CN1938325A - 合成膜锚着点 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自发和稳定地掺入脂双层(包括细胞膜)的合成分子。本发明特别是,但并非仅仅,涉及这些分子用作合成膜锚着点或者合成分子构造,从而在细胞表面抗原表达中实现定性和定量变化的用途。
Description
技术领域
本发明涉及自发和稳定地掺入脂质双层(包括细胞膜)的合成分子。本发明特别而言,并非仅仅,涉及这些分子用作合成膜锚着点或者合成分子构造,从而在细胞表面抗原表达中实现定性和定量变化的用途。
背景技术
细胞表面抗原介导大量细胞和它们环境之间的相互作用。这些相互作用包括细胞-细胞相互作用、细胞-表面相互作用和细胞-溶质相互作用。细胞表面抗原还介导着细胞内信号传输。
细胞通过表达的细胞表面抗原中的定性和定量差异进行特征化。在表达的细胞表面抗原中的定性和定量变化改变了细胞功能(作用方式)和细胞功能(提供的作用)。
能够在通过细胞表达的表面抗原中实现定性和/或定量变化具有诊断学和治疗学价值。在通过细胞表达的表面抗原中实现定性和/或定量变化的转基因和非转基因方法是已知的。
蛋白质着色是一种在通过细胞表达的表面抗原中实现定性和/或定量变化的非转基因方法。这种方法利用了GPI连接蛋白质经它们的脂质末端自发固着到细胞膜上的能力。描述于国际申请号PCT/US98/15124(WO99/05255)附属说明书中的方法包括将从生物源分离的GPI连接蛋白质插入到膜内的步骤。据称这些分离的GPI-固着蛋白质具有不寻常的与细胞表膜重新结合的能力。
细胞存在于含水的环境中。细胞膜为在细胞的细胞质和此含水环境之间充当半渗透屏障的脂双层。将抗原定位在细胞表面上还可以通过使用糖脂作为膜锚着点而得到实现。
描述于国际申请号PCT/NZ02/00214(WO03/034074)附属说明书中的方法包括将可控量的糖脂插入到膜内的步骤。对插入的糖脂量进行控制,从而提供具有期望抗原表达水平的细胞。
描述于国际申请号PCT/NZ03/00059(WO03/087346)附属说明书中的方法包括将修饰的糖脂插入到作为“膜锚着点”的膜内的步骤。修饰的糖脂供抗原在细胞或者多细胞结构表面定位之用。从而,新的特征可以给予到细胞或者多细胞结构。
这些方法一般都包括从生物源分离糖脂或者连接糖脂的抗原。从生物源分离糖脂或者连接糖脂的抗原是非常昂贵和易变的,并且可分离量通常会受到限制。从动物源获得试剂用于治疗学应用是尤其存在问题的,特别是意欲将该试剂或者其衍生物产品给药至人类主体时。
优选使用合成分子,因为由此受动物病原体污染的危险可以得到排除。已经了报道天然存在糖脂的合成相应物和合成新糖脂。然而,对于欲用作膜锚着点的合成糖脂而言,它必须能够自发和稳定地掺入含水环境中的脂双层中。合成糖脂在诊断学和治疗学应用中的使用进一步受限于那些合成糖脂需要在盐水中形成溶液。
用于促进糖脂在盐水中溶解的有机溶剂和/或去垢剂必须是生物相容的。由于它们会对一些细胞膜造成损伤,因此通常必须将溶剂和去垢剂除去或者快速消除。溶剂或者去垢剂从所述制剂中的除去会成为一个难题。
对细胞膜的损伤可以得到防止,特别是其中细胞或者多细胞结构的供给源(例如胚胎)得到限制或者细胞为对摄动特别敏感的细胞(例如肝细胞)时。
就它们自发和稳定地掺入脂双层(包括细胞膜)的能力而言,需要与天然存在的糖脂和连接糖脂的抗原功能等效的水溶性合成分子。
提供这种合成分子可以避免从生物源分离的糖脂和连接糖脂的抗原的局限性,并且可以促进在通过细胞表达的表面抗原中实现定性和/或定量变化。
本发明的目的是提供这种合成分子和它们的制备方法。本发明的另一目的是提供用于诊断学和治疗学应用中的合成分子。上述目的将分别进行阐述,同时目的是至少为公众提供一种可用的选择。
发明内容
本发明的第一方面在于用作合成膜锚着点或者用于制备合成分子构造的结构为R-S2-L的分子,其中:
R为化学活性官能团;
S2是将R连接至L的间隔基团;和
L是选自以下的类脂:二酰基-和二烷基-甘油脂,包括甘油基磷酸脂;和衍生于二酰基-和二烷基-脂肪的鞘氨醇,包括N-脂酰基鞘氨醇。
优选R选自,包括:二(N-羟基琥珀酰亚胺基)、二(4-硝基苯基)、二(五氟苯基)、二(五氯苯基)。
优选S2选自以下,包括:-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯(Ad))和-CO(CH2)5CO-。
优选R和S2是酯连接的。
优选L是选自二酰基-和二烷基-甘油脂(包括甘油基磷酸脂)的脂质。更优选L选自:衍生于一种或多种反式-3-十六烯酸、顺式-5-十六烯酸、顺式-7-十六烯酸、顺式-9-十六碳烯酸、顺式-6-十八碳烯酸、顺式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、顺式-11-十八碳烯酸、顺式-11-二十烯酸或者顺式-13-docsenoic酸的二酰基甘油脂、磷脂酸酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和双磷脂酰甘油。更优选衍生于一种或者多种顺式-不饱和脂肪酸的脂质。最优选L选自:1,2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1,2-二油酰基甘油(DOG)。
优选L为甘油基磷酸脂和所述分子包括以下亚结构:
其中n=3~5,和*不是H。优选n为3。
在具体实施方案中,所述分子具有以下结构:
表示为Ad-DOPE;结构:
表示为sp1-Ad-DOPE;或者结构:
M一般为H,但是可以被其它一价阳离子替换,比如Na+、K+或者NH4 +。
本发明的第二方面在于结构为F-S1-S2-L的合成分子构造,其中:
F选自碳水化合物、蛋白质、脂质、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素;
S1-S2是将F连接至L的间隔基团;和
L为选自二酰基-和二烷基-甘油脂(包括甘油磷酸脂)和衍生于二酰基-和二烷基-脂的鞘氨醇(包括N-脂酰鞘氨醇)的脂。
优选该分子为水溶性分子。
优选当分子溶液与脂双层接触时,该分子自发掺入脂双层中。更优选该分子稳定地掺入脂双层中。
优选F、S1、S2和L共价连接。
优选F选自天然存在或者合成的glycotopes、抗体(免疫球蛋白)、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素。最优选F选自天然存在或者合成glycotopes或者抗体(免疫球蛋白)。
优选L为选自二酰基-和二烷基-甘油脂(包括甘油磷酸脂)的脂。更优选L选自:衍生于一种或多种反式-3-十六烯酸、顺式-5-十六烯酸、顺式-7-十六烯酸、顺式-9-十六烯酸、顺式-6-十八烯酸、顺式-9-十八烯酸、反式-9-十八烯酸、反式-11-十八烯酸、顺式-11-十八烯酸、顺式-11-二十烯酸或者顺式-13-docsenoic酸的二酰基甘油脂、磷脂酸酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和双磷脂酰甘油。更优选所述脂衍生于一种或多种顺式-不饱和脂肪酸。最优选L选自:1,2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1,2-二油酰基丙三醇(DOG)。
优选L为甘油基磷酸脂,并且所述分子包括以下亚结构:
其中n=3~5,X为H或者C,并且*不为H。优选n为3。
对S1-S2进行选择,从而提供水溶性的合成分子构造。
在第一实施方案中,F为天然存在或者合成的glycotope。优选F为三个(三糖)或者更多个糖单元组成的天然存在或者合成glycotope。更优选F为选自以下的glycotope:lacto-neo-tetraosyl、lactotetraosyl、lacto-nor-hexaosyl、lacto-iso-octaosyl、globoteraosyl、globo-neo-tetraosyl、globopentaosyl、gangliotetraosyl、gangliotriaosyl、gangliopentaosyl、isoglobotriaosyl、isoglobotetraosyl、mucotriaosyl和mucotetraosyl系列低聚糖。最优选F选自包括以下末端糖基的glycotopes:GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ;Galα1-3Galβ;Galβ;Galα1-3(Fucα1-2)Galβ;NeuAcα2-3Galβ;NeuAcα2-6Galβ;Fucα1-2Galβ;Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
当F为glycotope时,L为甘油基磷酸脂和S2选自包括以下的基团:-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)、-CO(CH2)5CO-和-CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-,优选S1为选自3-氨基丙基、4-氨基丁基或者5-氨基戊基的C3-5-氨基烷基。更优选S1为3-氨基丙基。
在第二实施方案中,F为介导细胞-细胞相互作用或者细胞-表面相互作用的分子。优选F为对表达在靶细胞或者表面上的组分具有亲合力的碳水化合物、蛋白质或者脂质。更优选F对表达在上皮细胞或者细胞外间质的组分具有亲和力。更优选F对表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质的组分具有亲和力。最优选表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分可以为天然表达的组分或者为外源性掺入组分。
在第三实施方案中,F为介导细胞溶质间相互作用的分子。优选F为结合分子的配体,其中结合分子的存在用于诊断病理症状。更优选F为抗体(免疫球蛋白)配体。
在具体的实施方案中,所述水溶性合成分子构造具有以下结构:
表示为Atri-sp-Ad-DOPE(I);结构:
表示为Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);结构:
表示为Atri-sp-Ad-DSPE(III);结构:
表示为Btri-sp-Ad-DOPE(VI);结构:
表示为Htri-sp-Ad-DOPE(VII);结构:
表示为Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);结构:
表示为Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);结构:
表示为Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);或者结构
表示为Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
M一般为H,但是可以被其它一价阳离子替换,比如Na+、K+或者NH4 +。
本发明的第三方面在于制备结构为F-S1-S2-L的合成分子构造的方法,包括以下步骤:
1.使活化剂(A)与脂(L)反应,从而提供活化脂(A-L);
2.对抗原(F)进行衍生,从而提供衍生化的抗原(F-S1);和
3.使A-L与F-S1缩合,从而提供分子;
其中:
A为选自以下的活性剂,包括:(C3~C7)含碳二酸(carbodioicacids)的二(N-羟基琥珀酰亚胺基)、二(4-硝基苯基)、二(五氟苯基)、二(五氯苯基)酯。
L为选自二酰基-和二烷基-甘油脂(包括甘油磷酸脂)和衍生于二酰基-和二烷基-脂的鞘氨醇(包括N-脂酰鞘氨醇)的脂。
F为选自碳水化合物、蛋白质、脂质、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素的抗原;和
S1-S2为将F连接至L的间隔基团,其中S1选自以下,包括:伯氨基烷基、仲脂肪族烷基烷基或者伯芳香胺;和S2不存在或者选自以下,包括:-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)和-CO(CH2)5CO-。
优选该分子为水溶性分子。
当分子溶液与脂双层接触时,优选该分子自发掺入脂双层中。更优选该分子稳定地掺入脂双层中。
优选F、S1、S2和L共价连接。
优选F选自天然存在或者合成的glycotopes、抗体(免疫球蛋白)、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素。最优选F选自天然存在或者合成的glycotopes或者抗体(免疫球蛋白)。
优选L为选自二酰基-和二烷基-甘油脂(包括甘油磷酸脂)的脂。更优选L选自二酰基甘油脂、磷脂酸酯(phosphatidate)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和由以下一种或多种物质衍生得到的双磷脂酰甘油:反式-3-十六烯酸、顺式-5-十六烯酸、顺式-7-十六烯酸、顺式-9-十六烯酸、顺式-6-十八烯酸、顺式-9-十八烯酸、反式-9-十八烯酸、反式-11-十八烯酸、顺式-11-十八烯酸、顺式-11-二十烯酸或者顺式-13-docsenoic酸。更优选所述脂衍生于一种或多种顺式-不饱和脂肪酸。最优选L选自:1,2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1,2-二油酰基丙三醇(DOG)。
优选L为甘油基磷酸脂,并且所述分子包括以下亚结构:
其中n=3~5,X为H或者C,并且*不为H。优选n为3。
优选对A(R-S2)和S1进行选择,从而提供水溶性的合成分子构造。
在第一实施方案中,F为天然存在或者合成的glycotope。优选F为三个(三糖)或者更多糖单元组成的天然存在或者合成glycotope。更优选F为选自以下的glycotope:lacto-neo-tetraosyl、lactotetraosyl、lacto-nor-hexaosyl、lacto-iso-octaosyl、globoteraosyl、globo-neo-tetraosyl、globopentaosyl、gangliotetraosyl、gangliotriaosyl、gangliopentaosyl、isoglobotriaosyl、isoglobotetraosyl、mucotriaosyl和mucotetraosyl系列低聚糖。最优选F选自包括以下末端糖基的glycotopes:GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ;Galα1-3Galβ;Galβ;Galα1-3(Fucα1-2)Galβ;NeuAcα2-3Galβ;NeuAcα2-6Galβ;Fucα1-2Galβ;Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
当F为glycotope时,L为甘油基磷酸脂和S2选自包括以下的基团:-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)、-CO(CH2)5CO-(例如,A是双(N-羟基琥珀酰亚胺)(己二酸酯))和-CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-,优选S1为选自3-氨基丙基、4-氨基丁基或者5-氨基戊基的C3-5-氨基烷基。更优选S1为3-氨基丙基。
在第二实施方案中,F为介导细胞-细胞相互作用或者细胞-表面相互作用的分子。优选F为对表达在靶细胞或者表面上的组分具有亲合力的碳水化合物、蛋白质或行脂质。更优选F对表达在上皮细胞或者细胞外间质上的组分具有亲和力。更优选F对表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分具有亲和力。最优选表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分可以为天然表达的组分或者为外源性掺入组分。
在第三实施方案中,F为介导细胞溶质间相互作用的分子。优选F为结合分子的配体,其中结合分子的存在用于诊断病理症状。更优选F为抗体(免疫球蛋白)配体。
在具体的实施方案中,所述水溶性的合成分子构造具有以下结构:
表示为Atri-sp-Ad-DOPE(I);结构:
表示为Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);结构:
表示为Atri-sp-Ad-DSPE(III);结构:
表示为Btri-sp-Ad-DOPE(VI);结构:
表示为Htri-sp-Ad-DOPE(VII);结构:
表示为Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);结构:
表示为Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);结构:
表示为Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);或者结构:
表示为Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
M一般为H,但是它可以被其它一价阳离子替换,比如Na+、K+或者NH4 +。
本发明的第四方面在于根据本发明第三方面的方法制备的水溶性合成分子构造。
本发明的第五方面在于在通过细胞或者多细胞结构表达的表面抗原中实现定性和/或定量变化的方法,包括以下步骤:
1.在足以在通过细胞或者多细胞结构表达的表面抗原中实现定性和/或定量变化的温度和时间下,使细胞或者多细胞结构的悬浮液与根据本发明第二方面或者第四方面的合成分子构造接触。
优选所述细胞或者多细胞结构源于人类或者鼠。
优选水溶性合成分于构造在悬浮液中的浓度为0.1~10mg/mL。
优选所述温度为2~37℃。更优选所述温度为2~25℃。最优选所述温度为2~4℃。
在第一实施方案中,所述细胞为红血球。
在此实施方案中,优选F选自包括以下末端糖基的glycotopes:GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ;Galα1-3Galβ;Galβ;Galα1-3(Fucα1-2)Galβ;NeuAcα2-3 Galβ;NeuAcα2-6Galβ;Fucα1-2Galβ;Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。更优选F为选自低聚糖GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ和Galα1-3(Fucα1-2)Galβ的glycotopes。
优选所述合成分子构造选自以下,包括:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
在第二实施方案中,所述多细胞结构为胚胎。
在此实施方案中,优选F为连接分子,其中该连接分子对表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分具有亲和力。
表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分可以为天然表达的组分或者为外源性掺入组分。
优选所述合成分子构造选自以下,包括:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
在第三实施方案中,所述细胞为红血球。
在此实施方案中,优选F为结合分子的配体,其中结合分子的存在用于诊断病理症状。更优选F为抗体(免疫球蛋白)配体。
本发明的第六方面在于含有根据本发明第二或者第四方面的水溶性合成分子构造的细胞或者多细胞结构。
优选所述细胞或者多细胞结构源于人类或者鼠。
在第一实施方案中,所述细胞为含有选自以下水溶性合成分子构造的红血球,包括:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
在第一实施方案中,所述多细胞结构为掺入选自以下水溶性合成分子构造的胚胎:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);
Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
本发明的第七方面在于包括根据本发明第一方面的分子的干燥制剂或者溶液的试剂盒,或者根据本发明第二或者第四方面的水溶性合成分子构造的干燥制品或者溶液的试剂盒。
优选根据本发明第一方面的分子选自Ad-DOPE;sp1-Ad-DOPE;和Ad-DSPE。
优选根据本发明第二或者第四方面的水溶性合成分子构造选自:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
本发明的第八方面在于,包括根据本发明第六方面的细胞或者多细胞结构的悬浮溶液形式的混悬物的试剂盒。
优选所述悬浮溶液基本不含脂。
优选所述细胞或者多细胞结构源于人类或者鼠。
优选所述细胞为不天然表达A-或者B-抗原并且掺入选自以下的水溶性合成分子构造的红血球:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。更优选所述细胞为灵敏度对照。
本发明的第九方面在于包括根据本发明第二或者第五方面的水溶性合成分子构造的干燥制品或者溶液的药物制剂。
优选所述药物制剂为吸入给药的制剂形式。
优选所述药物制剂为注射给药的制剂形式。
本发明的第十方面在于包括根据本发明第六方面的细胞或者多细胞结构的药物制剂。
优选所述细胞或者多细胞结构源于人类或者鼠。
优选所述药物制剂为吸入给药的制剂形式。
优选所述药物制剂为注射给药的制剂形式。
发明详述
当分子溶液与脂双层接触时,本发明的合成分子构造自发和稳定地掺入脂双层(比如膜)中。虽然并不希望由理论对其进行限定,但是可以相信,脂(L)的脂末端插入膜内是热力学有利地。随后合成分子构造从脂质膜的解离被认为是热力学不利地。惊人地,还发现在此确定的合成分子构造具有水溶性。
本发明的合成分子构造用于转化导致表达的表面抗原中产生定性和/或定量变化的细胞。应当承认,根据本发明的细胞转化作用不同于通过基因工程进行的细胞转化作用。本发明提供细胞的表型转化作用,不提供遗传转化作用。
在本说明书上下文中,关于细胞而使用的术语“转化作用”是指将外源性制备的合成分子构造插入或者掺入细胞膜中,从而在通过细胞表达的细胞表面抗原中实现定性和定量变化。
本发明的合成分子构造包括经间隔基团(S1-S2)与脂质部分连接的抗原(F)。所述合成分子构造可以通过缩合抗原的伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺衍生物与活化脂质而进行制备。制备拟糖复合物方法已经得到了综述(Bovin,N.Biochem.Soc.Symp.,69,143-160)。
使用本发明的合成分子构造,期望的表型转化作用可以通过一步法或者二步法实现。在一步法中,水溶性合成分子构造(F-S1-S2-L)包括表面抗原作为F。
在二步法中,合成分子构造(F-S1-S2-L)包括作为官能团的抗原(F),合成分子构造插入到膜中后,表面抗原可以连接到该官能团上。所述官能团可以为比如外源凝集素、抗生物素蛋白或者生物素的基团。当用于两步法时,所述合成分子构造充当合成膜锚着点的作用。
根据本发明对伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺以及脂质活化剂进行选择,从而提供具有水溶性的合成分子构造,并且当该合成分子构造溶液与脂双层接触时它将自发和稳定地掺入脂双层。
在此说明书上下文中,措词“水溶性”是指在不存在有机溶剂或者去垢剂下,当合成分子构造与水或者盐水接触时稳定的单相系统得到形成,并且术语“溶液”具有相应的含义。
在本说明书上下文中,措词“稳定地掺入”是指合成分子构造掺入脂双层或者膜内,同时在脂双层或者膜与脂双层或者膜的外部含水环境之间具有最小继发交换。
伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺以及活化剂的选择取决于要连接到脂质(L)的抗原(F)的理化性质。
本领域熟练的技术人员应当理解,对于非特异性相互作用,比如二酰基-或者二烷基-甘油酯和膜之间的相互作用,天然存在脂质的结构异构体和立体异构体也是功能等效的。例如,发明人可以预期二酰甘油2-磷酸酯可以被磷脂酸酯(二酰甘油3-磷酸酯)代替。此外,本发明发明若可以预期磷脂酸酯的绝对构型可以为或者R或者S。
本发明发明人已经确定,为了制备其中抗原(F)是选自ABO血型A-、B-和H-抗原的glycotopes的寡糖的本发明合成分子构造,应当对伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺以及活性剂进行选择,从而提供具有一种根据下表中结构的间隔基团(S1-S2):
水溶性合成分子构造(F-S1-S2-L)的可能S1-S2结构,其中F为与ABO血型的A-、B-或者H-抗原的碳水化合物部分具有类似理化性质的碳水化合物(或者其它抗原),并且其中L为甘油基磷酸脂(n、m独立地等于2~5) |
S1选自:-O(CH2)nNH- | S2选自:-CO(CH2)nCO-或者-CO(CH2)mNHCO(CH2)nCO- |
本领域熟练的技术人员应当理解,一旦用于给定类型抗原的间隔基团(S1-S2)的结构得到确定,可以采用相同结构的间隔基团制备具有类似理化性质的其它类型抗原的合成分子构造。
例如,对于其中F是ABO血型A-、B-和H-抗原的glycotope的合成分子构造(F-S1-S2-L)的间隔基团结构,也可以对该间隔基团结构进行选择,以制备理化性质与ABO血型A-、B-和H-抗原的glycotopes相似的其它抗原的合成分子构造。
原则上,糖脂或者糖蛋白相关的大量血型的glycotope都可以是合成分子构造F-S1-S2-L的抗原(F),其中S1-S2-L与表示为以下的合成分子构造的相应部分相同或者等效:Atri-sp-Ad-DOPE(I),Atri-spsp1-Ad-DOPE(II),Atri-sp-Ad-DSPE(III),Btri-sp-Ad-DOPE(VI),Htri-sp-Ad-DOPE(VII),Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII),Galβ-sp-Ad-DOPE(IX),Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII)和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
已知的相关血型糖脂和糖蛋白(参见参考文献)的结构提供于以下:
糖脂*
(*通常,对于几乎所有的A-抗原实施例,末端A糖基GalNAc都可以替换为B糖基Gal。另外,缺乏A或者B抗原决定簇就形成等量的H抗原决定簇。)
A-6-1
A-6-2
A-7-2(ALey)
A-7-1(ALeb)
A-7-4
A-8-2
A-9-3
A-12-2
A-14-2
A-16-2
乳糖基酰基鞘氨醇(Lactosylceramide)
Galβ1→4Glcβ1→1Cer
血糖苷脂/GM3
NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer
Lactotriaosylceramide
GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer
Globotriaosylceramide/Pk
Galα1→4Galβ1→4Glcβ1→1Cer
红细胞糖苷脂/P
GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1→1Cer
Paragloboside/neolactotetraosylceramide
Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer
Lec-4/Lactotetraosylceramide
Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer
Sialoyl paragloboside/sialoyl neolactotetraosylceramide
NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer
H-5-1
Lex-5
H-5-2
Lea-5
SialylLex
Sialyl Lea-6/胃肠癌症抗原(GlCA或者Ca 19-9)
Disialoyl Lea-7
Leb-6
Ley-6
P-like
GalNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer
福斯曼抗原
GalNAcα1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1→1Cer
Cad红血球
Cad肝癌抗原
P1
Galα1→4Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer
LKE/’GL 7/SSEA-4
NeuAcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1→1Cer
B-6-1
H-6-4
B-6-2
BLeb-7
BLey-7
i抗原/乳糖基-N-nor-hexaosylceramide
Galβ1→4GlcNAclβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer
Sialyl-nor-hexaosylceramide/sialoyl-lacto-N-nor-hexaosylceramide
NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAclβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→1Cer
Lex-7
H-8-3
Lex-8
Leb-8
Lea-11
B-8-2
I抗原
Lec-9(fucosylated backbone)
Lec-9(fucosylated branch)
VIM-2
红血球Fl抗原
Lex-11
B-12-2
B-14-2
B-16-2
I-active polyglycosylceramide
O-连接糖蛋白
Monosialotrisaccharide
Disialotetrasaccharide
Disialoyl group oligosaccharide
H-活化三糖
Sialylated H-活性四糖
Cad寡糖
GlcNAc寡糖
粘蛋白寡糖/A-活性糖蛋白
卵巢囊肿A-活性糖蛋白-6a
卵巢囊肿A-活性糖蛋白-6b
卵巢囊肿Lea-活性糖蛋白-7
卵巢囊肿Lea-活性糖蛋白-10
卵巢囊肿A-活性糖蛋白-18
N-连接糖蛋白
复型/碱金属-稳定链
混合型
Tamm-Horsfall糖蛋白
高-甘露糖型
二烷基胎儿红血球抗原
Trisialoyl胎儿红血球抗原(disialoyl group on branch)
Monofucosyl-monosialyl foetal erythrocyte antigen(fucosylated backbone)
Monofucosyl-monosialyl foetal erythrocyte antigen(fucosylated branch)
Monofucosyl-disialyl foetal erythrocyte antigen(disialyl group on branch)
Difucosyl foetal erythrocyte antigen
Foetal lactosaminoglycan
Adult lactosaminoglycan
Monofucosyl-monosialoyl adult erythrocyte antigen
Monofucosyl-monosialoyl adult erythrocyte antigen
Difucosyl adult erythrocyte antigen
关键:Gl=D-Gal,Gc=D-Glc,GcN=D-GlcNAc,M=D-Man,F=L-Fuc,NA=NeuAc.
本领域熟练技术人员应当理解,其中F是寡糖的本发明合成分子构造(F-S1-S2-L)可以用作“合成糖脂”并且可以代替从生物(植物或者动物)源获得的糖脂。
在本发明说明书上下文中,术语“糖脂”是指两亲性质碳水化合物的脂质,包括:糖基化甘油脂,比如糖基化磷酸甘油脂和糖基甘油脂;糖基化鞘脂(中性糖脂),比如糖基神经酰胺或者脑苷脂;和神经节苷脂(酸性糖脂)。
在本发明说明书上下文中,措词“连接糖脂的抗原”是指含有碳水化合物的脂质,其中抗原(例如蛋白质)经分子的碳水化合物部分连接到糖脂上。连接糖脂的抗原的实例包括GPI-连接蛋白质。
本领域熟练技术人员可以理解,糖脂本身为一种抗原。术语和措词“糖脂”和“连接糖脂的抗原”用来区分其中抗原是糖脂的天然存在分子和其中抗原(例如蛋白质)经糖脂的碳水化合物部分连接到糖脂上的天然存在分子。照此类推,根据抗原可以是合成糖脂自身或者可以连接到合成糖脂上,本发明的合成分子构造既可以称为“合成糖脂”也可以称为“合成膜锚着点”。
本领域熟练的技术人员应当理解,通过描述于国际申请号PCT/NZ2003/00059(公开为WO03087346)附属说明书的方法,糖脂的碳水化合物部分还可以进行修饰或者连接其它抗原。
在本发明说明书上下文中,术语“glycotope”是指位于糖脂的碳水化合物部分的抗原决定簇。在血型血清学中,糖脂质抗原的分类基于糖脂的碳水化合物部分的结构进行。
在血型血清学中,熟知A-抗原的glycotopes的末端糖基为GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ,和B-抗原的glycotopes的末端糖基为Galα1-3(Fucα1-2)Galβ。掺入膜内的本发明其中F为GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ或者Galα1-3(Fucα1-2)Galβ的水溶性合成分子构造分别提供了与A-抗原或者B-抗原表达RBCs血清学相当的RBCs。
天然存在的A-或者B-抗原碳水化合物部分的末端三个糖基是A和B血型鉴定的抗原决定簇。天然存在A-抗原碳水化合物部分的末端四或者五个糖基是血液亚型A型1、A型2等等的抗原决定簇。据此,结合有本发明合成分子构造的RBCs可以用于对不同特异性的血型测定试剂(抗体)进行特征化和区分。
本发明发明人对排除了碳水化合物部分的本发明水溶性合成分子构造进行了预期。在所述“合成糖脂”中,不是碳水化合物或者寡糖但是具有类似理化性质的抗原可以代替F。
本发明发明人还对包括与碳水化合物或者寡糖理化性质不同的抗原(F)的本发明合成分子构造进行了预期。含有这些抗原的水溶性合成分子构造可以通过选择不同的间隔基团而得到制备。
当用于国际申请号PCT/N02/00212(公开为WO03/034074)和PCT/NZ03/00059(公开为WO03087346)说明书所述的发明实践中时,将会产生由本发明合成分子构造提供的优点。这些申请的附属说明书在此引入作为参考。
在本发明实践中,所述合成分子构造克服了许多使用天然糖脂的局限性。所述合成分子构造的具体优点是它们的性能优越并且它们具有在低温(例如4℃)下转化细胞的能力。
如本文中所述,并非所有的间隔基团(S1-S2)结构都能提供具有水溶性并且自发和稳定地掺入脂双层(比如细胞膜)中的合成分子构造(F-S1-S2-L)。表示为Atri-sp-lipid(IV)和Atri-PAA-DOPE(V)的合成分子构造确定不具有水溶性和/或不能自发和稳定地掺入脂双层(比如细胞膜)中。
表示为Atri-sp-lipid (IV)
表示为Atri-PAA-DOPE(V)其中x,y=0.05~0.2
本发明现在将参考以下非限制性实施例和附图进行说明,其中:
图1显示了在(从左到右)为10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、2mg/mL*和1mg/mL下,通过天然A糖脂转化溶液转化的CellstabTM贮存的细胞的Diamed结果。使用的抗血清为Albaclone(顶部)和Bioclone(底部)。(*——在培养之后未对转化溶液(含有糖脂)进行冲洗,将其放置过夜和第二天对其进行冲洗。)
图2显示了在(从左到右)为10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、2mg/mL*和1mg/mL下,通过天然B糖脂转化溶液转化的CellstBbTM贮存的细胞的Diamed结果。使用的抗血清为Albaclone(顶部)和Bioclone(底部)。(*——在培养之后未对转化溶液(含有糖脂)进行冲洗,将其放置过夜和第二天对其进行冲洗。)。
图3表示在三种转化温度下,37℃(顶部)、22℃(中间)和4℃(底部),使用天然Leb-6糖脂进行的人类Le(a-b-)红血球体外转化作用的FACS分析随时间的变化。
图4表示在4℃下通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)转化溶液进行的细胞转化的Diamed结果,所述转化溶液(从左到右):洗涤的0.08mg/mL;未洗涤的0.08mg/mL;洗涤的0.05mg/mL;未洗涤的0.05mg/mL;洗涤的0.03mg/mL;和未洗涤的0.03mg/mL。使用的抗血清为Bioclone anti-A。
图5显示了在试验之前不进行洗涤的细胞,在4℃下通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)转化溶液进行转化的细胞的Diamed结果,所述转化溶液(从左到右):0.08mg/mL、0.05mg/mL和0.03mg/mL。使用的抗血清为Bioclone anti-A。
图6在左侧栏显示了在4℃下,通过Btri-sp-Ad-DOPE(VI)转化溶液进行的细胞转化Diamed结果,所述转化溶液(从左到右):洗涤的0.6mg/mL;未洗涤的0.6mg/mL;洗涤的0.3mg/mL;未洗涤的0.3mg/mL;洗涤的0.15mg/mL;和未洗涤的0.15mg/mL;和在右侧栏中显示了在4℃下,通过Btri-sp-Ad-DOPE(VI)转化溶液进行的细胞转化Diamed结果,转化溶液(从左到右):洗涤的0.08mg/mL;未洗涤的0.08mg/mL;洗涤的0.05mg/mL;未洗涤的0.05mg/mL;洗涤的0.03mg/mL;和未洗涤的0.03mg/mL。使用的抗血清为Bioclone Bnti-B。
图7显示了在试验之前不进行洗涤的细胞,在4℃下通过Btri-sp-Ad-DOPE(VI)转化溶液进行转化的细胞的Diamed结果,转化溶液(从左到右):0.6mg/mL、0.3mg/mL和0.15mg/mL。
图8显示了在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含经洗涤的A0.07+B0.3mg/mL。针对抗A和抗B,管3和4包含未洗涤的A0.07+B0.3mg/mL。
图9显示了在试验之前不进行洗涤的细胞在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含未洗涤的A0.07+B0.3mg/mL。
图10显示了在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含经洗涤的A0.07+B0.2mg/mL。针对抗A和抗B,管3和4包含未洗涤的A0.07+B0.2mg/mL。
图11显示了在试验之前不进行洗涤的细胞在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含未洗涤的A0.07+B0.2mg/mL。
图12显示了在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含经洗涤的A0.06+B0.3mg/mL。针对抗A和抗B,管3和4包含未洗涤的A0.06+B0.3mg/mL。
图13显示了在试验之前不进行洗涤的细胞在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含未洗涤的A0.06+B0.3mg/mL。
图14显示了在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含经洗涤的A0.06+B0.2mg/mL。针对抗A和抗B,管3和4包含未洗涤的A0.06+B0.2mg/mL。
图15显示了在试验之前不进行洗涤的细胞,在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含未洗涤的A0.06+B0.2mg/mL。
图16显示了在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含经洗涤的A0.05+B0.3mg/mL。针对抗A和抗B,管3和4包含末洗涤的A0.05+B0.3mg/mL。
图17显示了在试验之前不进行洗涤的细胞,在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含未洗涤的A0.05+B0.3mg/mL。
图18显示了在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含经洗涤的A0.05+B0.2mg/mL。针对抗A和抗B,管3和4包含未洗涤的A0.05+B0.2mg/mL。
图19显示了在试验之前不进行洗涤的细胞,在4℃下,通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)平行转化作用转化的细胞的Diamed结果。针对抗A和抗B,管1和2(从左到右)包含未洗涤的A0.05+B0.2mg/mL。
对比实施例
这些对比实施例并不构成本发明权利要求部分。这些对比实施例描述了使用天然糖脂进行的红血球转化。
对比实施例1-天然糖脂的制备
通过HPLC纯化
在第一阶段,在每次运行之前都用干燥二氧化硅(15~25μm)对柱进行填充。因为二氧化硅可以进行排除以及理论上其可以高水平不可逆地粘结杂质,因此可以对相对脏的样品使用HPLC。
在硅胶上对糖脂进行分离,使用极性升高的流动相。洗脱程序为线性梯度,开始为100%的氯仿-甲醇-水80∶20∶1(v/v),最终为100%的氯仿-甲醇-水40∶40∶12(v/v)。
使用的HPLC设备是能够以程序比例泵入和混合四种分离溶剂的Shimadzu系统。由于氯仿、甲醇和水以不同的速率蒸发,因此对程序进行开发,使得所述溶剂组分在未进入HPLC不进行混合。
所述Shimadzu HPLC通过依次从四个烧瓶之一中提取“弹药”混合四种不同的液体。在管道中氯仿和水“弹药”彼此直接相接会引起混溶性问题。甲醇需要夹在这两个不互溶的组分之间。另外,将水与甲醇按1∶1的比例进行预混合,以进一步避免混溶性问题。
对比实施例2-使用天然糖脂进行的红血球转化的转化作用
凝集
除了使用常规的试管血清学之外,使用Diamed-ID Micro Typing System通过凝集作用对红血球的转化作用进行评价。不使用Diamed ABO分型卡。使用的卡为NaCl、酶试验和冷凝集素卡,它们不预装载任何抗血清或者其它试剂。这允许以两种方法应用特异抗血清。
表1凝胶-卡片
制造商 | 相关类目 |
Diamed | NaCl、酶试验和冷凝集素卡 |
在试管血清学和Diamed系统之间进行对比试验,以确定两个系统的性能。细胞在25℃下转化4小时。使用计量相等的Seraclone和Alba-clone抗A血清。所得结果示于下表3中。
表2.在试管血清学与Diamed系统对比中使用的抗血清。
制造商 | 相关类目 | 标签 | 有效期限 |
Albaclone,SNBTSSeraclone,Biotest | Anti-A.801320100 | Z00107701310401 | 12.12.0412.04.03 |
表3.试管血清学与Diamed系统比较的凝集结果
糖脂(mg/mL) | ||||||
10 | 5 | 2 | 1 | 0 | ||
试管Diamed | AlbacloneSeracloneAlbacloneSeraclone | 3+3+2+3+ | 2+2+2+2+ | 0001+ | 000w+ | 0000 |
在此试验中,经证实,使用Seraclone抗A而非Albaclone时Diamed系统比试管血清学对弱反应更为敏感。这些试剂进行了不同配制,由此不能期望它们等同进行。然而,,Seraclone抗A试管血清学组合可能因为操作者的介入因素确实不能检测确定性(positivity)。由此,弱反应就非常难以得到精确评分,在试管血清学中,1+和0之间的差异可能难以辨别。
最优化
对变量糖脂浓度、培养温度、培养持续时间、稀释剂和贮存溶液进行了测定,以测定它们对细胞健康的影响。通过与相关抗体的凝集作用对转化作用的效率和稳定性进行了评价。
表4.天然糖脂A转化细胞在不同时间和温度下的试管血清学凝集作用。
A | |||||||||
10 | 5 | 2 | 1 | 0.1 | 0.01 | 0.001 | 0.0001 | 0 | |
Seraclone(37℃保持1.5小时)Seraclone(25℃保持4小时) | 3+4+ | 2+3+ | 02+ | 01+ | w+ | 0 | 0 | 0 | 00 |
糖脂浓度
使用高度纯化(HPLC)的Leb糖脂样品和纯度较差的血型A糖脂样品进行初始转化试验。转化作用在37℃下进行1.5小时。
A糖脂样品含有其它脂质杂质,并且由此与相同浓度(w/v)的Leb糖脂样品相比,它含有按重量计相对较少的血型A分子。这由与Leb糖脂相比,产生同等的凝集评价(参见表6)需要更高浓度的A糖脂而得到证实。
A糖脂样品中杂质的浓度还可能有助于降低其在62天周期内的稳定性——A-转化细胞在最高浓度时“死亡”(接收了最高剂量的杂质)。
表5.用于天然糖脂转化作用初始试验的抗-A和抗-Leb。
制造商 | 相关类目 | 批号 | 有效期限 |
抗-ASeraclone,Biotest | 801320100 | 1310401 | 12.04.03 |
抗-LebCSL | 12801 |
表6.在62天周期内,通过试管血清学凝集作用评价的使用天然A和Leb糖脂转化的RBCs的稳定性。
糖脂(mg/mL) | Leb | A |
第1天 第25天 第62天 | 第1天 第25天 第62天 | |
10 | 4+ 2-3+ | 3+ 2+ ? |
5210 10.010.0010.00010 | 4+ 2.3+3+ 1.2+4+ 2+3+ 2+ 02+ 2+ 02+ 2+ 02+ 0 00 0 0 | 2+ 2+ w+0 1+ 00 1+ 000000 0 0 |
还对上述细胞的溶血强度速率进行了测定并且这些结果示于下表7中。
表7.直观评价的溶血作用。第1天——转化之后第一次洗涤的上清液;第25和62天——在贮存后细胞再悬浮之前的细胞防腐液中。评价尺度类似于从4+~0的凝集作用评价尺度:hhhh-剧烈溶血,hhh—非常溶血,hh-中等溶血,h-适度溶血,w-微弱溶血和0-未观察到溶血。
糖脂浓度(mg/mL) | 溶血作用 | |||||
Leb | A | |||||
第1天 | 第25天 | 第62天 | 第1天 | 第25天 | 第62天 | |
105210.10.010.0010.0001Control | hhhwwh | 00000 | hhhhhhhhhhhhhhhh | hwwhh | h000h | deadhhhhhhhhhhhhhh |
这些结果表明,细胞溶血作用可以被证明与高浓度糖脂的转化作用相关。现在还不清楚进行上述作用的机制是否是通过大量插入的糖脂分裂胞质膜、上述插入速率或者可能是由于相关杂质的数量导致。然而,Leb在第62天时的结果看来支持第一种解释。
在进行溶解之前,Leb样品是高度纯化的,它是一种纯白颜色的粉末,并且因此所述溶血作用不可能是由于杂质的有害作用。参照第62天时很显然,溶血作用的量随着糖脂浓度的降低产生了减少。
培养温度
进行此试验以研究在插入步骤期间降低RBCs溶血作用的其它可能机制。先前试验已经表明,同低浓度时相比,较高糖脂浓度的溶血作用较差,由此可以认为溶血作用还可能与糖脂插入的速率相关。因为人们认为温度会影响插入的速率,因此进行试验,比较37℃时的转化作用和室温下(RT;25℃)的转化作用。
因为预计速率会由于温度降低而下降,因此室温试验的培养期为4小时。在插入后,对溶血作用进行直观估定和评价。还在细胞上进行血清学试验。结果示于表8中。
表8.在将糖脂插入RBC膜期间,培养温度对溶血作用和凝集作用的影响。在三次洗涤的每次洗涤之时对溶血作用进行直观评价。
糖脂(mg/mL) | 溶血作用 | 血清学 | ||||||
RT | 37℃ | RT | 37℃ | |||||
第一次洗涤 | 第二次洗涤 | 第三次洗涤 | 第一次洗涤 | 第二次洗涤 | 第三次洗涤 | |||
10 | w | 0 | 0 | hh | w | 0 | 2+ | 2+ |
1 | w | 0 | 0 | hh | h | vw | 1+ | w+ |
培养持续时间
在37℃下培养进行1和2小时,以及它对细胞健康和通过与相关抗体的凝集作用进行评价的转化作用的影响。
表9.在培养试验持续期间使用的抗血清。
制造商 | 相关类目 | 批号 | 有效期限 |
Albaclone,SNBTS | Anti-A. | Z0010770 | 12.12.04 |
Bioclone,OCD | Anti-A,试验试剂 | DEV01102 | - |
Albaclone,SNBTS | Anti-B | Z0110670 | 01.07.05 |
Bioclone,OCD | Anti-B,试验试剂 | DEV01103 | - |
表10.培养时间对用天然糖脂转化的细胞凝集作用的影响
糖脂 | 浓度(mg/mL) | Albaclone | BioClone | ||
1小时 | 2小时 | 1小时 | 2小时 | ||
A | 105210.5 | 4+4+4+3+2+ | 4+4+3+2+2+ | 4+4+3+2+1+ | 4+2+2+2+w+ |
B | 105210.5 | 3+3+2+1+1+ | 2+2+2+w+w+ | 4+3+2+1+w+ | 1+2+1+w+w+ |
这些结果表明,在天然糖脂插入期间增加培养持续时间不会增强凝集作用。事实上,在两小时培养之后凝集作用评价还会降低。这可能是由于膜的去稳定性或者糖脂重新返回溶液所致。
稀释
还进行了下述试验以确定改变糖脂稀释溶液是否会降低溶血作用。将PBS工作强度与2×PBS以及有2%牛血清蛋白(BSA)的PBS工作强度进行比较。细胞在37℃下培养1.5小时。结果示于表11中。
表11.在将糖脂插入RBC膜期间,改变糖脂稀释溶液对溶血作用影响的研究。
糖脂浓度(mg/mL) | 糖脂稀释溶液 | ||
PBS | 2×PBS | 2%BSA in PBS | |
403020100 | hhhhhhhhhhhh0 | hhhhhhhhhhhh0 | hhhhhhhhhhhh0 |
稳定性
在将A和B血型糖脂HPLC纯化至可接受的程度后,进行试验以寻找用于稳定性试验的适当浓度。
表12.用天然A糖脂转化的细胞的早期稳定性试验。
试验 | 天 | A |
10 5 2 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 0 | ||
1234567 | 7435060677481 | 4+ 3-4+ 1+ 0 0 0 0 0 03+ w+ 0 0 0 0 0 0 01+ 0 0 03+ 1+ 0w+ vw vw2+ 0 02+ 1+ 0 |
表13.用于稳定性试验(表14和表15)的抗血清。
制造商 | 相关类目 | 批号 | 有效期限 |
Albaclone,SNBTS | Anti-A. | Z0010770 | 12.12.04 |
Bioclone,OCD | Anti-A,试验试剂 | DEV01102 | - |
Albaclone,SNBTS | Anti-B | Z0110670 | 01.07.05 |
Bioclone,OCD | Anti-B,试验试剂 | DEV01103 | - |
表14.为了确定用于稳定性试验的适当浓度,用A糖脂转化的O RBCs试管血清学。
抗-A | 试验 | A糖脂(mg/mL) | ||||||||
10 | 5 | 2 | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.01 | 0.001 | 0 | ||
Alba | 12 | 3+4+ | 2+4+ | 1+3+ | 02+ | w+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
Bio | 12 | 3+4+ | 2+4+ | 1+3+ | 02+ | w+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
1&2 在25℃下转化4小时
表15.为了确定用于稳定性试验的适当浓度,用B糖脂转化的O RBCs试管血清学。
抗-B | 试验 | B糖脂(mg,mL) | ||||||||
10 | 5 | 2 | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.01 | 0.001 | 0 | ||
Alba | 12 | 2+1+ | 1+1+ | w+w+ | 00 | w+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
Bio | 12 | 3+1+ | 2+1+ | w+w+ | 00 | w+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
1&2 在25℃下转化4小时
两组细胞使用不同浓度的天然A糖脂进行转化。转化作用在25℃下进行。对一组细胞进行长期试验,而另一组细胞每周进行凝集作用试验。由试管血清学和Diamed得到的凝集作用结果示于下表16中。所有细胞都贮存在CellstabTM中,放在平底烧瓶中。在任何时候,这些细胞都表现最低程度的溶血作用,甚至没有溶血作用。
表16.使用不同浓度天然A糖脂进行转化的细胞的凝集结果。结果使用Albaclone抗-A获得。
A糖脂(mg/mL)10 5 2 1 0.1 control | ||
长期试验1天17天 | TubeDiamedTubeDiamed | 4+ 3+ 2+ 1+ +w 03+ 3+ +w 0 0 03+ 2+ 0 0 03+ 2+ 1+ 0 0 |
每周试验1天8天15天22天29天36天43天 | TubeDiamedTubeDiamedTubeDiamedTubeDiamedTubeDiamedTubeDiamedTubeDiamed | 3+ 2+ 0 03+ 0 0 01+ 0 0 03+ 0 0 01+ 0 0 03+ 2+ 0 03+ 0 0 03+ 0 0 0*+w *0 *0 *0*3+ *0 *0 *0* * * *0*3+ *0 *0 *0* * * *0* * * *0 |
*-Albaclone,同时其它都使用Seraclone抗-A.
贮存溶液
对两种细胞贮存溶液(CelpresolTM(CSL)和CellstabTM(Diamed))进行比较,以试验它们保持修饰的RBCs的相抵能力。
当贮存入两种不同的防腐液-CellstabTM和AlseversTM中时,对使用不同浓度血型A和B抗原溶液转化的RBCs的稳定性进行了试验。
将来自两种不同来源的A和B抗血清用于血清学试验中。
全部细胞都使用标准试管血清学平台试验高达42天,此时细胞凝集反应已经达到了难以人工评价的程度(A结果参见表17,和R结果参见表18)。
对Alsevers贮存细胞进行Diamed凝胶-卡片试验至56天,该试验在第63天时由于真菌污染而停止(虽然仍然返回阳性评价)。对CellstabTM贮存细胞持续试验至高达70天,并且此时仍然可行(A结果参见图1,和B结果参见图2)。
用于稳定性试验的试剂示于表13中。
表17.使用不同浓度的A糖脂转化和贮存在或者CellstabTM或者AlseversTM中的细胞稳定性试验的试管血清学结果
天 | 细胞贮存溶液 | Albaclone抗-A(SNBTS)转化溶液(mg/mL) | BiocIone抗-A(OCD-试验性试剂) | ||||||||
10 | 5 | 2 | 2* | 1 | 10 | 5 | 2 | 2* | 1 | ||
281421283642 | AlseversCellStabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTM | 4+4+4+4+4+4+3+3+2+2+_3+3+_3+4+_ | 3+4+4+4+3+3+2+3+2+2+_2+2+_3+4+_ | 2+3+2+3+2+3+2+2+1+_2+_1+_ | 1+1+1+2+2+2+2+_1+_2+_w+_ | w+1+1+1+w+w+1+_001+_0_ | 3+3+2+3+2+3+2+2+2+1+3+3+_2+_ | 3+3+2+3+1+2+2+_2+w+3+_2+_ | 1+2+1+2+w+w+2+_1+02+_2+_ | 1+1+1+W+VWVW1+_1+01+_1+_ | 00000000001+_1+0 |
*-在培养之后未对转化溶液(含有糖脂)进行洗涤,将其放置过夜和第二天对其进行洗涤。
≠-阳性细胞标志(Button),但是细胞负性减少(不可能评价)
表18.使用不同浓度的B糖脂转化和贮存在或者CellstBbTM或者AlseversTM中的细胞稳定性试验的试管血清学结果
天 | 细胞贮存溶液 | Albaclone抗-B(SNBTS)转化溶液(mg/mL) | Bioclone抗-B(OCD-试验性试剂) |
10 5 2 2* 1 | 10 5 2 2* 1 | ||
281421283642 | AlseversCellstabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTMAlseversCellstabTM | 3+ 3+ 1+ 1+ 1+3+ 3+ 2+ 2+ 1+1+ 1+ w+ 0 02+ 1+ w+ 02+ 2+ 0 w+ 01+ w+ 0 0 0_ _ _ _ __ _ _ _ _2+ 1+ w+ 0 0_ _ _ 0 02+ 2+ 2+ 1+ 1+_ _ _ _ _2+ 2+ 2+ 2+ w+_ _ _ _ _ | 2+ 1+ 1+ 1+ 02+ 2+ 2+ 1+ w+0 0 0 0 01+ 1+ w+ 0 00 1+ 1+ 2+ 02+ 2+ w+ 1+ 1+1 1 _ _ _+ + + _ _2+ 1+ 2+ 0 0_ 0 _ _ 02+ 2+ 2+ 1+ 1+_ _ _ _ _2+ 2+ 1+ w+ w+_ _ _ _ _ |
*-在培养之后未对转化溶液(含有糖脂)进行洗涤,将具放置过夜和第二天对其进行洗涤。
≠-阳性细胞标志,但是细胞负性减少(不可能评价)。
糖脂插入的FACS分析
使用天然Leb-6糖脂进行的人类Le(a-b-)红血球体外转化作用的FACS分析随时间的变化在三种转化温度下(37℃、22℃和4℃)下进行(图3)。将天然Leb-6糖脂溶于血浆中并且其用于转化RBCs,最终浓度为2mg/mL和最终悬浮为10%。
通过FACS分析,使用γ抗-Leb对反应性进行确定。(血清学检测级别为102个分子。天然糖脂在4℃下进行的8小时插入通过与抗体的凝集作用是不可检测的。)由FACS分析得到插入曲线的速率射影并没有表明在4℃下,插入速率在24小时内将会达到凝集作用检测水平。
低培养温度
使用天然A或B糖脂的RBCs转化作用在37℃下进行1小时和在2℃下进行不同的时间。细胞与Bioclone抗-A或者Bioclone抗-B凝集在一起。所得结果提供于表19和20中。
表19.天然A糖脂转化作用在37℃下进行1小时和在2℃下进行不同时间的对比Diamed结果。
温度 | 时间(小时) | Nat A(mg/mL) | ||||
10 | 5 | 2 | 1 | 0 | ||
37℃ | 1 | 3+ | 3+ | 2-3+ | 2+ | 0 |
2℃ | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
8 | 1-2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
24 | 2-3+ | 2+ | 1-2+ | 0 | 0 | |
48 | 3+ | 2-3+ | 2-3+ | 0 | 0 | |
72 | 3-4+ | 3+ | 2+ | 0 | 0 |
表20.天然B糖脂转化作用在37℃下进行1小时和在2℃下进行不同时间的对比DiBmed结果。
温度 | 时间(小时) | Nat B(mg/mL) | ||||
10 | 5 | 2 | 1 | 0 | ||
37℃ | 1 | 3+ | 2-3+ | 2+ | 0 | 0 |
2℃ | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
24 | 1+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
48 | 2+ | 1-2+ | 0 | 0 | 0 | |
72 | 2+ | 1+ | 0 | 0 | 0 |
对于天然A糖脂和天然B糖脂而言,在2℃下,它们的转化速率都缓慢,如1小时之后的负凝集作用评价所表明。在37℃,在此时间间隔下表现了显著的插入作用。
在2℃下,天然A糖脂需要插入48小时才能达到通过在37℃下转化作用可获得的相同插入水平。在此时间之后,没有观察到进一步的插入作用。同样地,天然B糖脂在2℃下的插入作用也没有37℃下的转化作用迅速。通过继续培养并不能促进凝集作用评价,由此看来,对于这些浓度此时已经达到了最大插入。
实施例
以下实施例描述了使用本发明合成分子构造的红血球转化作用。在这些实施例范围内,术语“合成糖脂”用来指代上述这些构造。
实施例1-合成糖脂的制备
物质和方法
TLC分析在硅胶60 F254板(Merck)上进行,化合物通过用8%磷酸水溶液点板,随后在超过200℃的温度下加热进行检测。柱色谱在硅胶60(0.2~0.063mm,Merck)或者葡聚糖凝胶LH-20(Amersham)上进行。1H NMR光谱在Bruker DRX-500波谱仪上获得。化学位移以ppm(δ)相对于CD3OD给出。
活化1,2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1,2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)(甘油基磷酸脂)的合成
向二(N-羟基琥珀酰亚胺基)己二酸酯(A)(70mg,205μmol)的无水N,N-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶液中加入DOPE或者DSPE(L)(40μmol)的氯仿(1.5ml)溶液,随后向其中加入三乙胺(7μl)。将上述混合物在室温下保持2小时,然后用乙酸对其进行中和并且在真空中进行部分浓缩。
对所得残余物进行柱色谱(葡聚糖凝胶LH-20,1∶1氯仿-甲醇,0.2%乙酸)分离,得到为无色浆状的活化脂质(A-L)(37mg,95%);TLC(氯仿-甲醇-水,6∶3∶0.5):Rf=0.5(DOPE-A),Rf=0.55(DSPE-A).
1H NMR(CDCl3/CD3OD,2∶1),δ:
DOPE-A-5.5(m,4H,2×(-C
H=C
H-),5.39(m,1H,-OCH2-C
HO-CH2O-),4.58(dd,1H,J=3.67,J=11.98,-CCOOHC
H-CHO-CH2O-),4.34(dd,1H,J=6.61,J=11.98,-CCOO
HCH-CHO-CH2O-),4.26(m,2H,PO-CH2-CH2-NH2),4.18(m,2H,-C
H 2-OP),3,62(m,2H,PO-CH2-C
H 2-NH2),3.00(s,4H,ONSuc),2.8(m,2H,-C
H 2-CO(Ad),2.50(m,4H,2×(-C
H 2-CO),2.42(m,2H,-C
H 2-CO(Ad),2.17(m,8H,2×(-C
H 2-CH-CH2-),1.93(m,4H, COCH2C
H 2C
H2CH2CO),1.78(m,4H,2×(COCH2C
H 2-),1,43,1.47(2bs,40H,20CH2),1.04(m,6H,2CH3).
DSPE-A-5.39(m,1H,-OCH2-C
HO-CH2O-),4.53(dd,1H,J=3.42,J=11.98,
-CCOOHCH-C
HO-CH2O-),4.33(dd,1H,J=6.87,J=11.98,-CCOO
HCH-CHO-CH2O-),4.23(m,2H,PO-C
H2-CH2-NH2),4.15(m,2H,-C
H 2-OP),3,61(m,2H,PO-CH2-C
H 2-NH2),3.00(s,4H,ONSuc),2.81(m,2H,-C
H 2-CO(Ad),2.48(m,4H,2×(-C
H2-CO),2.42(m,2H,-C
H 2-CO(Ad),1.93(m,4H,COCH2C
H 2CH2CH2CO),1.78(m,4H,2×(COCH2C
H 2-),1,43,1.47(2 bs,40H,20 CH2),1.04(m,6H,2 CH3).
活化DOPE(或者DSPE)与氨基丙基糖苷的缩合。
向活化DOPE(或者DSPE)(A-L)(33μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1ml)溶液中加入30μmol Sug-S1-NH2(F-S1-NH2)和5μl三乙胺。例如,所述Sug可以为或者为GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ三糖(A-glycotope)(F)或者为Galα1-3(Fucα1-2)Galβ三糖(B-glycotope)(F)的氨基丙基糖苷(F-S1-NH2)。
将上述混合物在室温下搅拌2h。对上述混合物进行柱色谱(在1∶1氯仿-甲醇下用葡聚糖凝胶LH-20,随后在乙酸乙酯-异丙醇-水(4∶3∶1(v/v/v))下用硅胶)分离,一般得到85~90%的合成分子构造,例如Atri-sp-Ad-DOPE(I)或者Btri-sp-Ad-DOPE(VI)。
1H NMR(CDCl3/CD3OD,1∶1),δ:
Atri-sp-Ad-DOPE(I)-5.5(m,4H,2×(-C
H=C
H-),5.43-5,37(m,2H,H-1(GalNHAc)and-OCH2-C
HO-CH2O-),5.32(d,1H,H-1,J=3.5 H-1 Fuc),2.50(m,4H,2×(-CH2-CO),2.40(m,4H,COCH2CH2CH2CH2CO),2.20(m,8H,2×(-CH2-CH=CH-CH2-),2.1(s,3H,NHAc),1.92(m,2H,O-CH2CH2CH2-NH),1.8(m,8H,COCH2CH2CH2CH2CO and 2×(COCH2CH2-),1,43,1.47(2bs,40H,20 CH2),1.40(d,3H,J=6.6,CH3 Fuc),1.05(m,6H,2 CH3).
Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)-5.5(m,4H,2×(-C
H=C
H-),5.43-5,37[m,2H,H-1(GalNHAc)and-OCH2-C
HO-CH2O-],5.32(d,1H,H-1,J=3.6 H-1 Fuc),2.50(m,4H,2×(-CH2-CO),2.40-2.32(m,6H,COCH2CH2CH2CH2CO andCOCH2-(sp1),2.18[m,8H,2×(-CH2-CH=CH-CH2-)],2.1(s,3H,NHAc),1.95(m,2H,O-CH2CH2CH2-NH),1.8[m,10H,COCH2CH2CH2CH2CO,2×(COCH2CH2-…),-COCH2 CH2(CH2)3NH-],1.68(m,2H,CO(CH2)3CH2CH2NH-),1,43,1.47(2 bs,42H,22 CH2),1.37(d,3H,J=5.6,CH3 Fuc),1.05(m,6H,2 CH3).
Atri-sp-Ad-DSPE(III)-5.42-5.38(m,2H,H-1(GalNHAc)and-OCH2-C
HO-CH2O-),5.31(d,1H,H-1,J=3.5 H-1 Fuc),2.48[m,4H,2×(-CH2-CO)],2.42(m,4H,COCH2CH2CH2CH2CO),2.18(s,3H,NHAc),1.95(m,2H,O-CH2CH2CH2-NH),1.8[m,8H,COCH2CH2CH2CH2CO and2×(COCH2CH2-)],1,43,1.47(2 bs,56H,28 CH2),1.38(d,3H,J=6.6,CH3Fuc),1.05(m,6H,2 CH3).
Btri-sp-Ad-DOPE(VI)-5.5(m,4H,2×(-C
H=C
H-),5.42-5,38[m,2H,H-1(Gal)and-OCH2-C
HO-CH2O-],5.31(d,1H,H-1,J=3.7,H-1 Fuc),2.48[m,4H,2×(-CH2-CO)],2.39(m,4H,COCH2CH2CH2CH2CO),2.18[m,8H,2×(-CH2-CH=CH-CH2-)],1.93(m,2H,O-CH2CH2CH2-NH),1.8[m,8H,COCH2CH2CH2CH2CO and 2×(COCH2CH2-)],1,43,1.47(2 bs,40H,20 CH2),1.36(d,3H,J=6.6,CH3 Fuc),1.05(m,6H,2 CH3).
Htri-sp-Ad-DOPE(VII)-5.5[m,4H,2×(-C
H=C
H-)],5.4(m,1H,-OCH2-C
HO-CH2O-),5.35(d,1H,H-1,J=3.2,H-1 Fuc),4.65,4.54(2d,J=7.4,J=8.6,H-1 Gal,H-1 GlcNHAc),4.46(dd,1H J=3.18,J=12,-CCOOHC
H-CHO-CH2O-),4.38-4.28(m,2H,H-5 Fuc,CCOOHC
H-CHO-CH2O-),2.48[m,4H,2×(-CH2-CO)],2.40(m,4H,COCH2CH2CH2CH2CO),2.18[m,8H,2×(-CH2-CH=CH-CH2-)],2.08(s,3H,NHAc),1.92(m,2H,O-CH2CH2CH2-NH),1.82-1.72[m,8H,COCH2CH2CH2CH2CO and 2×(COCH2CH2-)],1,48,1.45(2 bs,40H,20 CH2),1.39(d,3H,J=6.5,CH3 Fuc),1.05(m,6H,2 CH3).
Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)-5.49(m,4H,2×(-C
H=C
H-),5.37(m,1H,-OCH2-CHO-CH2O-),5.24(d,1H,H-1,J=2.95,H-1 Fuc),4.46(d,J=7.34,H-1 Gal),2.48[m,4H,2×(-CH2-CO)],2.42-2.35(m,4H,COCH2CH2CH2CH2CO),2.17[m,8H,2×(-CH2-CH=CH-CH2-)],1.95(m,2H,O-CH2CH2CH2-NH),1.81-1.74[m,8H,COCH2CH2CH2CH2CO and2×(COCH2CH2-)],1,45,1.41(2 bs,40H,20 CH2),1.39(d,3H,J=6.5,CH3Fuc),1.03(m,6H,2 CH3).
Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)-5.51[m,4H,2×(-C
H=C
H-)],5.4(m,1H,-OCH2-C
HO-CH2O-),4.61(dd,1H J=3.18,J=12,-CCOO
HCH-CHO-CH2O-),4.41(d,J=7.8,H-1 Gal),4.37(dd,1H,J=6.6,J=12,-CCOOHC
H-CHO-CH2O-),2.50[m,4H,2×(-CH2-CO)],2.40(m,4H,COCH2CH2CH2CH2CO),2.20[m,8H,2×(-CH2-CH=CH-CH2-)],1.97(m,2H,O-CH2CH2CH2-NH),1.82-1.72[m,8H,COCH2CH2CH2CH2CO and2×(COCH2CH2-)],1,48,1.45(2 bs,40H,20 CH2),1.05(m,6H,2CH3).
实施例2-合成糖脂的溶解性
为了用于细胞转化中,第一个条件就是合成糖脂必须满足它们可以溶于含水溶剂中,例如磷酸盐缓冲盐水中。为了使测试的合成糖脂(表21)的溶解度最大化,最初使用了许多技术,包括热处理和/或超声处理。
所述合成糖脂还必须能够插入膜中和能够被用于转化的适当抗体识别以通过凝集作用进行检测。对分子的初期试验将确定溶解性,并且由此除去那些不适于用于细胞转化中的分子。
这些初期试验的结果提供于表22中。
表21.试验的合成糖脂分子的范围。
DOPE脂质末端: | |
Btri-sp-Ad-DOPE(VI) | |
Atri-sp-Ad-DOPE(I) | |
Galβ-sp-Ad-DOPE(IX) | |
Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII) | |
Htri-sp-Ad-DOPE(VII) | |
Atri-spsp1-Ad-DOPE(II) | |
Btri-PAA-DOPE(V) | |
Different脂质末端: | |
Atri-sp-lipid(IV) | |
Atri-sp-Ad-DSPE(III) |
表22.在热PBS中合成糖脂的溶解性和转化能力。
合成糖脂 | 水溶性 | 可检测的转化能力 |
Atri-sp-lipid(IV) | 非 | 无 |
Btri-PAA-DOPE(V) | 非 | 无 |
Btri-sp-Ad-DOPE(VI) | 是 | 有 |
Atri-sp-Ad-DOPE(I) | 是 | 有 |
Galβ-sp-Ad-DOPE(IX) | 是 | 无 |
Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII) | 是 | 无 |
Htri-sp-Ad-DOPE(VII) | 是 | 有 |
Atri-spsp1-Ad-DOPE(II) | 是 | 有 |
Atri-sp-Ad-DSPE(III) | 是 | 有 |
认为Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)和Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)不具有可检测的转化作用是由于抗体不具有识别这些合成分子glycotope的能力。
Atri-sp-lipid(IV)具有单酰基而非二酰基尾,由此认为这种合成分子并没有插入到膜双层中去。
实施例3-通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)合成糖脂进行的RBCs低温转化作用
RBCs在4℃贮存时较为健康,由此认为在4℃转化时同样较为健康。根据先前所述研究(参见对比实施例)和他人研究(Schwarzmann,2000),并不认为合成糖脂在4℃下会产生显著的插入速率。这些研究使用天然糖脂进行。惊人地发现,这些研究并不能预测本发明合成糖脂的行为。
虽然并不希望与理论结合,但是在Schwarzmann的研究中,天然糖脂插入的低速率可能是由于天然糖脂末端(鞘脂和脂肪酸)的物理化学性能而导致。
糖脂的二酰基尾在确定插入速率中可能是重要的。某些二酰基尾在低温下可以保持较大的流动性。另外,这些糖脂二酰基尾插入的胞质膜区域可以保持此较大流动性。
众所周知,天然糖脂的鞘脂尾在刚性区域内聚集,这些区域在低温下可能不允许糖脂的进一步结合。具有顺式不饱和二酰基尾的合成糖脂可以有利于应用。
首先对RBCs与具有不同脂质末端的合成糖脂的转化进行了评价(表22和24)。
表23.用于获得列于表24~27中的结果的抗血清。
抗-A
制造商 相关类目 批号 有效期限
Albaclone,SNBTS Z0010770 12.12.04
BioClone,OCD 试验试剂 01102 -
抗-B
制造商 相关类目 批号 有效期限
Albaclone,SNBTS Z0110600 27.04.03
BioClone,OCD 试验试剂 01103 -
表24.对不同脂质末端通过与相关抗血清凝集而插入的评价
分子Atri-sp-Ad-DOPE(I)Btri-sp-Ad-DOPE(VI)Atri-spsp1-Ad-DOPE(II)Atri-sp-lipid(IV)Atri-sp-Ad-DSPE(III)*-干扰 | 抗血清AlbaBioAlbaBioDBAAlbaBioAlbaBioAlbaBioAlbaBioDBAAlbaBioAlbaBioAlbaBioDBA | 转化溶液(μg/mL)1000 500 250 125 100 60 50 40 30 20 10w+ w+ 0 0 02+ 1+ w+ 0 04+ 3+ 2-3+ 2+4+* 4+* 3+* 3+03+3+2+ 2+ 1+ 0 03+ 2+ 1+ 0 00 0 0 0 00 0 0 0 04+ 3+ 2+ 2+4+* 3-4+* 3+* 2+0000 0 0 0 00 0 0 0 02-3+ 2-3+ 2+ 2+3+ 2-3+ 2+ 2+0 |
在4℃时,使用Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)合成糖脂进行的RBCs转化作用,然后对其进行评价(表25~28)。这些转化作用直接指向A、B或者A和B glycotopes的低水平表达的细胞(“弱A、B和AB细胞”)的制备。
为了制备弱A和B细胞,将在1×PBS中的转化溶液(20μL,Atri-sp-Ad-DOPE(I)为0.08、0.05和0.03mg/mL,和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)为0.6、0.3、0.15、0.08、0.05和0.03mg/mL)与经洗涤、封装的O型RBCs(60μL)混合。
为了制备弱AB细胞,将在1×PBS中的转化溶液(20μL,Atri-sp-Ad-DOPE(I)为0.07、0.06和0.05mg/mL,和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)为0.3和0.2mg/mL)与洗涤、包装的O型RBCs(60μL)合并在封闭滴定管中。所述组合为:0.07mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.3mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI);0.07mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.2mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI);0.06mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.3mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI);0.06mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.2mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI);0.05mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.3mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI);和0.05mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)+0.2mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)。
将细胞和转化溶液置于4℃的冷冻机中。每隔一段时间进行一次移液混合。细胞由于每隔一段时间与相关抗血清进行一次试验而得到了消除,并且细胞以洗涤态和未洗涤态(即,洗涤样品除去了转化溶液)均进行试验。
48小时之后,将CelpresolTM加入到细胞中,使得最终细胞∶非细胞的比例为3∶5(v/v)。继续每隔一段时间对细胞进行一次试验。10之后将试验终止,因为此时细胞变成了褐色。
这种变色可以归结为多种因素,包括:当进行转化时,细胞已经生存了21天;48小时转化作用在PBS而非CelpresolTM中进行,因此此时细胞受到了压迫;和在转化室和测试实验室之间运送中,细胞可能处理不当。上述变色可以通过在CelpresolTM而非PBS中转化细胞而得到缓解。
表25.在4℃下通过抗-A转化的弱A RBCs的Diamed结果。
时间 | Atri-sp-Ad-DOPE(I)(mg/mL) | |||||
洗涤 | 未洗涤 | |||||
0.08 | 0.05 | 0.03 | 0.08 | 0.05 | 0.03 | |
2小时 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
4小时 | 1+ | 0 | 0 | 2+ | 0 | 0 |
6小时 | 2+ | 0 | 0 | 2+ | 0 | 0 |
8小时 | 2+ | 0 | 0 | 2-3+ | 0 | 0 |
12小时 | 2-3+ | 0 | 0 | 3+ | 1+ | 0 |
24小时 | 3-4+ | 1+ | 0 | 3-4+ | 2+ | 0 |
30.5小时 | 3-4+ | 1+ | 0 | 3-4+ | 2+ | 0 |
48小时 | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 2+ | 0 |
72小时 | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 2-3+ | 0 |
96小时 | 4+ | 2-3+ | 0 | 4+ | 2-3+ | 0 |
Day7 | 3-4+ | 2+ | 0 | |||
Day10 | 3-4+ | 2+ | 0 |
表26.在4℃下通过抗-B转化的弱B RBCs的Diamed结果。
时间 | Btri-sp-Ad-DOPE(VI)(mg/mL) | |||||
洗涤 | 未洗涤 | |||||
0.6 | 0.3 | 0.15 | 0.6 | 0.3 | 0.15 | |
2小时 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
4小时 | 0 | 0 | 0 | 1+ | 0 | 0 |
6小时 | w+ | 0 | 0 | 1+ | 0 | 0 |
8小时 | 2+ | 0 | 0 | 2+ | w+ | 0 |
12小时 | 2+ | w+ | 0 | 2-3+ | 2+ | 0 |
24小时 | 4+ | 3+ | 2+ | 4+ | 3+ | 2+ |
30.5小时 | 4+ | 2-3+ | 0 | 4+ | 2-3+ | w+ |
48小时 | 4+ | 3+ | 1+ | 4+ | 3+ | 2+ |
72小时 | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ |
96小时 | 4+ | 3-4+ | 2-3+ | 4+ | 3-4+ | 2-3+ |
7天 | 4+ | 2-3+ | 0 | |||
10天 | 4+ | 2+ | 0 |
表27.在4℃下在封闭滴定管中通过抗-A转化的弱AB RBCs的Diamed结果。
天 | Btrisp-Ad-DOPE(VI)(mg/mL) | Atri-sp-Ad-DOPE(I)(mg/mL) | |||||
洗涤 | 未洗涤 | ||||||
0.07 | 0.06 | 0.05 | 0.07 | 0.06 | 0.05 | ||
1 | 0.30.2 | 2+2+ | 1-2+1-2+ | w+0 | 2-3+2-3+ | 2+2+ | 1+1+ |
5 | 0.30.2 | 2+2+ | 1-2+1-2+ | 1+w+ | 2-3+2-3+ | 2+2+ | 1-2+1-2+ |
8 | 0.30.2 | 2-3+2-3+ | 2+2+ | 2+1-2+ |
表28.在4℃下在封闭滴定管中通过抗-B转化的弱AB RBCs的Diamed结果。
天 | Btri-sp-Ad-DOPE(VI)(mg/mL) | Atri-sp-Ad-DOPE(I)(mg/mL) | |
洗涤 | 未洗涤 | ||
0.07 0.06 0.05 | 0.07 0.06 0.05 | ||
1 | 0.30.2 | 3+ 3+ 2+1+ 1-2+ 0 | 3+ 3+ 2-3+2+ 2+ 1-2+ |
5 | 0.30.2 | 2+ 2+ 1+0 w+ vw | 2+ 2+ 2+1+ w+ vw |
8 | 0.30.2 | 2+ 2+ 2+1+ 1+ 0 |
实施例4—通过Atri-sp-Ad-DOPE(I)和Btri-sp-Ad-DOPE(VI)合成糖脂进行的RBCs转化作用的插入效率
将转化后上清液溶液(得自于浓度为0.08mg/mL、0.05mg/mL和0.03mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)和0.6mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI),20μL)以1∶2稀释溶液加入到干净和经洗涤、封装的基团ORBCs(60μL)中。将该试管在37℃水浴中培养一小时,每15分钟进行一次混合。
转化的RBCs用PBS洗涤3×,然后将其悬浮在适当浓度的CellstabTM中以进行血清学测试。
表29.试管血清学
预-转移浓度(mg/mL) | 评价 |
浓度为0.08的Atri-sp-Ad-DOPE(I)浓度为0.08的Atri-sp-Ad-DOPE(I)的1∶2稀释物 | 00 |
浓度为0.05的Atri-sp-Ad-DOPE(I)浓度为0.05的Atri-sp-Ad-DOPE(I)的1∶2稀释物 | 00 |
浓度为0.03的Atri-sp-Ad-DOPE(I)浓度为0.03的Atri-sp-Ad-DOPE(I)1∶2稀释物 | 00 |
浓度为0.60的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)浓度为0.60的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)1∶2稀释物 | vw+0 |
由转化后上清液溶液(得自于0.08mg/mL的预转化溶液)给出的评价甚至不及第一通道(first pass)中0.03mg/mL转化溶液的评价。这些结果表明,在第一通道中>75%的分子插入到了RBC膜中。
此外,将转化后溶液浓缩20×并且将其与已知浓度的转化溶液进行平行比较。仅仅对来源于0.08mg/mL Atri-sp-Ad-DOPE(I)和0.6mg/mLBtri-sp-Ad-DOPE(VI)溶液的转化后溶液进行试验。
将转化后溶液(20μL)渗析(孔径500Da)通过去离子水2天。然后将该样品放置在通分橱(fumehood)中10天以进行干燥。在此时间结束后,将它们转移入旋转蒸发烧瓶中,和启动旋转蒸发在真空和无加热下旋转过夜。
在40℃的水浴中对样品进行干燥并且用氯仿-甲醇2∶1将其冲入较小的容器内,剩余了大量的无水多细胞物质。将2∶1氯仿-甲醇洗液全部除去,然后再次用2∶1氯仿-甲醇冲洗入试管中和将洗液全部除去。将这些样品再溶于1mL1×PBS中并且将其用于转化试验中。烧瓶底部的多细胞材料用水冲洗入另一套试管中。
将转化后溶液(得自于0.08mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)和0.6mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI),20μL)加入到经洗涤、封装的RBCs(60μL)中。平行地,将转化溶液(0.08mg/mL的Atri-sp-Ad-DOPE(I)和0.6mg/mL的Btri-sp-Ad-DOPE(VI),20μL)加入到经洗涤、封装的RBCs(60μL)中。
将该试管在37℃水浴中培养一小时,每15分钟进行一次混合。转化的RBCs用PBS洗涤3×,然后将其悬浮在适当浓度的CellstabTM中以进行血清学测试。
表30.Diamed血清学
浓度(mg/mL) | 评价 |
Atri-sp-Ad-DOPE(I)为0.08 | 3+ |
Atri-sp-Ad-DOPE(I)为0.05 | 2+ |
Atri-sp-Ad-DOPE(I)为0.03 | 1+ |
FromAtri-sp-Ad-DOPE(I)为0.08 | 0 |
Btri-sp-Ad-DOPE(VI)at 0.60 | 4+ |
FromBtri-sp-Ad-DOPE(VI)为0.60 | 0 |
这些结果表明,在转化后溶液中,即使浓缩20×时都没有通过血清学检测的充分分子。
实施例5—通过Htri-sp-Ad-DOPE(VII)合成糖脂进行的鼠RBCs的转化作用
小鼠细胞在37℃下转化1小时。
表31.用于表32和33结果中的抗-H试剂。
抗血清 | 制造商 | 批次 |
Anti-HIgM | Japanese Red Cross | HIRO-75 |
UEA | Lorne Laboratories | 11549E D.O.E.06.2004 |
Bio-UEA | EY Labs | 201105-2 |
表32.试管血清学
细胞 | H抗血清 | |||
IgM | UEA | Bio-UEA | ||
T=0 | T=20 | |||
鼠RBCs(-对照) | 0 | 0 | 0 | |
鼠RBCs+0.01mg/mLHtri-sp-Ad-DOPE(VII) | 0 | |||
鼠RBCs+0.05mg/mLHtri-sp-Ad-DOPE(VII) | 1+ | |||
鼠RBCs+0.1mg/mLHtri-sp-Ad-DOPE(VII) | 3+ | |||
鼠RBCs+0.25mg/mLHtri-sp-Ad-DOPE(VII) | 4+ | 1+ | ||
鼠RBCs+1mg/mLHtri-sp-Ad-DOPE(VII) | 2+ | 2+ | ||
人类O RBCs(+control) | 4+ | 1+ | 2/3+ | 4+ |
表33.Diamed
细胞 | 评分 |
鼠RBCs+0.01mg/mLHtri-sp-Ad-DOPE(VII) | 0 |
鼠RBCs+0.05mg/mL Htri-sp-Ad-DOPE(VII) | 0 |
鼠RBCs+0.1mg/mL Htri-sp-Ad-DOPE(VII) | 2+ |
鼠RBCs+0.25mg/mLHtri-sp-Ad-DOPE(VII) | 3+ |
实施例6—通过过滤的Atri-sp-Ad-DOPE(I)合成糖脂进行的RBCs转化
将一些Atri-sp-Ad-DOPE(I)无菌滤过0.2μm的过滤器。为了研究是否转化作用与该产品一样,进行对比试验。
表34.用于产生列于表35中结果的抗-A。
制造商 | 相关类目 | 批号 | 有效期限 |
BioClone,OCD | 试验试剂 | 01102 | - |
表35.使用不同浓度无菌过滤对比未过滤的Atri-sp-Ad-DOPE(I)转化的RBCs凝集栏
浓度(mg/mL) | 无菌过滤的Atri-sp-Ad-DOPE(I) | 未过滤的Atri-sp-Ad-DOPE(I) |
0.20.10.050.01 | 4+4+2-3+0 | 4+3-4+2-3+0 |
对照37℃对照25℃ | 00 |
这些结果表明在Atri-sp-Ad-DOPE(I)的两种制剂之间不存在显著差异,并且表明滤过0.2μM过滤器不会除去分子或者改变组合物或者使流体性能改变到转化作用受影响的程度。
实施例7-转化细胞的贮存
为了研究在4℃或者37℃下贮存是否会改变Atri-sp-Ad-DOPE(I)和转化O RBCs的天然的A糖脂的凝集结果,分别将其确定为“Syn-A”和“Nat-A”细胞,并且将其分为两份和以5%的浓度悬浮在CellstabTM中。
将一组细胞贮存在4℃水浴中和将另一组细胞贮存在37℃水浴中。对贮存的转化细胞的凝集作用进行评价(表36)。
表36.
时间(小时) | 平台 | 温度(℃) | ||||
Syn-A | Nat-A | Control | ||||
Atri-sp-Ad-DOPE(I)at0.1mg/mL | At1mg/mL | At10mg/mL | ||||
0 | 试管 | 3+ | 0 | 1-2+ | 0 | |
20 | 柱 | 4 | 4+ | 0 | 3+ | 0 |
37 | 4+ | 0 | 3+ | 0 | ||
44 | 柱 | 437 | 4+4+ | 3+3+ | 00 |
实施例8-使用带有不同的非碳水化合物结构的A-和B-抗原合成糖脂进行的RBC转化
表示为Atri-sp-Ad-DOPE(I)、Atri-sp1sp2-Ad-DOPE(II)、Atri-sp-Ad-DSPE(III)和Btri-sp-Ad-DOPE(vI)的水溶性合成糖脂根据实施例1中所述方法与必要变形进行制备。
将经洗涤的封装O型红血球(RBCs)(3体积份)和合成糖脂溶液(1体积份,不同浓度)加入到微量离心管中。将该试管在37℃水浴中培养一小时,每15分钟进行一次混合。转化的RBCs用PBS洗涤3×,然后将其悬浮在适当浓度的CellstabTM中以进行血清学测试。
使用不同合成分子构造转化的RBCs的试管血清学和Diamed凝胶-卡片结果提供于表38中。使用不同浓度的不同合成糖脂转化的RBCs的稳定性结果提供于表39~44中。
表37.用于产生列于表38~44中的结果的抗血清。
抗血清 | 制造商 | 批次 |
Albaclone抗-A | SNBTS | Z0010770-D.O.E 12.12.04 |
Bioclone抗-A | Ortho Diagnostics | 01102-D.O.M 16.05.02 |
Albaclone抗-B | SNBTS | Z0110670-D.O.E 12.12.04 |
Bioclone抗-B | Ortho Diagnostics | 01103-D.O.M 16.05.02 |
表38.使用不同浓度A-抗原合成糖脂的RBCs转化作用的对比
缩略语: n. 未测定出
d.
表39.使用高浓度(1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL)Atri-sp-Ad-DOPE(I)转化的RBCs的稳定性试验。通过人工试管血清学进行凝集。
天 | 细胞贮存溶液 | Albaclone抗-A | Bioclone抗-A | ||||
转化溶液的浓度(mg/mL) | |||||||
1 | 0.5 | 0.25 | 1 | 0.5 | 0.25 | ||
2 | Alsevers | 4+ | 4+ | 4+ | 4+° | 4+° | 4+° |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+° | 4+° | 4+° | |
10 | Alsevers | 3+ | 2+ | 2+ | 4+° | 4+° | 3+ |
CellstabTM | 4+° | 3+° | 2+ | 4+° | 4+° | 4+° | |
17 | Alsevers | 4+ | 4+ | 4+ | 4+° | 4+° | 4+° |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+° | 4+° | 4+° | |
24 | Alsevers | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+° | 4+ | 4+ |
缩略语: ° 干扰
表40.使用低浓度(0.1mg/mL、0.05mg/mL和0.025mg/mL)Atri-sp-Ad-DOPE(I)转化的RBCs的稳定性试验。通过人工试管血清学进行凝集。
天 | 细胞贮存溶液 | Albaclone抗-A | Bioclone抗-A | ||||
转化溶液的浓度(mg/mL) | |||||||
0.1 | 0.05 | 0.025 | 0.1 | 0.05 | 0.025 | ||
2 | Alsevers | 3+/2+ | 1+ | 1+/w+ | 2+ | 2+/1+ | 1+ |
CellstabTM | 3+/2+ | 2+ | 1+ | 3+/2+ | 3+/2+ | 2+ |
8 | Alsevers | 2+ | 1+ | w+ | 3+/2+ | 2+ | 2+ |
CellstabTM | 2+ | 1+/w+ | vw | 3+° | 2+ | 1+ | |
15 | Alsevers | 2+ | 1+ | 0 | 3+ | 2+ | Vw |
CellstabTM | 4+ | w+ | 0 | 4+ | 4+ | 1+ | |
22 | Alsevers | 2+ | 2+ | 0 | 3+ | 2+ | w+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 1+ | 4+ | 4+ | 1+ | |
44 | Alsevers | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
CellstabTM | 4+ | 2+ | w+ | 4+ | 2+ | w+ |
缩略语: n.d 未测定出
° 干扰
表41.使用高浓度(1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL)Atri-sp-Ad-DOPE(I)转化的RBCs的稳定性试验。在Diamed凝胶-卡片上进行凝集。
天 | 细胞贮存溶液 | Albaclone抗-A | Bioclone抗-A | ||||
转化溶液的浓度(mg/mL) | |||||||
1 | 0.5 | 0.25 | 1 | 0.5 | 0.25 | ||
2 | Alsevers | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
10 | Alsevers | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
17 | Alsevers | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
24 | Alsevers | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
45 | Alsevers | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
59 | Alsevers | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | ||
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
73 | Alsevers | ||||||
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
88 | Alsevers | ||||||
CellstabTM | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
其中存在不足以进行测试的细胞,对此表示为空白。
表42.使用低浓度(0.1mg/mL、0.05mg/mL和0.025mg/mL)Atri-sp-Ad-DOPE(I)转化的RBCs的稳定性试验。在Diamed凝胶-卡片上进行凝集。
天 | 细胞贮存溶液 | Albaclone抗-A | Bioclone抗-A | ||||
转化溶液的浓度(mg/mL) | |||||||
0.1 | 0.05 | 0.025 | 0.1 | 0.05 | 0.025 | ||
2 | Alsevers | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 1+ |
CellstabTM | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 1+ | |
8 | Alsevers | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+ | 1+ |
CellstabTM | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+ | 1+ | |
15 | Alsevers | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+/2+ | 1+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 0 | 4+ | 4+ | 1+ | |
22 | Alsevers | 4+ | 3+/2+ | 0 | 4+ | 3+ | w+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 0 | 4+ | 4+ | 1+ | |
29 | Alsevers | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | w+ |
CellstabTM | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+ | 2+ | |
43 | Alsevers | 4+ | 3+ | w+ | 4+ | 4+ | 2+ |
CellstabTM | 4+ | 4+/3+ | 0 | 4+ | 4+ | 1+ | |
50 | Alsevers | 4+ | 3+ | w+ | 4+ | 4+ | 2+ |
CellstabTM | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+ | 1+ | |
5 | Alse | 4+ | 3+/2+ | 4+ | 4+ |
7 | vers | ||||||
CellstabTM | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 3+ | w+ | |
63 | Alsevers | ||||||
CellstabTM | 4+/3+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 0 | |
71 | Alsevers | ||||||
CellstabTM | 4+/3+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 0 | |
86 | Alsevers | ||||||
CellstabTM | 4+/3+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 0 |
其中存在不足以进行测试的细胞,对此表示为空白。
表43.使用高浓度(1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL)Btri-sp-Ad-DOPE(VI)转化的RBCs的稳定性试验。通过人工试管血清学进行凝集。
天 | 细胞贮存溶液 | Albaclone抗-B | Bioclone抗-B | ||||
转化溶液的浓度(mg/mL) | |||||||
1 | 0.5 | 0.25 | 1 | 0.5 | 0.25 | ||
2 | Alsevers | 3+ | 3+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ |
CellstabTM | 3+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1+ | |
9 | Alsevers | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 3+ | 2+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
16 | Alsevers | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 2+ |
Cells | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ |
tabTM | |||||||
23 | Alsevers | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
30 | Alsevers | 3+ | 3+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ |
CellstabTM | 4+ | 3+ | 2+ | 3+° | 3+° | 2+ | |
37 | Alsevers | 3+ | 2+ | 1+ | 3+ | 2+ | 1+ |
CellstabTM | 3+ | 3+ | 2+/1+ | 4+° | 3+ | 1+ | |
44 | Alsevers | 4+ | 3+ | 1+ | 3+ | 3+ | w+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | n.d. | 4+ | 4+ | _ | |
51 | Alsevers | 3+ | 3+ | 2+ | 4+ | 3+ | 2+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | n.d. | 4+ | 4+ | 2+ |
缩略语: ° 干扰
表44.使用高浓度(1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL)Btri-p-Ad-DOPE(VI)转化的RBCs的稳定性试验。在Diamed凝胶-卡片上进行凝集。
天 | 细胞贮存溶液 | Albaclone抗-B | Bioclone抗-B | ||||
转化溶液的浓度(mg/mL) | |||||||
1 | 0.5 | 0.25 | 1 | 0.5 | 0.25 | ||
2 | Alsevers | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
9 | Alsevers | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
16 | Alsevers | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 1+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
23 | Alsevers | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
30 | Alsevers | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
37 | Alsevers | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
44 | Alsevers | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 3+ |
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 4+/3+ | |
5 | Alse | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 3+ |
1 | vers | ||||||
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
58 | Alsevers | 4+ | 1+ | 4+ | 2+ | ||
CellstabTM | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
72 | Alsevers | 4+ | 2+ | 4+ | 3+ | ||
CellstabTM | 4+ | 4+ | 3+/2+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
87 | Alsevers | ||||||
CellstabTM | 4+ | 4+/3+ | 1+ | 4+ | 4+/3+ | 2+/1+ | |
116 | Alsevers | ||||||
CellstabTM | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+/3+ | 1+ |
其中存在不足以进行测试的细胞,对此表示为空白。
实施例9—与H-抗原合成糖脂进行的红血球转化作用
表示为Htri-sp-Ad-DOPE(VII)、Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)和Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)的水溶性合成糖脂根据实施例1中所述方法与必要修正进行制备。
将经洗涤的封装鼠RBCs(3体积份)和合成糖脂溶液(1体积份,不同浓度)加入到微量离心管中。将该试管在37℃水浴中培养一小时,每15分钟进行一次混合。转化的RBCs用PBS洗涤3×,然后将其悬浮在适当浓度的CellstabTM中以进行血清学测试。
使用不同合成糖脂转化的RBCs的试管血清学和Diamed凝胶-卡片结果存在于表46中。结果表明,三糖(Htri)需要通过抗-HIgM,至少需要通过所用试剂进行检测。
表45.用于产生存在于表46中的结果的抗血清。
抗血清 | 制造商 | 批次 |
Anti-H IgM | Japanese Red Cross | HIRO-75 |
UEA | Lorne Laboratories | 11549E D.O.E.06.2004 |
Bio-UEA | EY Labs | 201105-2 |
表46.使用制成不同浓度的带有不同glycotopes的H-抗原合成糖脂的RBCs转化作用的对比
缩略语: n.d 未测定出
实施例10-Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)和Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)合成糖脂向鼠红血球的插入
表示为Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII)和Galβ-sp-Ad-DOPE(IX)的水溶性合成糖脂根据实施例1中所述方法与必要变形进行制备。
鼠RBCs在1×PBS中洗涤3×。将30μl封装的RBCs与30μlHdi-sp-Ad-DOPE(VIII)合并,并且将30μl封装的RBCs与30μlGalB-sp-Ad-DOPE(IX)合并。两种合成分子构造的浓度都为1.0mg/ml。将30μl1×PB S加入到30μl封装的RBCs,作为对照组。将细胞在37℃的振荡水浴中培养90分钟。RBCs在1×PBS中洗涤3×。
在室温下,将三组封装的RBCs与等体积量的选择素UEA-1一起培养30分钟。选择素在1×PBS中进行制备,浓度为0.1mg/ml。在Immunofuge中,将50μl3%的细胞悬浮液以低速旋转15秒钟。所得结果通过试管血清学进行读取。所得结果存在于表48中。结果表明,抗-H IgM和UEA-1都没有检测到二糖(Hdi)。
表47.用于产生列于表48中的结果的抗血清。
抗血清 | 制造商 | 批次 |
Biotest anti-H | Biotest AG | |
UEA | EY Labs | 201105-2 |
表48.使用Galβ-sp-Ad-DOPE或者Hdi-sp-Ad-DOPE转化的鼠RBCs,通过凝集作用进行评价。
细胞类型 | 插入分子 | UEA-1 | 鼠IgMH |
Murine RBC | Galβ(1mg/ml) | 0 | n.d. |
Murine RBC | Hdi(1mg/ml) | 0 | 0 |
Murine RBC | Control(PBS) | 0 | 0 |
Human RBC | Control(PBS) | 4+ | 3+ |
缩略语: n.d 未测定出
实施例11-敏感性对照的制备
本发明的合成糖脂可以用于制备如国际申请号PCT/NZ02/00214(WO03/034074)附属说明书中所述的“敏感性对照”(还称为“质量对照细胞”、“血清学对照”或者“工艺对照”)。本发明合成糖脂提供了RBCs的转化作用可以在低温下实现的优点。
RBC转化溶液
使用了两种母液:
溶液1:悬浮在CelpresolTM溶液中的1mg/mL Atri-sp-Ad-DOPE(I)。
溶液2:悬浮在CelpresolTM溶液中的5mg/mL Btri-sp-Ad-DOPE(VI)。
糖脂被制备成白色干燥粉末。如此形式的糖脂(将其装入控制温度下的密封容器中)可以无限期的稳定。为了配制转化溶液,将上述糖脂按重量计悬浮在溶液(例如CelpresolTM)中。
一旦转化溶液在CSL处得到接收,在无菌条件下对它们进行过滤(滤过MILLEX_-GV 0.22μ过滤装置)。
RBCs的处理
使用连续流动离心洗涤器在无菌条件下对RBC给体进行处理。在缓冲盐水中对RBC给体进行洗涤,随后在CelpresolTM溶液中对其进行洗涤。在Beckman Coulter AcT Diff分析器上对RBC给体的PCV进行测定。然后,在加入CelpresolTM的同时,将给体调节至50%的红细胞压积(PCV)。
转化RBCs从而提供“弱AB细胞”
在缓冲盐水和CelpresolTM中对RBCs进行洗涤。将细胞悬浮在CelpresolTM溶液中,以使PCV>50%。使用Beckman Coulter AcT Diff对红血球的PCV进行测定。对红血球溶液的质量进行称重。
The amount of用于转化的Atri-sp-Ad-DOPE(I)、Btri-sp-Ad-DOPE(VI)和CelpresolTM的量通过使用以下方程进行计算:
c=P-(1-P)-a-b
其中:
a=要加入到每1mL红细胞中的Atri-sp-Ad-DOPE(I)的量(mL)
b=要加入到每1mL红血球中的Btri-sp-Ad-DOPE(VI)的量(mL)
c=要加入到每1mL红血球中的CelpresolTM的量(mL),从而将细胞稀释至50%PCV
P=红细胞溶液的PCV
F=糖脂的最终期望浓度
S=糖脂储液的浓度
为了确定加入到红血球总试样中的糖脂和CelpresolTM的量,使红血球体积分别乘以a、b和c。将Atri-sp-Ad-DOPE(I)、Btri-sp-Ad-DOPE(VI)和CelpresolTM无菌加入到红血球总试样中。
在20℃下,在控温和恒定温和搅拌下,将样品培养3小时。在3小时时间结束时,将红血球无菌除去,并且对样品进行测试以确定RBCs的转化作用。使用试管、平铺和柱凝集技术(CAT)工艺对血型进行鉴定。
在2~8℃下,在控温下将红血球样品培养3小时,并进行恒定温和搅拌18小时。在3小时时间结束时,将红血球无菌除去,并且对样品进行测试以确定红血球的转化作用。使用试管、平铺和CAT方法对血型进行鉴定。
在使用CelpresolTM溶液的无菌条件下,使用连续流动离心法洗涤转化的红血球。测量经洗涤的红细胞的PCV,并且通过加入CelpresolTM溶液调节至50%PCV。
制剂和分配
将一定量的转化RBCs与一定量的模拟血浆稀释剂(SPD)无菌组合。所述血浆可以含有单克隆和多克隆抗体。根据期望的敏感性对照特性对抗体进行选择。所述血浆可以另外含有酒石黄和牛血清蛋白。
使用试管、平铺和CAT方法对全样进行血型鉴定和抗体屏蔽。然后,将转化的RBC-SPD混合物无菌地分配入BD Vacutainer试管中并且相应地对试管进行标记。
证实性测试
通过利用合成糖脂(在表51~53中表示为AwBw)形成的弱AB细胞用于与天然存在的弱A、弱B和弱AB细胞平行地证实大量试验平台。
表49.用于证实测试中的试剂和卡片
方法 | 试剂 | ||
试管 | Epiclone | ||
平铺 | Epiclone | ||
Ref | 制造商和类型 | 批次 | 有效期限 |
CAT1 | OCD BioVue ABD/Rev | ABR528A | 16.06.05 |
CAT2 | OCD BioVue ABD/Rev | ABR521A | 06.05.06 |
CAT3 | OCD BioVue ABD/ABD | ACC255A | 24.05.05 |
CAT4 | Diamed ID-MTS | 50092.10.02 | Apr-05 |
CAT5 | Diamed ID-MTS Donor typing | 51051.05.04 | Mar-05 |
CAT6 | Diamed ID-MTS Recipient typing | 50053.07.02 | Apr-05 |
CAT7 | Diamed ID-MTS Cord typing | 50961.08.03 | Jul-05 |
表50.证实测试的试验平台方法
平铺 | 1滴3%细胞,2滴试剂,在RT下在保湿室中15min@RT。 |
Tube | 2滴@RT,10min。 |
ID-MTS | 根据厂家说明书使用Dil-2。 |
BioVue | 根据厂家说明书使用0.8%RCD。 |
表51.所有方法对抗-A的证实结果
试验平台 |
细胞 | 类型 | Tube | Tile | CAT1 | CAT2 | CAT3 | CAT4 | CAT5 | CAT6 | CAT7 |
1 | Ax | w+ | 0 | 2+ | 1+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
2 | Ax | w+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
3 | A1B | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
4 | Ax | w+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
5 | A2B | 3+ | 3+ | 4+ | 3+ | 3+ | 1+ | 2+ | 3+ | |
6 | Ax | w+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
7 | Ax | 1+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
8 | Ax | w+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
9 | Ax | 0 | 0 | 1+ | 1+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
10 | Ax | w+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
11 | A3 | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 1+ | 1+ | 3+ | |
12 | A3B | 3+ | 3+ | 3+ | 3+ | 2+ | w+ | w+ | 2+ | |
13 | B3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
14 | B3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
15 | AwBw | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
表52.所有方法对抗-B的证实结果
细胞 | 类型 | 试验平台 | ||||||||
Tube | Tile | CAT1 | CAT2 | CAT3 | CAT4 | CAT5 | CAT6 | CAT7 | ||
1 | Ax | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
2 | Ax | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
3 | A1B | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 4+ |
4 | Ax | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
5 | A2B | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 4+ | |
6 | Ax | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
7 | Ax | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
8 | Ax | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
9 | Ax | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
10 | Ax | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
11 | A3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
12 | A3B | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
13 | B3 | 2+ | 2+ | 3+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ |
14 | B3 | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ | 2+ |
15 | AwBw | 3+ | 3+ | 1+ | 1+ | 1+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
表53.所有方法对抗-AB的证实结果
细胞 | 类型 | 试验平台 | ||||||||
Tube | Tile | CAT1 | CAT2 | CAT3 | CAT4 | CAT5 | CAT6 | CAT7 | ||
1 | Ax | 3+ | 2+ | 2+ | ||||||
2 | Ax | 4+ | 2+ | 3+ | ||||||
3 | A1B | 4+ | 4+ | 4+ | ||||||
4 | Ax | 3+ | 2+ | 3+ | ||||||
5 | A2B | 4+ | 4+ | 4+ | ||||||
6 | Ax | 4+ | 4+ | 3+ | ||||||
7 | Ax | 4+ | 4+ | 3+ | ||||||
8 | Ax | 3+ | 4+ | 3+ | ||||||
9 | Ax | 4+ | 2+ | 2+ | ||||||
10 | Ax | 3+ | 4+ | 3+ | ||||||
11 | A3 | 4+ | 4+ | 4+ | ||||||
12 | A3B | 4+ | 4+ | 4+ | ||||||
13 | B3 | 2+ | 2+ | 2+ | ||||||
14 | B3 | 2+ | 2+ | 2+ | ||||||
15 | AwBw | 3+ | 3+ | 3+ |
实施例12-修饰胚胎与转化子宫内膜细胞的连接
对在通过细胞类型而非RBCs表达的细胞表面抗原内实现定性和定量差异的能力进行研究。将能够增强胚胎与子宫内膜细胞粘结的选定为模型系统。
合成分子可以用作合成膜锚着点和/或合成分子构造。因此,它们还可以用于入国际专利申请号PCT/NZ2003/000059(公开为WO03/087346)中所述的增强胚胎植入的方法中,此申请在此引入作为参考。
·子宫内膜细胞转化作用
水溶性合成分子构造的插入
对子宫内膜上皮细胞的单细胞悬浮液进行制备。通过再悬浮在CMFHBSS中和在2000rpm下离心3分钟,将子宫内膜细胞洗涤3×。将经洗涤的细胞制剂再悬浮在50μlM2中。
准备各自含有50μl5M/ml子宫内膜细胞的溶液的微离心管。向分离的子宫内膜细胞试管中加入50μl合成糖脂Atri-sp-Ad-DOPE(I)或者Btri-sp-Ad-DOPE A(VI),或者将50合成μlM2加入到对照细胞中。在37℃下,在混合器上将细胞培养90分钟。通过再悬浮在CMF HBSS介质中和在2000rpm下离心3分钟,将子宫内膜细胞洗涤3×。将经洗涤的细胞制剂再悬浮在50μlM2中。
使用荧光探针进行的插入测试
将50μl相应的原生鼠单克隆抗体加入到各个试管中。在室温下将各个试管培养10分钟。在M2介质将细胞洗涤3×。将10μl鼠抗-IgG FITC加入到各个试管中。在黑暗环境中,将试管在室温下培养10分钟。将子宫内膜细胞载片到载玻片并且在荧光显微镜下对其进行观察。
直接凝集测试
将5μl各血型细胞放置在分离的显微镜载片上。向5μl各血型细胞中加入5μl相应的抗体。在载片上将各细胞温和地混合2分钟。在显微镜下对凝集作用进行观察。所得结果存在于表55中。
表54.用于产生列于表55中的结果的抗血清。
抗血清 | 制造商 | |
Bioclone抗-A | Ortho Diagnostics | 01102 D.O.M.16.05.02 |
Bioclone抗-B | Ortho Diagnostics | 试验性试剂 |
55.使用Atri-sp-Ad-DOPE(I)或者Btri-sp-Ad-DOPE A(VI)转化的子宫内膜细胞,通过荧光进行观察。
细胞类型 | 插入的抗原 | 1°抗体 | 培养后使用I9FITC探针得到的荧光评价 | 通过显微镜观察的凝集反应 |
子宫内膜细胞 | Atri-sp-Ad-DOPE(I)(1mg/ml) | 抗-A Bioclone | 4+ | 4+ |
子宫内膜细胞 | Btri-sp-Ad-DOPE(VI)(1mg/ml) | 抗-B Bioclone | 1+ | 3+ |
子宫内膜细胞 | 对照组(M2介质) | 抗-A Bioclone | 0 | 0 |
·胚胎修饰
水溶性合成分子构造的插入:
通过在37℃烘箱中,用0.5%链霉蛋白酶处理胚胎6分钟将胚胎透明带除去,或者直至所有的透明带都得到消除。Atri-sp-Ad-DOPE(I)orBtri-sp-Ad-DOPE(VI)通过将5μl浓度为1mg/mL的合成糖脂加入到45μl覆盖有矿物油的M2介质滴中,微滴得到制备。在37℃下,将所有的胚胎组在50μl上述微滴中培养1小时。试验和对照组的胚胎都用M2介质洗涤3×。
插入试验:
将试验和对照组胚胎都放入相应抗体微滴中,并且将其在37℃下培养30分钟。试验和对照组的胚胎都用M2介质洗涤3×。
将所有的试验和对照组胚胎都放入抗-鼠Ig FITC(抗-鼠Ig FITC在M2中1∶50的稀释液)微滴中并且将其在37℃下培养30分钟。试验和对照组的胚胎都用M2介质洗涤3×。将胚胎载片在显微镜载片的5μl M2滴中,所述M2滴用油覆盖。
在荧光显微镜下对载片进行观察。结果列于表56和57中。
Btri-sp-Ad-DOPE使用(VI)转化的否定结果是由于缺少11°抗体敏感性。
表56.利用荧光观察的Atri-sp-Ad-DOPE(I)转化的胚胎 | ||||
细胞类型 | 插入的抗原 | 1°抗体 | 培养后使用IgFITC探针得到的荧光评价 | 插入24小时后的胚胎形态 |
胚胎 | Atri-sp-Ad-DOPE(I) | 抗-A Bioclone | 2+/1+ | 可观察到 |
胚胎 | 对照 | 抗-A Bioclone | 0 | 可观察到 |
表57.使用Atri-sp-Ad-DOPE(I)或者Btri-sp-Ad-DOPE(VI)转化的胚胎,利用荧光进行观察。 | ||||
细胞类型 | 插入的抗原 | 1°抗体 | 培养后使用IgFITC探针得到的荧光评价 | 插入后24小时的胚胎形态 |
胚胎 | Atri-sp-Ad-DOPE(I) | 抗-A Bioclone | 2+ | n.d. |
胚胎 | Btri-sp-Ad-DOPE(VI) | 抗-B Bioclone | 0 | n.d. |
胚胎 | 对照组(M2介质) | 抗-A Bioclone | 0 | n.d. |
缩略语: n.d 未测定出
转化子宫内膜细胞与修饰胚胎的增强连接
修饰的(BioG-Avidin-BioIgGB和BioG-Avidin-BioIgMA)胚胎根据国际申请号PCT/NZ03/00059(公开为WO03/087346)附属说明书所述的方法进行制备。
准备两个凹面载玻片,其中一个具有两个合成糖脂Atri-sp-Ad-DOPE(I)插入子宫内膜细胞,另一个具有两个合成糖脂Btri-sp-Ad-DOPE(VI)插入子宫内膜细胞。
将两组胚各自胎转移到一个凹面载玻片上:
载玻片1 Atri/IgGB胚胎
Atri/IgMA胚胎
载玻片2 Btri/IgGB胚胎
Btri/IgMA胚胎
所述胚胎周围环绕有子宫内膜细胞。用矿物油对所述细胞进行覆盖并且在37℃下将其培养15分钟。用大开口把手移液管将各组胚胎小心地转移到新鲜的M2介质滴中。对所述胚胎进行温和洗涤。将所述胚胎温和地转移入标记的显微镜载片上的M2介质中。每滴都用矿物油进行覆盖。
在Olympus显微镜的焦点中心面下,对各组中粘附到胚胎上的子宫内膜细胞数目进行估定。对粘附到各个胚胎上的细胞数目进行记录。所得结果列于表58中。
表58.Endometrial cells transformed with使用Atri-sp-Ad-DOPE(I)或者Btri-sp-Ad-DOPE(VI)转化的子宫内膜细胞,和用BioG-Avidin-BioIgGB或者BioG-Avidin-BioIgMA修饰的胚胎。通过连接到胚胎上的子宫内膜细胞进行估定。 | |||
细胞类型 | 转化的子宫内膜细胞 | 修饰的胚胎 | 连接到修饰的胚胎上的子宫内膜细胞的平均数 |
子宫内膜细胞 | Atri-sp-Ad-DOPE(I) | BioG-Avidin-BioIgGB | 2.3 |
BioG-Avidin-BioIgMA | 7.25 | ||
子宫内膜细胞 | Btri-sp-Ad-DOPE(VI) | BioG-Avidin-BioIgGB | 6.7 |
BioG-Avidin-BioIgMA | 3.4 |
在上述说明书中,已经对已知等价物进行了整体或者部分参考,上述等价物在此作为单独阐述引入。
虽然本发明已经通过实施例和参考其可能的实施方案进行了描述,但是应当理解,可以对本发明进行改进和/或变形,这并不背离本发明的精神和范围。
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Claims (125)
1.用作合成膜锚着点或者用于制备合成分子构造的结构为R-S2-L的分子,其中:
R为化学活性官能团;
S2是将R连接至L的间隔基团;和
L是选自以下的脂质:二酰基-和二烷基-甘油脂,包括甘油基磷酸脂;和衍生于二酰基-和二烷基-脂肪的鞘氨醇,包括N-脂酰基鞘氨醇。
2.权利要求1的分子,其中R选自以下基团,包括:二(N-羟基琥珀酰亚胺基)、二(4-硝基苯基)、二(五氟苯基))))、二(五氯苯基)。
3.权利要求1或者2的分子,其中S2选自以下基团,包括:-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯(Ad))和-CO(CH2)5CO-。
4.权利要求1~3任一项的分子,其中R和S2为酯连接。
5.权利要求1~4任一项的分子,其中L为选自二酰基-和二烷基-甘油脂的脂质,其中二酰基-和二烷基-甘油脂包括甘油基磷酸脂。
6.根据权利要求5的分子,其中L选自:衍生于一种或多种反式-3-十六烯酸、顺式-5-十六烯酸、顺式-7-十六烯酸、顺式-9-十六碳烯酸、顺式-6-十八碳烯酸、顺式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、顺式-11-十八碳烯酸、顺式-11-二十烯酸或者顺式-13-docsenoic酸的二酰基甘油脂、磷脂酸酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和双磷脂酰甘油。
7.根据权利要求6的分子,其中所述脂质衍生于一种或多种顺式-不饱和脂肪酸。
8.根据权利要求7的分子,其中L选自:1,2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1,2-二油酰基甘油(DOG)。
10.根据权利要求9的分子,其中n为3。
13.根据权利要求1的分子,其中所述分子具有以下结构:
其表示为Ad-DSPE,并且其中M一般为H,但是它可以被其它一价阳离子替换,比如Na+、K+或者NH4 +。
14.一种结构为F-S1-S2-L的合成分子构造,其中:
F是选自碳水化合物、蛋白质、脂质、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素所构成组群的抗原;
S1-S2是将F连接至L的间隔基团;和
L是选自以下的脂质:二酰基-和二烷基-甘油脂,包括甘油基磷酸脂;和衍生于二酰基-和二烷基-脂肪的鞘氨醇,包括N-脂酰基鞘氨醇。
15.根据权利要求14的合成分子构造,其中所述合成分子构造具有水溶性。
16.根据权利要求14或者15的合成分子构造,其中当所述合成分子构造溶液与脂双层接触时,所述合成分子构造自发地掺入脂双层中。
17.根据权利要求16的合成分子构造,其中所述合成分子构造稳定地掺入脂双层中。
18.根据权利要求14~17任一项的合成分子构造,其中F、S1、S2和L共价连接。
19.根据权利要求14~18任一项的合成分子构造,其中F选自天然存在或者合成glycotopes、抗体(免疫球蛋白)、外源凝集素、抗生物素蛋白和生物素。
20.根据权利要求19的合成分子构造,其中F选自天然存在或者合成glycotopes或者抗体(免疫球蛋白)。
21.根据权利要求14~20任一项的合成分子构造,其中L为选自二酰基-和二烷基-甘油脂的脂质,其中二酰基-和二烷基-甘油脂包括甘油基磷酸脂。
22.根据权利要求21的合成分子构造,其中L选自:衍生于一种或多种反式-3-十六烯酸、顺式-5-十六烯酸、顺式-7-十六烯酸、顺式-9-十六碳烯酸、顺式-6-十八碳烯酸、顺式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、顺式-11-十八碳烯酸、顺式-11-二十烯酸或者顺式-13-docsenoic酸的二酰基甘油脂、磷脂酸酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和双磷脂酰甘油。
23.根据权利要求22的合成分子构造,其中所述脂质衍生于一种或多种顺式-不饱和脂肪酸。
24.根据权利要求23的合成分子构造,其中L选自:1,2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1,2-二油酰基甘油(DOG)。
25.根据权利要求14~24任一项的合成分子构造,其中L为甘油基磷酸脂和所述合成分子构造包括以下亚结构:
其中n=3~5,X为H或者C,和*不是H。
26.根据权利要求25的合成分子构造,其中n为3。
27.根据权利要求14~24任一项的合成分子构造,其中对S1-S2进行选择,从而提供水溶性合成分子构造。
28.根据权利要求14~27任一项的合成分子构造,其中F选自天然存在的或者合成的glycotope。
29.根据权利要求28的合成分子构造,其中F为由三个(三糖)或者更多个糖元组成的天然存在或者合成的glycotope。
30.根据权利要求28的合成分子构造,其中F为选自以下的glycotope:lacto-neo-tetraosyl、lactotetraosyl、lacto-nor-hexaosyl、lacto-iso-octaosyl、globoteraosyl、globo-neo-tetraosyl、globopentaosyl、gangliotetraosyl、gangliotriaosyl、gangliopentaosyl、isoglobotriaosyl、isoglobotetraosyl、mucotriaosyl和mucotetraosyl系列寡糖。
31.根据权利要求28的合成分子构造,其中F选自包括以下末端糖基的glycotopes:GalNAcα1-3(Fucα1-2)Ga1β;Galα1-3Galβ;Galβ;Galα1-3(Fucα1-2)Galβ;NeuAcα2-3Galβ;NeuAcα2-6Galβ;Fucα1-2Galβ;Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
32.根据权利要求14~31任一项的合成分子构造,其中当F为glycotope时,L为甘油基磷酸脂,和S2选自以下基团,包括:-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)、-CO(CH2)5CO-和-CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-。
33.根据权利要求14~32任一项的合成分子构造,其中S1为选自3-氨基丙基、4-氨基丁基或者5-氨基戊基的C3-5-氨基烷基。
34.根据权利要求33的合成分子构造,其中S1为3-氨基丙基。
35.根据权利要求14~27任一项的合成分子构造,其中F介导细胞-细胞相互作用或者细胞-表面相互作用。
36.根据权利要求35的合成分子构造,其中F为对表达在靶细胞或者表面上的组分具有亲和力的碳水化合物、蛋白质、脂质、外源凝集素、抗生物素蛋白或者生物素。
37.根据权利要求36的合成分子构造,其中F对表达在上皮细胞或者细胞外间质上的组分具有亲和力。
38.根据权利要求37的合成分子构造,其中F对表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分具有亲和力。
39.根据权利要求38的合成分子构造,其中表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分可以为天然表达的组分或者外源性掺入的组分。
40.根据权利要求14~27任一项的合成分子构造,其中F介导细胞-溶质相互作用。
41.根据权利要求40的合成分子构造,其中F为结合分子的配体,其中所述结合分子的存在用于诊断病理症状。
42.根据权利要求41的合成分子构造,其中F为抗体(免疫球蛋白)的配体。
47.根据权利要求14的合成分子构造,其中所述水溶性合成分子构造具有以下结构:
表示为Htri-sp-Ad-DOPE(VII),和M一般为H,但是它可以被其它一价阳离子替换,比如Na+、K+或者NH4 +。
49.根据权利要求14的合成分子构造,其中所述水溶性合成分子构造具有以下结构:
表示为Galβi-sp-Ad-DOPE(IX),和M一般为H,但是它可以被其它一价阳离子替换,比如Na+、K+或者NH4 +。
51.根据权利要求14的合成分子构造,其中所述水溶性合成分子构造具有以下结构:
表示为Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII),和M一般为H,但是它可以被其它一价阳离子替换,比如Na+、K+或者NH4 +。
52.一种制备结构为F-S1-S2-L的合成分子构造的方法,包括以下步骤:
-使活化剂(A)与脂质(L)反应,从而提供活化脂质(A-L);
-对抗原(F)进行衍生化,从而提供衍生化的抗原(F-S1);
和
-使A-L与F-S1进行缩合,从而提供所述构造;
其中:
A为选自以下的活化剂,包括:(C3~C7)碳二酸的二(N-羟基琥珀酰亚胺基)、二(4-硝基苯基)、二(五氟苯基)、二(五氯苯基)酯;
L是选自以下的脂质:二酰基-和二烷基-甘油脂,包括甘油基磷酸脂;和衍生于二酰基-和二烷基-脂肪的鞘氨醇,包括N-脂酰基鞘氨醇;
F是选自碳水化合物、蛋白质、脂质、外源凝集素、抗生物素蛋白所构成组群的抗原;和
S1-S2为将F连接至L的间隔基团,其中S1选自以下基团,包括:伯氨基烷基、仲脂族氨基烷基或者伯芳香胺;和S2不存在或者选自以下基团,包括:CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)和-CO(CH2)5CO-。
53.根据权利要求52的方法,其中所述合成分子构造具有水溶性。
54.根据权利要求51或者52的方法,其中当所述合成分子构造的溶液与脂双层接触时,所述合成分子构造自发地掺入脂双层中。
55.根据权利要求54的方法,其中所述合成分子构造稳定地掺入脂双层中。
56.根据权利要求52~55任一项的方法,其中F、S1、S2和L共价连接。
57.根据权利要求52~56任一项的方法,其中F选自天然存在或者合成的glycotopes、抗体(免疫球蛋白)、外源凝集素、抗生物素蛋白、和生物素。
58.根据权利要求57的方法,其中F选自天然存在或者合成的glycotopes或者抗体(免疫球蛋白)。
59.根据权利要求52~58任一项的方法,其中L为选自二酰基-和二烷基-甘油脂的脂质,其中二酰基-和二烷基-甘油脂包括甘油基磷酸脂。
60.根据权利要求59的方法,其中L选自:衍生于一种或多种反式-3-十六烯酸、顺式-5-十六烯酸、顺式-7-十六烯酸、顺式-9-十六碳烯酸、顺式-6-十八碳烯酸、顺式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、顺式-11-十八碳烯酸、顺式-11-二十烯酸或者顺式-13-docsenoic酸的二酰基甘油脂、磷脂酸酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和双磷脂酰甘油。
61.根据权利要求60的方法,其中所述脂质衍生于一种或多种顺式-不饱和脂肪酸。
62.根据权利要求61的方法,其中L选自:1,2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和rac-1,2-二油酰基甘油(DOG)。
63.根据权利要求52~62任一项的方法,其中L为甘油基磷酸脂和所述合成分子构造包括以下亚结构:
其中n=3~5,X为H或者C,和*不是H。
64.根据权利要求63的方法,其中所述n为3。
65.根据权利要求52~62任一项的方法,其中对A和S1进行选择,从而提供水溶性的合成分子构造。
66.根据权利要求52~65任一项的方法,其中F为天然存在或者合成的glycotope。
67.根据权利要求66的方法,其中F为由三个(三糖)或者更多个糖元组成的天然存在或者合成的glycotope。
68.根据权利要求66的方法,其中F为选自以下的glycotope:lacto-neo-tetraosyl、lactotetraosyl、lacto-nor-hexaosyl、lacto-iso-octaosyl、globoteraosyl、globo-neo-tetraosyl、globopentaosyl、gangliotetraosyl、gangliotriaosyl、gangliopentaosyl、isoglobotriaosyl、isoglobotetraosyl、mucotriaosyl和mucotetraosyl系列寡糖。
69.根据权利要求66的方法,其中F选自包括以下末端糖基的glycotopes:GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ;Galα1-3Galβ;Galβ;Galα1-3(Fucα1-2)Galβ;NeuAcα2-3Gaβ;NeuAcα2-6Gaβ;Fucα1-2Galβ;Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
70.根据权利要求52~69任一项的方法,其中当F为glycotope时,L为甘油基磷酸脂,和S2选自以下基团,包括:-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-(己二酸酯)、-CO(CH2)5CO-和-CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-。
71.根据权利要求52~70任一项的方法,其中S1为选自3-氨基丙基、4-氨基丁基或者5-氨基戊基的C3-5-氨基烷基。
72.根据权利要求71的方法,其中S1为3-氨基丙基。
73.根据权利要求52~65任一项的方法,其中F介导细胞-细胞相互作用或者细胞-表面相互作用。
74.根据权利要求73的方法,其中F为对表达在靶细胞或者表面上的组分具有亲和力的碳水化合物、蛋白质或脂质。
75.根据权利要求74的方法,其中F对表达在上皮细胞或者细胞外间质上的组分具有亲和力。
76.根据权利要求75的方法,其中F对表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分具有亲和力。
77.根据权利要求76的方法,其中表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分可以为天然表达的组分或者外源性掺入的组分。
78.根据权利要求52~65任一项的方法,其中F是介导细胞-溶质的合成分子构造。
79.根据权利要求78的方法,其中F为结合分子的配体,其中所述结合分子的存在用于诊断病理症状。
80.根据权利要求79的方法,其中F为抗体(免疫球蛋白)的配体。
83.根据权利要求52的方法,其中所述水溶性合成分子构造具有以下结构:
表示为Atri-sp-Ad-DSPE(III),和其中M一般为H,但是它可以被其它一价阳离子替换,比如Na+、K+或者NH4 +。
85.根据权利要求52的方法,其中所述水溶性合成分子构造具有以下结构:
表示为Htri-sp-Ad-DOPE(VII),和其中M一般为H,但是它可以被其它一价阳离子替换,比如Na+、K+或者NH4 +。
90.根据权利要求52~89任一项的方法制备的水溶性合成分子构造。
91.一种在细胞或者多细胞结构表达的表面抗原中实现定性和/或定量变化的方法,包括以下步骤:
-使细胞或者多细胞结构的悬浮液与根据权利要求14~51或者90任一项的水溶性合成分子构造在足以使细胞或者多细胞结构表达的表面抗原实现定性和/或定量变化的时间和温度下接触。
92.根据权利要求91的方法,其中所述细胞或者多细胞结构源于人类或者鼠。
93.根据权利要求91或者92的方法,其中所述水溶性合成分子构造在悬浮液中的浓度为0.1~10mg/mL。
94.根据权利要求91~93任一项的方法,其中所述细胞或者多细胞结构悬浮液在2~37℃的温度下与水溶性合成分子构造接触。
95.根据权利要求94的方法,其中所述细胞或者多细胞结构的悬浮液在2~25℃的温度下与所述水溶性合成分子构造溶液接触。
96.根据权利要求95的方法,其中所述细胞或者多细胞结构的悬浮液在2~4℃的温度下与所述水溶性合成分子构造溶液接触。
97.根据权利要求91~96任一项的方法,其中F选自包括以下末端糖基的glycotopes:GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ;Galα1-3Galβ;Galβ;Galα1-3(Fucα1-2)Galβ;NeuAcα2-3Galβ;NeuAcα2-6Galβ;Fucα1-2Galβ;Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Gaβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;NeuAcα2-3 Galβ1-4GlcNAcβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ;Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc;或者GalNAcβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc。
98.根据权利要求97的方法,其中F选自由寡糖GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ和Galα1-3(Fucα1-2)Galβ组成的glycotopes。
99.根据权利要求91或者96任一项的方法,其中所述合成分子构造选自以下,包括:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE (IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
100.根据权利要求91~99任一项的方法,其中所述细胞或者多细胞结构为胚胎。
101.根据权利要求100的方法,其中F为连接分子,其中该连接分子对表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分具有亲和力。
102.根据权利要求101的方法,其中表达在子宫内膜上皮细胞或者细胞外间质上的组分可以为天然表达的组分或者外源性掺入的组分。
103.根据权利要求91~99任一项的方法,其中所述细胞或者多细胞结构为红血球。
104.根据权利要求103的方法,其中F为结合分子的配体,其中所述结合分子的存在用于诊断病理症状。
105.根据权利要求104的方法,其中F为抗体(免疫球蛋白)的配体。
106.结合有根据权利要求14~51或者90任一项的水溶性合成分子构造的细胞或者多细胞结构。
107.根据权利要求106的细胞或者多细胞结构,其中所述细胞或者多细胞结构源于人类或者鼠。
108.根据权利要求106或者107的细胞或者多细胞结构,其中所述细胞或者多细胞结构为掺入水溶性合成分子构造的红血球,所述水溶性合成分子构造选自以下,包括:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
109.根据权利要求106或者107的细胞或者多细胞结构,其中所述细胞或者多细胞结构为掺入选自以下的水溶性合成分子构造的胚胎:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE (IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
110.一种试剂盒,包括根据权利要求1~13任一项的分子制剂,或者包括根据权利要求14~51或者90任一项的水溶性合成分子构造的干燥制品或者溶液。
111.根据权利要求110的试剂盒,其中根据权利要求1~13任一项的分子选自:Ad-DOPE;sp1-Ad-DOPE;和Ad-DSPE。
112.根据权利要求110的试剂盒,其中根据权利要求14~51或者90任一项的水溶性合成分子构造选自:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβi-sp-Ad-DOPE(IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
113.一种包括根据权利要求106~109任一项的细胞或者多细胞结构的悬浮溶液形式的混悬物的试剂盒。
114.根据权利要求113的试剂盒,其中所述悬浮溶液基本上不含脂质。
115.根据权利要求113或者114的试剂盒,其中所述细胞或者多细胞结构源于人类或者鼠。
116.根据权利要求113~115任一项的试剂盒,其中所述细胞为不天然表达A-或者B-抗原的红血球,并且所述细胞包含选自以下的水溶性合成分子构造:Atri-sp-Ad-DOPE(I);Atri-spsp1-Ad-DOPE(II);Atri-sp-Ad-DSPE(III);Btri-sp-Ad-DOPE(VI);Htri-sp-Ad-DOPE(VII);Hdi-sp-Ad-DOPE(VIII);Galβ1-sp-Ad-DOPE (IX);Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII);和Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII)。
117.根据权利要求116的试剂盒,其中所述悬浮溶液另外包含一种或多种抗体。
118.根据权利要求117的试剂盒,其中所述细胞为敏感性对照细胞。
119.一种药物制剂,包括根据权利要求14~51或者90任一项的水溶性合成分子构造的干燥制品或者溶液。
120.根据权利要求119的药物制剂,其中所述药物制剂为吸入给药的形式。
121.根据权利要求120的药物制剂,其中所述药物制剂为注射给药的形式。
122.一种药物制剂,其包括根据权利要求106~109任一项的细胞或者多细胞结构。
123.根据权利要求122的药物制剂,其中所述细胞或者多细胞结构源于人类或者鼠。
124.根据权利要求122或者123的药物制剂,其中所述药物制剂为吸入给药的形式。
125.根据权利要求122或者123的药物制剂,其中所述药物制剂为注射给药的形式。
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