CN1965674A - 一种复合微生物饲料添加剂及其生产方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合微生物饲料添加剂及其生产方法和用途。该添加剂包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus caseisubsp.casei)，经过斜面培养、一级种子、二级种子以及混合培养发酵，实现了复合菌生物量及其不同菌种配比的最优化，复合添加剂有效活菌数大于2×109cuf/mL。本发明提供的复合微生物饲料添加剂，能有效提高饲料利用率和养殖动物机体免疫能力，减少患病几率，并且能够改善养殖动物肉、蛋、奶的品质，降低动物饲养成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合微生物饲料添加剂、其生产方法以及在作为动物饲料添加剂中的用途。
技术背景
微生物饲料添加剂是根据微生态平衡理论、微生态失调理论、微生态营养理论和微生态防治理论选用动物体内正常微生物菌株及其生长促进物质经特殊加工工艺而制成的制剂。我国饲料添加剂分为饲料级氨基酸、酶制剂、微生物添加剂、抗氧化剂和稳定剂等12类。
其中，微生物制剂、酶制剂由于其明显的使用效果，并且无抗生素、激素和农药残留，符合当前食品安全概念，应用日益广泛。
目前，国内外微生物饲料添加剂已有品种上市。国外产品有“Probios”“Biomaax40TM”“Primalac”，国内品种有“华星宝”“促生康”等。微生物饲料添加剂从菌种存活状态可分活菌、灭活菌制剂；从菌种构成可分单一菌剂和多菌种复合菌剂；从剂型上分液体、固体、颗粒剂型，也有少量微囊化包埋制剂。
目前国内在复合微生物筛选培养过程中，由于缺乏基本的理论指导以及成熟的生产工艺，对复合培养的发酵过程及其各菌群之间的相互作用及其机理普遍了解甚少，导致产品活菌总数不能保持一定水平，产品质量不稳定，影响了其在使用过程中的效果。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，公开了一种复合微生物饲料添加剂，用于动物养殖。本发明还公开了该添加剂的生产方法和用途。
(二)技术方案
本发明从大量已知可定植养殖动物体内有益菌群中筛选出3种不同属、种的活性微生物菌种，它们具有较好的协同共生关系，本发明筛选出的微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus caseisubsp.casei)。
根据上述筛选结果，本发明设计了一种复合微生物饲料添加剂，包括酿酒酵母1.0×108～5.0×109cfu/mL、植物乳杆菌1.0×108～5.0×1010cfu/mL、干酪乳杆菌干酪亚种1.0×108～4.0×1010cfu/mL。
优选地，该添加剂包括酿酒酵母3.0×108～1.0×109cfu/mL、植物乳杆菌5.0×108～5.0×109cfu/mL、干酪乳杆菌干酪亚种5.0×108～5.0×109cfu/mL。
本发明所述的复合微生物饲料添加剂的生产方法，包括如下步骤：
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母15～38℃条件下培养2～6天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种15～42℃条件下培养1～3天，使菌种活化；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母15～38℃条件下，100～200r/min摇床培养2～6天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种15～42℃条件下静止培养1～3天，单菌种液体培养OD600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，酿酒酵母15～38℃条件下，搅拌速度为100～200r/min，通气量为1∶0.5～1.5，培养2～6天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种15～42℃条件下培养1～3天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得添加剂。
其中，步骤1)、2)、3)中酿酒酵母所用的培养基是PDA培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种所用的培养基是MRS培养基。固态培养基与液态培养基的区别在于固态培养基在制备过程中添加了适量的琼脂。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜1～30％、硫酸铵0.5～10％、蛋白胨0.5～5％、碳酸钙0.5-3％，余量为水；
所述的高密度发酵培养可以采用补料分批培养(FBC)方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物。
并且，培养过程分阶段调控发酵pH、溶解氧、搅拌转速和温度等条件。具体地说发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1～1.5，调控发酵溶解氧5～15％，搅拌转速150～200r/min，搅拌间隔时间1～3小时，搅拌1～3分钟，温度25～35℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：24～96小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间3～5小时，搅拌3～5分钟，使用碳酸钙调节pH保持稳定在3.8～4.5之间，温度25～35℃。
本发明所述复合微生物饲料添加剂可作为饲料添加剂用于动物的饲养。
(三)有益效果
本发明能有效提高饲料利用率和养殖动物机体免疫能力，减少患病几率，并能改善养殖动物肉、蛋、奶的品质，降低动物饲养成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明所要保护的范围。
实施例1 复合微生物饲料添加剂的构成
总菌数为 3.9×109cfu/mL
酿酒酵母 8.0×108cfu/mL
植物乳杆菌 1.0×109cfu/mL
干酪乳杆菌干酪亚种 2.1×109cfu/mL
实施例2 复合微生物饲料添加剂的构成
总菌数为 2.0×109cfu/mL
酿酒酵母 1.0×109cfu/mL
植物乳杆菌 5.0×108cfu/mL
干酪乳杆菌干酪亚种 5.0×108cfu/mL
实施例3 复合微生物饲料添加剂的构成
总菌数为 2.0×1010cfu/mL
酿酒酵母 3.0×108cfu/mL
植物乳杆菌 5.0×109cfu/mL
干酪乳杆菌干酪亚种 5.0×109cfu/mL
实施例4 复合微生物饲料添加剂的构成
总菌数为 5.0×1010cfu/mL
酿酒酵母 1.0×108cfu/mL
植物乳杆菌 5.0×1010cfu/mL
干酪乳杆菌干酪亚种 1.0×108cfu/mL
实施例5 复合微生物饲料添加剂的构成
总菌数为 4.5×1010cfu/mL
酿酒酵母 5.0×109cfu/mL
植物乳杆菌 1.0×108cfu/mL
干酪乳杆菌干酪亚种 4.0×1010cfu/mL
实施例6 复合微生物饲料添加剂的生产方法
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母30℃条件下培养3天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种37℃条件下培养2天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母30℃条件下，150r/min摇床培养3天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种37℃条件下静止培养2天，制得一级种子，结束培养时各菌悬液光密度OD600值均达到4.0；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，酿酒酵母30℃条件下，搅拌速度为150r/min，通气量为1∶1，培养3天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种37℃条件下培养2天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得添加剂，
其中，步骤1)、2)、3)中酿酒酵母所用的培养基是PDA培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种所用的培养基是MRS培养基。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜15％、硫酸铵5％、蛋白胨2.5％、碳酸钙2％，余量为水；
高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨。
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1.2，调控发酵溶解氧10％，搅拌转速180r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：60小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间4小时，搅拌4分钟，使用碳酸钙调节稳定pH4.0，温度30℃。
实施例7 复合微生物饲料添加剂的生产方法
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母15℃条件下培养6天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种42℃条件下培养1天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母15℃条件下，200r/min摇床培养6天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种15℃条件下静止培养3天，制得一级种子，结束培养时各菌悬液光密度OD600值均达到3.0；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5％的接种量，将一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，酿酒酵母15℃条件下，搅拌速度为200r/min，通气量为1∶0.5，培养6天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种42℃条件下培养1天，制得二级种子。
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为20％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得添加剂。
其中，步骤1)、2)、3)中酿酒酵母所用的培养基是PDA培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种所用的培养基是MRS培养基。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜30％、硫酸铵0.5％、蛋白胨0.5％、碳酸钙3％，余量为水；
高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油；氮源为：牛肉膏、蛋白胨。
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1，调控发酵溶解氧5％，搅拌转速200r/min，搅拌间隔时间3小时，搅拌3分钟，温度35℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：96小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间3小时，搅拌3分钟，使用碳酸钙调节稳定pH4.5，温度35℃。
实施例8 复合微生物饲料添加剂的生产方法
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母38℃条件下培养2天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种15℃条件下培养3天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母38℃条件下，100r/min摇床培养2天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种42℃条件下静止培养1天，制得一级种子，结束培养时各菌悬液光密度OD600值均达到3.0；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为20％的接种量，将一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，酿酒酵母38℃条件下，搅拌速度为100r/min，通气量为1∶1.5，培养2天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种15℃条件下培养3天，制得二级种子。
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得添加剂。
其中，步骤1)、2)、3)中酿酒酵母所用的培养基是PDA培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种所用的培养基是MRS培养基。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜1％、硫酸铵10％、蛋白胨5％、碳酸钙0.5％；
高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：蔗糖、糖蜜；氮源为：硫酸铵、牛肉膏。
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1.5，调控发酵溶解氧15％，搅拌转速150r/min，搅拌间隔时间1小时，搅拌1分钟，温度25℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：24小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间5小时，搅拌5分钟，使用碳酸钙调节稳定pH3.8，温度25℃。
实施例9 禽类使用
1、禽类使用量
正常使用量2000只家禽每天使用0.1公斤。作为治疗腹泻与下痢等用途，2000只家禽每天使用量为0.5公斤，连续使用一周。
2、使用方法
(1)饮水：将本饲料添加剂菌剂0.1公斤加入糖蜜50克(红糖、白糖都可)，用干净水配成稀释菌液，饮水使用。蛋鸡可以采用饮一周，停一周的办法循环使用。
(2)将本饲料添加剂菌剂0.1公斤加入糖蜜，用干净水配成稀释菌液直接拌入饲料。
3、结果：
(1)提高家禽免疫力，防治由细菌、病毒引起的疾病；
(2)提高肉蛋产量。
在30天试验期间，用2％的本饲料添加剂饮水、日粮中添加4‰本饲料添加剂喂养种鸡。添加本饲料添加剂菌剂种鸡产蛋破蛋率1.44％不添加本添加剂种鸡产蛋破蛋率2.52％。
肉仔鸡增重情况：在50天试验期间，试验组鸡平均日增重为45g，对照组鸡平均日增重为40g，试验组比对照组提高12.5％。雏鸡发病率平均由26％减至5.8％。
饲喂本发明饲料添加剂对降低种蛋破损率效果、肉仔鸡增重极显著。
实施例10 猪使用
1、使用量和使用方法
(1)乳猪、成猪：直接使用：饲料1000公斤加1-2公斤本饲料添加剂菌剂，喷洒到料中喂养。秋冬季最好用温水10公斤加入50克糖蜜(红糖、白糖都可)活化2小时，饮用或拌料效果更佳。
(2)仔猪促生长：喂养时间从断奶至上市连续使用。
使用方法：进入生长圈舍0～15天，按5ml/头(约一瓶盖)饮水或拌料喂养；16～30天10ml/头；31～60天，按饲料量的2‰添加量加到饲料中喂养。
(3)仔猪防治下痢使用方法：
母猪产前15天到断奶，添加1～2‰本饲料添加剂到饲料当中喂养。仔猪断奶后，进入生长圈舍饲喂方法同(2)。
作为治疗下痢用使用量：饲料100公斤加1公斤本添加剂，连续使用一周或直接灌服30ml/头连续使用一周。
2、效果：可显著提高猪日增重、提高饲料报酬。经30天仔猪(36头)喂养，饲料中添加本饲料添加剂菌剂与不添加相比，平均每头仔猪增重0.53公斤。控制仔猪下痢情况与大剂量抗生素的添加相同。同对照组相比，下痢率减少20％。
实施例11 牛使用
1、使用量
饲养场全价饲料喂养的用量为1000公斤全价饲料加本饲料添加菌剂1.5L；
饲养场自己配料时1000公斤饲料加3L饲料添加剂菌剂；
饮水喂养时每天每头牛25ml(相当25g，约合半两)；
作为治疗用使用量1000公斤饲料加7L本饲料添加剂菌剂，连续使用一周。
2、使用方法：
(1)直接添加：按照使用量加入，用干净水10倍量稀释，拌入饲料中混匀即可。
(2)饮水喂养：将本饲料添加剂菌剂拌入水中喂养(冬天最好用25-30℃温水)。
每天每头牛25ml(相当25g，约合半两)本饲料添加剂菌剂加适量水饮用。
冬天最好用25-30℃温水加入50克糖蜜(红糖、白糖都可)活化2小时。
3、效果：显著提高肉、奶产量和品质，饲料报酬高。经60天喂养，饲料中添加本饲料添加剂菌剂与不添加相比，平均每头奶牛产奶日增0.7公斤。
Claims (6)
1、一种复合微生物饲料添加剂，其特征在于该添加剂包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)1.0×108～5.0×109cfu/mL、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)1.0×108～5.0×1010cfu/mL、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)1.0×108～4.0×1010cfu/mL。
2、根据权利要求1所述的复合微生物饲料添加剂，其特征在于该添加剂包括酿酒酵母3.0×108～1.0×109cfu/mL、植物乳杆菌5.0×108～5.0×109cfu/mL、干酪乳杆菌干酪亚种5.0×108～5.0×109cfu/mL。
3、根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于该添加剂包括酿酒酵母8.0×108cfu/mL、植物乳杆菌1.0×109cfu/mL、干酪乳杆菌干酪亚种2.1×109cfu/mL。
4、一种如权利要求1～3任一项所述的复合微生物饲料添加剂的生产方法，其特征是包含如下步骤：
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母15～38℃条件下培养2～6天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种15～42℃条件下培养1～3天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母15～38℃条件下，100～200r/min摇床培养2～6天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种15～42℃条件下静止培养1～3天，单菌种液体培养OD600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，酿酒酵母15～38℃条件下，搅拌速度为100～200r/min，通气量为1∶0.5～1.5，培养2～6天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种15～42℃条件下培养1～3天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得添加剂，
其中，所述的高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物。
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1～1.5，调控发酵溶解氧5～15％，搅拌转速150-200r/min，搅拌间隔时间1～3小时，搅拌1～3分钟，温度25～35℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：24～96小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间3～5小时，搅拌3～5分钟，使用碳酸钙调节pH保持稳定在3.8～4.5之间，温度25～35℃。
5、一种如权利要求4所述的复合微生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于：
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母、干酪乳杆菌干酪亚种30℃条件下培养3天，植物乳杆菌37℃条件下培养2天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母30℃条件下，150r/min摇床培养3天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种37℃条件下静止培养2天，单菌种液体培养OD600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，酿酒酵母30℃条件下，搅拌速度为150r/min，通气量为1∶1，培养3天，植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种37℃条件下培养2天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得添加剂，
其中所述的高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：糖蜜；氮源为：蛋白胨，
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1.2，调控发酵溶解氧10％，搅拌转速180r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：60小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间4小时，搅拌4分钟，使用碳酸钙调节pH保持稳定在4.0，温度30℃。
6、一种如权利要求1～3任一项所述的复合微生物饲料添加剂在作为动物饲料添加剂中的用途。
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