CN112870169A - 一种双载药环境敏感型口服Janus纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双载药环境敏感型口服Janus纳米粒及其制备方法和应用。该口服Janus纳米粒以阳离子天然聚合物和阴离子聚合物交联固化为内水相载体，以高分子聚合物作为有机相载体，通过相分离方法制得。相比于现有的递送载体，本发明的口服Janus纳米粒具有稳定的双室结构，可实现多种不同性质药物的独立包载和协同递送；同时具备较佳的环境敏感性，能在胃液中稳定，在肠道中释放，规避了口服用药中胃肠环境的不利影响；可同时包载不同性质的药物以发挥协同增效作用；而且粒径均一可控，包封率高、粒径小，具有可控释性的同时，还具有良好的生物相容性和生物安全性；制备方法具有过程简单，产量大，成本低等优势，具有良好的应用前景。

Description

一种双载药环境敏感型口服Janus纳米粒及其制备方法和 应用

(一)技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种含多肽类药物的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒及其制备方法和应用。

(二)背景技术

当前，纳米载体已广泛为医学研究所应用，其包括脂质基制剂(脂质体、胶束、固体脂质纳米粒等)和非脂质基制剂(树状大分子、多孔二氧化硅纳米粒等)。纳米粒的形状、大小和组成的多样性使其可作为适宜的运载工具用于多种应用途径。例如，脂质体、自组装脂质囊泡等已成功用于输送不同的水溶性治疗药物；胶束因其疏水性的内核而通常用于输送脂溶性药物；树状大分子可用于设计复杂的多功能药物释放系统；介孔二氧化硅纳米粒可作为多种活性药物包封和释放的理想材料。与以上各种纳米递药系统相比，新型的各向异性Janus纳米颗粒由于具有双重功能性和各向异性，能将疏水性和亲水性生物活性分子封装在一个复杂的体系中，且形成一个具有两室的单颗粒结构，在靶点同时递药和释放；其所具有的复杂局部构型亦能够阻止与进入的巨噬细胞的初始接触，从而避免网状内皮系统的快速清除，因此更显示出作为药物传递系统的巨大潜力。

尽管已有多项技术可以实现两种疏水性或两种亲水性药物的联合传递，但通常难以实现两者在独立包封结构中的同时传递。通过精确控制微粒的内部结构使其能够满足两种不同理化性质药物的联合包载，且互不影响，这取决于制备方法的优化以及载体材料的选择。目前，Janus纳米粒的合成方法主要有三种：掩蔽、相分离和自组装。在液相体系中，通过异相分离的方法合成Janus纳米粒，具有产量大、成本低廉的优点，但仍存在应用缺陷，包括药物包封率低，粒径不易控制，粒径分布范围宽，以及因载体材料的刺激性而不利于实际使用。公开号为CN 106881465 A的中国专利文献公开了一种双亲性Janus金纳米粒子的制备方法，利用三苯基磷氯金与四羟甲基氯化磷在有机溶剂/水乳滴微界面反应，实现小批量合成双亲性Janus金纳米粒子，但是它存在细胞毒性的问题，三苯基磷氯金对呼吸系统和皮肤具有很大的刺激性，用于口服给药不安全；而且虽然具有两亲性，但是存在不能将包载的多肽药物定位可控释放至肠道的缺陷，在胃液中稳定性较差，并且不能高效通过胃肠道黏膜细胞。

因此，如何选择适宜材料，改善双亲性递药体系中亲水组分和疏水组分混溶后体系的稳定性、生物安全性和粒径均一性是目前的研究难点。此外，以口服途径取代注射给药是众多医药工作者期待并不断付诸努力的另一研究热点，而生物药物的口服给药是难度最大而又最热门的给药途径。多肽或蛋白质的口服后一般在胃肠道降解成小分子氨基酸后吸收，其生物活性也随之消失。阻止这些大分子口服吸收进入的主要屏障是致密的肠上皮细胞膜、胃酸和各种消化酶。因此改进其生物利用度的焦点就在于如何减少这些屏障的影响。这其中需要权衡口服屏障和首过效应的规避以及体内安全性，即，需要筛选出载体材料和制备方法的优化组合。目前，Janus纳米粒用于口服给药的研究国内尚未见报道。因此，开发一种双载药口服Janus纳米给药系统将为实现不同性质药物，尤其是含多肽类药物的协同给药、提高药物的口服生物利用度进而增强药效提供广阔前景。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种含多肽类药物的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备方法。该口服Janus纳米粒具有双室结构，可实现不同性质药物的独立包载、协同递送和胃肠道环境响应性。以其为载体同时包载不同性质的镇痛药物可发挥协同镇痛的作用，可以进一步提高镇痛药物的治疗效果，为中枢性疼痛，尤其是多模式镇痛的有效治疗开拓了一种新的途径。

本发明的目的是提供一种双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备方法。

本发明的第二个目的是提供由上述制备方法制得的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒。

本发明的第三个目的是提供上述双载药环境敏感型口服Janus纳米粒在制备镇痛制剂方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

S1.将含有第一药物的酸溶液与氯化钙溶液混合后，加入阴离子聚合物溶液中，得到阴离子聚合物混合溶液；将阳离子天然聚合物溶液与所述阴离子聚合物混合溶液搅拌混合，得到内水相；

S2.将高分子聚合物和乳化剂溶于有机溶剂中，加入第二药物和表面活性剂后搅拌混合，得到油相；将该油相与步骤S1所述内水相经超声乳化反应后得到形成油包水W₁/O初乳；

S3.向上述W₁/O初乳中加入复合表面活性剂溶液，经乳化反应得到W₁/O/W₂复乳；恒温搅拌除去有机溶剂进行相分离，即可得到所述口服Janus纳米粒；

其中所述第一药物为多肽药物、核酸药物或水溶性蛋白质药物中的至少一种；所述第二药物为脂溶性药物。

本发明从胃肠道的内环境特点出发，合成基于阳离子天然聚合物和阴离子聚合物的新型生物相容性高、可实现不同性质药物的独立包载、协同递送和胃肠道环境响应性的功能性口服Janus纳米粒，不仅克服了多肽类药物在口服给药中由于胃液降解和胃肠道黏膜屏障的存在导致生物活性降低的不足，而且改善了脂溶性药物的溶解性，极大的提高了脂溶性药物的可利用性，同时对环境具有较强的敏感性，提高了多肽类药物和脂溶性药物在肠道定向释放后的生物活性。

在本发明中，所述壳聚糖为低分子量壳聚糖；所述壳聚糖的相对分子量为10～50kDa。

在本发明中，对所述酸溶液中酸性物质的种类没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的酸性物质即可；在本发明实施例中，所述酸溶液优选为盐酸溶液，所述盐酸溶液的浓度优选为0.05～0.3mol/L，更优选为0.1～1.5mol/L。

在本发明中，对所述氯化钙溶液的浓度没有任何特殊的限定，根据实际需要调节即可；在本发明实施例中，所述氯化钙溶液的浓度优选为0.1～1mmol/L，更优选为0.5mmol/L。

在本发明中，对超声功率和搅拌的时间没有特殊规定，根据实际需要调节即可；在本发明实施例中，所述超声功率优选为75～500W，更优选为125W～250W；所述超声时间优选为5～60min，更优选为10～30min，最优选为15min。

优选地，所述多肽类药物选自眼镜蛇神经毒素、胰岛素或鲑鱼降钙素中的一种或几种；所述脂溶性药物选自白藜芦醇、紫杉醇或姜黄素中的一种或几种。

优选地，所述眼镜蛇神经毒素为中华眼镜蛇神经毒素(αCT)。

优选地，所述阴离子聚合物选自海藻酸钠和/或聚丙烯酰胺；所述阳离子天然聚合物选自壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚(L-赖氨酸)或聚甲基丙烯酸-N,N-二甲基氨基乙酯中的一种或几种；所述高分子聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氰丙烯酸丁酯或聚乳酸中的一种或几种。所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸与羟基乙酸的质量比大于50:50，优选为65:35。

在本发明中，所述阴离子聚合物与阳离子天然聚合物的摩尔比优选为1～3:0.5～2.0，更优选为0.8～1.5:0.4～1.0，最优选为1:1。

优选地，所述乳化剂为双硬脂酸甘油酯、胆酸钠或大豆磷脂中的一种或几种；所述乳化剂与所述高分子聚合物的质量比优选为10～40:60～85，更优选为20～30:60～85，进一步优选为25:75。当乳化剂为双硬脂酸甘油酯，高分子聚合物为聚乳酸-羟基乙酸，且乳化剂与所述高分子聚合物的质量比例为25:75时，所制得的口服Janus纳米粒环境响应特性最强，且其合成纳米粒子时粒径均一、尺寸合适，能明显增加多肽类载药体系的生物利用度。

优选地，步骤S2所述有机溶剂选自乙酸乙酯和/或二氯甲烷；所述表面活性剂选自司盘-80和/或泊洛沙姆188。

优选地，步骤S3所述复合表面活性剂溶液由0.1％～0.5％w/v聚丙乙烯溶液与0.05％～0.3％w/v十二烷基苯磺酸钠溶液组成。

更优选地，步骤S3所述复合表面活性剂溶液由0.3％～0.4％w/v聚丙乙烯溶液与0.1％～0.2％w/v十二烷基苯磺酸钠溶液组成。

优选地，步骤S1控制所述第一药物的酸溶液的pH值为7.8～8.7；控制所述阳离子天然聚合物溶液的pH值为6.3～6.9。

更优选地，步骤S1控制所述第一药物的酸溶液的pH值为8.0～8.4；控制所述阳离子天然聚合物溶液的pH值为6.2～6.8。在本发明中，所述阳离子天然聚合物溶液用NaOH溶液调节pH，搅拌下滴加适量生理盐水溶液。所述NaOH溶液的浓度优选为0.05～1mol/L，更优选为0.1mol/L。

本发明对所述相分离的方式经溶剂蒸发诱导完成，采用本领域技术人员熟知的溶解蒸发的方式即可，优选采用恒温搅拌的方式进行；在本发明实施例中，步骤S3所述的恒温搅拌所述搅拌的转速优选为30～80rpm，更优选为30rpm。所述搅拌的温度优选为35～55℃，恒温搅拌4～12h。Janus纳米粒在制备过程需控制反应条件，搅拌的温度和时间会影响获得产物的性能效果，如果搅拌温度过高或时间过久，材料内部的功能键生成速率加快，会造成其分子量分布变宽，从而得到的产品稳定性能会下降；而搅拌温度过低或时间过短，造成其内部不能形成足够且有效的功能结构，进而影响其递药及释药性能。

优选地，在进行相分离后，对得到的Janus纳米粒混悬液进行离心和洗涤1～3次，以除去残余的游离药物和有机溶剂。本发明对所述离心的转速和时间没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的离心分离方式即可；所述离心的次数优选为3次。所用的洗涤试剂优选为去离子水，洗涤次数优选为3次，每次超声均0.5h以上。在保证不减少Janus纳米粒得率的同时，进一步提高Janus纳米粒的纯度和稳定性。

本发明还提供了使用上述制备方法制得的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒。本发明得到的新型口服Janus纳米粒，在人体内稳定性好，无毒副作用，生物利用度高，并能实现胃液中基本不释放而在肠液中缓慢释放的肠道靶向缓释功能。本发明制得的口服Janus纳米粒，粒径均一可控，包封率高、粒径小，具有可控释性的同时，还具有良好的生物相容性和生物安全性；制备方法具有过程简单，产量大，成本低等优势，具有良好的应用前景。

在本发明中，对所述口服Janus纳米粒的粒径和包封率没有任何特殊的限定；在本发明实施例中，所述口服Janus纳米粒的粒径大小为283.2～350.8nm；包封率为55％～95％。

本发明还涉及到使用上述制备方法制得的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒在制备镇痛作用制剂中的应用，其中所述第一药物为眼镜蛇神经毒素；所述第二药物为白藜芦醇。同时包载有神经毒素和白藜芦醇的Janus纳米粒可用于中枢性疼痛的镇痛，两者同时包载具有协同增效的功效。

不同的修饰材料对于载药和递送性能有不同程度的影响。本发明所制备的纳米递药体系中，充分将胃肠道微环境、聚合物的结构、功能域和亲疏水性等因素考虑在内，通过选择合适的聚合材料以及控制制备条件来调整Janus纳米材料的物理化学性质，结合口服给药的特征，制备出粒径合适、亲水性适宜、具有高环境响应性的、含多肽类药物的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明以阳离子天然聚合物和阴离子聚合物交联固化为内水相载体，以高分子聚合物作为有机相载体，通过相分离方法制得具有稳定双室结构的、含多肽类药物的、双载药环境敏感型口服Janus纳米粒，具有操作简单、反应步骤少、产量大、成本低且产物无污染等优点，其制备方法更为简单、高效、经济。

(2)本发明的口服Janus纳米粒生物相容性好，可实现多种不同性质药物的独立包载和协同递送；同时具备较佳的环境敏感性，能在胃液中稳定，在肠道中释放，规避了口服用药中胃肠环境的不利影响；可同时包载不同性质的药物以发挥协同增效作用；而且粒径均一可控，包封率高、粒径小，具有良好的可控释性，同时提高了多肽类药物和脂溶性药物的生物利用度。

(四)附图说明

图1为表示含多肽类药物的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的透射电镜图。

图2表示含多肽类药物的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒在人工胃液(pH＝1.2)及PBS缓冲液(pH＝7.4)环境下的体外释药曲线(n＝3)。

图3表示脊髓损伤后中枢性疼痛模型大鼠50％缩足反应阈值(n＝10，

脊髓损伤模型组与正常对照组比较，p＜0.01；*：假手术组与中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇双载药口服Janus纳米粒给药组比较，p＜0.05；Δ：脊髓损伤模型组与中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇双载药口服Janus纳米粒组比较，p＜0.05；ΔΔ：脊髓损伤模型组与中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇双载药口服Janus纳米粒组比较，p＜0.01；▲：中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇单药组合组与中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇双载药口服Janus纳米粒组比较，p＜0.05；▲▲：中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇单药组合组与中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇双载药口服Janus纳米粒组比较，p＜0.01)

(五)具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实验材料：

中华眼镜蛇神经毒素(αCT，纯度>95％)：云南龙凤谷生物药业有限公司

白藜芦醇(Res)：美国Sigma-Aldrich公司

三羟甲基氨基甲烷(Tris)：美国Sigma-Aldrich公司

海藻酸钠(ALG)：美国Sigma-Aldrich公司

低分子量壳聚糖(LMWC)：美国Sigma-Aldrich公司

聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)：美国Sigma-Aldrich公司

双硬脂酸甘油酯(PATO)：美国Sigma-Aldrich公司

司盘-80：上海阿拉丁生化科技股份有限公司

无水氯化钙(CaCl₂)：天津永大化学试剂有限公司

氢氧化钠(NaOH)：天津永大化学试剂有限公司

二氯甲烷(CH₂Cl₂)：天津永大化学试剂有限公司

实施例1：双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备

1、双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备，包括以下步骤：

S1.将0.5mL(1mg/mL)的αCT溶于2mL的HCl溶液(0.1mol/L)，Tris调节pH值至8.0～8.4，将此溶液溶于CaCl₂溶液(0.5mmol/L)，其后滴加至ALG溶液(2mg/mL)中，探头超声15min(225W)；另取LMWC溶液(2mg/mL)10mL，用NaOH溶液(0.1mol/L)调节pH值至6.5，搅拌下滴加适量生理盐水溶液，与ALG混合后继续搅拌1h，形成内水相；

S2.油相由聚乳酸-羟基乙酸和双硬脂酸甘油酯按一定比例(75:25)组成，将油相溶于乙酸乙酯，加入2.5mg Res和司盘80；将上述内水相与油相采用探头超声(225W)乳化形成W₁/O初乳；

S3.将复合表面活性剂溶液(0.30％w/v PVA和0.10％w/v SDBS)加入至W₁/O初乳中，继续探头超声(225W)乳化形成W₁/O/W₂复乳；40℃恒温搅拌该溶液4h除去乙酸乙酯溶液，得到Janus纳米粒混悬液；所得的混悬液离心3次，并同时以去离子水洗涤3次，以除去残余的游离药物和表面活性剂。

2、结果

(1)双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的理化性质

如图1所示，所制得的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒形状较为统一，且基本可见两相结构；外形为不对称的附着结样的哑铃形，粒径范围为283.2～350.8nm，PDI为0.196～0.248，Zeta电位约为23.6mV。

测得该双载药环境敏感型口服Janus纳米粒中多肽类药物αCT的包封率为(58.14±2.36)％，难溶性药物Res的包封率为(87.49±3.43)％。

(2)双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的体外释药

检测所得口服Janus纳纳米粒在人工胃液(SGF，pH 1.2)中2h、以及在PBS(pH 7.4)中24h的释放行为，以此分别模拟空腹胃和小肠的pH环境。因白藜芦醇(Res)属于疏水性药物(难溶性药物)，在释放介质中加入2％十二烷基硫酸钠(w/v)增加其溶解。

由图2可知，在人工胃液(SGF，pH 1.2)中，αCT溶液累积释放约40.17％左右，而包载于Janus纳米粒中的αCT几乎未测到累积释放量。类似地，游离Res释药较快，在1h内约释放93.76％，而包载于纳米粒中的Res则未见明显释放。

在PBS 7.4中，1h内，αCT单药释放约67.89％，Res单药释放约86.71％。αCT在αCT-JNPs和αCT/Res-JNP中分别释放约30.03％和28.11％，而Res在Res-JNPs和αCT/Res-JNP中释放约40.21％和39.09％。由此可知，与αCT和Res原药相比，其所包载的纳米粒具有明显的缓释特征。

在12h内，αCT在αCT-JNPs和αCT/Res-JNP中的累计释放量分别约为78.44％和73.82％，而Res在Res-JNPs和αCT/Res-JNP中累计释放分别约为94.41％和94.57％，并且由释药结果可知，αCT和Res在Janus纳米粒中的释药未见明显的相互影响。

上述实验结果说明，本发明可成功合成具有独特腔室结构、粒径可控的新型口服Janus纳米粒，可协同、独立、高效包载大分子多肽类药物和小分子难溶性药物；该口服Janus纳米粒具备环境敏感性，可实现两种不同性质药物的协同递药和胃肠道环境触发释药，在胃液中稳定，在肠液中溶胀。

实施例2：载有两种镇痛药物的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒对中枢性疼痛的镇痛作用

1、实验动物和试验药物

实验动物：SPF级雄性SD大鼠，体重200～250g。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(沪)2013-0016。

试验药物：使用实施例1方法制备得到的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒。

2、中枢性疼痛模型的制作

SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉。按WADE法造成脊髓损伤，建立大鼠脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)的中枢性疼痛模型。具体操作为：SD大鼠麻醉后，固定头部和四肢，腹部朝下。背部皮肤剪毛消毒，切口以L1为中心，长约3cm，暴露T12-L2节段棘突和椎板，咬除L1棘突和椎板，以脊髓为中心暴露3～4mm的打击区域。用玻璃管引导铜棒在设定的高度下坠落至脊髓暴露区域中心，采用改良的Allen’s捶击法造成脊髓损伤组大鼠300g·cm(约为0.98Nm)的脊髓损伤，观察大鼠出现摆尾反射，以双下肢瘫痪作为造模成功的标志。生理盐水清洗创口，逐层缝合内层肌肉和创口皮肤。术后人工辅助排尿每日4次，大约一周后每日3次，直至形成反射性排尿。术后肌注青霉素钠20万U/d共3天预防感染

3、镇痛效果评价

(1)动物分组

SD雄性大鼠(120～200g)共50只，随机分为五组，分别为：

①正常对照组：大鼠不实施手术，每天给予生理盐水；

②假手术组：大鼠施行麻醉，在切开皮肤后只暴露椎板不损伤脊髓，术后每天给予生理盐水；

③SCI模型组：大鼠实施SCI手术建模，术后每天给予生理盐水；

④SCI模型+αCT/Res-JNP溶液组：大鼠实施SCI手术建模，术后每天给予载有αCT和Res的双载药Janus纳米粒(αCT/Res-JNP)溶液；

⑤SCI模型+原药溶液组：大鼠实施SCI手术建模，术后每天给予αCT溶液+Res溶液；给药剂量为50ug/kg(以αCT计)，给药持续28天；在术前(不给药)、术后d4、d7、d10、d14、d21、d28灌胃给药2h后测定机械缩足反射阈值。

(2)von Frey细丝法测定大鼠痛阈

在室温(22±1)℃的安静环境中，采用弗莱毛(von Frey hair，Stoelting，WoodDale，美国)细丝测定机械性痛觉超敏来评定大鼠疼痛状况。测定时将SD大鼠置于底为网格的有机玻璃框(26cm×20cm×14cm)内，限制其在小范围内自由活动，适应30min后开始测试。测试区域为坐骨神经分布的足底中部的左后爪。根据Dixon介绍的“up and down”法，将一系列von Frey细丝(0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0g)从2.0g力度开始刺激大鼠左后爪中部皮肤，接触足底加压使丝呈C状，弧度如3/8缝合针，保持6～8秒，至动物抬脚或走开。无反应记为阴性反应“O”，有反应(表现为缩足、舔足或走开)记为阳性反应“X”，移除细丝后立刻缩足视为阳性反应。当出现足部移动等模棱两可的行为时，可重复刺激。如第一根细丝刺激无反应，则给予大一级力度的细丝刺激；如有反应则改用小一级力度的毛刺激，反复类推，如此连续进行，直至出现第1次阳性和阴性(或阴性和阳性)反应的骑跨，再连续测定4次。以出现“X”的前一次的“O”作为起点，选择包括该起点范围内的连续6次刺激所得到的O、X值作为推算50％缩足反应阈值的关键序列。序列组成不限于6次，根据大鼠对不同细丝力度的反应(可能出现SD大鼠无法安静)，最小序列组成为4次，最多9次，不同刺激之间相隔30s，以消除前一刺激的影响；若直至测试完最大力度(15g)的von Frey细丝，动物仍不出现缩足反应，则大鼠的50％缩足阈值为15g。得到以“O”或“X”组合的序列后，将该序列和最后一根细丝的力度(f)输入公式计算出机械性疼痛阈值(MWT)。对每只大鼠进行两到四次评估，每个评估在单独的一天进行。为避免频繁或长时间的刺激造成动物耐受或痛敏，每根细丝每次刺激时间最长不超过8s，实验中每次测试之间间隔10s左右。中位数法计算50％缩足反应阈值：

50％缩足反应阈值(g)＝(10^[Xf+kδ])/10,000

其中f为最后一根毛的力度，X_f＝log(f*10000)；δ为各个毛力度取log后的均差，在此约等于0.224；k为根据测量所得“X”、“O”序列查表后得到的值。

(3)统计学方法

采用SPSS 16.0软件处理，各组数据以mean±SD表示，样本比较采用t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

(4)结果

所有实验大鼠在造模打击时均出现痉挛性摆尾，双下肢及躯体回缩扑动，随后双下肢瘫痪；损伤节段脊髓硬膜完整、出血、水肿。所有麻醉后大鼠于术后苏醒，出现双下肢瘫痪，运动、感觉功能丧失，依靠双上肢移动躯体，头颈部活动正常。辅助排尿7d后大部分大鼠恢复自主排尿功能。

为避开SCI后早期脊髓休克时期，von Frey细丝法从D4开始测试。von Frey细丝法评价各组镇痛效果的结果见表1和图3。

表1：脊髓损伤后中枢性疼痛模型大鼠50％缩足反应阈值(n＝10，±s)

*：NS对照组(假手术组)与αCT/Res-JNP(SCI)相比，p<0.05；

SCI模型组与正常对照组相比，p<0.01；^Δ：SCI模型组与αCT/Res-JNP(SCI)相比，p<0.05；^ΔΔ：SCI模型组与αCT/Res-JNP(SCI)相比，p<0.01；^▲：αCT+Res组(SCI)与αCT/Res-JNP(SCI)相比，p<0.05；^▲▲：αCT+Res组(SCI)与αCT/Res-JNP(SCI)相比，p<0.01。

从图3和表1的结果可知，五组大鼠术前痛阈基础值无统计学差异(p>0.05)；SCI术后大鼠机械缩爪反射阈值较正常大鼠和假手术组大鼠明显下降。术后4d左右出现脊髓损伤后中枢性疼痛的急性期，术后10d开始为脊髓损伤后慢性神经病理性疼痛形成时期，疼痛症状开始加重并持久。

与正常对照组相比，SCI模型大鼠术后侧足的痛阈值明显呈下降趋势(p<0.01)，而假手术组大鼠术后迅速恢复；与αCT/Res-JNP灌胃给药组相比，αCT溶液+Res溶液灌胃给药组大鼠术后侧足的痛阈值呈明显下降(p<0.05或p<0.01)，在术后D7的痛阈值下降至最低；与假手术组相比，经αCT/Res-JNP灌胃给药的SCI组在术后D4的痛阈值升高，之后开始稍有下降，但仍保持平稳趋势，两组间的痛阈值无显著性差异(p>0.05)；αCT/Res-JNP灌胃给药的SCI组与正常对照组的痛阈值无显著性差异(p>0.05)。

上述实验结果说明，本发明双载药环境敏感型口服Janus纳米粒具有稳定的双室结构，可实现不同性质的两种药物的同时包载和协同递送；该口服Janus纳米粒的包封对游离多肽类药物在酸性环境中有一定的抵御作用；可使包载药物在胃液中稳定，肠液中释药，且所包载的两种药物无释药相互影响，适宜以口服途径给药；同时包载中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇的Janus纳米粒能明显减轻中枢性疼痛痛觉过敏，并明显升高脊髓损伤模型大鼠的机械缩爪反射阈值，提示中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇的双载药口服Janus纳米粒在中枢性疼痛的治疗方面将有良好的应用前景。

实施例3：双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备

1、双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备，包括以下步骤：

S1.将含有第一药物的HCl溶液用Tris调节pH值至8.0，与氯化钙溶液混合后，滴加至阴离子聚合物溶液(2mg/mL)中，探头超声15min(225W)，得到阴离子聚合物混合溶液；另取阳离子天然聚合物溶液中，用NaOH溶液(0.1mol/L)调节pH值至6.8，搅拌下滴加适量生理盐水溶液，然后与阴离子聚合物混合溶液搅拌混合，得到内水相；

S2.将高分子聚合物和乳化剂溶于有机溶剂中，加入第二药物和表面活性剂司盘80后搅拌混合，得到油相；将该油相与步骤S1所述内水相经150W超声10min进行乳化反应后得到形成油包水W₁/O初乳；

S3.向上述W₁/O初乳中加入复合表面活性剂溶液(0.10％w/v PVA和0.30％w/vSDBS)，经乳化反应得到W₁/O/W₂复乳；50℃恒温搅拌6h除去有机溶剂，同时进行相分离，得到含有Janus纳米颗粒的混悬液；对所得混悬液离心洗涤3次，即可得到口服Janus纳米粒；

其中，在本实施例中，第一药物选用1mL(1mg/mL)多肽药物中华眼镜蛇神经毒素，第二药物选用5mg脂溶性药物白藜芦醇；阴离子聚合物选用海藻酸钠，阳离子天然聚合物选用分子量为10～50kDa的低分子量壳聚糖，且海藻酸钠与低分子量壳聚糖的摩尔比为1:1；高分子聚合物选用聚乳酸-羟基乙酸共聚物；乳化剂选用双硬脂酸甘油酯，且其与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为25:75。

2、性质分析

经实验分析，本实施例所制得的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒形状较为统一，且基本可见两相结构，外形为不对称的附着结样的哑铃形，且中华眼镜蛇神经毒素和白藜芦醇在Janus纳米粒中的释药未见明显的相互影响。说明，本实施例可成功合成具有独特腔室结构、粒径可控的新型口服Janus纳米粒，可协同、独立、高效包载大分子多肽类药物和小分子难溶性药物；该口服Janus纳米粒具备环境敏感性，可实现两种不同性质药物的协同递药和胃肠道环境触发释药，在胃液中稳定，在肠液中溶胀，明显提高大分子多肽类药物和小分子难溶性药物的生物利用度，从而达到更加有效的镇痛效果。

实施例4：双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备

其他条件同实施例3，唯一不同之处在于：第一药物为胰岛素，海藻酸钠与低分子量壳聚糖的摩尔比为2:1，高分子聚合物为聚氰丙烯酸丁酯。

实施例5：双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备

其他条件同实施例3，唯一不同之处在于：第一药物为鲑鱼降钙素，海藻酸钠与低分子量壳聚糖的摩尔比为1.3:1，高分子聚合物为聚乳酸。

实施例6：双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备

其他条件同实施例3，唯一不同之处在于：乳化剂为双硬脂酸甘油酯；乳化剂双硬脂酸甘油酯与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比例为20:85。

实施例7：双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备

其他条件同实施例3，唯一不同之处在于：复合表面活性剂溶液由0.50％w/v PVA和0.05％w/v SDBS组成。

经实验分析，实施例4～7所制得的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒形状较为统一，粒径均一可控，且基本可见两相结构，外形为不对称或对称的哑铃形，所得Janus纳米粒的包封率高、粒径小；且所负载的两种不同性质药物在Janus纳米粒中的释药未见明显的相互影响，可实现多种不同性质药物的独立包载和协同递送；同时具备较佳的环境敏感性，能在胃液中稳定，在肠道中释放，规避了口服用药中胃肠环境的不利影响，避免了药物在胃液中提前释放，具有较好的可控释性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双载药环境敏感型口服Janus纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将含有第一药物的溶液与氯化钙溶液混合后，加入阴离子聚合物溶液中，得到阴离子聚合物混合溶液；将阳离子天然聚合物溶液与所述阴离子聚合物混合溶液搅拌混合，得到内水相；

S2.将高分子聚合物和乳化剂溶于有机溶剂中，加入第二药物和表面活性剂后搅拌混合，得到油相；将该油相与步骤S1所述内水相经超声乳化反应后得到形成油包水W₁/O初乳；

S3.向上述W₁/O初乳中加入复合表面活性剂溶液，经乳化反应得到W₁/O/W₂复乳；恒温搅拌除去有机溶剂进行相分离，即可得到所述口服Janus纳米粒；

其中所述第一药物为多肽药物、核酸药物或水溶性蛋白质药物中的至少一种；

所述第二药物为脂溶性药物。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述多肽类药物选自中华眼镜蛇神经毒素、胰岛素或鲑鱼降钙素中的一种或几种；所述脂溶性药物选自白藜芦醇、紫杉醇或姜黄素中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述阴离子聚合物选自海藻酸钠和/或聚丙烯酰胺；所述阳离子天然聚合物选自壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚(L-赖氨酸)或聚甲基丙烯酸-N,N-二甲基氨基乙酯中的一种或几种；所述高分子聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氰丙烯酸丁酯或聚乳酸中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述阴离子聚合物与阳离子天然聚合物的摩尔比为0.5～2:0.5～2.0。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述乳化剂为双硬脂酸甘油酯、胆酸钠或大豆磷脂中的一种或几种；其中，所述乳化剂与所述高分子聚合物的质量比为10～40:60～85。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2所述有机溶剂选自乙酸乙酯和/或二氯甲烷；所述表面活性剂选自司盘-80和/或泊洛沙姆188；

步骤S3所述复合表面活性剂溶液由0.1％～0.5％w/v聚丙乙烯溶液与0.1％～0.3％w/v十二烷基苯磺酸钠溶液组成。

7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1控制所述第一药物的酸溶液的pH值为7.8～8.7；控制所述阳离子天然聚合物溶液的pH值为6.0～6.9。

8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述恒温搅拌的条件为35～55℃恒温搅拌4～12h。

9.权利要求1～8任一所述制备方法制得的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒。

10.权利要求1或权利要求3～8任一所述制备方法制得的双载药环境敏感型口服Janus纳米粒在制备镇痛作用制剂中的应用，其特征在于，所述第一药物为眼镜蛇神经毒素；所述第二药物为白藜芦醇。

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