CN1966516A - 纳米胶原寡肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从动物皮一步法直接提取纳米胶原寡肽的制备方法，该方法包括将含有胶原蛋白的天然动物皮直接酶解，获得小分子胶原，产物，平均分子量约500D，产物分子量分布主要在100～1000D之间，为二肽到七肽的小分子组合，高斯分布峰值分子为三肽、四肽、五肽，产物胶原特征氨基酸组成为甘胺酸(glycine)24％、脯胺酸(proline)14％及羟脯胺酸(hdroxyproline)11％，谷氨酸9％，精氨酸8％。用本方法提取的纳米胶原寡肽可以作为良好的医药、保健品、化妆品原料。
Description
技术领域
本发明涉及一种从动物皮中直接提取纳米胶原寡肽的制备方法，具体地讲是将含有胶原蛋白的天然动物皮直接酶解，获得小分子纳米胶原寡肽。用本方法提取的纳米胶原寡肽可以作为良好的医药、保健品、化妆品原料。
背景技术
本发明中所述的胶原蛋白(Collagen)又称胶原，它是动物结缔组织重要的蛋白质，结缔组织除了含60～70％的水分外，胶原蛋白占了约20～30％，因为有高含量的胶原蛋白，结缔组织具有了一定的结构与机械力学性质，如张力强度、拉力、弹力等以达到支撑、保护的功能。人体成分中有16％左右是蛋白质，胶原蛋白占体内蛋白质总量的30～40％，故成年人体内约有3kg左右胶原蛋白，主要存在于皮肤肌肉、骨骼、牙齿、内脏(如胃、肠、心肺、血管与食道)与眼睛等处。
皮肤成分中除了水外，有70％是由胶原蛋白组成，皮肤如一个大套子紧紧包住身体各处，表面积相当大，人体四肢活动时，皮肤中胶原蛋白发挥功能，使皮肤具有保护功能，又有适当弹性及坚硬度。表皮基底膜与真皮中的胶原蛋白紧密结合，真皮呈现波浪状也使得表皮随之起伏。手脚能自由弯曲，跳高时具有弹性，主要归功于胶原蛋白。胶原蛋白在皮肤结构中是紧紧包住真皮层中的毛根皮脂腺以及细胞。皮肤老化后会失去弹性，主要与胶原蛋白有关。
胶原蛋白是维持皮肤与肌肉弹性的主要成分。但随着年龄增加，皮肤与肌肉中的水分会减少这是老化的开始。此时，胶原蛋白纤维开始变为细小，弹性蛋白之弹性也会减低，原先真皮中胶原蛋白与弹性蛋白交互构成有规则的网目结构会逐渐崩解，最后导致皱纹的生成。所以补充胶原蛋白能使皮肤保持年轻，道理即在于此。再加上环境污染，紫外线照射，精神紧张等各种原因，结果使皮肤显得干燥，变薄，失去弹性，脸上的皱纹也逐渐增多，这就是为什么皮肤老化会失去青春光彩的原因。
因此，皮肤进入老化期，适当补充胶原蛋白是非常必要的。胶原蛋白产品常常被应用于化妆品中以增加化妆品的保湿、皮肤修护等功能。
动物来源的普通胶原蛋白是由三条a链绞合而成的螺旋结构组成的，每条a链是由数百个至上千个氨基酸缩合成的，平均分子量高达几十万至几百万，在一般情况下，口服或外敷普通胶原蛋白，其生物利用度很低。
因此，人们通过酶等方法把胶原蛋白水解变成肽，以提高其生物利用度。早期和目前市场上的绝大多数水解胶原蛋白，主要由30-100个氨基酸构成多聚氨基酸或称为胶原多肽，平均分子量达1000-10000D，其皮肤渗透性、生物利用率和功效比大分子胶原蛋白有所提高，但仍然有限。
李岩等在pH渐变条件下双酶协同水解猪皮(“食品科学”，2003，V24，No7，P74-79)制备胶原蛋白寡肽，得到的胶原蛋白寡肽是分子量分布在800～5000D，平均分子量在2500左右。
赵征、胡爱军在专利(CN200410071942)中采用复合酶水解鱼皮制备胶原蛋白寡肽，得到产物分子量分布在2000～6000范围内。
陈三、李学强等在专利(CN02133825.6)中，采用明胶为原料，制备胶原多肽，得到分子量在2000～8000D范围内的胶原多肽。
史宗洁等在专利(CN200310104047.4)中，采用猪皮为原料，复合酶法水解，得到胶原多肽，分子量在5000D以上。
郭洪臣等在专利中(CN03110986.1)采用猪皮为原料，复合酶法水解，得到胶原多肽含10个氨基酸左右，是分子量在800～2000D范围内的胶原多肽。
上述技术，虽然水解胶原蛋白产物分子量已经相对较小，但皮肤渗透性仍然不高，由于分子量仍然比较大，在化妆品上主要起外层的护理作用，难以渗透进入真皮层、真正起到皮肤的护理、修复作用。
上述产物分子量尚不能算是严格意义上的胶原寡肽(二肽到七肽)，因此还不具有胶原寡肽营养的价值。
发明内容
本发明的目的之一是通过复合酶法水解动物皮肤，得到纳米胶原寡肽。
本发明的另一目的是将水解得到的纳米胶原寡肽用作医药、保健品、化妆品原料。
一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽，分子量主要分布在100～1000D之间，为二肽到七肽的小分子组合，高斯分布峰值分子量约为500D；
一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽，主要为三肽、四肽、五肽，其分子大小和长度
在几个纳米到十几个纳米之间；
一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽的制备方法，包括将含有胶原蛋白的动物皮经过预处理，采用复合酶法水解提取胶原蛋白，大分子的胶原蛋白被水解成小分子的胶原蛋白寡肽；
一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽的制备方法，预处理过程是将鲜畜皮脱毛后，刮脂、洗净、缴碎成小块，先用10倍体积的饱和石灰水浸泡40天，用水漂洗干净，水处理动物皮；
一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽的制备方法，水解所采用的酶是指胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶，基质金属蛋白酶，中性蛋白酶，菠萝蛋白酶中的1种或几种的组合；
一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽的制备方法，每种酶的用量为畜皮重量的0.5～2％，每种酶的水解pH为3～10，水解时间为1～8小时。
一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽的制备方法，提取纳米胶原寡肽的温度是20-75℃；
一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽的制备方法，提取纳米胶原寡肽的水解反应是在真空条件下进行的；
一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽的制备方法，提取纳米胶原寡肽采用的水解混合物固含量是1-40％；
通过上述方法制备所得的纳米胶原寡肽，主要用作医药、保健品、化妆品原料。
用本发明方法得到的胶原蛋白寡肽，具有低分子量、高生物活性的特点，分子量主要分布在100～1000D，平均分子量500D，其肽链长度约为十几个纳米，是胶原肽分子的十分之一、胶原蛋白分子的千分之一。
用本发明得到的胶原蛋白水解产物，根据其分子量分布，属于纳米胶原寡肽，拥有极强的吸收性，可以不必经过胃肠、肝脏消化，大大减轻胃肠、肝脏负担，大大提高生物利用度；可以直接参与酶、激素、人体所需蛋白质的合成，而不必分解成氨基酸再发挥作用，其参与胶原合成的速度更快捷。
用本发明方法得到的纳米胶原寡肽，对皮肤的渗透性极大提高，能以较快的速率渗透通过表皮屏障进入真皮层和皮下组织，充分发挥其营养、修护皮肤的作用。这是普通胶原蛋白、以及胶原蛋白肽或多肽所难以企及的。
本发明方法得到的纳米胶原寡肽具有显著的生物活性，促进成纤维细胞、上皮细胞形成，制造抗体，提高免疫力，它的许多生理活性是氨基酸、多肽、蛋白质所没有的。
用本发明方法得到的纳米胶原寡肽的突出功能表现是：
(1)、营养性：可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增循环，达到滋润皮肤延缓老化、美容、祛皱、嫩肤、养发的目的；
(2)、修复性：纳米胶原寡肽具有独特的修复功能，与周围组织的亲合性好，具有优秀的修复组织的作用，对于疤痕、皮肤粗糙有独特的修复效果，快速增加皮肤的平滑性和弹性；
(3)、保湿性：由于纳米胶原寡肽中含有大量的亲水基，使之具有了良好的保湿功效，能够达到保持肌肤润泽度的目的。它可以深入皮肤深层，达到深层保湿、长效保湿的效果；
(4)、吸湿性：纳米胶原寡肽具有极强的吸湿性能，干燥的粉末暴露在空气中，会迅速吸收空气中的水分。
(5)、亲和性：皮肤对纳米胶原寡肽有很好的吸收作用。纳米胶原寡肽分子量小，其不同肽段的肽链没有相互铰链，而是呈线性结构。实验表明，纳米胶原寡肽的皮肤吸收率几乎达到100％，而胶原蛋白吸收率在0％～2.5％，胶原肽的吸收率40％左右。
(6)、良好的溶解性：纳米胶原寡肽含有大量的亲水基团(-COOH，-NH2，-OH)，从而使得纳米胶原寡肽与水分子之间的相互作用增强，其水溶性大为增加。
(7)、低免疫原性、安全无副作用：纳米胶原寡肽，本身就是蛋白质类物质，无任何毒副作用，可以长期食用、敷用。
用本发明方法得到的纳米胶原寡肽的主要应用领域是：
化妆品：纳米胶原寡肽在纯天然强力保湿、迅速除皱、快速修复疤痕、平滑肌肤、嫩肤防衰、美白祛斑、滋润秀发、丰胸等方面，具有不可替代的突出优势，可在美容、美肤、美发化妆品中广泛使用。
生物、医学上的应用：血管修复、可溶性胶原、创伤烧伤修复材料、注射等整形外科、用于手足皲裂、皮肤搔痒、鱼鳞病等皮肤病，对慢性胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡等内科病、类风湿性关节炎、骨质疏松、肝硬化、红斑狼疮、破皮病、牛皮藓、白癜风、细胞联结障碍、毛细血管脆性增加、创伤难愈合、牙齿出血肿胀导致坏血病等胶原病，都有广泛的应用。
美容保健品、营养食品等领域也有十分广泛的用途。
下面结合实施例对本发明进一步说明：
实施例1：鲜猪皮脱毛后，刮脂、洗净、缴碎成小块，先用10倍体积的饱和石灰水浸泡40天，用水漂洗干净，水洗至接近中性，再用10倍体积的1M的HCl，浸泡48小时，水洗至pH等于4左右，得到预处理猪皮。取预处理猪皮200g，放入旋转蒸发仪的反应瓶，加水1800克，分别加入2g胃蛋白酶和2g胰蛋白酶，保持真空度1～10KPa，50℃恒温水解4小时，然后加入木瓜蛋白酶2克，用0.1M的NaOH调pH值为5，同样真空条件下，60℃恒温水解3小时。然后加入基质金属蛋白酶2克，继续60℃恒温，同样真空条件下水解3小时。加热至100℃，10分钟，冷却至60℃后，脱脂棉过滤，然后活性炭过滤，产品为金黄色透明液体。然后通过喷雾干燥，得到白色粉末状纳米胶原寡肽。
采用日立835-50氨基酸分析仪分析产物氨基酸组成。如表1所示；
表1氨基酸含量Content of amino acid
| 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) | 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) |
| Asp(天冬) | 5.423 | Ile(异亮) | 1.035 |
| Thr(苏) | 1.623 | Ieu(亮) | 0.000 |
| Ser(丝) | 3.266 | Tyr(酪) | 2.530 |
| Glu(谷) | 9.447 | Phe(苯丙) | 1.025 |
| Gly(甘) | 24.253 | Lys(赖) | 1.452 |
| Ala(丙) | 9.287 | His(组) | 0.630 |
| Cys(胱) | 0.085 | Arg(精) | 8.102 |
| Val(缬) | 2.220 | Pro(脯) | 13.781 |
| Met(蛋) | 0.843 | Hypro(羟脯) | 10.981 |
| TOTAL(总含量) | 100.1 | ||
表1氨基酸分析结果表明，水解产物具有胶原蛋白的特征氨基酸组成，产物胶原特征氨基酸组成为甘胺酸(glycine)24％、脯胺酸(proline)14％及羟脯胺酸(hdroxyproline)11％，谷氨酸9％，精氨酸8％。
图1是电喷雾质谱法(ESI/MS)检测产物纳米胶原寡肽的分子量分布示意图。ESI/MS分析结果表明，产物分子量90％分布在100～1000D之间，为二肽到七肽的小分子组合，高斯分布峰值分子量约为500D，主要为三肽、四肽、五肽，因此产物为胶原寡肽，其分子大小和长度应该在几个纳米到十几个纳米之间，为纳米级分子，因此水解产物是纳米胶原寡肽。实施例2：鲜猪皮脱毛后，刮脂、洗净、缴碎成小块，先用10倍体积的饱和石灰水浸泡40天，用水漂洗干净，水洗至接近中性，再用10倍体积的1M的HCl，浸泡48小时，水洗至pH等于4左右，得到预处理猪皮。取预处理猪皮200g，放入旋转蒸发仪的反应瓶，加水1800克，分别加入2g胃蛋白酶和2g胰蛋白酶，保持真空度10～30KPa，50℃恒温水解4小时，然后加入菠萝蛋白酶2克，用0.1M的NaOH调pH值为5，同样真空条件下，72℃恒温水解3小时。然后加入基质金属蛋白酶2克，继续60℃恒温，同样真空条件下水解3小时。加热至100℃，10分钟，冷却至60℃后，脱脂棉过滤，然后活性炭过滤，产品为金黄色透明液体。然后通过喷雾干燥，得到白色粉末状纳米胶原寡肽。氨基酸分析仪分析产物氨基酸组成。如表2所示；
表2氨基酸含量Content of amino acid
| 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) | 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) |
| Asp(天冬) | 5.123 | Ile(异亮) | 1.015 |
| Thr(苏) | 1.626 | Ieu(亮) | 0.000 |
| Ser(丝) | 3.263 | Tyr(酪) | 2.551 |
| Glu(谷) | 9.447 | Phe(苯丙) | 1.028 |
| Gly(甘) | 24.554 | Lys(赖) | 1.450 |
| Ala(丙) | 9.286 | His(组) | 0.625 |
| Cys(胱) | 0.087 | Arg(精) | 8.112 |
| Val(缬) | 2.222 | Pro(脯) | 13.760 |
| Met(蛋) | 0.840 | Hypro(羟脯) | 11.005 |
| TOTAL(总含量) | 100.3 | ||
实施例3：鲜猪皮脱毛后，刮脂、洗净、缴碎成小块，先用10倍体积的饱和石灰水浸泡40天，用水漂洗干净，水洗至接近中性，再用10倍体积的1M的HCl，浸泡48小时，水沈至pH等于4左右，得到预处理猪皮。取预处理猪皮200g，放入旋转蒸发仪的反应瓶，加水1800克，分别加入2g胃蛋白酶和2g胰蛋白酶，保持真空度10～30KPa，40℃恒温水解4小时，然后加入木瓜蛋白酶2克，用0.1M的NaOH凋pH值为5，同样真空条件下，70℃恒温水解3小时。然后加入基质金属蛋白酶2克，继续60℃恒温，同样真空条件下水解3小时。加热至100℃，10分钟，冷却至60℃后，脱脂棉过滤，然后活性炭过滤，产品为金黄色透明液体。然后通过喷雾干燥，得到白色粉末状纳米胶原寡肽。产物氨皋酸组成如表3所示：
实施例4：鲜猪皮脱毛后，刮脂、洗净、缴碎成小块，先用l0倍体积的饱和石灰水浸泡40天，用水漂洗干净，水洗至接近中性，再用10倍体积的1M的HCl，浸泡48小时，水洗至pH等于4左右，得到预处理猪皮。取预处理猪皮600g，放入旋转蒸发仪的反应瓶，加水1800克，分别加入4g胃蛋白酶和4g胰蛋白酶，保持真空度10～30KPa，50℃恒温水解4小
表3氨基酸含量Content of amino acid
| 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) | 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) |
| Asp(天冬) | 5.221 | Ile(异亮) | 1.145 |
| Thr(苏) | 1.219 | Ieu(亮) | 0.000 |
| Ser(丝) | 3.567 | Tyr(酪) | 2.641 |
| Glu(谷) | 9.332 | Phe(苯丙) | 1.122 |
| Gly(甘) | 24.420 | Lys(赖) | 1.321 |
| Ala(丙) | 9.161 | His(组) | 0.520 |
| Cys(胱) | 0.070 | Arg(精) | 8.006 |
| Val(缬) | 2.115 | Pro(脯) | 13.562 |
| Met(蛋) | 0.751 | Hypro(羟脯) | 10.635 |
| TOTAL(总含量) | 99.6 | ||
时，然后加入木瓜蛋白酶4克，用0.1M的NaOH调pH值为5，同样真空条件下，60℃恒温水解3小时。然后加入基质金属蛋白酶4克，继续60℃恒温，同样真空条件下水解3小时。加热至100℃，10分钟，冷却至60℃后，脱脂棉过滤，然后活性炭过滤，产品为金黄色透明液体。然后通过喷雾干燥，得到白色粉末状纳米胶原寡肽。产物氨基酸组成如表4所示；实施例5：鲜猪皮脱毛后，刮脂、洗净、缴碎成小块，先用10倍体积的饱和石灰水浸泡40天，用水漂洗干净，水洗至接近中性，再用10倍体积的1M的HCl，浸泡48小时，水洗至pH等于4左右，得到预处理猪皮。取预处理猪皮200g，放入旋转蒸发仪的反应瓶，加水1800克，分别加入2g胃蛋白酶和2g胰蛋白酶，保持真空度10～30KPa，20℃恒温水解8小时，然后加入木瓜蛋白酶2克，用0.1M的NaOH调pH值为5，同样真空条件下，75℃恒温水解3小时。然后加入基质金属蛋白酶2克，继续60℃恒温，同样真空条件下水解3小时。加热至100℃，10分钟，冷却至60℃后，脱脂棉过滤，然后活性炭过滤，产品为金黄色透明液体。然后通过喷雾干燥，得到白色粉末状纳米胶原寡肽。产物氨基酸组成如表5所示；
表4氨基酸含量Content of amino acid
| 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) | 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) |
| Asp(天冬) | 5.125 | Ile(异亮) | 1.141 |
| Thr(苏) | 1.626 | Ieu(亮) | 0.000 |
| Ser(丝) | 3.322 | Tyr(酪) | 2.629 |
| Glu(谷) | 9.526 | Phe(苯丙) | 1.117 |
| Gly(甘) | 24.461 | Lys(赖) | 1.592 |
| Ala(丙) | 9.288 | His(组) | 0.631 |
| Cys(胱) | 0.072 | Arg(精) | 8.115 |
| Val(缬) | 2.320 | Pro(脯) | 13.883 |
| Met(蛋) | 0.843 | Hypro(羟脯) | 10.872 |
| TOTAL(总含量) | 100.5 | ||
表5氨基酸含量Content of amino acid
| 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) | 氨基酸名称Amino Acid | 检测结果Analysis Result(mg/100mg) |
| Asp(天冬) | 5.326 | Ile(异亮) | 1.045 |
| Thr(苏) | 1.598 | Ieu(亮) | 0.000 |
| Ser(丝) | 3.099 | Tyr(酪) | 2.319 |
| Glu(谷) | 9.315 | Phe(苯丙) | 1.201 |
| Gly(甘) | 24.341 | Lys(赖) | 1.381 |
| Ala(丙) | 9.380 | His(组) | 0.521 |
| Cys(胱) | 0.096 | Arg(精) | 8.007 |
| Val(缬) | 2.331 | Pro(脯) | 13.692 |
| Met(蛋) | 0.810 | Hypro(羟脯) | 10.762 |
| TOTAL(总含量) | 99.2 | ||
Claims (10)
1、一种从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽，其特征在于，分子量主要分布在100～1000D之间，为二肽到七肽的小分子组合，高斯分布峰值分子量约为500D。
2、根据权利要求1所述从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽，主要为三肽、四肽、五肽，其分子大小和长度在几个纳米到十几个纳米之间。
3、权利要求1或2所述从动物皮中水解提取得到的纳米胶原寡肽的制备方法，包括将含有胶原蛋白的动物皮经过预处理，采用复合酶法水解提取胶原蛋白，大分子的胶原蛋白被水解成小分子的胶原蛋白寡肽。
4、根据权利要求3，其特征在于，预处理过程是将鲜畜皮脱毛后，刮脂、洗净、缴碎成小块，先用10倍体积的饱和石灰水浸泡40天，用水漂洗干净，水洗至接近中性，再用10倍体积的1M的HCl，浸泡48小时，水洗至pH接近4左右，得到预处理动物皮。
5、根据权利要求3，其特征在于，水解所采用的酶是指胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、基质金属蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶中几种的组合。
6、根据权利要求3，其特征在于，每种酶的用量为畜皮重量的0.5～2％，每种酶的水解pH为3～10，水解时间为1～8小时。
7、根据权利要求3，其特征在于，提取纳米胶原寡肽的温度是20-75℃。
8、根据权利要求3，其特征在于，提取纳米胶原寡肽的水解反应是在真空条件下进行的。
9、根据权利要求3，其特征在于，提取纳米胶原寡肽采用的水解混合物固含量是1-40％。
10、根据权利要求1-9之任一项的纳米胶原寡肽在医药、保健品、化妆品的应用。
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