，同时蛋白与随其一起分布在PLGA复合微球表面的海藻酸与壳聚糖结合，既可延缓近表面蛋白的释放，又通过减少甚至闭合表面的多孔结构，阻碍原本经孔道释放的药物，以达到降低药物突释的目的。

Description

乳酸-羟乙酸共聚物复合微球制剂及制备方法

技术领域

本发明属于药剂学领域，涉及生物可降解微球制剂及其制备方法，尤其涉及经天然亲水性生物可降解材料海藻酸、壳聚糖修饰的疏水性生物可降解乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)复合微球制剂及其制备方法。这种新型的复合制剂对解决包囊在缓释PLGA微球中药物突释现象有着重大的意义，尤其对于那些效能强、有效剂量与中毒剂量接近，即治疗窗小的药物更具意义。

背景技术

乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)又名丙交酯乙交酯共聚物，聚乙丙交酯等。它由羟乙酸(或称乙醇酸)和乳酸聚合而成，是一种生物可降解高分子材料。由于其易于合成、生物兼容性、生物可降解性、机械强度、降解速度可调节性和良好的可塑性，近10多年来被大量用作微球控释系统的骨架材料。

对于治疗剂量低、需要长时间内持续给药的蛋白、多肽、激素类药物，PLGA微球控释系统是相当理想的载药系统。PLGA微球包裹水溶性药物最常用的制备方法是乳化溶剂挥发法，即首先将小体积药物水溶液与PLGA的二氯甲烷溶液混合，制成初乳。然后将初乳倾入含有乳化剂的水溶液中制备复乳。最后挥干溶剂，洗涤，冻干即得微球。此种制备方法存在的主要问题之一是药物的突释，通常在24h内释放出20～50％的蛋白药物。采用W/O/W复乳法制备PLGA微球多可形成多孔性微球。一般，小且多孔性的微球具有较大的表面积，因此，最终产生较低的包封率和较高的突释。在常压或真空干燥的过程中，水分在蒸发之前向基质的表面转移，同时，药物也通过对流向表面扩散，导致药物在聚合物基质中的不均匀分布。聚合物基质中药物的不均匀分布造成干燥和储藏阶段药物的转移，且真空干燥使孔隙率更大。给药初期的突释有可能导致血药浓度接近或超过中毒水平，产生明显的毒副作用。因此，突释现象已成为PLGA微球控释系统研究者面临的一个亟待解决的问题。

许多因素可以影响突释，在复乳法制备PLGA微球过程中，常常采用提高PVA浓度、以减压溶剂挥发法代替常压溶剂挥发法^[7]、在内水相中加入一定量的Tween20、有机相中加入甘油、乙醇或水、连续相中加入盐或者糖、改变有机相比例或锌复合物以抑制突释，甚至待微球成形但未冻干前反复洗涤以减小突释。以上大部分方法在W/O/W制备PLGA微球时已经采用，而有些则会使微球的载药量减少，从而使制剂的有效作用时间缩短。

附加剂会改变PLGA微球的表面特征及蛋白的体外释放。在制备微球时共同包囊附加剂以改变微球的形态和释药已引起研究者的注意，已报道一些附加剂能减少蛋白聚集变性，但多使蛋白释放加快，如甘油三癸酸酯^]、麦芽糖以及PEG。

采用微球制备新技术：Leach等人尝试先将蛋白粉碎至纳米级晶体，后以S/O/O方法制备微球。当载药量达到5％时，24h突释只有2.5～4.1％，是普通微球的1/5～1/10。Fu等将PLGA、蛋白溶于一种多成分溶剂系统，并将其倾入PVA水溶液中，两系统自发形成乳液，挥干溶剂后即固化形成载药微球。蛋白和聚合物同时溶解于一个系统中，改善了药物在聚合物中分布的均匀度，从而降低突释。前者受制备条件限制，后者溶剂的选择不同对微球的粒径改变较大。

通过改变微球骨架材料的组成、骨架性质可降低突释，例如采用嫁接了PVA的PLGA材料制备微球。另一种方式是用具有较高粘度的聚合物材料对突释严重的微球进行包衣。PLGA、PLA双层微球是一种特殊的包衣形式。利用PLGA、PLA在一定条件下相分离特性制备的微球，具有PLA为壳，含药PLGA为核的双层结构。不含药的PLA层对药物的释放构成了屏障，减小突释；将药物储库包入PLGA中，也能有效改善突释。Jiang等把胰岛素放入聚丙烯羟乙基淀粉凝胶中，再用溶剂抽提/挥干法将PLGA包裹于凝胶微粒之外，构成突释小、释放慢的复合微球。国内周等以海藻酸微球为核心，外包聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)的复合微球之上，其突释百分率较普通PLGA微球有所降低，但仍达23.1％。我们曾经制备海藻酸钙微球，并采用壳聚糖溶液孵育形成海藻酸-壳聚糖双层微球，再采用S/O/O乳化法，将海藻酸-壳聚糖双层微球分散入PLGA中，制成海藻酸-壳聚糖-PLGA复合微球，突释量在2％～24％。此复合微球中的药物完全包囊入双层的海藻酸-壳聚糖微球中，使蛋白类药物受到双重的亲水性聚合物的保护，不仅具有一个合适的亲水性微环境，有望使蛋白的稳定性得到提高，而且复合微球保持了海藻酸-壳聚糖微球对BSA具有的高包封效率，可以弥补单一PLGA微球包封率低的缺陷，但存在制备方法复杂，粒径较大(平均粒径30μm)的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种经亲水性海藻酸、壳聚糖修饰的乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)复合微球制剂，本发明微球制剂的主要组成为：模型药物、海藻酸钙、壳聚糖、乙交酯丙交酯共聚物、乳化剂、药用敷料。

本发明的模型药物主要包括多肽类、蛋白类及其它需缓释的亲水性药物。

海藻酸钠溶液在内水相的含量为0.05％～0.75％(w/w)。

微球粒径为1μm～10μm。

本发明的微球制剂的制剂形式包括注射剂型和口服剂型。

本发明的另一个目的是提供乳酸-羟乙酸共聚物PLGA复合微球制剂的制备方法。本发明的复合微球制剂的制备方法，与传统的W/O/W复乳、溶剂挥发法制备PLGA微球的操作步骤一样简便。在含药物的内水相中添加低浓度的海藻酸钠溶液，与含PLGA的有机相形成初乳后，注入添加了壳聚糖和氯化钙的聚乙烯醇(PVA)溶液中形成复乳，经减压旋蒸固化后，水洗、冷冻干燥即得。

本发明复合微球制剂的制备方法主要通过以下方案实现：

将模型药物溶于100μl蒸馏水和100μl重量体积比为0.10％～1.50％(w/v)的海藻酸钠溶液组成内水相，称取PLGA 0.2～0.5克溶于2～6ml二氯甲烷作为有机相，两相混合后置探头式超声仪，于50～200瓦(w)，10～40秒(s)超声，充分乳化后注入20～60ml混悬液中(50ml 2％ PVA，50ml 2％壳聚糖溶液，1克CaCl₂组成的混合溶液的续滤液)，800～20000rpm搅拌下乳匀3～7分钟，减压旋转蒸发，除去二氯甲烷，离心收集微球，蒸馏水洗涤后冷冻干燥即可。

本发明方法使包囊在PLGA复合微球中的蛋白有一个相对亲水的微环境，从而很好地保护蛋白药物，同时，蛋白与随其一起分布在PLGA复合微球表面的海藻酸与壳聚糖结合，既可以延缓近表面蛋白的释放，又通过减少甚至闭合表面的多孔结构，阻碍原本经孔道释放的药物，以达到降低药物突释的目的。本发明方法较其它复合微球的一个突出特点是微球制备简单，微球的粒径大小不变。这种新型的复合制剂对制备毒性较大，需严格控制体内血药浓度水平的药物有着重大的意义。

本发明的优点及积极效果

采用亲水性生物可降解聚合物海藻酸、壳聚糖修饰疏水性PLGA微球得到的一种复合微球。这种修饰作用可以使PLGA微球的初始释药量得以有效的控制，为克服PLGA微球制剂常见的突释问题提出了一种新的方法。与其它减少突释的方法相比，它的特点是：方法简便易行，不影响微球的粒径，不改变蛋白的包封率。

(1)本发明制备方法简单，操作步骤同传统PLGA微球的制备步骤基本一致。首先在内水相中添加天然多糖，含聚阴离子的海藻酸钠，与PLGA有机相形成W/O初乳，使海藻酸钠与药物一起包囊入PLGA有机相内，或部分分散在PLGA骨架内；后注入添加了氯化钙和壳聚糖的PVA溶液中，通过过量的钙离子交联生成海藻酸钙，同时与添加的另一成分，天然聚阳离子壳聚糖，一步法生成海藻酸钙-壳聚糖聚电解质膜，一方面为疏水性PLGA微球添加了亲水性的元素，从而更好地保护蛋白类药物，使其免受或少受有机溶剂对活性的影响，另一方面通过与药物一起分布在PLGA微球表面的海藻酸与壳聚糖的作用，既可以延缓近表面蛋白的释放，又使PLGA微球表面的多孔结构减少，或者闭合，阻碍原本经PLGA微球孔道释放的药物，以达到降低突释的目的。

(2)复合微球明显减少药物的初始突释现象。与对照PLGA微球相比，经0.75％海藻酸或1.5％海藻酸与1％壳聚糖修饰的复合微球其0.5h初始突释量分别降至1/6和1/3，存在显著性差异，经1.5％海藻酸修饰的复合微球对释放的阻滞大于0.75％，但24h突释量均无显著差异。此外，药物的最终释放模式仍通过调整PLGA中PLA与PGA的比例加以控制。

(3)经修饰后的PLGA微球的粒径、药物包封率与对照微球相比没有统计学差异，当然这需要在本制备方法限定的条件内。因为在实验过程中发现：内水相海藻酸钠浓度的不同可以影响微球包封率的大小，由于添加的海藻酸钠浓度较高时，粘稠的内水相会导致成乳困难，如添加的海藻酸钠的浓度为1.5％时，微球包封率比PLGA微球小；在内水相中加入的海藻酸钠浓度为0.75％时，壳聚糖的作用使修饰PLGA微球的包封率有所增加，虽然这两种不同浓度海藻酸修饰的微球间包封率存在差异(P＜0.05)，但两者与对照PLGA微球的包封率比较均无统计学意义上的差异(P＞0.05)。

(4)本发明在充分研究PLGA微球的表面形态和引起突释的可能原因后，不改变PLGA微球的基本制备步骤，利用两种亲水性生物可降解材料海藻酸和壳聚糖，巧妙地通过药剂学手段进行修饰，有效控制24h突释量，从而调节药物的释放。此方法简便易行，在不影响微球的粒径和包封率基础上，明显减少初始突释，为PLGA微球的制备提供一种新的修饰方法，有望减少因突释所致的药物副作用，增强药物的后续释放，从而推动PLGA微球给药系统更广泛的应用。

附图说明

图1为经海藻酸、壳聚糖修饰的PLGA微球与PLGA微球的扫描电镜图。

图2为经海藻酸和壳聚糖修饰后的复合PLGA微球与PLGA微球的包封率比较。

图3为经海藻酸、壳聚糖修饰后的PLGA微球与PLGA微球的的体外释放比较。

具体实施方式

实施例1  本发明经海藻酸、壳聚糖修饰的PLGA微球的一种制备方法

称取约0.33g PLGA(50∶50)，溶解于4ml的二氯甲烷作为有机相；另称取30mg BSA模型药物，溶于100μl蒸馏水和100μl 1％海藻酸钠作为内水相，两相混合后探头超声(50w，1s×20次)，充分乳化后注入到40ml混合溶液中(50ml 2％PVA+50ml 2％壳聚糖溶液+1g CaCl₂混合溶液的续滤液)，12000rpm高速搅拌5min，减压旋蒸1h，离心，水洗3次，冷冻干燥。得到5μm大小，粒径均匀、形态圆整的海藻酸、壳聚糖修饰PLGA微球。

通过本发明方法制得的复合微球，可明显减少突释现象，而且，可通过改变外层PLGA的组成比调节药物的释放模式。

由于吸附在微球表面及近表面的蛋白分子可很快从微球表面的微孔释放是产生PLGA微球突释严重的主要原因，而包囊及释放过程中引起蛋白的不溶性聚集则将导致蛋白的不完全释放。在含药的内水相中加入一定浓度的海藻酸钠，使蛋白处于一个亲水性的内环境，有利于蛋白结构的伸展，从而减少蛋白在制备、贮存和释放过程中折叠和聚集，在外水相中添加氯化钙和壳聚糖溶液，与分布在PLGA微球表面的海藻酸结合，由海藻酸钠的羧基与壳聚糖的氨基通过静电作用形成的复合膜，既可以延缓近表面蛋白的释放，又可以减少甚至闭合PLGA微球表面的小孔，阻碍原本经孔道释放的药物。为了得到更清晰的表面微孔特征图，实验中按同样设计，只是乳化过程中的搅拌速度减小，得到大粒径的修饰和未修饰PLGA微球。在SEM下观察可见：修饰后几乎所有的表面小孔呈闭合状，充分证实了设计的可行性。

虽然经修饰后的PLGA微球的蛋白包封率与对照微球相比没有统计学差异，但在实验过程中发现：内水相海藻酸钠浓度的不同可以影响微球包封率的大小，从本实验结果也可见这种趋势。在内水相中加入的海藻酸钠浓度为0.75％时，壳聚糖的作用使修饰PLGA微球的包封率有所增加，但浓度提高到1.5％，却反使包封率下降，这两种不同浓度海藻酸修饰的微球间包封率存在差异(P＜0.05)。因此，此修饰方式受内水相凝胶浓度限制，内水相的粘度提高到一定程度会不利于W/O初乳的形成而导致包封率下降，甚至难以成乳。

由于添加的海藻酸钠浓度较高时，粘稠的内水相会导致成乳困难，使添加的海藻酸钠的浓度受到限制，此修饰作用也受局限，而且海藻酸与壳聚糖之间的静电作用强度也是局限性的一个重要因素。因此这种修饰作用主要体现在有效控制微球24h内的突释方面，本实验体外释放数据也充分证明了这一点。然而，这种控制对毒性较大，需严格控制体内血药浓度水平的药物来说至关重要。此外，本修饰方法较其它复合微球的一个突出优点即是不改变微球的粒径大小。同时，药物的不同释放模式可通过改变PLGA中PLA与PGA的比例，从50∶50到100∶0的范围或混合不同比例的PLGA微球加以控制。这种复合微球的制备不仅给予蛋白、多肽类药物以海藻酸凝胶亲水性微环境作为第一层保护，而壳聚糖的加入使药物的突释大为减少，并进一步地稳定蛋白，最外层的PLGA，通过本身PLA与PGA比例的调整使药物的最终控释成为可能。因此，对解决蛋白类疫苗制剂的瓶颈问题有重大的意义。

实施例2

同实施例1，但PLGA为70∶30比例，得到经海藻酸、壳聚糖修饰的PLGA(70∶30)微球。

实施例3

同实施例1，但称取的PLGA量为0.2g，溶于2ml二氯甲烷作为有机相，与水相混合后置探头式超声仪，于200w，40s超声，形成初乳后注入20ml混合溶液中，800rpm搅拌下乳匀3min，得到经海藻酸、壳聚糖修饰的PLGA微球包封率和粒径无统计学差异。

实施例4

同实施例1，但称取的PLGA量为0.5g，溶于6ml二氯甲烷作为有机相，形成初乳后注入60ml混合溶液中，20000rpm搅拌下乳匀3min，得到经海藻酸、壳聚糖修饰的PLGA微球包封率和粒径无统计学差异。

实施例5

同实施例1，但内水相100μl海藻酸钠的浓度为0.1％，得到经海藻酸、壳聚糖修饰的PLGA微球包封率和粒径无统计学差异，但对模型药物BSA的初始释放改变较小，其中1h释放量下降约15％。

实施例6

同实施例1，但内水相100μl海藻酸钠的浓度为1.5％，得到经海藻酸、壳聚糖修饰的PLGA微球包封率和粒径无统计学差异。

实施例7

同实施例1，但注入混合溶液后经20000rpm高速搅拌7min，得到3μm以内，粒径均匀、形态圆整的海藻酸、壳聚糖修饰PLGA微球。

实施例8

同实施例1，但注入混合溶液后经8000rpm高速搅拌3min，得到10μm以内，粒径均匀、形态圆整的海藻酸、壳聚糖修饰PLGA微球。

实施例9

同实施例1，但为了便于微球表面特征的观察，在制备时采用磁力搅拌5min代替12000rpm高速搅拌3min制成大粒径微球，仅供SEM下比较，以下经海藻酸、壳聚糖修饰的大粒径PLGA微球与此相同，注入混合溶液后，磁力搅拌5min，减压旋蒸1h，离心，水洗3次，冷冻干燥。得到约120μm，粒径均匀、形态圆整的海藻酸、壳聚糖修饰PLGA微球，参见图1，其中A、C、E：为PLGA微球；B、D、F：为修饰后复合微球。为了得到更清晰的表面微孔特征图，图1采用大粒径的修饰和未修饰PLGA微球进行观察。

实施例10  经海藻酸和壳聚糖修饰后的复合PLGA微球与PLGA微球的包封率比较

精密称取PLGA微球10mg，用1.0ml乙腈溶解，离心(16000rpm×10min)，弃去含聚合物的溶液，重复一次后将沉淀真空干燥过夜。次日，加PBS重新分散，在37℃，100rpm下恒温振荡6h，离心，保留上清液于4℃冰箱，沉淀进一步分散于0.1mol/L NaOH，充分涡旋后放置于37℃，100rpm下恒温振荡过夜，离心，合并上清液，沉淀进一步分散于0.1mol/L HCl中再次放置于37℃，100rpm下恒温振荡过夜。将上述提取液合并、混匀，用微量BCA法于570nm处测定BSA浓度。测得经0.75％海藻酸和0.5％壳聚糖修饰的PLGA微球、经1.5％海藻酸和0.5％壳聚糖修饰的PLGA微球与未经修饰的PLGA微球比较，包封率没有统计学差异(P＞0.05)，结果参见图2。

实施例11  修饰对PLGA微球体外释放的影响

经0.75％海藻酸和0.5％壳聚糖修饰的PLGA微球、经1.5％海藻酸和0.5％壳聚糖修饰的PLGA微球与未经修饰的PLGA微球体外释放比较：经海藻酸、壳聚糖修饰后的PLGA微球的体外初始释放受到明显阻滞，参见图3。

由于修饰与未修饰PLGA微球的体外释放区别主要在释放的24h内，故列出初始的0.5h和1h时间点的释放量，参见表1。

表1修饰与未修饰PLGA微球初始的0.5h、1h和24h时间点的释放量比较

	0.5h	1h	24h
				AC-PLGA(1.5％Alg，0.5％Chi)AC-PLGA(0.75％Alg，0.5％Chi)PLGA(50∶50)	**5.04±1.38**10.24±1.3330.65±1.90	*12.97±3.3120.38±3.2733.54±3.38	26.01±1.5532.32±2.2334.62±2.90

注：与PLGA(50∶50)微球比较有显著性差异：^**p＜0.01，^*p＜0.05。

Claims (6)

1.一种乳酸-羟乙酸共聚物复合微球制剂，其特征是：制剂由模型药物、海藻酸钙、壳聚糖、乙交酯丙交酯共聚物、乳化剂、药用敷料组成，微球粒径为1μm～10μm。

2.根据权利要求1所述的乳酸-羟乙酸共聚物复合微球制剂，其特征是：模型药物主要包括多肽类、蛋白类及其它需缓释的亲水性药物。

3.根据权利要求1所述的乳酸-羟乙酸共聚物复合微球制剂，其特征是：制剂形式为注射制剂和口服制剂。

4.根据权利要求1所述的乳酸-羟乙酸共聚物复合微球制剂的制备方法，其特征是通过以下方案实现：将模型药物溶于100μl蒸馏水和100μl重量体积比为0.10％～1.50％的海藻酸钠溶液组成内水相，称取乳酸-羟乙酸共聚物0.2～0.5克溶于2～6ml二氯甲烷作为有机相，两相混合后置探头式超声仪，于50～200瓦，10～40秒超声，充分乳化后注入20～60ml混悬液中，800～20000rpm搅拌下乳匀3～7分钟，减压旋转蒸发，除去二氯甲烷，离心收集微球，蒸馏水洗涤后冷冻干燥即可。

5.根据权利要求5所述的乳酸-羟乙酸共聚物复合微球制剂的制备方法，其特征是：海藻酸钠溶液在内水相的含量为0.05％～0.75％。

6.根据权利要求5所述的乳酸-羟乙酸共聚物复合微球制剂的制备方法，其特征是：所述的乳化后注入20～60ml混悬液，是指50ml 2％聚乙烯醇、50ml 2％壳聚糖溶液、1克CaCl₂组成的混合溶液的续滤液。