CN1966687A - 一种调控水稻赤霉素合成的转录因子基因OsYAB1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因OsYAB1与水稻赤霉素合成有关。将该基因的完整翻译序列(Coding sequence)与花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)结合后直接转入水稻，转基因植株明显比野生型对照植株矮；在外源赤霉素(GA3)作用下，转基因植株株高可恢复正常，进一步的分析发现，转基因植株内赤霉素氧化酶基因(OsGA3ox2)的表达受到了抑制，而其它氧化酶基因不受影响。表明OsYAB1可负调控OsGA3ox2的表达，并影响植物株高。

Description

一种调控水稻赤霉素合成的转录因子基因OsYAB1及其应用

                             技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种调控水稻植株赤霉素合成的DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。

                             背景技术

赤霉素(GA)是一类植物生长激素，属于双萜类化合物，能够促进植物的生长、发芽、开花和结果，因而对植物的生长发育起着至关重要的作用。植物体内的GA成分有数十种，但具有生物活性的主要有两种，即GA1和GA4，其生物合成是通过trans-geranylgeranyl diphosphate(GGPP，牦牛儿焦磷酸)途径合成而来(Hedden and Kamiya，Gibberellin biosynthesis：enzymes，genes and their regulation.Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol.1997，48：431-460；Heden and Pillips，Gibberellin metabolism：newinsights revealed by the genes.Trends Plant Sci.2000，5：523-530)。具体过程是，在内根-贝壳杉烯合成酶的作用下从牦牛儿焦磷酸(GGPP)首先合成内根-贝壳杉烯；然后在细胞色素P450催化下，内根-贝壳杉烯转化成GA12醛；最后，GA12醛在双加氧酶的作用下氧化成为具有生物活性的GA。在水稻中，参与GA早期合成的氧化酶基因(如：CPS，KS，KO和KAO)主要由单基因编码，而参与GA后期合成的氧化酶基因(如：GA20ox，GA3ox和GA2ox)则由家族基因编码(Satkamoto等，An overview of gibberellinmetabolism enzyme genes and their related mutants in rice.Plant Physiol.2004，Apr；134(4)：1642-53)。

已有的研究表明，在水稻株高发育上，GA起到十分重要的作用。目前已有一批水稻GA缺失突变体被鉴定出来，这些突变体无一类外均表现出矮化的突变表型。水稻中首先被鉴定出来的GA缺失突变体是D18的缺失突变体，D18编码GA合成中的氧化酶基因OsGA3ox2，D18功能缺失以后引起水稻半矮突变(Itoh H等，Cloning and functional analysis of gibberellin 3β-hydroxylase genes that are differentlyexpressed during the growth of rice.Proc Natl Acad Sci USA.2001，98：8909-8914)。另外一个是SD1(Semi-Dwarf1)基因，SD1编码GA合成中的氧化酶基因OsGA20ox2，SD1功能缺失以后也引起水稻半矮突变(Sasaki等A mutant gibberellin-synthesis gene in rice.Nature.2002，416：701-702)。此外还有一个半矮基因是D35，编码GA合成中的氧化酶基因OsKO2，其功能缺失突变体也表现为半矮突变(Itoh H等，A rice semi-dwarf gene，Tan-Ginbozu(D35)，encodes the gibberellin biosynthesis enzyme，ent-kaurene oxidase.Plant Mol Biol.2004，Mar；54(4)：533-47)。这三个基因因为能控制株高的生长发育而被誉为水稻中的绿色革命基因。

赤霉素氧化酶基因的表达也要受到很多转录因子的调控，如烟草中的RSG基因可以调控GA3氧化酶基因的表达(Jutarou Fukazawa等，REPRESSION OF SHOOT GROWTH，a bZIP Transcriptional Activator，Regulates Cell Elongation by Controlling the Level of Gibberellins.Plant Cell，2000，Vol.12，901-915)。中国发明专利申请公开说明书(公开号CN 1566147A)公开了一种调控赤霉素生成的转录因子及其编码的基因与应用，该转录调控因子命名为GPBF，来源于玉米，但是它没有转化玉米本身，而是转化拟南芥。在植物种属的分类上，拟南芥是双子叶植物而玉米是单子叶植物，因此该基因是否能够转化玉米并调控玉米植物的赤霉素的合成，其功能尚待进一步研究。

本发明找到了一个来源于水稻并能调控水稻赤霉素合成的转录因子基因，这个基因在超量表达以后能够降低其调控的内源赤霉素氧化酶基因的表达，从而降低植物体内赤霉素的水平，并最终引起植株的矮化。

                              发明内容

本发明的目的在于提供一种调控赤霉素合成的转录因子，通过转化水稻本身，培育一种能够调控赤霉素合成的转基因水稻。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明从水稻中分离得到一种调控植物赤霉素合成的转录因子基因OsYAB1，它是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ NO：1中第106-615所示的DNA序列；或

2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

本发明的转录因子OsYAB1的编码基因(SEQ ID NO：1)来源于水稻，由1043个碱基组成，其推测的蛋白质编码序列有510个碱基，是序列1自5’端第106位碱基到615位碱基组成。

所述的基因OsYAB1与水稻赤霉素合成有关。将该基因的完整编码序列(Coding sequence)与花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S结合后直接转入水稻，转基因植株株高明显比野生型对照植株株高要矮；在外源赤霉素(GA3)作用下，转基因植株的株高可恢复正常。进一步的分析发现，本发明的转基因植株内赤霉素氧化酶基因(OsGA3ox2)的表达受到了抑制，表明本发明转录因子基因OsYAB1能够调控OsGA3ox2的表达。

赋予植物调控赤霉素合成能力的DNA序列，它是与SEQ ID NO：1中第340-1173位所示DNA序列相似性在85％以上且能调控与赤霉素氧化酶基因OsGA3ox2表达的同源DNA序列。

如附图2所示，本发明构建了一种超表达载体pDS1301，获得转化载体pDS1301-YAB1。利用该转化载体转化水稻品种“日本晴”(一种粳稻亚种)，得到转基因水稻植株。

具体操作步骤如下：

(1)利用农杆菌介导的转基因方法将所述的基因OsYAB1导入水稻受体，获得转化植株；

(2)借助PCR方法分析鉴定阳性转基因植株；

(3)将步骤(2)的转基因植株进行大田种植并观察其性状；

(4)利用反转录(RT)-PCR分析转基因植株中目标基因的表达，

(5)用外源赤霉素(GA3)对转基因植株进行处理，并观察其表型；

(6)借助RT-PCR分析转基因植株和野生型植株中参与赤霉素合成的氧化酶基因的表达。

本发明所克隆的转录因子基因OsYAB1可用于抗倒伏和紧凑型水稻育种上。

更详细的技术发明细节由以下实施例给出，但并不是限制该发明的保护范围。

                              附图说明

图1：为FIL和OsYAB1的蛋白质序列分析图

图2：为pDS1301-YAB1转化载体构建示意图

图3：为野生型植株及OsYAB1转基因植株株高及各节示意图。图中：A，转基因水稻植株出现矮化表型；B，野生型水稻植株和转基因植株各节示意图。

图4：为OsYAB1在野生型对照及其转基因植株中的表达分析(RT-PCR)。本发明的转基因水稻植株

(YAB1-n)中OsYAB1的表达比野生型水稻植株(W.T)OsYAB1的表达要强。

图5：为OsYAB1转基因矮化植株的GA3互补实验

图6：为OsYAB1转基因植株和对照植株体内GA氧化酶基因的表达分析。A，表示其中的一个转基因家系YAB1-1植株体内各赤霉素氧化酶基因的表达情况，仅发现GA3ox2的表达受到了抑制；B，显示的另外两个家系GA3ox2的表达情况，发现GA3ox2的表达也受到了抑制。

                            具体实施方式

实施例1 OsYAB1基因的克隆及序列分析：

用拟南芥的FIL(YABBY类转录因子，NCBI蛋白质登录号为AAD33715)基因的蛋白质序列在REDB( http：//redb.ncpgr.cn/)网站中选择Regular blast工具，在“Rice EST”数据库做tblastx分析，找到水稻中的同源克隆(EI#95-L17)，从cDNA文库(见参考文献：储昭晖、彭开蔓等，水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定。科学通报.2002，47(21).1656-1662)获得这个克隆，测序获得全长cDNA序列(序列测定由上海国家基因测序中心完成)，将该DNA序列命名为OsYAB1，它的cDNA核苷酸序列如序列表SEQNO：1所示(见序列表)。用GenDoc软件(版本：GenDoc3.2)对FIL和OsYAB1的蛋白质序列分析发现，OsYAB1具有典型的YABBY类转录因子特征，即具有典型的锌指结构域(Zinc finger domain)和YABBY结构域(YABBY domain)(见图1)。

实施例2 双元Ti质粒载体的构建和转化农杆菌的建立：

具体步骤如下：

1)将带有OsYAB1的cDNA克隆，装载质粒为pSPORT1(见附图2)用KpnI和BamHI酶切后，分离目标基因片段(加上pSPORT1来源的酶切接头片段，OsYAB1基因的大小为1103bp)，直接与KpnI和BamHI酶切的载体质粒pDS1301连接(所使用的内切酶均购自TAKARA公司，用法及用量按照产品说明书；连接酶为invitrogen公司产品，用法及用量按照产品说明书)；

2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入DH10B(购自Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(Roche公司产品)的LA(LA配方参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)抗性培养基上涂皿培养；

3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述抽提质粒，用KpnI和BamHI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的超表达双元Ti质粒载体：pDS1301-YAB1(见附图2)；

4)把新构建的pDS1301-YAB1通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数如上所述)导入农杆菌EHA105(购于CAMBIA公司)菌株中。转化后的菌株命名为T-YAB1。

实施例3 双元Ti质粒载体的转化及转基因植株的阳性检测：

1)将T-YAB1向受体品种“日本晴”转化，转化方法参照Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformationof rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)进行。所获得的T0代转基因植株命名为YAB1-n，其中n＝1，2，3...代表转基因的不同家系。

2)取T0代转化植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，Theor Appl Genet，83，495-499)。然后用PCR方法对T0代转化植株用潮霉素引物进行阳性检测。潮霉素引物的序列如下：Hn-P5′-agaagaagatgttggcgacct-3′，Hn-R 5′-gtcctgcgggtaaatagctg-3′(上海生物技术公司提供)。PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，左、右引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃1分钟，③56℃1分钟，④72℃2.5分钟，⑤从②-④循环32次，⑥72℃10分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。因为潮霉素基因为转化载体所特有，这样能扩增出潮霉素基因特异带的转基因植株即为阳性植株。

3)对T0代阳性植株收种子(T1代)，为T1代的大田种植和性状调查做准备。在本实施例中，遗传转化(转基因植株获得)的主要步骤、培养基以及使用的试剂如下：遗传转化的主要步骤、培养基及其试剂如下：

(1)培养基中试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；Hn(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亚砜)；N6 max(N6基本培养基的大量成分溶液)；N6 mix(N6基本培养基的微量成分溶液)；MS max(MS基本培养基的大量成分溶液)；MS mix(MS基本培养基的微量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6基本培养基大量元素母液[10倍浓缩液]的配制：

硝酸钾(KNO₃)                28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)         4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)         4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)        1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)        1.66g

将上述试剂逐一用蒸馏水溶解，然后在室温下用蒸馏水定容至1000ml，备用。

2)N6基本培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI)                   0.08g

硼酸(H₃BO₃)                0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)       0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)       0.15g

室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(配制成100X液)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，用蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid)            0.1g

维生素B1(Thiamine HCl)        0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl)      0.1g

甘氨酸(Glycine)                 0.2g

肌醇(Inositol)                  10g

加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS基本培养基的大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵            16.5g

硝酸钾            19.0g

磷酸二氢钾        1.7g

硫酸镁            3.7g

氯化钙            4.4g

室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。

6)MS基本培养基的微量元素母液(100X)的配制

碘化钾                     0.083g

硼酸                       0.62g

硫酸锰                     0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)   0.0025g

室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取2，4-D  100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后用蒸馏水定容至100ml，于室温下保存、备用。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml用蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存，备用。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取NAA  100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解并定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基组分及用量

1)愈伤组织诱导培养基

N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)            100ml

N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)           10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)     10ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)         10ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)          2.5ml

脯氨酸(Proline)                           0.3g/L

CH                                        0.6g/L

蔗糖(Sucrose)                             30g/L

Phytagel                                  3g/L

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，在121℃下灭菌12分钟。

2)愈伤组织继代培养基

N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)         100ml

N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)        10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)  10ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)      10ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)          2.0ml

脯氨酸                                    0.5g/l

CH                                        0.6g/l

蔗糖                                      30g/l

Phytagel                                  3g/l

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口在121℃下灭菌12分钟。

3)预培养基

N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)            12.5ml

N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)           1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)     2.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)         2.5ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液)               0.75ml

CH                                           0.15g/L

蔗糖                                         5g/L

琼脂粉(Agarose)                              1.75g/L

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，在121℃下灭菌12分钟。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)           12.5ml

N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)          1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)    2.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)        2.5ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)            0.75ml

CH                                          0.2g/L

蔗糖                                        5g/L

琼脂粉                       1.75g/L

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口，在121℃下灭菌12分钟。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)             5ml

N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)            0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)      0.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)          1ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)              0.2ml

CH                                            0.08g/L

蔗糖                                          2g/L

加蒸馏水至100ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，在121℃下灭菌12分钟。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)          25ml

N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)         2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)   2.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)       2.5ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)           0.625ml

CH                                         0.15g/L

蔗糖                                       7.5g/L

琼脂粉                                     1.75g/L

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250μl Hn和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)               25ml

N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)              2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)        2.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)            2.5ml

6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)                  0.5ml

KT贮存液(从已配好的贮存液中)                    0.5ml

NAA贮存液(从已配好的贮存液中)                   50μl

IAA贮存液(从已配好的贮存液中)                   50μl

C                                               0.15g/L

蔗糖                                            7.5g/L

琼脂粉                                          1.75g/L

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250μl Hn和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)           100ml

N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)          10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好100X浓缩液中)      10ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)        10ml

6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)              2ml

KT贮存液(从已配好的贮存液中)                2ml

NAA贮存液(从已配好的贮存液中)               0.2ml

IAA贮存液(从已配好的贮存液中)               0.2ml

CH                                          1g/L

蔗糖                                        30g/L

Phytagel                                    3g/L

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，在121℃下灭菌12分钟。

9)生根培养基

MS max母液(从已配好的10X浓缩液中)             50ml

MS min母液(从已配好的100X浓缩液中)            5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)      5ml

维生素贮存液(从已配好的100X贮存液中)          5ml

蔗糖                                          30g/L

Phytagel                                      3g/L

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，在121℃下灭菌12分钟。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤：

3.1愈伤组织诱导

(1)将成熟的水稻种子(品种为：“日本晴”)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

(2)用无菌水冲洗种子4-5次；

(3)将灭过菌的水稻种子放在诱导培养基上(培养基的组成如上所述)；

(4)将接种后的培养基置于25±1℃的黑暗处培养4周。

3.2愈伤组织继代培养

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于如前所述的愈伤组织继代培养基上，在25±1℃，黑暗条件下培养2周。

3.3愈伤组织的预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于前面所述的预培养基上，在25±1℃，黑暗条件下培养2周。

3.4农杆菌培养

(1)农杆菌EHA105接种在在带有对应抗性选择的培养基LA上预培养，培养温度为28℃培养48小时；

(2)再将步骤(1)的农杆菌转移至前面描述的悬浮培养基上，在28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤组织转移至灭过菌的玻璃瓶内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

(3)将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤组织至灭好菌的滤纸上吸干；然后将其接种到如前所述的共培养基上，培养温度19-20℃，培养3天。

3.6愈伤组织洗涤和选择培养(抗性筛选)

(1)用无菌水洗涤愈伤组织至看不见农杆菌；

(2)将愈伤组织浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的无菌水中30分钟；

(3)将该愈伤组织转移至灭菌好的滤纸上，使该愈伤组织不带水；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400毫克/升，第二次以后为250毫克/升)。

3.7预分化和分化

(1)将以上得到的抗性愈伤组织转移至如前所述的预分化培养基上，在黑暗处培养5-7周；培养温度26℃。

(2)转移预分化培养的愈伤组织至如前所述的分化培养基上，置光照下，光照强度2000lx培养，培养温度为26℃。

3.8诱导生根

(1)剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至如前所述的生根培养基中，在光照强度2000lx下培养2-3周，培养为温度26℃，经过15天得到生根的小植株。

3.9移栽

洗掉小植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室培养，同时在移栽的最初的几天保持水分湿润。

实施例4 T1代性状调查和表达分析：

1)将本发明的转基因YAB1-n的阳性家系以及野生型按20株/家系进行T1代大田种植。在各家系的全生育期进行性状调查。调查数据显示在OsYAB1的转基因家系中，绝大部分家系表现出株高变矮的变异表型，出现矮化特征(参见图3所示)。

3)为了比较OsYAB1转基因矮化植株各节相对于野生型植株各节的变化，我们对OsYAB1转基因植株中的5个家系在稻粒完全成熟以后取各家系所有的矮化植株进行调查。结果发现，转基因植株除了基部的第五节变化不大外，其上各节(包括穗部)都较野生型要矮，数据如下表：

表1野生型植株及OsYAB1转基因植株各节长度及株高调查(单位：厘米)

家系	各家系调查的植株数目	各节长度						株高
									P	I	II	III	IV	V
		野生型YAB1-1YAB1-2YAB1-3YAB1-4YAB1-5	131114999	19.8±1.111.9±2.117.9±3.316.3±2.711.2±0.814.1±1.6	32.6±3.013.3±2.924.3±4.927.8±4.511.4±2.120.2±1.5	13.4±2.06.3±1.78.4±1.68.3±1.74.8±1.47.7±1.5	7.9±1.34.4±1.14.3±0.84.3±0.84.0±1.13.7±1.4								3.8±1.82.5±0.51.2±0.41.7±0.72.6±0.72.0±1.3	0.9±0.31.5±1.00.8±0.10.7±0.11.0±0.50.6±0.2	78.4±3.240.0±4.256.9±4.759.0±2.935.1±4.448.3±4.1

3)另外，我们发现矮化的植株均表现出分蘖增多的现象，表明这些植株有更广阔的增产潜力。数据来自于OsYAB1的5个家系，每个家系取10株进行调查。结果如下：

表2本发明的OsYAB1转基因植株与野生型植株分蘖情况的调查。

家系	野生型	YAB1-1	YAB1-2	YAB1-3	YAB1-4	YAB1-5
							分蘖数	18.7±4.0	46.2±3.0	56.6±8.0	61.1±24.0	68.2±19.0	67±25.0

4)为了检测转基因植株中目标基因的表达量，我们用RT-PCR和northern杂交等方法对转基因矮化植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自剑叶期的叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配混合液1：总RNA 2μg，DNAse I 2u，10xDNAse I buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于70℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，④将冷却的混合液1立即置于70℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2：混合液110μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl.10mM dNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；RT-PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCRbuffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，左、右引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下：①94℃2分钟，②94℃1分钟，③56℃1分钟，④72℃1分钟，⑤从②-④循环30次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。RT-PCR用到的OsYAB1基因的引物为：YAB1-F5′-ctcctcctccagcattgaag-3′，YAB1-R 5′-gctcatgcacttccttcctc-3′，Actin引物为Actin-F 5′-tatggtcaaggctgggttcg-3′，Actin-R 5′-ccatgctcgatggggtactt-3′(均为上海生物技术公司提供)。

结果显示在这些矮化植株中OsYAB1的表达量都得到提高，表明矮化的变异表型是由目标基因的超量表达引起的，表达分析结果如图4所示。

实施例5 转基因矮化植株的GA3互补分析和GA氧化酶基因的表达分析：

GA3互补实验的具体操作步骤是：

①配制发芽培养基

MS max母液(取已配好的10X浓缩液中)             50ml

MS min母液(取已配好的100X浓缩液中)            5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(取已配好的100X贮存液中)      5ml

维生素贮存液(取已配好的100X贮存液中)          5ml

蔗糖                                          15g/L

Phytagel                                      3g/L

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(30ml/瓶)，封口高温湿热灭菌12分钟左右，冷却到60℃左右，在超净工作台向三角瓶中加入125mg/L的Hn，然后向一半加有Hn的三角瓶中加入30mg/L的GA3(Sigema公司产品)(野生型对照瓶不加Hn和GA3)，摇匀，冷却并使之凝固后待用；

②种子脱毒

任选OsYAB1转基因的三个阳性家系(YAB1-1，YAB1-2，YAB1-4)和野生型(品种日本晴)的成熟种子，去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，倒去乙醇后用0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒18分钟；用灭菌水洗种子4-5次；

③种子接种及发芽培养

将OsYAB1各家系脱毒后的种子分成两等分，一份接种于仅加有Hn的培养基，另一份接种于既加有Hn又加有GA3的培养基，这样接种的目的是完全抑制转基因种子中分离出来的与野生型种子基因型相同的种子的萌发，并观察在加与不加GA3的情况下种苗的生长情况。然后野生型种子接种于不加Hn和GA3的培养基，接种后的培养基在28℃光照培养室培养两个星期；

④两个星期后取样并照相。

结果显示，在施加30ppm的外源GA3后，这些转基因植株的矮化表型基本能得到恢复，说明这些植株体内的GA水平较之其野生型对照体内的GA水平要低。结果见图5。

实施例6 转基因矮化植株中GA氧化酶基因的表达分析：

对OsTAB1转基因植株的三个家系(如实施例5所述)和野生型对照植株赤霉素代谢过程中各氧化酶基因的表达进行了分析。所用到的总RNA、反转录方法、RT-PCR反应体系和反应条件如实施例4中所述，RT-PCR所用到的各基因的引物如下表：

              表3GA氧化酶基因表达分析所用到的引物

基因	左引物碱基序列	右引物碱基序列	扩增产物大小
				OsCPS1	ACGAATTGAGGAGGCAGCATCTATG	GAGCAAGTTCTTGCATACCCAACTC	182bp
OsGA3OX1	ATGGAGGAGTACGACTCGTCGATGAGAG	CTCTGCAGGATGAAGGTGAAGAAGCCTG	239bp
				OsGA3OX2	CGACCTCTTCCACATCCTCACC	CGTCGGTGGAGACCATCTTGAG	257bp
OsGA20OX1	CTGTCGTTCCGGTACTCATCG	AGTAGTTGAGGCGCATGATGG	253bp
				OsGA20OX2	GAGACCCTCTCCTTCGGCTTC	CATGGCGGGTAGTAGTTGCAC	248bp
OsGA20OX3	GTGGAAGGAGACCATGTCGTTCAACTGC	TCATCACGTCGCAGTACTCCTGGTACAC	137bp
				OsGA20OX4	GCTCTACCCGGACTTCACCTG	AGCTAGCTGGACGCCCTAGAC	176bp
OSGA2OX3	TTCTTCGTCAACGTCGGCGACTCGTTGC	TCTCAAACTGGGCCAGCCTGTTGTCTCC	265bp
				OSGA2OX4	GCGTGCGAGAGGTTTGGGTTCTTCAAGG	CTCCGCCACCATCTCCAGCACCGTCC	330bp

结果表明，在这些矮化植株中，GA3 oxidase2(OsGA3ox2)的表达降低了，而其它氧化酶基因的表达不受影响。从而说明OsYAB1能负调控GA3Ox2，结果见图6。

                              序列表

                         SEQUENCE LISTING

<110>华中农业大学

<120>一种调控水稻赤霉素合成的转录因子基因OsYAB1及其应用

<130>

<141>2005-11-08

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1043

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1043)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(616)..(1043)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(106)..(615)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(105)

<223>

<400>1

gctcctggat atatagctag cttctttctt tcttcctctc tccctgtgtg gcacgcgcct     60

ccaatcgatc tcttcggtga gtagacgcat cgagatcggg gggaa atg tcg gtc cag    117

                                                  Met Ser Val Gln

                                                  1

ttt aca tcg gag cat gtt tgc tat gtc aac tgc aac tat tgc aac act    165

Phe Thr Ser Glu His Val Cys Tyr Val Asn Cys Asn Tyr Cys Asn Thr

5                   10                  15                  20

atc ctt gtg gtg aat gtg cca aac aat tgt tcc tac aac att gtg act    213

Ile Leu Val Val Asn Val Pro Asn Asn Cys Ser Tyr Asn Ile Val Thr

                25                  30                  35

gtt aga tgt ggg cat tgc aca atg gtg ctc tcc atg gat ctt gct cct    261

Val Arg Cys Gly His Cys Thr Met Val Leu Ser Met Asp Leu Ala Pro

            40                  45                  50

ttt cac caa gca cgc act gtt caa gat cac cag gta cag aac aga gga    309

Phe His Gln Ala Arg Thr Val Gln Asp His Gln Val Gln Asn Arg Gly

        55                  60                  65

ttt caa ggt aat aac ttt gga agc tat gac ata gct tcc aga aat cag    357

Phe Gln Gly Asn Asn Phe Gly Ser Tyr Asp Ile Ala Ser Arg Asn Gln

    70                  75                  80

agg aca tcg aca gcc atg tac cca atg cca acc agt cag cag caa gtg    405

Arg Thr Ser Thr Ala Met Tyr Pro Met Pro Thr Ser Gln Gln Gln Val

85                  90                  95                  100

tca cct ata cgt ccc cct gag aaa aga cag cgt gtc cca tct gca tac    453

Ser Pro Ile Arg Pro Pro Glu Lys Arg Gln Arg Val Pro Ser Ala Tyr

                105                 110                 115

aac aga ttc atc aag gag gag ata cag agg att aaa acc agc aat cct    501

Asn Arg Phe Ile Lys Glu Glu Ile Gln Arg Ile Lys Thr Ser Asn Pro

            120                 125                 130

gag att agc cac agg gag gca ttc agt gct gct gca aag aac tgg gct    549

Glu Ile Ser His Arg Glu Ala Phe Ser Ala Ala Ala Lys Asn Trp Ala

        135                 140                 145

cat ctt ccc cgg ctc cat ttt ggc ctc aac gtc gcc gac ggc ggc ggc    597

His Leu Pro Arg Leu His Phe Gly Leu Asn Val Ala Asp Gly Gly Gly

    150                 155                 160

ggc ggc ggc agc aac taa tcgcggcggc gcggcctgcc ggccggccac           645

Gly Gly Gly Ser Asn

165

cgatcgccgg cgtgcacgcc ggcgcgcgcg acggccggtc gagaatgcgc gcgcaggagg  705

gacgacgacg atatattatt atcgcgtgtg cccctctctc ttcgccgcgt aattaattaa    765

tcagttaatt aattacgtac gacctactgt gttatgctat cgatccgtgt taattaatta    825

cctacgtatc ttgattaatt agtctcgtat tatacgtact attatacgta cgtgctgtgc    885

tatgtacgta gacaacaaaa aaaaatgtgc gtgatgagtt ctactacgta cgtacgtact    945

gtgttctagt gttttaattt gtatccgaac caaggagttg tttaattaac tgcatgcaca   1005

tgcactggac ttgaatctgg agtaaaaaaa aaaaaaaa                           1043

<210>2

<211>169

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Ser Val Gln Phe Thr Ser Glu His Val Cys Tyr Val Asn Cys Asn

1               5                   10                  15

Tyr Cys Asn Thr Ile Leu Val Val Asn Val Pro Asn Asn Cys Ser Tyr

            20                  25                  30

Asn Ile Val Thr Val Arg Cys Gly His Cys Thr Met Val Leu Ser Met

        35                  40                  45

Asp Leu Ala Pro Phe His Gln Ala Arg Thr Val Gln Asp His Gln Val

    50                  55                  60

Gln Asn Arg Gly Phe Gln Gly Asn Asn Phe Gly Ser Tyr Asp Ile Ala

65                  70                  75                  80

Ser Arg Asn Gln Arg Thr Ser Thr Ala Met Tyr Pro Met Pro Thr Ser

                85                  90                  95

Gln Gln Gln Val Ser Pro Ile Arg Pro Pro Glu Lys Arg Gln Arg Val

            100                 105                 110

Pro Ser Ala Tyr Asn Arg Phe Ile Lys Glu Glu Ile Gln Arg Ile Lys

        115                 120                 125

Thr Ser Asn Pro Glu Ile Ser His Arg Glu Ala Phe Ser Ala Ala Ala

    130                 135                 140

Lys Asn Trp Ala His Leu Pro Arg Leu His Phe Gly Leu Asn Val Ala

145                 150                 155                 160

Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn

                165

Claims (5)

1、一种调控植物赤霉素合成的转录因子基因OsYAB1，它是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ NO：1中第106-615所示的DNA序列；或

2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

2、赋予植物调控赤霉素合成能力的DNA序列，它是与SEQ ID NO：1中第106-615位所示DNA序列相似性在85％以上且能调控与赤霉素氧化酶基因OsGA3ox2表达的同源DNA序列。

3、权利要求1所述的基因OsYAB1的转化载体。

4、权利要求3所述的转化载体是pDS1301-YAB1。

5、权利要求1-2所述的基因在调控水稻赤霉素合成中的应用。

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