CN1973028B - 增加活细胞或可培养的有机体的繁殖率的装置及方法 - Google Patents

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Abstract

通过自然选择过程增加活细胞在悬浮液中的繁殖率(通过增加的繁殖速率和/或增加的繁殖产量)或任何可培养的有机体的繁殖率的方法和装置，所述装置包括：a)包含培养基的柔性消毒管道(7)，b)将所述管道(97)分成独立区域的活动门(夹具)的系统(3、4、5)，所述独立区域包含消耗的培养物的区域(下游区域)、包含生长培养物的区域(生长室)和包含新鲜生长培养基的区域(上游区域)，c)使所述门和所述管道移动以使得所述生长室的一部分和相关联的培养物可脱离夹持且与所述生长室分开且使得包含未使用培养基的一部分新鲜管道可与一部分所述培养物和所述生长室中已经存在的相关联培养基相联的装置(13)。

Description

增加活细胞或可培养的有机体的繁殖率的装置及方法
技术领域
所述发明提供了一种允许在液体或半固体培养基中选择具有增加的繁殖率和特定代谢性质的活细胞的方法和装置。对于选择过程(适应进化)而言，基因变异的有机体(突变体)形成群体且与相同起源的其它变异体竞争。具有最快繁殖率的那些有机体的相对比例随时间增加，导致形成具有增加的繁殖率的群体(和单个有机体)。该过程能够改进工业过程中使用的或为学术目的使用的有机体的性能。 
背景技术
对增加的繁殖率(适合度)的选择需要持续生长，通过对生长培养物进行定期稀释实现所述持续生长。在现有技术中这通过两种方式完成：序列稀释和连续培养，所述两种方式的不同之处主要在于稀释程度。 
序列培养包括将小体积的生长培养物重复传递至大得多的包含新鲜生长培养基的器皿。当培养的有机体在新器皿中已经生长达到饱和时，重复该过程。在文献(Lenski&Travisano：Dynamics of adaptation and diversification：a10,000-generation exper iment with bacterial populations.1994.Proc Natl Acad Sci U S A.15：6808-14)中，通过清楚地证实了繁殖率在几年时期内持续改进的实验，利用这种方法证实了持续培养的最长时期。该工艺通常要通过手工实现，且劳动力投入可观，且由于暴露于外部环境而易于受到污染。如下面的段落所述，序列培养同样效率较低。 
选择率或繁殖率的改进率取决于群体规模(Fisher：The Genetical Theory of Natural Selection.1930.Oxford University Press，London，UK)。此外，在群体规模快速波动如序列传递的情况下，选择与群体量的调和平均值(
Figure DEST_PATH_GFW00000077953200011
)成比例(Wright：Size of population and breeding structure in relation to evolution.1938.Science87：430-431)，且因此可通过周期期间的最低群体量进行估计。 
通过连续培养可维持群体规模且因此使得选择更有效。与序列稀释不同地，连续培养包括更小的相对体积以使得一小部分生长培养物由相等体积的新鲜生长培养基规则地替换。该过程通过增加群体在周期稀释过程中的最小规模而使有效群体规模最大化。如果稀释以特定时间间隔发生，那么允许进行连续培养的装置被称作“恒化器”，且如果当培养物生长至特定密度时稀释自动发生，那么所述装置被称作“恒浊器”。 
为简便起见，在下文中两种类型的装置将被统称为“恒化器”。20世纪50年代两个小组同时发明了恒化器(Novick & Szilard：Description of the chemostat.1950.Science112：715-716)和(Monod：la technique de la culture continue-Théorie etapplications.1950.Ann.Inst.Pasteur79：390-410)。恒化器已被用于证实繁殖率的短期迅速改进(Dykhuizen DE.Chemostats usedfors tudyingnatural selection and adaptive evolution.1993.Methods Enzymol.224：613-31)。 
传统的恒化器不能维持对增加的繁殖率的长期选择，原因是不希望地选择了耐稀释(静态)的变异体。这些变异体能够通过粘附到恒化器表面上而耐受稀释，且通过这样做使得不与粘性较低的个体竞争，所述粘性较低的个体包括具有更高繁殖率的那些个体，因此不能实现装置所希望的目的(Chao & Ramsdell：The effects of wallpopulations on coexistence of bacteria in the liquid phase ofchemostat cultures，.1985.J.Gen.Microbiol.131：1229-36)。 
已经发明了一种方法和恒化装置(基因引擎)以避免连续培养过程中的耐稀释性(PASTEUR INSTITUT[FR] & MUTZEL RUPERT[DE]申请的美国专利6,686,194-B1)。该方法利用阀控制的流体传递以使生长培养物周期性地在两个恒化器之间移动，从而允许在活性培养物的生长时期之间对每个所述恒化器进行消毒和漂洗。规则的消毒周期通过摧毁耐稀释变异体而防止选择所述耐稀释变异体。该方法和装置实现了所述目的，但需要对消毒(密封)环境内的多种流体进行独立的复杂操控，所述多种流体包括具有较强的腐蚀性且潜在地具有较强活性、迅速损伤阀并且造成污染和水处理问题的一种物质(NaOH)。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种改进(且完全独立)的方法和装置以在不受到耐稀释变异体干扰的情况下实现有机体(包括细菌、古生菌(archaea)、真核生物和病毒)的连续培养。与其它恒化器相似，所述装置提供了通过新鲜生长培养基对生长培养物进行定期稀释的方式、在所述培养物与外部环境之间进行气体交换的方式、消毒状态、和作为恒化器或恒浊器的自动操作。 
本发明被设计以在没有任何流体传递的情况下实现该目标，所述目标包括消毒或漂洗功能。这代表了本发明与现有技术相比的具体优点，所述优点在于本发明避免了与消毒和漂洗相关联的危险和困难，所述危险和困难包括密封度和涉及腐蚀性溶剂的复杂流体传递。 
在填充有生长培养基的柔性消毒管道内部实现连续培养。所述培养基和所述室表面相对于彼此静止，且通过使所述管道蠕动通过“门(gates)”或点而规则地同时替换所述培养基和所述室表面，在所述点处通过防止培养有机体在所述管道区域之间移动的夹具(clamps)而在消毒情况下对所述管道进行再分。还可(可选地)在所述培养器皿的上游和下游添加紫外门以保证附加安全。 
本方法和装置相对于现有技术而言的改进之处还在于它们连续而非周期性地进行选择从而防止耐稀释变异体粘附到恒化器表面上，原因是受影响表面的替换与稀释过程一前一后地发生。 
所述管道以瞬态方式再分以使得形成包含饱和(完全生长)培养物的区域、包含新鲜培养基的区域和所述两个区域之间被称作生长室的区域，在所述生长室中生长培养物与新鲜培养基混合以实现稀释。所述门周期性地从所述管道上的一点被释放且在另一点处被放回，以使得生长培养物以及与其相关联的生长室表面和附接的静态有机体通过与所述生长室隔离而被去除且被新鲜培养基和新鲜室表面替换。通过这种方法，通过从发生选择的区域(所述生长室)中去除静态变异体而实现所述静态变异体的特定反选择。 
附图说明
并非穷举和限制性地，一种可能的通常构型将包括下文所述的多个部件。下面基于优选实施例并由此参考附图对本发明进行示例性说 明，其中： 
图1示出了装置的可能构型的总图，其中： 
(1)表示包含装置的不同区域的柔性管道，所述不同区域为：上游新鲜培养基(7)、生长室(10)、采样室(11)和经处理的生长培养物的区域(15)。 
(2)表示恒温控制箱，所述恒温控制箱允许根据使用者确定的条件调节温度，且其中可设置： 
a.所述生长室(10)， 
b.所述采样室(11)， 
c.限定出所述生长室(10)的开始部分的上游门(3)， 
d.限定出所述生长室(10)的末端部分和所述采样室(11)的开始部分的下游门(4)， 
e.限定出所述采样室(11)的末端部分的第二下游门(5)， 
f.允许使用者或自动控制系统监控生长培养物的光学密度且操作反馈控制系统(13)，允许管道(1)基于培养物密度进行受控移动(恒浊器功能)的浊度计(6)， 
g.一个或多个搅动器(9)。 
应该注意到，列为a-g的装置元件还可位于恒温控制箱外部或可在没有恒温控制箱的情况下设置所述装置元件。 
(7)表示未使用柔性管道中的新鲜培养基， 
(8)表示装载有填充新鲜培养基的管道以便在操作过程中分配所述新鲜培养基和管道的筒部。 
(12)表示可选的紫外辐射门， 
(13)表示控制系统，所述控制系统可包括与装置相连的计算机，所述装置被连通至允许进行自动化操作且控制操作的不同监控或操作界面，如光学密度浊度计、温度测量和调节装置、搅动器和可倾斜马达等， 
(14)表示光学处理筒部，包含填充经处理的生长培养物管道的管道卷绕在所述光学处理筒部上， 
(15)表示位于所述采样室下游的经处理的生长培养物。 
图2示出了装置的两种可能位置，示例说明了如下事实：所述恒温控制箱(2)和与所述培养物室相关联的所述装置的其它部件可产 生不同程度的倾斜以实现搅动目的、气体循环和去除目的以及确保去除可能通过沉积到底部而逃离稀释的粒状(聚集)细胞的目的。 
图3至图9示出了位于所述恒温控制箱(2)内的适当位置处且通过门(3)、(4)和(5)被引入的所述柔性管道(1)，通过所述门使得所述管道在所述过程的所有步骤期间保持停置且通过所述门使得所述管道根据其蠕动产生移动。 
图3示出了装置的状态T0，其中所述柔性管道的所有区域在注入旨在进行连续培养的有机体之前填充有新鲜培养基。图4示出了刚注射有机体菌株之后的所述柔性管道的状态T1。图5示出了装置的状态T2，所述状态为生长期，在所述生长期间培养物在限定为由所述门(3)和(4)限制的生长室(10)的区域中生长。 
图6示出了管道和相关培养基刚进行第一次蠕动之后的装置的状态T3，所述状态限定出第二生长周期的开始，与通过门4的移动将相等体积的管道、培养基和生长培养物传递离开生长室区域(10)且进入采样室区域(11)内同时地，通过门3的移动引入新鲜管道和培养基。关键在于意识到管道、管道内的培养基和已经在所述培养基中生长的任何培养物都一起移动。流体传递仅在新鲜培养基与生长培养物通过生长室区域内的搅动混合在一起的程度上发生。 
图7示出了装置的状态T4，所述状态为第二生长周期；在该周期期间，在管道的蠕动后保持在生长室中的有机体现在可利用在该步骤期间中与剩余培养物混合的新鲜培养基中提供的营养物生长。 
图8示出了管道和所包含的培养基刚进行第二次蠕动之后的装置的状态T5，所述状态确定了第三生长周期的开始，与通过门4的移动将相等体积的管道、培养基和生长培养物传递离开生长室区域(10)且进入采样室区域(11)内同时地，通过门3的移动引入新鲜管道和培养基。 
图9示出了装置的状态T6，所述状态为第三生长周期；该步骤与状态T4等效且示出了进一步操作的重复本质。可在任何时候利用注射器或其它收回装置从采样室区域(11)上去除所选择有机体的试样。 
图10示出了确定门构型的齿部的可能的外形轮廓，所述门构型包括挤压柔性管道的两个叠置齿部。门还可由单个齿部确定，所述齿部压靠在活动带、可拆卸夹具或防止有机体移动通过门且可沿管道交 替地安放在可变位置处且从所述位置处去除的其它机构上。 
具体实施方式
装置的基本操作如图3至图9所示。 
本装置的一种可能构型如图1所示，所述构型看来处于已经装载有消毒培养基的新鲜管道(如图所示被所述门(3)、(4)和(5)分成区域A-H)之后的状态。 
可通过注射(图4，区域B)将有机体引入生长室内(图3)而实现将所选择的有机体植入装置的过程。培养物随后允许生长至所需密度且可开始连续培养(图5)。 
连续培养将通过管道的门控区域的重复移动而进行。这包括门、管道、培养基和管道内的任何培养物的同时移动。管道将总是沿相同方向移动；包含新鲜培养基的未使用管道(且在下文中被称作生长室的‘上游’(7))将移动进入生长室内且与所述生长室中剩余的培养物混合，为所述生长室中包含的有机体的进一步生长提供基质。在引入生长室区域内之前，该培养基及其相关联的管道将通过上游门(3)与生长室分开从而被保持处于消毒状态。包含生长培养物的已使用管道将同时向‘下游’移动且通过下游门(4)与生长室分开。 
门构型不是本专利申请的特异点。例如，在给定构型中，可通过同时移动的多个齿部的一条链设计门，或在另一种构型中将门分离成如图1所示的明显同步的链。门可包括由两个齿部制成的系统，所述齿部以如图10所示的叠置方式挤压管道，从而通过齿部之间界面的精确性避免管道的区域G与H之间的污染。在另一种构型中，可通过将一个齿部压靠在管道的一侧上且由此将管道紧密压靠在固定基底上而获得消毒门，消毒门被标记为3、4和5，管道在如图3至图9所示的蠕动过程中沿所述固定基底滑动。 
通过已公知的装置如与加热和冷却装置相联的温度计获得所述恒温控制箱(2)。 
当培养的有机体的生长或实验设计需要时，在不通过使用气体可渗透的管道提供机械辅助的情况下直接实现换气(气体交换)。例如且并非限制地，柔性的气体可渗透管道可由硅酮制成。可通过与环境气氛交换或通过与人工限定的气氛(液体或气体)交换而实现换气， 所述人工限定的气氛与生长室或整个恒化器接触。当实验需要厌氧生活时，柔性管道可以是气体不可渗透的。例如且并非限制地，柔性的气体不可渗透的管道可由涂覆或处理的硅酮制成。 
对于厌氧进化条件而言，管道区域还可限于特定且受控的气氛区域以控制气体交换动力学。这可通过将所述恒温控制箱制成气密性的且随后将中性气体注入所述恒温控制箱内或通过将整个装置安放在气氛受控室内实现。 
通过替换生长室表面以及生长培养基实现静态变异体的反选择。 
装置被进一步设计以便可沿相对于重力的多个取向操作，即如图2所示沿达360°的范围倾斜。 
如果聚集的细胞可落到下游且由此避免从室中被去除，则耐稀释变异体可通过彼此粘结而不是粘结到室壁上而避免稀释。因此所希望的是管道通常向下倾斜，以使得聚集细胞将落向在管道移动周期期间将从生长室中被去除的区域。该构型包括使装置倾斜以使得下游门相对于重力位于上游门下面。 
生长室可根据实验选择的条件减压或超压。可利用不同的调节压力方式，例如将真空或加压空气施加至新鲜培养基和管道且穿过生长室的上游末端并穿过生长室；可通过交替挤压和锁定生长室上游的管道而实现另一种使管道减压或超压的方式。 
当培养基被包含在气体可渗透的管道中时，可在培养基内形成空气气泡。这些气泡将上升至管道的密封区域顶部且被捕获在所述顶部处直至区域(和限定所述区域的门)的移动将区域释放进入生长室、采样室内或恒化器的端点内(图6，区域D-C、B或A)。如果装置向下倾斜，则所述气泡将积聚在生长室或采样室中并取代培养物。装置被设计以在管道移动周期内周期性地向上倾斜，从而允许从所述室中去除积聚气体。 
可通过外部装置(9)使装置产生倾斜移动和/或使生长室震动而减少细胞在生长室内的聚集。另一种可选方式是，在培养操作过程中进行消毒和进行磁搅动之前，一个或多个搅拌棒可被包括在填充有新鲜培养基的管道中。 
与培养物室的长度相比，由上游门限定出的新鲜培养基区域的比例长度将限定出在周期期间获得的稀释程度。
可通过定时(恒化器功能)或通过反馈调节确定稀释频率，由此通过浊度计(图1标记为6)测量生长室中的培养物密度且当浊度达到阈值时(恒浊器功能)，稀释周期发生。 
采样室允许撤回生长的培养物以便分析实验结果、收集具有改进生长率的有机体以进行进一步培养、储存、或功能的实施、或其它目的如计算群体、检查培养基的化学成分，或测试生长培养物的pH。为了实现对生长室内部pH的持久监控，可通过构造埋置/镶嵌在管道壁部中的pH指示剂衬里而包括管道。 
任何形式的液体或半固体材料可被用作本装置中的生长培养基。利用半固体生长基质的能力是超越现有技术的显著进步。使用者可选择和限定生长培养基，所述生长培养基将限定出得到选择工艺改进的代谢过程。 
如果需要，该装置可包含多个生长室，以使得一个生长室的下游门成为另一个生长室的上游门。这可例如允许一种有机体在第一室中单独生长，且随后用作第二室中第二种有机体(或病毒)的营养源。 
该装置和方法允许研究者和产品开发者使可培养的活细胞的任何菌株通过持续生长(连续培养)在悬浮液中进化；所得的改进有机体可构成新菌株或物种。这些新有机体可被培养过程中获得的突变体识别，且这些突变体可允许新有机体与其原种基因型特征区分开。该装置和方法允许研究者通过自然选择过程改进繁殖率而分离个体从而选择任何活的有机体的新菌株。

Claims (22)

1.一种通过自然选择过程增加活细胞在悬浮液中的繁殖率或增加任何可培养的有机体的繁殖率的装置，其中所述增加活细胞在悬浮液中的繁殖率以增加的繁殖速率和/或增加的繁殖产量实现，所述装置包括：
a)包含培养基的柔性消毒管道(1)，
b)借助夹具获得的门(3，4，5)系统，以便将所述管道分成：
包含新鲜生长培养基的上游区域(7)，
包含生长培养物设置在上游区域和下游区域之间的生长室(10)，和
包含消耗的培养物的下游区域，
c)使所述管道(1)与所述门(3，4，5)同时移动并相对于所述门(3，4，5)移动的装置，以使得所述生长室的一部分(B)和相关联的培养物可脱离夹持且与所述生长室分开且使得包含未使用培养基的新鲜管道的一部分(D)可与所述培养物的一部分(C)和所述生长室中已经存在的相关联培养基相联；
其特征在于，通过所述门的同时移动，所述管道(1)、培养基和所述管道内的培养物可蠕动移动。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述门系统还将所述管道(1)分成设置在所述生长室下游的采样室(11)。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述门系统还将所述管道(1)分成多个生长室，一个生长室的下游门成为另一个生长室的上游门。
4.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述管道是柔性的以允许进行夹持且分离成独立的室。
5.根据权利要求1或2所述的装置，其中，通过同时移动多个齿部的一条链设计所述门。
6.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述门由以叠置方式挤压所述管道的两个齿部的系统组成，通过所述齿部之间界面的精确性避免所述管道的区域(G，H)之间的污染。
7.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述管道是气体可渗透的，以允许根据实验类型在培养的有机体与外部环境之间进行气体交换。
8.根据权利要求1或2所述的装置，其中如果实验需要厌氧生活，则所述管道是气体不可渗透的，以防止在所述管道与所述外部环境之间进行气体交换。
9.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述管道是透明或半透明的，以允许测量浊度。
10.根据权利要求9所述的装置，还包括浊度计(6)和控制系统(13)，以监控生长培养物的光学密度并且基于培养物密度操作所述管道(1)的受控移动。
11.根据权利要求1或2所述的装置，根据实验需求的必要性，还包括使所述生长室管道和相关联的培养基和培养物相对于环境气氛减压或超压的装置。
12.根据权利要求1或2所述的装置，还包括埋置/镶嵌在所述管道壁部中的pH指示剂衬里，以实现对生长室内的pH的持久监控。
13.根据权利要求1或2所述的装置，为适于实验条件，还包括加热或冷却所述生长室管道以及相关联的培养基和培养物的恒温控制箱(2)。
14.根据权利要求1或2所述的装置，还包括搅动所述生长室管道以及相关联的培养基和培养物的搅动器(9)。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述管道可包括一个或多个搅拌棒以实现搅动目的。
16.根据权利要求1或2所述的装置，所述管道的区域可限制在特定且受控的气氛区域中，以控制气体交换动态。
17.根据权利要求1或2所述的装置，还包括使所述生长室管道和相关联的培养基和培养物或者向下倾斜以去除聚集的细胞或者向上倾斜以去除空气的装置。
18.一种通过自然选择过程增加活细胞在悬浮液中的繁殖率或增加任何可培养的有机体的繁殖率的方法，所述方法包括：
a)通过关闭门(3，4，5)将一包含生长培养基的柔性管道(1)分成上游的新鲜培养基区域(7)、生长室(10)，其包含设置在新鲜培养基区域(7)下游的生长培养物、设置在所述生长室的下游的采样室(11)、和经处理的生长培养物的区域(15)；
b)通过在消毒情况下将发酵剂培养物注入包含消毒生长培养基的消毒管道内，而在所述生长室(10)中提供起始培养物；
c)根据实验需要保持生长条件；
d)在特定时期和/或相关联的培养物生长之后，施加所述门(3，4，5)的同时移动以便移动所述管道(1)和所述管道内的所述培养基和培养物，以使相等部分的新鲜培养基和生长培养物分别移动进入和离开限定为所述生长室的区域，允许生长培养物的剩余部分与新鲜培养基的引入部分混合且继续生长；
e)重复步骤c)和d)直至实验结束从而实现连续培养且选择具有增加的繁殖率的变异体；
f)根据需要从采样室(11)中撤回生长培养物的样品。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述步骤c)包括根据温度、压力、光学密度、化学酸度、搅动和用多种气体进行换气保持生长条件。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述步骤c)还包括将所述管道的区域限制在特定且受控的气氛区域中，以控制气体交换动态。
21.根据权利要求18或19所述的方法，其中使所述装置倾斜和操作搅动器的组合导致进行适当搅动以使所述生长培养物混合从而防止或抑制活的有机体的聚集。
22.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述步骤a)还包括将所述管道分成多个生长室，一个生长室的下游门成为另一个生长室的上游门，并且步骤b)还包括将第二有机体提供在所述另一个生长室中。
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