CN1946840A

CN1946840A - 具有支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉水解活性的蛋白,编码该蛋白的基因,表达该蛋白的细胞及其生产方法

Info

Publication number: CN1946840A
Application number: CNA2005800037522A
Authority: CN
Inventors: 金都满; 姜希暻; 李镇河
Original assignee: Lifenza Co Ltd
Current assignee: Lifenza Co Ltd
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-27
Publication date: 2007-04-11
Also published as: WO2005073369A1; KR20050078078A; EP1713905A1; KR100604401B1; EP1713905A4; JP2007534315A; US20070077212A1

Abstract

本发明公开了氨基酸序列为SEQ.ID.No.1，具有支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉水解活性的酶，以及编码该酶的基因和表达该基因的转化细胞。此外，本发明还公开了生产能够降解支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉的酶的方法，该方法包括培养细胞、在细胞中表达该酶以及酶的纯化。含有该酶的组合物被提供用于除去糖生产过程中的葡聚糖或多糖污染物。

Description

具有支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉水解活性的蛋白，编码该蛋白的基因，表达该蛋白的细胞及其生产方法

发明背景

1、发明领域

本发明涉及了能够水解支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉的酶，该酶的基因，表达该酶的细胞及其生产方法。更具体来说，本发明涉及了一种酶，它不仅由于其抑制牙菌斑的形成和降解以前形成的牙菌斑的能力而可以用在抗牙菌斑组合物或漱口液中，而且由于其水解葡聚糖的良好能力而可以用于除去糖生产过程中的葡聚糖，此外还涉及了编码该酶的基因，表达该酶的细胞以及生产该酶的方法。

2、相关技术描述

牙菌斑是在牙齿上沉积的生物膜，来自于牙齿表面的微生物定居。牙菌斑的主体由被称为葡聚糖(不溶性葡聚糖)的细菌产生的细胞外多糖构成，它也被称为齿斑葡聚糖，能够增强定居。该多糖总数达到牙菌斑干重的大约20％，是导致龋齿的重要因素。对变体链球菌(Streptococcus mutans)产生的葡聚糖进行的结构研究表明，不溶性葡聚糖中的葡萄糖部分彼此之间主要通过α-1，3-、α-1，4-和α-1，6-D-糖苷键连接。因此，有效地消除牙菌斑需要齿斑葡聚糖、淀粉和葡聚糖水解活性。

按照常规，防止牙菌斑和龋齿的形成主要依靠降低口腔中的变体链球菌的生长。由于这一点，具有抗变体链球菌生长活性的化合物例如抗菌剂或氟，被包含在口腔产品例如牙膏或漱口液中。氟是一种流行的抗龋洞化合物，因为它能够抑制变体链球菌的生长，但是它也能够引起牙齿氟中毒(在牙釉质中形成色斑)以及副作用例如强烈的毒性和空气污染。已经进行了另一种预防龋齿的尝试，就是使用酶例如葡聚糖酶；但是，它的效果还没有得到证实。

美国专利No.5741773提供了含有具有抗牙菌斑和抗龋齿活性的配糖巨肽的牙粉组合物。这种常规技术目的在于抑制引起龋齿的细菌的生长。但是，还没有提出防止牙菌斑的形成或水解以前形成的牙菌斑。

授权于发明人的美国专利No.6,485,953(对应于韩国专利No.10-0358376)提出使用能够水解多种结构多糖的DXAMase来抑制牙菌斑的形成并降解以前形成的牙菌斑。除了能够水解多种多糖的酶之外，生产该酶的微生物(斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)KFCC-11077)和含有该酶的组合物也被公开了。

然而，对于在抑制牙菌斑的形成并水解以前形成的牙菌斑方面具有更高活性的酶的需求仍然存在。

在韩国专利申请No.10-2001-48442中，本发明人还提出了由韩国专利No.10-0358376的微生物(斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)KFCC-11077)产生的酶DXAMase，由于其高度的葡聚糖降解活性，可以用于除去葡聚糖。

因此，在本技术领域内存在着明显的需求，开发具有葡聚糖降解活性的新酶，其活性足够用于除去葡聚糖。

发明概述

因此，在本发明的形成过程中一直考虑着现有技术中存在的上述问题，并且本发明的目的是提供新的酶，它能够水解多种多糖，包括支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉，以及提供编码该酶的基因。

本发明的另一个目的是提供带有该基因的菌株。

本发明的另一个目的是提供生产该酶和该基因的方法。

本发明的另一个目的是提供含有该酶的可以在工业中使用的组合物。

本发明的一个方面是提供了含有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，具有支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉水解活性的蛋白，具有该活性的该蛋白的衍生物或其片段，以及为该蛋白编码的基因。

本发明的另一方面是提供了表达该基因的转化细胞。

本发明的另一方面是提供了生产具有支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉水解活性的酶的方法，包括：培养细胞；在培养的细胞中表达该酶；以及纯化表达的酶。

附图简述

根据下面的详细描述以及附图，将会更清楚地理解本发明的上述和其它的目的、特征和优点，其中：

图1显示了从本发明的斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)(LSA)中获得的糖水解酶的氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的1946bp的核苷酸序列，其中通过成熟蛋白的N-端氨基酸测序分析获得的用于在载体中克隆成熟蛋白的PCR引物对应于下划线的标准字符，信号肽剪切位点用箭头标明，α-淀粉酶的保守区用下划线的粗体字符表示；

图2是一张照片，显示了SDS-PAGE结果，其中在胶上上样了煮沸的酶(1道)和未煮沸的酶(2道)，同时还显示了Western杂交结果，其中抗糖水解酶抗体与煮沸的酶结合(3道)；

图3是一张照片，显示了SDS-PAGE和Western杂交的结果，具中用箭头指示的本发明的LSA与分子量标准(M)一起在胶上电泳，通过考马斯亮蓝染色(1道)和活性染色(2道)显现，并与母细胞的抗LSA的抗体反应(3道)；

图4是将本发明的LSA的活性和稳定性对温度制作的图；

图5是将本发明的LSA的活性和稳定性对pH值制作的图；

图6显示了丙酮对本发明的LSA的活性的影响；

图7显示了乙醇对本发明的LSA的活性的影响；

图8是TLC结果的照片，显示本发明的LSA的酶活性，其中分析的样品是酶水解之前和之后的淀粉样品(1％w/v)和麦芽糖糊精(Mn)(分别为A图的1道和2道)，以及纯化的LSA与一系列麦芽寡糖包括G1(葡萄糖)到G7(麦芽七糖)反应后的麦芽寡糖样品(1％w/v)(分别为B图中的1到7道)。

优选实施方案描述

编码本发明的糖水解酶(LSA)的基因的获取是从在含有淀粉的培养基中培养斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)开始的。然后，在从斯氏油脂酵母中纯化的碳水化合物水解酶的N-端氨基酸序列的基础上，构建了含有预计的保守区的引物，然后用这些引物进行PCR扩增。PCR产物大约2kb长，被用于5’RACE和3’RACE以获得完整的糖水解酶基因(LSA)。在通过PCR扩增后，将该基因克隆到载体pRSETB中(Invitrogen，USA)，然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中。

己知斯氏油脂酵母能够产生降解葡聚糖的内切葡聚糖酶(EC3.2.1.11)和降解淀粉的α-淀粉酶。该微生物已经被应用于食品中，尚未报道能产生抗生素或其它有毒代谢物。

已知大多数由微生物产生的葡聚糖酶，除了几种来自细菌的之外，都是诱导酶。在美国专利No.5,229,277中首先报道的斯氏油脂酵母ATCC 74054产生葡聚糖酶和淀粉酶，其性质已经被公开。此外也已经报道了该菌从蔗糖和淀粉产生低分子量的葡聚糖。在这些发现的基础上，本发明人在2002年10月11日获得了韩国专利No.10-0358376(对应于2002年11月26日的美国专利No.6,485,953)，该专利涉及能够水解葡聚糖和淀粉两者的DXAMase酶，生产该酶的微生物(鉴定为斯氏油脂酵母KFCC-11077)，以及含有该酶的组合物。

自本发明的基因(lsa)表达的酶是能够水解支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉的糖水解酶。此外，本发明的酶被发现能够降解葡聚糖、α-环状糊精和普鲁兰。该酶是高度稳定的。其活性不仅在相对宽的pH范围内(pH5-8)能保持最大活性的90％，而且甚至不被变性溶液例如含有EGTA的溶液所抑制。Ca²⁺和Mg²⁺作为该酶的辅助因子。

此外，本发明还涉及带有编码糖水解酶基因的新的微生物。本发明的菌株大肠杆菌BL21(DE3)pLysS保藏在位于韩国Daejeon市Yusung Gu的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，登记号KCTC10573BP，保藏日期是2003年12月24日。

此外，本发明涉及生产糖水解酶的方法。首先，对大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行培养。在从培养物中收获后，将细胞用玻璃珠破碎，然后从其中分离糖水解酶。

含有本发明的酶的组合物可以用于各种口腔护理领域。由于其降解多糖例如葡聚糖和淀粉的能力，本发明的酶也可以有效地用于在糖生产过程中除去葡聚糖。此外，含有本发明的酶的组合物可以用于食品中，例如口香糖、饮料、牛奶等，本领域的专业技术人员可以容易地确定其成分。

通过下面的实施例可以获得对本发明更好的理解，这些实施例是为了说明的目的，而不对本发明构成限制。

实施例1：将lsa基因克隆到斯氏油脂酵母中

1)菌株和质粒

能够产生具有葡聚糖酶和淀粉酶活性的DXAMase的斯氏油脂酵母KFCC-11077被用作cDNA分离和淀粉酶基因筛选的DNA供体。普通的DNA操作和DNA测序是用大肠杆菌DH5α和pGEM-T easy载体(Promega，USA)进行的。为了构建cDNA文库，大肠杆菌XL1-Blue和SOLR(Stratagene，USA)被用作宿主细胞，λ噬菌体Uni-ZAP XR(Stratagene，USA)被用作载体。

2)培养条件

斯氏油脂酵母被培养在添加了1％(w/v)淀粉的LW培养基中。LW培养基含有0.3％(w/v)酵母提取物和0.3％(w/v)KH₂PO₄，用HCl将pH调整到4.5。对于细菌的培养来说，使用LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.3)和LBA培养基(每毫升含有50g氨苄青霉素的LB培养基)。

3)糖水解酶的纯化

为了获得预培养物，斯氏油脂酵母在添加了1％(w/v)淀粉的LW培养基中振荡生长。然后，将预培养物接种到含有8.3升LW培养基的10L发酵罐(Hanil R&D，Korea)中培养，培养基中添加了1％(w/g)淀粉作为碳源以生产所需的糖水解酶。培养上清液通过截留分子量100K的中空纤维(Saehan，Korea)过滤，然后通过截留分子量30K的中空纤维(Millipore，USA)浓缩到830ml。通过在浓缩液中加入多达70％量的硫酸铵(Sigma Chemical Co.，USA)将蛋白沉淀。离心后，将沉淀悬浮在60ml 20mM的磷酸钾缓冲溶液中(pH6.4)。在纯化的每个阶段测量蛋白的浓度和滴度。将蛋白浓缩液(30mg/1.5m1)上样到用20mM的磷酸钾缓冲溶液(pH6.4)平衡的DEAE-Sepharose柱上，然后用从0到1.0M的NaCl浓度梯度进行洗脱。将有活性的洗脱级分合并、浓缩，然后上样到GPC柱上(Bio-Rad Co.，A-0.5m，70cm×2.6cm)以分离所需的蛋白。柱子用50mM柠檬酸磷酸缓冲溶液(pH5.5)平衡，浓缩液含有液浓度为4mg/ml的蛋白。

4)poly A+RNA的分离

将斯氏油脂酵母接种到添加了1％(w/v)淀粉的LW培养基中。在28C培养36小时后(达到指数生长期中期)，将培养液于6500xg离心，得到细胞沉淀。使用玻璃珠和热的酸性苯酚分离总RNA。将细胞与含有硫氰酸胍、0.5％月桂基肌氨酸钠、0.1Mβ-巯基乙醇和25mM柠檬酸钠(pH 7.0)的溶液混合，然后与等体积的酸洗过的玻璃珠和苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1，v/v/v)混合物混合，再以最高速度涡旋振荡5分钟。离心后，将混合溶液与3倍体积的异丙醇和0.3倍体积的3M乙酸钠混合以产生RNA沉淀，然后将沉淀溶解在无RNA酶的蒸馏水中储存，直到下次使用。

5)N-端氨基酸测序和寡聚核苷酸合成

使用基于Edman降解方法的自动蛋白测序仪(型号471A，AppliedBiosystems，USA)来分析纯化的淀粉酶蛋白的氨基末端氨基酸序列。

在纯化后，对从斯氏油脂酵母获得的糖水解酶(LSA，具有葡聚糖酶和淀粉酶活性)进行分析，N-端氨基酸序列是DXSTVTVLSSPETVT(其中X尚未确定)。在氨基酸序列TVTVLSSPE的基础上，设计了一个寡聚核苷酸，即正义引物1(5’-TACAGTTACGGTCTTGTCCTCCCCTGA-3’)(SEQ.ID.No.3)。设计了反义引物2(5’-CTCTACATGGAGCAGATTCCA-3’)(SEQ.ID.No.4)。使用正义和反义引物获得的PCR产物通过电泳测量，发现大小大约为2kb。

6)斯氏油脂酵母cDNA文库的构建

从在添加淀粉的培养基中培养了36小时的斯氏油脂酵母获得5gpoly A+RNA，使用ZAP-cDNA合成试剂盒从中制备了cDNAs。通过旋转柱分级方法从制备的cDNAs中分离了大小在500bp及其以上的cDNAs，并与用EcoRI-XhoI消化的Uni-ZAP XR载体连接。使用Gigapack Gold试剂盒(Stratagene，USA)对连接的噬菌体cDNAs进行体外包装。

7)lsa的克隆

通过PCR获得了具有lsa基因的开放阅读框的DNA片段，所用引物为正义引物5’-TACAGTTACGGTCTTGTCCTCCCCTGA-3’，反义引物5’-CTCTACATGGAGCAGATTCCA-3’，它们分别对应于显示了葡聚糖酶和淀粉酶特性的蛋白的N-端和C-端氨基酸序列。在琼脂糖凝胶上分离后，用AccPrep^TM凝胶提取试剂盒(Bioneer，Korea)纯化PCR产物，与pGEM-T easy载体(Promega，USA)进行连接。使用ABI PRISMCycle测序试剂盒(Perkin Elmer Corp.USA)，在GeneAmp 9600热循环仪DNA测序系统(型号373-18，Applied Biosystems，USA)中进行了碱基测序。

8)LSA蛋白在大肠杆菌中的异源表达和纯化

将lsa基因插入到pRSETB载体(Invitrogen USA)的Sacl-EcoRI位点中制备重组载体pRSET-LSA。用pRSET-LSA转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS在含有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养到稳定期中期。在培养物中加入IPTG至终浓度为1mM后，在28℃继续培养6小时。通过离心(5000gx 10分钟)收集细胞，用0.1M磷酸钾(pH7.4)洗涤细胞，然后通过超声裂解细胞。使用Ni²⁺-次氮基三乙酸-琼脂糖(NTA)(Quiagene，Germany)进行表达蛋白的纯化。将细胞裂解液与Ni²⁺-NTA结合，在4℃放置1小时，将混合物上样至柱子上，然后用清洗缓冲液洗涤4次。每0.5ml蛋白级分用缓冲液乳化。

9)电泳和活性染色

对于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来说，蛋白样品被上样到10％聚丙烯酰胺凝胶上，使用Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.8)。在聚丙烯酰胺凝胶中含有1％淀粉，以检测蛋白样品是否能够降解淀粉多糖。电泳完成后，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和20％2-丙醇溶液清洗凝胶1小时以除去SDS。将凝胶浸泡在反应缓冲液中(50mM乙酸钠，5mM CaCl₂，pH5)37℃放置2天，然后在碘溶液中(0.3％碘，3％碘化钾)浸泡10分钟，用蒸馏水清洗。通过在棕色背景上出现透明的区域可以鉴定淀粉水解活性。

为了确定所需蛋白的分子量，在凝胶上还上样了分子量标准品，包括肌球蛋白(200kDa)、β-半乳糖苷酶(116kDa)、磷酸化酶b(97.4kDa)、血清白蛋白(66.2kDa)、碳酸酐酶(31kDa)和抑蛋白酶肽(6.5kDa)。

10)Western杂交

在电泳后，将凝胶上的蛋白在存在电场的情况下转移到PVDF膜上。使用特异性针对糖水解酶(同时具有葡聚糖酶和淀粉酶活性)的兔多克隆抗体检测LSA。含有抗糖水解酶抗体的血清以1∶200的比例稀释使用。将抗体处理过的膜用含有0.1％Tween 20(T)的Tris缓冲的盐溶液(TBS)(20mM Tris-HCl，137mM NaCl)洗涤3次。使用ECLWestern杂交分析系统(Amersham Pharmacia，USA)与第二抗体相结合探测抗原-抗体结合物。用作第二抗体的过氧化物酶偶联的抗兔IgG(Amersham Pharmacia，USA)以1∶1500的比例稀释。Biomax胶卷(Kodak，USA)被用来屏幕曝光1分钟。

实施例2：糖水解酶活性的分析

通过DNS(3，5-二硝基水杨酸)方法与二辛可宁酸铜方法相结合来测定糖水解酶的还原值。具体来说，将100μl二辛可宁酸铜加入到100μl酶溶液中，在80℃反应35分钟，然后冷却大约15分钟。在560nm测量吸收值。

实施例3：酶的最适pH、温度和稳定性分析

通过测量在pH3-9的范围内相隔1个pH单位的反应速度来分析LSA酶的最适pH。为此，使用了20mM柠檬酸磷酸缓冲液(pH4.0)、柠檬酸/磷酸缓冲液(pH5-6)和磷酸钠缓冲液(pH7-9)。在37℃反应48小时后，通过DNS方法测定酶的糖水解酶活性。此外，酶的pH稳定性是在酶加入到每种缓冲液中并于22℃保温3小时后测定的。

酶的最适温度是通过测量已经在不同温度(20-80℃，间隔10℃)下保温30分钟的酶的反应速度来确定的。为了确定酶的温度稳定性，测量酶在不同温度(20-90℃，间隔10℃)下保温30分钟后的残余活性。使用1％(w/v)淀粉作为底物测定酶的活性和稳定性。

实施例4：金属离子、螯合溶液和变性溶液对酶活性的影响

测量了EDTA、EGTA和金属离子对酶活性的影响。EDTA和EGTA每种使用的终浓度是1mM。金属离子，包括ZnCl₂、CuSO₄、CaCl₂和MgCl₂，使用的终浓度是5mM。也测量了在存在十二烷基硫酸钠(SDS，0.1％、0.5％、1％、2％)、尿素(2M)、丙酮(0-80％)和乙醇(0-70％)的情况下的酶活性。在测量时，将酶与作为底物的2％淀粉于37℃反应30分钟。

结果

从斯氏油脂酵母克隆lsa基因

在纯化后，分析从斯氏油脂酵母获得的糖水解酶(LSA，同时具有葡聚糖酶和淀粉酶活性)，N-端氨基酸序列是DXSTVTVLSSPETVT(X：尚未确定的氨基酸残基)。在氨基酸序列TVTVLSSPE的基础上，设计并合成了正义引物1(5’-TACAGTTACGGTCTTGTCCTCCCCTGA-3’)。另外设计了反义引物2(5’-CTCTACATGGAGCAGATTCCA-3’)。PCR产物通过电泳显示为大小大约为2kb的条带。氨基酸和碱基测序结果在图1和SEQ.ID.No.1和2中给出。

lsa基因的表征

从产生葡聚糖酶和淀粉酶的斯氏油脂酵母KFCC11077中克隆了为LSA编码的基因，这是一个1946bp的cDNA片段。在cDNA片段中，开放阅读框由1944bp(647个氨基酸)组成，分子量为71889Da，对应于未修饰的LSA前体。它的成熟蛋白被发现具有619个氨基酸(1857bp)，分子量为68709Da。据推断前体蛋白在Arg²⁸和Asp²⁹之间的位置被加工，从而产生成熟的蛋白(图1)。

LSA的ORF开始于核苷酸1位的起始密码子ATG，结束于核苷酸1944位的终止密码子TAG。推测的LSA氨基酸序列与来自多种酵母和植物的α-淀粉酶，来自细菌的环状糊精葡聚糖转移酶、普鲁兰酶和α-糖苷酶，以及来自多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)的β-淀粉酶具有同源性。LSA被发现与结林卡油脂酵母(L.kononenkoae)、西方许旺氏酵母(Sw.occidentalis)(AMY1)和肋状复膜孢糖酵母(Sh.Fibuligera)(ALP1)的α-淀粉酶显示出52-78％的同源性(Park，J.C.，Bai，S.，Tai，C.Y.和Chun，S.B.(1992)酵母西方许旺氏酵母(Schwanniomycesoccidentailis)ATCC 26077中的细胞外淀粉酶基因的核苷酸序列，FEMSMicrobiol Lett.93，17-24；Steyn，A.J.C.，Marmur，J.和Pretorius，I.S.(1995)含有结林卡油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)α-淀粉酶编码基因的cDNA的克隆、序列分析及其在酵母中的表达，GENE，166，65-7；Ito，T.，Yamashita，I.和Fukui，S.(1987)酵母肋状复膜孢糖酵母(Saccharomycopsis fibuligera)中α-淀粉酶基因(ALP1)的核苷酸序列，FEBS Lett.219，339-342)。为了进行比较，在下面的表1中给出了各种淀粉酶包括按照本发明获得的LSA基因的四个保守区域。在保守区域中6个框中的氨基酸残基是完全一样的。

表1

酶的缩写：LSA，斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)的α-淀粉酶；AMYA，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的α-淀粉酶；ALP1，肋状复膜孢糖酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的α-淀粉酶；SWA2，西方德巴利氏酵母(Debaromyces occidentails)的α-淀粉酶；AMY2，粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccahromyces pobme)的α-淀粉酶；LKA1，结林卡油脂酵母(L.Kononenkoae)的α-淀粉酶；NPL，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的新普鲁兰酶；IAM，Pseudomonasamyloderamosa的异淀粉酶；PUL1，产气克雷伯氏杆菌(Klebsiellaaerogenes)的普鲁兰酶；PUL2，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的普鲁兰酶；CGT1，肺炎克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)的环状糊精葡聚糖转移酶；CGT2，浸麻芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的环状糊精葡聚糖转移酶；CGT3，嗜碱芽孢杆菌(Alkaliphilic Bacillus sp.)的环状糊精葡聚糖转移酶；CGT4，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的环状糊精葡聚糖转移酶；BE1，大肠杆菌(Escherichia coli)的分枝酶；BE2，Synechococcus sp.的分枝酶；BE3，玉米的分枝酶；MAL，卡尔斯伯糖酵母(Saccharomycescarisbergensis)的麦芽糖酶；1,6G，腊状芽孢杆菌(B.cereus)的寡聚-1，6-糖苷酶。

在LSA的基因组DNA中存在一个内含子，它被发现位于cDNA的966和967碱基之间，由60个碱基(5’-GTGGTATGTATCTAAGCATATTTGTAGCATTCTATCTTGGAACTGACCGGCCCTCAGTGC-3’)组成。按照本发明制备的重组LSA的分子量在通过SDS-PAGE测量时发现与母细胞(斯氏油脂酵母)中的LSA的分子量(大约100kDa)不同。这种差别相信是由于母细胞的酶被酵母中的糖蛋白糖基化而产生的。母细胞中的糖水解酶，在用抗糖水解酶抗体检测时大约是100kDa(图2)。因为在未煮沸的情况下倾向于彼此聚集，当用凝胶渗透层析测量时有活性的LSA酶被发现是200kDa。

lsa基因的表达

在大肠杆菌中在IPTG诱导后，收集细胞，通过超声进行破碎。使用组氨酸标记的亲和柱纯化蛋白，通过SDS-PAGE(10％)进行分析(图3，1道)。主要的表达蛋白带对应于73kDa(LSA+His-tag)。为了检查纯化的蛋白降解多糖例如淀粉的能力，使用含有淀粉的PAGE凝胶进行了电泳。在电泳完成后，将凝胶在37C放置30分钟，然后用碘液染色。在棕色背景上显出了LSA活性条带的透明区域(图3，2道)。正如在Western杂交分析中看到的那样，抗糖水解酶抗体检测到了大约73kDa的蛋白(LSA+His-tag)(图3，3道)。

LSA的生物化学性质

LSA酶被发现在40℃显示出最适活性，在20-50℃的温度范围内保持稳定。在60℃保温3小时后，LSA酶的活性为稳定温度下活性的70％(图4)。LSA酶的淀粉酶活性在pH5-8的范围内保持稳定，最适pH为6(图5)。

尽管被5mM Cu²⁺所抑制，酶的淀粉降解活性在存在5mM Ca²⁺和5mM Mg²⁺的情况下分别增加大约315％和220％(表2)。酶的活性被1mM EDTA所抑制，但是不受1mM EGTA的影响。SDS完全抑制了酶的淀粉降解活性，而尿素或丙酮能够增加酶活性。当在10-40％的丙酮溶液和10-20％的乙醇溶液中使用时，LSA酶的活性分别增加1.03-1.22倍和1.25-1.33倍。在存在60％丙酮或乙醇的情况下，LSA酶显示出低于50％的最适活性(图6和图7)。本发明的LSA酶的高稳定性与目前已知的淀粉水解酶相当不同。

表2

金属离子、螯合试剂和变性剂对LSA酶活性的影响

添加物	浓度	相对活性(％)
添加物	浓度	相对活性(％)	无	-	100
CaCl₂+EDTA	5mM/1mM	185	无	-	100
CaCl₂+EDTA	5mM/1mM	185	CaCl₂	5mM	315
CuSO₄+EDTA	5mM/1mM	12	CaCl₂	5mM	315
CuSO₄+EDTA	5mM/1mM	12	CuSO₄	5mM	20
MgCl₂+EDTA	5mM/1mM	129	CuSO₄	5mM	20
MgCl₂+EDTA	5mM/1mM	129	MgCl₂	5mM	220
EGTA	1mM	105	MgCl₂	5mM	220
EGTA	1mM	105	EDTA	1mM	46
SDS	2％1％0.5％0.1％	12244966	EDTA	1mM	46
SDS	2％1％0.5％0.1％	12244966	尿素	2M	115
丙酮	30％20％	115122	尿素	2M	115

在LSA与2％淀粉反应的早期阶段，产生大于麦芽五糖的寡糖。然后，麦芽寡糖被降解成为麦芽五糖和更低的寡糖。最后，寡糖中主要是麦芽三糖和麦芽四糖(图8)。当与麦芽寡糖系列的混合物(从麦芽糖到麦芽七糖)反应时，LSA不水解G2和G3，但是将G4降解成G2，G5降解成G2+G3，G6降解成G2+G4或G3+G3，G7降解成G3+G4(图8B)。此外，还发现LSA强烈地降解支链淀粉、淀粉(可溶性)和糖原，微弱地降解直链淀粉、淀粉糊精、葡聚糖、α-环状糊精和普鲁兰(表3)。

表3

LSA酶的相对底物特异性

底物	相对活性(％)
底物	相对活性(％)	淀粉	100
支链淀粉	141	淀粉	100
支链淀粉	141	糖原	80
直链淀粉	41	糖原	80
直链淀粉	41	淀粉糊精	17
葡聚糖	4	淀粉糊精	17
葡聚糖	4	α-环状糊精	4
普鲁兰	3	α-环状糊精	4

如上所述，本发明提供的酶能够有效地水解多种多糖，例如支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉。由于具有这样的降解活性，本发明的酶不仅能够在牙齿护理工业中发现广泛的应用，包括抗牙菌斑组合物和漱口液，而且也可以用于除去糖生产过程中的葡聚糖或多糖污染物。

尽管出于说明的目的公开了本发明的优选实施方案，本技术领域的专业人员将会认识到对本发明进行各种修改、补充和替代，而不背离权利要求中公开的本发明的范围和精神仍是可能的。

序列表

<110>利分扎株式会社(Lifenza Co.，Ltd.)

<120>具有支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉水解活性的蛋白，编码该蛋白的基因，表达

该蛋白的细胞及其生产方法(PROTEIN WITH ACTIVITY OF HYDROLYZING

AMYLOPECTIN，STARCH，GLYCOGEN AND AMYLOSE，GENE ENCODING THE SAME，CELL

EXPRESSING THE SAME，AND PRODUCTION METHOD THEREOF)

<130>SCT063526-47

<150>KR2004-0006186

<151>2004-01-30

<160>4

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>647

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>E.coli BL21(DE3)pLysS

<400>1

Met Leu Leu Ile Asn Phe Phe Ile Ala Val Leu Gly Val Ile Ser Leu

1 5 10 15

Ser Pro Ile Val Val Ala Arg Tyr Ile Leu Arg Arg Asp Cys Thr Thr

20 25 30

Val Thr Val Leu Ser Ser Pro Glu Ser Val Thr Ser Ser Asn His Val

35 40 45

Glu Leu Ala Ser His Glu Met Cys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Ser Leu

50 55 60

Tyr Ile Tyr Asn Asp Asp Tyr Asp Lys Ile Val Thr Leu Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Thr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Ser Val Thr Ala Ser Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Asn Asn Trp Glu Leu Trp Ser Leu Ser Ala Pro Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Val Glu Ile Thr Gly Ala Ser Tyr Val Asp Ser Asp Ala Ser Ala

115 120 125

Thr Tyr Ala Thr Ser Phe Asp Ile Pro Leu Thr Thr Thr Thr Thr Ser

130 135 140

Ser Ser Ser Ala Ser Ala Thr Ser Thr Ser Ser Leu Thr Thr Thr Ser

145 150 155 160

Ser Val Ser Ile Ser Val Ser Val Pro Thr Gly Thr Ala Ala Asn Trp

165 170 175

Arg Gly Arg Ala Ile Tyr Glu Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr

180 185 190

Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Leu Cys Asp Val Thr Asp Arg Val Tyr Cys

195 200 205

Gly Gly Ser Tyr Glu Gly Ile Ile Asn Met Leu Asp Tyr Ile Glu Gly

210 215 220

Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Val Glu Asn Ile Pro

225 230 235 240

Asp Asp Thr Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Met Lys Asp

245 250 255

Ile Phe Ala Leu Asn Thr Asn Phe Gly Thr Ala Asp Asp Leu Ile Ala

260 265 270

Leu Ala Thr Glu Leu His Asn Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Ile

275 280 285

Val Val Asn His Phe Ala Phe Ser Gly Ser His Ala Asp Val Asp Tyr

290 295 300

Ser Glu Tyr Phe Pro Tyr Ser Ser Glu Asp Tyr Phe His Ser Phe Cys

305 310 315 320

Trp Ile Thr Asp Tyr Ser Asn Glu Thr Asn Val Glu Gln Cys Trp Leu

325 330 335

Gly Asp Asp Thr Val Pro Leu Val Asp Val Asn Thr Glu Leu Asp Thr

340 345 350

Val Lys Ser Glu Tyr Gln Ser Trp Val Glu Glu Leu Ile Ala Asn Tyr

355 360 365

Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Thr Val Lys His Val Glu Met Asp

370 375 380

Phe Trp Ala Pro Phe Glu Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Ala Val Gly Glu

385 390 395 400

Val Phe Asp Gly Asp Pro Ser Tyr Thr Cys Pro Tyr Glu Glu Asn Leu

405 410 415

Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Tyr Pro Val Val Ser Ala Phe

420 425 430

Glu Ser Val Ser Gly Ser Val Ser Ser Leu Val Asp Met Ile Asp Thr

435 440 445

Leu lys Ser Glu Cys Thr Asp Thr Thr Leu Leu Gly Ser Phe Leu Glu

450 455 460

Asn Glu Asp Asn Pro Arg Phe Pro Ser Tyr Thr Ser Asp Glu Ser Leu

465 470 475 480

Ile Lys Asn Ala Ile Ala Phe Thr Met Leu Ser Asp Gly Ile Pro Ile

485 490 495

Ile Tyr Tyr Gly Glu Glu Gln Gly Leu Asn Gly Gly Asn Asp Pro Tyr

500 505 510

Asn Arg Glu Ala Leu Trp Leu Thr Gly Tyr Ser Thr Thr Ser Thr Phe

515 520 525

Tyr Lys Tyr Ile Ala Ser Leu Asn Glu Ile Arg Asn Glu Ala Ile Tyr

530 535 540

Lys Asp Asp Thr Tyr Leu Thr Tyr Glu Asn Trp Val Ile Tyr Ser Asp

545 550 555 560

Ser Thr Thr Ile Ala Met Arg Lys Gly Phe Thr Gly Asn Glu Ile Ile

565 570 575

Thr Val Leu Ser Asn Leu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Tyr Thr Leu Thr

580 585 590

Leu Ser Asn Thr Gly Tyr Thr Ala Ser Ser Val Val Tyr Glu Ile Leu

595 600 605

Thr Cys Thr Ala Val Thr Val Asp Ser Ser Gly Asn Leu Ala Val Pro

610 615 620

Met Ser Ser Gly Leu Pro Lys Val Phe Tyr Glu Glu Ser Gln Leu Val

625 630 635 640

Gly Ser Gly Ile Cys Ser Met

645

<210>2

<211>1946

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>E.coli BL21(DE3)pLysS

<400>2

atgttgctga tcaacttttt catcgctgtt ctgggagtga tatcactgtc tcctattgtg 60

gttgctcgtt atattcttcg acgagattgc actacagtta cggtcttgtc ctcccctgag 120

tctgtgacga gttcgaacca tgttcagcta gccagtcatg agatgtgcga cagtaccttg 180

tcagcgtccc tttatatcta caatgatgat tatgataaga ttgtgacact ttattatctt 240

acatcgtcgg gcacaactgg gtccgtaaca gcgtcttatt cttctagttt gagtaacaac 300

tgggaattgt ggtctctctc ggctccggct gcagatgctg tcgagatcac tggagctagt 360

tatgtagaca gcgatgcatc tgcgacatac gccacgtctt ttgatatacc tcttactacc 420

acgacaacgt cgtcgtcttc tgctagtgcg acttcaacat ctagtctaac cacaacatct 480

agtgtttcca tttcggtgtc cgtccetaca ggaacagctg caaattggcg aggtagggct 540

atctatcaga tcgtgactga tagatttgca cgcactgacg gctccaccac atatttatgc 600

gatgttaccg atagggtcta ttgcggaggg tcttatcagg ggattatcaa tatgctggat 660

tacatccaag gcatgggctt tactgctatt tggatttctc ctatagtgga aaatattccc 720

gatgacaccg gatacggtta cgcatatcat ggttattgga tgaaagatat cttcgccctg 780

aatacaaatt ttggtactgc agacgatttg atagcgttgg ctacggaatt gcataatcgc 840

ggcatgtact tgatggttga tattgttgtc aatcactttg ctttctcagg aagtcatgcc 900

gacgtggact actctgaata tttcccgtat tcgtcccagg attattttca ttcattttgc 960

tggattacag attactcgaa tcagacaaac gttgagcagt gctggcttgg cgacgatact 1020

gttcctctcg tggacgtcaa tacccaactt gacaccgtga aaagtgaata tcaatcctgg 1080

gttcaagaac ttatagctaa ttactctatt gacggcctaa gaattgacac cgtcaagcac 1140

gtgcagatgg atttttgggc accatttcaa gaggctgcag ggatttacgc cgttggtgaa 1200

gtattcgacg gtgatccatc ctacacatgt ccatatcagg aaaatcttga cggtgtcttg 1260

aattatcctg tttattatcc tgtcgtctct gcgtttgaga gtgttagtgg gtcggtctcc 1320

tcgttagtcg atatgattga tacgctcaag tctgaatgca ccgacactac tctcctaggc 1380

tcctttctag agaatcaaga taatccgcga ttccctagct acacttctga tgagtcttta 1440

attaaaaatg cgatcgcttt cactatgctc tcagacggca ttcccataat ttattacggt 1500

caggagcaag gcctcaatgg tggaaacgat ccctataatc gagaggcgct ttggcttacg 1560

ggctactcca caacgtcgac gttctacaaa tacattgcgt cgttgaatca gattagaaat 1620

caggctatat acaaagatga tacttatctc acatatcaga actgggttat ttattcggat 1680

tccacgacaa tagcaatgcg gaaaggtttt acagggaacc aaataattac ggttctgtca 1740

aatcttggga ccagtggcag ttcgtacact ttgacgcttt cgaatacggg atataccgca 1800

tctagcgttg tatatgagat cttgacatgc acagctgtga ctgtggattc gtctgggaat 1860

ttggcagtgc cgatgtccag tggcctacca aaagtctttt atcaggaatc gcaactggtt 1920

ggctctggaa tctgctccat gtagag 1946

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>L.starkeyi primer 1(sense)

<400>3

tacagttacg gtcttgtcct cccctga 27

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Artiflicial Sequence

<220>

<223>L.starkeyi primer 2(antisense)

<400>4

ctctacatgg agcagattcca 21

Claims

1.含有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，具有水解支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉活性的蛋白，其衍生物或片段。

2.SEQ.ID.No.2的基因，编码权利要求1的蛋白，其衍生物或片段，该基因的衍生物或片段。

3.表达权利要求2的基因，其衍生物或片段的转化细胞。

4.权利要求2的转化细胞，其中的细胞是原核细胞或真核细胞。

5.权利要求3或4的转化细胞，其中的细胞是保藏号为KCTC10573HP的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

6.生产具有支链淀粉、淀粉、糖原和直链淀粉水解活性的酶的方法，包括：

培养权利要求3的细胞；

在培养的细胞中表达酶；以及

纯化被表达的酶。

7.通过权利要求6的方法生产的酶。

8.含有权利要求7的酶的组合物。

9.权利要求8的组合物，其中的组合物用于在糖生产过程中除去葡聚糖。

10.权利要求8的组合物，其中的组合物用于消除牙菌斑或用作漱口液。