CN1902326A - 用于癌症诊断和治疗的差异性表达的肿瘤特异性多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于癌症的诊断、预测和治疗的试剂和方法。具体地，本发明涉及使用编码跨膜超家族成员6(TM4SF6)、突触泡蛋白样蛋白(SYPL)、stomatin样2(STOML2)、Ras－相关的GTP结合蛋白(RAGA)、核苷酸敏感的氯离子通道1A(CLNS1A)、朊病毒蛋白(p27－30)(PRNP)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β2－样1(GNB2L1)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白4(GNG4)、整合膜蛋白2B(ITM2B)、整合膜蛋白1(ITM1)、跨膜9超家族成员2(TM9SF2)、鸦片受体样1蛋白(OPRL1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)、人肾小球上皮蛋白1(GLEPP1)、toll样受体3(TLR3)、和/或透明带糖蛋白3A(ZP3)的核酸和氨基酸序列用于早期和晚期非类固醇特异性癌诊断、癌症预后、以及用于筛选调节所述蛋白的基因表达和/或生物学活性的治疗剂。本发明进一步涉及设计的用于抑制所述蛋白的基因表达和/或生物学活性的生物技术，包括使用在这里所述的筛选试验中鉴定的试剂、反义多核苷酸序列的载体递送以及所述蛋白的靶向抗体。在具体实施方案中，蛋白是人来源的蛋白。

Description

用于癌症诊断和治疗的差异性表达的肿瘤特异性多肽
本发明涉及用于癌症的诊断、预后和治疗的试剂和方法。具体地，本发明涉及使用编码跨膜超家族成员6(TM4SF6)、突触泡蛋白样蛋白(SYPL)、stomatin样2(STOML2)、Ras-相关的GTP结合蛋白(RAGA)、核苷酸敏感的氯离子通道1A(CLNS1A)、朊病毒蛋白(p27-30)(PRNP)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β2-样1(GNB2L1)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白4(GNG4)、整合膜蛋白2B(ITM2B)、整合膜蛋白1(ITM1)、跨膜9超家族成员2(TM9SF2)、鸦片受体样1蛋白(OPRL1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)、人肾小球上皮蛋白1(GLEPP1)、toll样受体3(TLR3)、和/或透明带糖蛋白3A(ZP3)的核酸和氨基酸序列用于早期和晚期非类固醇特异性癌症的诊断、癌症预后、以及筛选调节所述蛋白的基因表达和/或生物学活性的治疗剂。本发明进一步涉及设计的用于抑制所述蛋白的基因表达和/或生物学活性的生物技术，包括使用这里所述的筛选试验中所鉴定的试剂、反义多核苷酸序列的载体递送以及所述蛋白的靶向抗体。在具体实施方案中，蛋白是人来源的蛋白。
发明背景
尽管改善了对某种类型非类固醇依赖性癌的治疗，但是在世界范围内癌症仍然是死亡的最主要原因。疾病的早期检测常常极大地提高了完全缓解的机会，因而使其成为关于适当的诊断和治疗工具研发研究的选择焦点区。全球的诊断公司在研发这种早期诊断工具中投入了它们的大量研究基金，主要集中在实体瘤形成前的癌症检测。此外，为了提供在肿瘤的外科手术治疗后监测患者中癌症任何踪迹(例如，以原发肿瘤的残余组织的形式或者由于转移所致的继发肿瘤的形式)的方法，这些公司也在研发用于术后检验的检测工具。后者使医师能够制订适当的治疗方案如化疗，以补充手术治疗。
为了检测患者中的癌症，必需在癌症部位内出现大量非类固醇癌细胞以便使医生作出有效的诊断。实际上，事实并非这样。在癌症部位的物理检查期间，如果可检测到的非类固醇依赖性癌细胞的数量太少则会限制检测。此外，如果癌症部位可能不易被直接的目测法发现，那么会使得医生没有办法作出清楚的诊断。在产生潜在的继发肿瘤的情况中，不可能预测肿瘤可能将在哪里发生，因而使得通过目测法检测继发肿瘤变得很困难。为了克服这些问题，已研发了基于在患有或将产生癌细胞的患者中检测癌症相关蛋白的灵敏性诊断试验，并且当前可以买到。这种诊断试验的实例包括鉴定人原发性肝癌的甲胎蛋白和畸胎瘤(IZOTOP，Hungary)、使用癌胚抗原检测胃肠癌(Abbot/Roche，Switzerland)、检测滋养层和胚细胞的绒毛膜促性腺激素(IZOTOP，Hungary；BioCheck Inc.，CA)以及用于检测前列腺癌的前列腺酸性磷酸酶或者前列腺特异性抗原。尽管正在使用这些标记检测各种癌症，但是这些标记的缺点是它们能检测晚期的而不是早期的癌症。
此外，许多可买到的检测仅能应用于非常窄范围的非类固醇依赖性癌，意味着这种检测常常不能检测其它类型的癌。此外，这些检测应用范围窄意味着为了这些诊断目的其可能必需对一个患者进行多次检验。多次检验是昂贵的，并且许多检测方法之一可能产生假阳性检验结果的风险很高。因此，需要一次诊断性检验，其不仅能检测到患者体内的少量癌细胞而且能检测各种非类固醇依赖性癌如胃肠癌中的这些癌细胞。
理想的标记将是标记物在各种转化细胞中遗传表达，以及特异性的并可普遍地应用于癌症检测的目的。另外，其应当是免疫原性的以允许产生抗体，其可用于诊断和治疗。理想标记的另一个期望特性是其位于转化细胞的质膜，这样至少多肽的一部分易受潜在的诊断或治疗性分子影响。
迄今为止，不存在有效的症状前的临床表征或表明对非类固醇依赖性癌敏感的生物标记，因此使得早期检测在疾病的医疗管理中变得高度优先。由于当前的治疗策略对癌症早期的治愈率高于晚期癌症的治愈率，因此通过早期检测可提高患者的生存率。为了这个原因，对早期致癌组织特异的分子标记的鉴定将有助于发生癌症的诊断以及预后的监控。此外，这种分子标记也可用于筛选分子或化合物文库，用于研发有效治疗剂的目的，当在癌症产生的早期施用时，该治疗剂将提供抗恶性疾病的有效治疗。
本发明通过提供用于非类固醇依赖性癌的诊断、预后和/或治疗的肿瘤特异性多核苷酸和多肽着手解决这些问题。此外，使用这些多肽和相应的多核苷酸序列筛选改变它们生物学活性和/或基因表达的试剂，用于鉴定和研发治疗非类固醇依赖性癌治疗剂的目的。本发明提供免疫原性膜蛋白突触泡蛋白样蛋白(SYPL)、stomatin样2(STOML2)、Ras-相关的GTP结合蛋白(RAGA)、核苷酸敏感的氯离子通道1A(CLNS1A)、朊病毒蛋白(p27-30)(PRNP)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β2-样1(GNB2L1)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白4(GNG4)、整合膜蛋白2B(ITM2B)、整合膜蛋白1(ITM1)、跨膜9超家族成员2(TM9SF2)、跨膜超家族成员6(TM4SF6)、鸦片受体样1蛋白(OPRL1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)、人肾小球上皮蛋白1(GLEPP1)、toll样受体3(TLR3)、和/或透明带糖蛋白3A(ZP3)、编码所述蛋白、衍生物和/或其片段的核苷酸(分别是X68194、AF190167、BC006433、X91788、M13667、BC000214、U31382、NM_021999、L38961、U81006、AF043906、U30185、AB011540、U20489、U88879、X56777)和氨基酸序列(分别是CAA48279、AAF091421、AAH06433、CAA62902、AAA19664、AAH00214、AAC50204、NP_068839、P46977、AAB38973、ACC64257、AAA84913、BAA32468、AAA82892、AAC34134)。
尽管不知道在象例如分化、细胞生长或凋亡的癌症相关过程中是否包括所述免疫原性膜蛋白，但是令人惊奇地发现它们在转化细胞的膜上高度表达。因此，所述免疫原性膜蛋白允许转化细胞的特异性鉴定和靶向。
发明概述
通常地，本发明涉及使用选自跨膜超家族成员6(TM4SF6)、突触泡蛋白样蛋白(SYPL)、stomatin样2(STOML2)、Ras-相关的GTP结合蛋白(RagA)、核苷酸敏感的氯离子通道1A(CLNS1A)、朊病毒蛋白(p27-30)(PRNP)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β2-样1(GNB2L1)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白4(GNG4)、整合膜蛋白2B(ITM2B)、整合膜蛋白1(ITM1)、跨膜9超家族成员2(TM9SF2)、鸦片受体样1蛋白(OPRL1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)、人肾小球上皮蛋白1(GLEPP1)、toll样受体3(TLR3)、和/或透明带糖蛋白3A(ZP3)的免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列、(分别是X68194、AF190167、BC006433、X91788、M13667、BC000214、U31382、NM_021999、L38961、U81006、AF043906、U30185、AB011540、U20489、U88879、X56777)基因、所编码蛋白的氨基酸序列(分别是CAA48279、AAF091421、AAH06433、CAA62902、AAA19664、AAH00214、AAC50204、NP_068839、P46977、AAB38973、ACC64257、AAA84913、BAA32468、AAA82892、AAC34134)、衍生物或其片段，用于非类固醇依赖性癌的诊断、预后和治疗。在具体实施方案中，特定的蛋白是人来源的蛋白。
本发明提供筛选治疗非类固醇依赖性癌的治疗剂的方法，其中非类固醇依赖性癌由至少一种选自M4SF6、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽的免疫原性膜蛋白和/或其片段的异常表达和/或生物活性改变所致。
具体地，本发明涉及一种筛选试验分子或化合物文库以鉴定至少一种特异性调节所述至少一种编码免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列表达的治疗性分子或化合物的方法，包括在允许特异性结合和/或相互作用的条件下，将在所述免疫原性膜基因的启动子控制下的报告分子构建体与试验分子或化合物，或者试验分子或化合物的文库接触，以及检测报告分子构建体的表达水平(也见表1)。相对于对照，表达水平的改变表明具有潜在的治疗活性。
表1.在发生肿瘤的组织上调的编码膜蛋白基因的列表
  蛋白名称   缩写   蛋白登记号Acc.number   核苷酸登记号Acc.number
  突触泡蛋白样蛋白stomatin-样2Ras相关的GTP结合蛋白核苷酸敏感的氯离子通道1A朊病毒蛋白(p27-30)鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β2-样1鸟嘌呤核苷酸结合蛋白4整合膜蛋白2B整合膜蛋白1跨膜9超家族成员2跨膜超家族成员6鸦片受体样1蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白4人肾小球上皮蛋白1toll样受体3透明带糖蛋白3A   SYPLSTOML2RAGACLNS1APRNPGNB2L1GNG4ITM2BITM1TM9SF2TM4SF6OPRL1LRP4GLEPP1TLR3ZP3   CAA48279AAF091421AAH06433CAA62902AAA19664AAH00214AAC50204NP_068839P46977AAB38973ACC64257AAA84913BAA32468AAA82892AAC34134CAA40095   X68194AF190167AAH06433X91788M13667BC000214U31382NM_021999L38961U81006AF043906U30185AB011540U20489U88879X56777
本发明也涉及筛选试验分子或化合物的文库，鉴定至少一种特异性结合和/或与所述至少一种免疫原性膜蛋白(也见表1)相互作用的治疗性分子或化合物的方法，包括在允许特异性结合和/或相互作用的条件下，将所述至少一种免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段与试验分子或化合物，或者试验分子或化合物的文库接触，以及检测特异性结合和/或相互作用的水平。相对于对照，结合和/或相互作用水平的改变表明具有潜在的治疗活性。
分子或化合物的文库优选地选自DNA和/或RNA分子、肽、激动剂、拮抗剂、抗体，优选单克隆抗体、免疫球蛋白、小分子以及药物试剂。
也提供用于治疗在哺乳动物，优选人受试者中，由于所述至少一种免疫原性膜多肽的异常表达和/或生物活性所致的非类固醇依赖性癌的方法：包括提供一种包括经鉴定结合和/或与所述至少一种免疫原性膜蛋白相互作用或者调整特定蛋白表达水平(mRNA水平)的治疗剂的组合物，以及向哺乳动物受试者施用治疗有效量的所述组合物。该组合物可进一步含有药学可接受的载体。
本发明提供一种可供选择的方法，用于治疗由于编码所述至少一种免疫原性膜多肽的多核苷酸序列的异常表达所致的非类固醇依赖性癌，包括向人受试者施用治疗有效量的与编码所述至少一种免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列互补的反义多核苷酸序列。
可选择地，本发明所提供的治疗由于所述至少一种免疫原性膜多肽的异常生物活性所致的非类固醇依赖性癌的方法包括，向人受试者施用治疗有效量的对所述至少一种免疫原性膜多肽或其片段特异的抗体。
本发明的另一方面是调节靶细胞的增殖、分化和/或细胞迁移的方法，包括向所述靶细胞施用在本发明筛选方法中鉴定的试验分子或化合物。优选地，所述靶细胞是肿瘤细胞。
本发明的一个实施方案提供一种测定受试者是否有产生由所述至少一种免疫原性膜多肽的异常表达和/或生物活性所致的非类固醇依赖性癌的风险或者患该病的方法，包括测量受试者的细胞样品中编码所述至少一种免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列水平和/或所述蛋白本身水平的方法。在同一实施方案中，本发明提供一种试剂盒，带有基于上述方法如何使用该试剂盒的说明。
附图描述
图1.发现在结肠癌中上调的基因的热图(heat map)。
横行是点在所用cDNA微阵列上的单个序列，纵列是单个样品。基质中的每个正方形代表单个序列的表达水平。在微阵列上可用一个以上序列表示单个基因。在所述15个实验内所示基因至少30％上调1.5倍以上。染成红色的正方形表示所述基因在相应的实验中上调，而绿色则表示下调。黑色表示在所示实验中没有调整或者没有所述序列的数据。基因鸟嘌呤核苷酸结合蛋白γ4、整合膜蛋白1、朊病毒蛋白(p27-30)、Stomatin样2和突触泡蛋白样蛋白在所用cDNA微阵列上用两个点表示，因此这些基因显示两组数据。
图2：通过TM4SF6的Q-PCR诊断结肠直肠癌
用随机六聚体一式三份逆转录配对的非肿瘤(蓝色)和肿瘤(红色)样品的总RNA，然后使用TM4SF6特异性引物通过实时定量PCR扩增。使用Applied Biosystems′ABI PRISM 7000序列检测系统和SybrGreen作为荧光染料，进行扩增和检测。在每个样品中将TM4SF6的表达对18S rRNA进行标准化。最后，计算每个肿瘤对在相应非肿瘤组织中表达的表达倍数(顶部)。为了比较，显示对应的微阵列结果(底部)。
图3：用两种不同siRNAs对TM4SF6的有效敲除
细胞用50nM(DLD1和HelaS3)或25nM(SW480)所示的siRNAs转染两次或三次并在第一次脂质转染后4天收获。提取RNA并使用特异性引物进行定量PCR(Q-PCR)。使用18S或肌动蛋白进行标准化。每个柱是至少两份Q-PCR反应的均值。
图4：纯化流分的SDS-PAGE
根据在实施例5中所描述的方法克隆并纯化TM4SF6的EC2环。流分通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凝胶用染色考马斯蓝染色。泳道1：第一次电泳的流分2，泳道2：第一次电泳的流分3，泳道3：第二次电泳的流分3，泳道4：来源S流分28，泳道5：分子量标准(从底部到顶部的大小：10、15、25、35、45、55、70、100、130、180kDa)。
图5：使用TM4SF6抗体的免疫组化。
使用实施例6中所描述的方法进行免疫组化。TM4SF6抗体清楚地区分正常的结肠组织(图5B，左上)和形成肿瘤的结肠细胞(图5B，右下)。正常组织显示不染色，而癌细胞是阳性的。该染色在不同患者的结肠癌样品中也是明显的(图5B)。也在黑素瘤细胞中观察到TM4SF6的表达(图5C)。
发明详述
应当理解的是本发明不限于所描述的具体的材料和方法或者装置，由于这些都可能变化。也应当理解的是这里所使用的术语仅是用于描述具体实施方案的目的，并不用于限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求限定。
也应当注意到如这里和在所附权利要求中使用的，单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数参考，除非上下文清楚地要求其它含义。因此，例如，当提及“宿主细胞”时包括许多这种宿主细胞，当提及“抗体”时是指本领域技术人员已知的一个或多个抗体及其衍生物等。
除非有其它定义，这里所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管可使用与这里所具体描述的那些类似的任何材料和方法，或者装置去实践或检验本发明，但是下面描述优选的装置、材料和方法。引用这里所提到的所有出版物是为了描述的是和公开在出版物中所报道的细胞系、方案、试剂和载体的目的，其可连同本发明一起使用。这些文献均不对本发明因优于现有技术而应被授权造成影响。
定义
术语“衍生物”指多肽序列、多核苷酸序列或反义多核苷酸序列的修饰物。多肽通过化学方法修饰，并保留根据本发明的免疫原性膜蛋白(见表1)的生物学活性。此外，这种修饰可能也导致特定多肽生物学活性的抑制。多肽的衍生物与编码所述免疫原性膜蛋白(见表1)的氨基酸序列至少60％相同或相似。优选的衍生物与编码根据本发明的免疫原性膜蛋白(见表1)的氨基酸序列至少65％、70％，甚至更优选地至少80％、85％、90％、95％或98％相同或相似。
在具体优选的实施方案中，根据本发明使用整个氨基酸序列与所述免疫原性膜蛋白(见表1)的氨基酸序列至少65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％同源、相似或相同的衍生物。
在“衍生物”的定义下也包括由于一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而不同的经过修饰的多核苷酸序列，如等位变体；因此也将包括由于遗传密码的简并性而与编码SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽(见表1)的多核苷酸序列不同的序列。
可以理解地，可能在特定多肽的几个位点中以相同或不同程度存在相同类型的修饰。而且，特定多肽可包括许多类型的修饰。修饰可发生在多肽的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。修饰包括，例如，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、形成二硫键、脱甲基、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、γ羧基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧基化、羟基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的向蛋白添加氨基酸、如精氨酰基化以及遍在蛋白化。见，例如，PROTEINS--STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freemanand Company，New York(1993)和Wold，F.，Posttranslational ProteinModifications：Perspectives and Prospects，pgs.1-12 inPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS，B.C.Johnson编，Academic Press，New York(1983)；多肽可以是分支的或者环形的，有或没有分支。环形的、分支的和分支的环形多肽可能是由于翻译后的自然加工所致，也可能是通过完全合成的方法制备的。
衍生物也指多肽或其片段与赋予另外属性的化学基团或分子，例如PEG、荧光基团、放射基团、发光或发磷光的基团的偶联物，与酶、标签、碳水化合物侧链等的偶联物。
术语“片段”指包括至少5个连续氨基酸残基的多肽序列的一部分，优选地保留根据本发明的免疫原性膜蛋白的生物学活性，或者指那些多核苷酸序列，当其被翻译时产生保留所述膜蛋白的某些功能特性，例如抗原性或者结构域特征的多肽。
术语“生物学活性”可与术语“生物学上的活性”、“生物活性”、“活性”交替使用，相应于本发明的目的，意思是由根据本发明的免疫原性膜蛋白(无论以其天然的还是变性的构象)、衍生物或其片段直接地或间接地执行的免疫原性/抗原性或效应物功能。效应物的功能包括磷酸化作用(激酶活性)或其它分子的活化、分化的诱导、有丝分裂或生长促进活性、信号转导、免疫调节、DNA调控功能等，无论是目前已知的还是固有的。抗原性功能包括具有能与抗体交叉反应，引起抗天然存在的或变性的根据本发明的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段的表位或抗原位点。因此，这种蛋白的生物学活性可能是其作为靶细胞的信号途径中的衔接蛋白起作用。例如，这种信号途径可调节这种细胞的细胞分化、增殖和/或迁移。根据本发明的靶细胞可以是上皮细胞或癌细胞。
短语“核苷酸序列”、“寡核苷酸序列”或“多核苷酸序列”指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。这些短语也指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的并且可代表有义或反义链，指肽多核苷酸序列(PNA)，或者指任何DNA样或RNA样材料。
公知地，在个体的基因组内特定多肽的基因可能以单拷贝或多拷贝存在。这种重复基因可能是相同的或者可能具有某种修饰，包括核苷酸取代、添加或缺失，所有这些仍然编码基本上具有相同生物学活性的多肽。短语“编码根据本发明的免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列”可能因此指特定个体内的一个或多个基因。此外，在个体生物体之间核苷酸序列上可能存某种差异，这被称作等位基因。这种等位基因差异可能或者可能不导致所编码多肽的氨基酸序列的差异，而仍然编码具有相同生物学活性的蛋白。
术语“非类固醇依赖性癌”指由上皮细胞来源所引起的癌症，可包括，但不限于，乳腺癌、肺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、皮肤癌，特别是黑素瘤和/或其它癌。在本发明的上下文内，癌症可能是处于不同阶段的癌，例如癌前期的、早期的和/或晚期癌症。癌症也可能是处于分级中不同程度的癌症，其中分级指癌症进展的组织学分化的程度。癌症分期和分级的准则对于本领域技术人员来说是已知的，并且描述于美国癌症联合委员会的“癌症分期手册”中。也包括在本发明的上下文中，上皮癌可以指上皮来源的瘤。
术语“胃肠癌”指与特定受试者的胃肠道有关的癌症状态。在本发明的上下文中，胃肠癌包括，但不限于食管癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌以及胆道癌。在本发明的上下文内，胃肠癌可能处于不同阶段以及分级的不同程度(见美国癌症联合委员会的“癌症分期手册”)。
术语“瘤”可与短语“上皮的急性和慢性炎症”交替使用并且指任何新的和异常的生长，特别是组织的新生长，其中该生长不受控制并且进行性生长。
术语“生物样品”和“试验样品”指从任何特定受试者中分离的所有生物液、排泄物、组织和细胞。在本发明的上下文中，这种样品包括，但不限于，血液、血清、血浆、乳头抽吸物、尿液、精液、精液、精浆、前列腺液、排泄物、眼泪、唾液、汗液、活检、腹水、脑脊液、乳汁、淋巴或组织提取物样品。
这里所使用的短语“试验分子或化合物的文库”包括含有DNA分子、肽、激动剂、拮抗剂、单克隆抗体、免疫球蛋白和/或药剂的文库。这些可能包括新的或已经已知的分子或化合物。此外，这里所使用的术语“单克隆抗体”和“免疫球蛋白”包括片段或其衍生物。
“细胞”、“宿主细胞”、“靶细胞”或“重组宿主细胞”在这里是可交替使用的术语，指已转化的或转染的细胞，或者能够通过外源多核苷酸序列转化或转染。应当理解的是这些术语不仅指特定的受试者细胞，而且也指这种细胞的后代或潜在的后代。因为由于突变或环境影响，可能在随后的子代中发生某些修饰，因此这种后代实际上可能不与亲代细胞完全相同，但是仍然包含在这里所用术语的范围内。
“递送复合物”意思是靶向的方法(例如，导致反义多核苷酸序列、蛋白、多肽或者肽与靶细胞表面具有更高结合亲和力和/或增加靶细胞的细胞摄入的分子)。靶向方法的实例包括：固醇(例如，胆固醇)、脂质(例如，阳离子脂质、病毒体或脂质体)、病毒(例如，腺病毒、腺伴随病毒或逆转录病毒)。优选的复合物是在体内足够稳定以避免在被靶细胞内化前显著解偶联。然而，该复合物在细胞内在适当的条件下可被裂解，这样多核苷酸、蛋白、多肽或肽可以以有功能的形式被释放。
这里术语“报告分子构建体”包括与其它序列符合读框连接的靶基因，以提供其产物很容易测定的编码单元。报告基因的实例包括，但不限于，β半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Ds-红荧光蛋白、远红荧光蛋白(Hc-红)、分泌的碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、新霉素等。
“反义多核苷酸序列”指由至少约10个核苷酸构成的反义分子或抗基因剂。在某些实施方案中，反义多核苷酸序列由至少5、18、20、25、30、35、40或50个核苷酸构成。反义多核苷酸序列与mRNA的5′非翻译(UTR)区(直到并包括AUG翻译起始密码子)、3′UTR或者特定多核苷酸的非编码区互补。反义多核苷酸序列与编码特定多肽的多核苷酸序列的结合在表达所述mRNA的宿主细胞中有效改变所述mRNA的转录或翻译。在本发明的上下文内，反义多核苷酸序列可以是线性的、环形的或者形成三螺旋并且与编码根据本发明的免疫原性膜蛋白(见表1)的多核苷酸序列互补。此外，反义多核苷酸序列可以是单链或双链核酸(例如，吗啉、PNAs或RNAi)以及包括：a)至少一个选自下述的修饰的碱基部分，即：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mainnosylqueosine、5′-甲氧基羟甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2，6-二氨基嘌呤；和/或至少一个修饰的糖部分，所述修饰的糖部分选自包括但不限于，阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖，或者缺乏戊糖部分和/或至少一个选自下述的修饰的磷酸主链，即：硫代磷酸酯(phosphorothioate)、硫代氨基磷酰胺酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酰胺酸酯(phosphoamidate)、二氨基磷酸酰胺酯(phosphodiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯、formacetal或其类似物，以及α-DNA、2′-O-甲基RNA、吗啉主链、通过肽键连接的重复的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元(肽核酸；PNAs)或者锁定核酸(LNAs)。作为一种可选择的方法，本发明中也包括使用RNA干扰(RNAi)抑制已知功能的特定蛋白的表达。使用由核糖核酸酶III裂解更长dsRNAs所产生的小干扰RNAs(siRNAs)封闭翻译，优选地siRNAs长度在20-25个核苷酸之间。此外，本发明也包括使用RNA Lassos抑制已知功能的特定蛋白的翻译。
在一个实施方案中，术语“拮抗剂”指当结合根据本发明的免疫原性膜蛋白时，降低这种多肽的生物学活性的分子或化合物。这种拮抗剂可能与蛋白的配体结合区相互作用，因而避免配体诱导的蛋白活化。拮抗剂也可以通过在空间上阻碍关键的蛋白-蛋白相互作用位点，例如，二聚化区、支架区，抑制上述蛋白中的任何一种与其它分子之间的相互作用。此外，拮抗剂可以通过与特定多核苷酸的调控区相互作用，降低和/或抑制编码所述免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列的表达。可选择地，拮抗剂可以是抑制或降低位于SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3蛋白下游蛋白的表达或生物学活性，或者与所述蛋白相互作用的分子或化合物。拮抗剂也可以是降低上述蛋白中任何一种的生物学或免疫学活性效应的量或持续时间的分子或化合物。拮抗剂可包括蛋白、多核苷酸序列、碳水化合物、抗体或其片段，或者任何发挥这些效应的其它分子。
术语“肿瘤细胞”或“肿瘤组织”分别指经历显著细胞改变(转化)的细胞或组织。这种细胞改变显示为通过从特异性对照机制中逃脱、生长潜能增加、细胞表面改变、核型异常、形态学和生物化学偏离正常以及赋予能侵入、转移和杀伤的其它属性。
术语“抗体”指基本上由免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其结合并识别特异性抗原。例如，抗体作为完整的免疫球蛋白或者作为由肽酶消化产生的许多充分表征的片段存在。在本发明的上下文内包括通过修饰整个抗体或使用重组DNA方法合成所产生的抗体片段。在蛋白和其它生物活性分子的异种群内，抗体将在适当的结合条件下与其特异性抗原或其片段相互作用。在本发明的上下文中，在本发明范围内所用的抗体优选地结合SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3蛋白。也包括抗体偶联物，其中将抗体或其片段结合赋予抗体另外性质的化学基团或分子。
筛选疗法
本发明提供筛选治疗以至少一种免疫原性膜蛋白的异常表达和/或生物学活性为特征的非类固醇依赖性癌的治疗剂的方法，其中该免疫原性膜蛋白选自SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、或ZP3多肽和/其片段。
该方法鉴定候选物、试验分子或化合物，或者试剂(例如，肽、肽模拟物、小分子或其它药物)，其降低和/或抑制多肽、衍生物或其片段的生物学活性，或者具有抑制效应，例如抑制编码所述多肽的多核苷酸序列的表达。
在多核苷酸水平上，这种方法包括例如：
a.在允许特异性结合和/或相互作用的条件下，使在所述免疫原性膜蛋白启动子控制下的报告分子构建体与试验分子或化合物，或者试验分子或化合物的文库接触；和
b.检测报告分子构建体的表达水平，其中相对于对照，表达水平的改变表明具有潜在的治疗活性。
通常基因的启动子位于起始密码子的上游并且很容易使用公知的算法，如那些在网上由欧洲生物信息学协会提供的算法进行鉴定。
可通过现有技术中的已知方法测量表达水平，例如，放射性或其它标签的掺入、如果报告分子是酶的酶促活性或者定量PCR。已知的报告分子包括例如，β半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Ds-红荧光蛋白、远红荧光蛋白(Hc-红)、分泌的碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、新霉素等。
在蛋白水平上，这种方法例如包括：
a.在允许特异性结合和/或相互作用的条件下，将所述的至少一种免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段与试验分子或化合物、或者试验分子或化合物的文库接触；和
b.检测特异性结合和/或相互作用的水平，其中相对于对照，相互作用水平的改变表明具有潜在的治疗活性。
在一个实施方案中，多肽具有至少一种本发明的免疫原性膜蛋白的生物学活性。可通过各种方法鉴定能直接或间接与这种多肽、衍生物或其片段相互作用的蛋白或肽。例如，可使用基于各种结合试验的方法鉴定这种分子(见参考文献：酵母双杂交Bemis等(1995)MethodsCell Biol.46，139-151，Fields和Sternglanz(1994)Trends Genet.10，286-292，Topcu和Borden(2000)Pharm.Res.17，1049-1055；酵母三杂交：Zhang等(1999)Methods Enzymol.306，93-113；GST降低如在Palmer等(1998)EMBO J.17，5037-5047；以及噬菌体展示如在Scott and Smith(1990)Science 249，386-390)。
在优选的实施方案中，TM4SF6、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或者ZP3多肽的生物学活性是调节特异性靶细胞，例如上皮细胞或癌细胞的细胞分化、增殖和/或迁移。
在一个实施方案中，本发明提供筛选能结合、相互作用或者调节所述至少一种免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段的生物活性形式的试验分子或化合物的试验。可使用现有技术中已知的多种组合文库方法中的任何一种获得根据本发明的试验化合物，所述文库包括：生物文库、恰当可寻址的平行固相或液相文库、需要去褶合的合成文库法、“一珠一化合物”文库法以及使用亲和层析选择的合成文库法。生物文库方法限于肽文库，而其它四种方法可用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库(Bindseil等(2001)Drug Discov.Today 6，840-847；Grabley等(2000)Ernst Schering Res.Found.Workshop.pp.217-252；Houghten等(2000)Drug Discov.Today 5，276-285；Rader，C.(2001)Drug Discov.Today 6，36-43)。
可在现有技术中发现分子文库合成方法的实例，例如参见：DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6909-6913；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，11422-11426；Gallop等(1994)J.Med.Chem.37，1233-1251；Gordon等(1994)J.Med.Chem.37，1385-1401。
化合物文库可呈现在溶液中(例如，Houghten(1992)Biotechniques13，412-421)、或在珠(Lam等(1991)Nature 354，82-84)、芯片(Fodor等(1993)Nature 364，555-556)、细菌(1993年6月公开的美国专利No.5,223,409)、孢子[美国专利Nos.5,571,698(在1996年11月公开)；5,403,484(在1995年4月公开)；以及5,223,409(在1993年6月公开)]、质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，1865-1869)或者噬菌体(Scott和Smith(1990)Science.249，386-390；Devlin等(1990)Science.249，404-406；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6378-6382；Felici等(1991)J.Mol.Biol.222，301-310)上。
在优选的实施方案中，试验分子或化合物的文库选自DNA和/或RNA分子、肽、激动剂、拮抗剂、单克隆抗体、免疫球蛋白、小分子药物、药物试剂、和片段和/或它们的组合。
根据本发明，在本发明方法中鉴定的试验分子或化合物优选地证明能抑制本发明的至少一种免疫原性膜蛋白的基因表达和/或生物学活性。
在一个实施方案中，试验是基于细胞的试验，其中细胞表达有生物学活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段。将所表达的多肽与试验分子或化合物接触，测定试验分子或化合物结合或与多肽相互作用的能力。该细胞例如，可以是真核细胞，例如但不限于酵母细胞、无脊椎动物细胞(例如，线虫(C.Elegan))、昆虫细胞、硬骨鱼细胞、两栖动物细胞或者哺乳动物来源的细胞。测定试验分子或化合物结合或与多肽相互作用的能力可通过，例如，将试验分子或化合物与放射性同位素(例如，125I、35S、14C或3H)或者酶促(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶)标签偶联，这样可通过检测复合物中的标记分子或化合物测定试验分子或化合物与生物活性多肽、衍生物或其片段的结合或相互作用。标记和检测试验分子或化合物与膜结合的或膜相关蛋白相互作用的方法是本领域技术人员公知的。
在优选的实施方案中，该试验包括将表达本发明的有生物学活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段的细胞与结合或与所述免疫原性膜蛋白相互作用的已知分子或化合物接触以形成试验混合物，将该试验混合物与试验分子或化合物接触，以及测定试验分子或化合物结合、或与特定多肽相互作用的能力，其中测定试验分子或化合物结合、或与特定多肽相互作用的能力与对照进行比较。试验分子或化合物结合、或与本发明的特定免疫原性膜蛋白相互作用能力的测定是基于试验分子或化合物和已知的靶分子或化合物对特定多肽的竞争性结合/抑制动力学。检测两个分子对同一靶的竞争性结合，或者相互作用的方法是本领域技术人员公知的。
在另一个实施方案中，该试验是基于细胞的试验，包括将表达本发明的有生物学活性的膜蛋白、衍生物或其片段的细胞与试验分子或化合物接触，以及测定试验分子或化合物抑制特定多肽的生物学活性的能力。这可以通过例如，测定所述膜蛋白是否继续结合或与已知的靶分子相互作用、或者是否已经取消特异性细胞功能(例如离子通道)来完成。例如，靶分子可以是便于细胞外信号转导的信号转导途径中的元件、具有催化活性的第二细胞间蛋白、调控特定基因转录的蛋白、或者启动蛋白翻译的蛋白。测定有生物学活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段结合或与靶分子相互作用的能力，可通过测定靶分子的活性来完成。例如，可通过检测靶的细胞第二信使[例如，细胞内的Ca2+、二酰甘油和肌醇三磷酸IP3)]的诱导、检测靶对适当底物的催化/酶促活性、检测与编码可检测标记的多核苷酸可操作地连接的报告基因的诱导(通过可能对特定多肽反应的调节元件)，例如，β-半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Ds-红色荧光蛋白、远红荧光蛋白(Hc-红)、分泌的碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、新霉素等，或者检测细胞反应，例如，细胞分化、增殖或迁移，测定靶分子的活性。
在另一个实施方案中，本发明的试验是无细胞试验，包括将本发明的具有生物学活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段与试验分子或化合物接触，以及测定试验分子或化合物与所述多肽中的任何一种结合或相互作用的能力。如上所述可直接地或间接地测定试验分子或化合物与特定多肽的结合或相互作用。在优选的实施方案中，该试验包括将所述多肽中的任何一种与已知与特定的免疫原性膜蛋白结合或相互作用的靶分子或化合物接触，以形成试验混合物。将该试验混合物与试验分子或化合物接触，试验分子或化合物与该多肽相互作用能力的测定是基于试验分子或化合物和已知分子或化合物对所述多肽的竞争性结合/抑制动力学。检测两个分子对同一靶的竞争性结合或相互作用的方法是本领域人员公知的，其中该靶是免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段。
在另一个实施方案中，试验是无细胞试验，包括将所述有生物学活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段与试验分子或化合物接触，以及测定试验分子或化合物抑制所述多肽活性的能力。可通过例如，通过上述测定直接结合方法中的任何一种测定多肽结合靶分子的能力，测定试验分子或化合物抑制特定多肽活性的能力。在可选择的实施方案中，可通过测定所述多肽进一步调节靶分子的能力，测定试验分子或化合物调节所述多肽活性的能力。
在本发明的上述试验方法的实施方案中，可期望固定本发明的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段，或者其靶分子以便于从蛋白的一种或两种非复合型中分离复合型的，以及适应试验的自动化。可在适于含有反应物的任何容器中完成试验分子或化合物与所述免疫原性膜蛋白的结合、或者在存在和缺乏候选化合物时特定免疫原性膜蛋白与靶分子的相互作用。这种容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可提供融合蛋白，其添加了允许蛋白中的一种或两者结合到基质上的区域。例如，可将谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白吸附到谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(Sigma Chemical；St.Louis，MO)或者谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后将试验分子或化合物和未吸附的靶蛋白或生物活性免疫膜蛋白、衍生物或其片段结合。然后将该混合物在有助于形成复合物的条件下孵育(例如，在盐和pH的生理条件)。孵育后，洗涤珠或微量滴定板孔以除去任何未结合的成分，直接地或间接地测量复合物形成，例如，根据上所述方法。可选择地，可将复合物从基质中分离，可使用标准技术测定所述多肽的结合或活性的水平。
也可在本发明的筛选试验中使用将蛋白固定在基质上的其它技术。例如，可利用生物素和链霉抗生物素的偶联固定本发明的有生物学活性的免疫膜蛋白、衍生物或其片段，或者其靶分子。
在另一个实施方案中，在下述方法中鉴定所述免疫原性膜蛋白表达的抑制剂，该方法中将细胞与候选分子或化合物接触以及测定细胞内选定mRNA或蛋白[即，mRNA，或多核苷酸对应的蛋白，或有生物学活性的多肽]的表达。在优选的实施方案中，细胞是动物细胞。甚至更优选地，细胞可来自昆虫、鱼、两栖动物、小鼠、大鼠或人。将在存在候选分子或化合物时所选mRNA或蛋白的表达水平与在缺乏候选分子或化合物时所选mRNA或蛋白的表达水平进行比较。然后可基于这种比较，将候选分子或化合物鉴定为本发明的特定免疫原性膜蛋白表达的抑制剂。例如，当存在候选分子或化合物时所选mRNA或蛋白的表达比其缺乏时低(统计学上显著低)，那么该候选分子或化合物被鉴定为所选mRNA或蛋白的表达抑制剂。可通过这里所描述的方法测定细胞内所选mRNA或蛋白表达的水平。
在本发明的上下文中认为在上述试验中鉴定的那些试验分子或化合物是本发明免疫原性膜蛋白的特异性治疗剂。
在另一个实施方案中，也可通过使用报告分子试验鉴定所述治疗剂，其中在存在或缺乏试验分子或化合物时，测量在编码本发明免疫原性膜蛋白基因的启动子控制下报告分子构建体的表达水平。可通过用各自的cDNA筛选基因组文库，分离编码所述免疫原性膜蛋白基因的启动子；优选地含有cDNA的5′端。然后将所述启动子的一部分，典型地长20到约500个碱基对克隆到质粒中报告基因的上游，例如，β-半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Ds-红色荧光蛋白、远红荧光蛋白(Hc-红)、分泌的碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、新霉素。然后将该报告分子构建体转染到细胞中，例如，哺乳动物细胞。将转染的细胞分配到多孔平板的孔内，向孔内添加不同浓度的试验分子或化合物。孵育几个小时后，根据现有技术中的已知方法测定报告分子构建体的表达水平。报告分子构建体在与试验分子或化合物孵育的转染细胞中的表达水平相对于在不与试验分子或化合物孵育的转染细胞中的差异将表明，试验分子或化合物能够调节编码所述免疫原性膜蛋白基因的表达，因此是一种治疗剂。
在本发明的一个实施方案中，可使用所述治疗剂治疗非类固醇依赖性癌，并可应用于需要这种治疗的任何患者，包括例如哺乳动物如狗、猫、母牛、马、兔以及灵长类动物。但是最优选地，需要这种治疗的患者是人。
本发明也包括抑制编码所述至少一种免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列，以调节靶细胞的增殖和/或分化或细胞死亡的方法，包括：
提供一种包括通过本发明方法鉴定的治疗剂的组合物和
使治疗有效量的所述组合物与所述靶细胞接触。
已知与本发明的所述免疫膜蛋白结合/相互作用的分子可通过重组法(即，如果分子是具有氨基酸性质的分子)、化学法(即，核酸、化学化合物)对于抗体可通过生物合成法生产。
本发明进一步涉及通过上述筛选试验鉴定的新试剂及其在治疗非类固醇依赖性癌中的用途。
治疗非类固醇依赖性癌
在本发明的一个实施方案中，可用通过本发明方法鉴定的治疗剂治疗由于本发明免疫原性膜蛋白的异常基因表达和/或生物学活性所致的非类固醇依赖性癌。特定多核苷酸(见表1)的异常基因表达可导致有生物学活性的免疫原性膜蛋白的水平发生改变。在本发明的上下文内，作为异常基因表达的结果，所述膜蛋白水平增加可导致特定受试者内异常的细胞增殖、细胞分化、细胞迁移、肿瘤发生或转移。可通过施用本发明的治疗剂治疗鉴定为具有非类固醇依赖性癌或异常细胞增殖、细胞分化、细胞迁移、肿瘤发生或转移的患者，其中已证明该治疗剂降低其相应基因的表达水平或者抑制所述免疫原性膜蛋白的生物学活性。
本发明也提供预防肿瘤形成和/或发展的方法。例如，肿瘤的发生可在出现，如瘤前病变，例如，增生、化生和发育不良等病变之前。如本发明的上下文中所述，可在上皮组织中发现这种病变。因此，本发明提供抑制这种病变形成肿瘤病变的方法，包括向具有瘤前病变的受试者施用治疗有效量的本发明的所述免疫原性膜蛋白。
本发明的这个方面涉及在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，包括向哺乳动物接种本发明的膜蛋白、或其片段，足以产生抗体和/或T细胞免疫反应以使受试者的免疫系统能够对抗肿瘤疾病。本发明的另一个方面涉及在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，其包括通过载体递送免疫原性膜蛋白，指导所述蛋白在体内的表达以诱导这种免疫反应产生抗体以保护受试者不患这种疾病。
本发明的另一个方面涉及一种免疫/疫苗制剂(组合物)，当引入到哺乳动物宿主中时，其在该哺乳动物中诱导对受体多肽的免疫反应，其中该组合物包括本发明的免疫原性膜蛋白或其基因。该疫苗制剂可进一步包括适当的载体。由于膜蛋白可在胃中被分解，因此优选地通过非肠道途径(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内等途径注射)施用。适于非肠道给药的制剂包括水性的和非水性的无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、制菌剂和赋予制剂与受者的血液等张的溶质；水性的和非水性的无菌悬液其可包括悬浮剂或增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器内，例如，密封的安瓿和小瓶，也可在冷冻干燥条件中贮藏，使用前仅需要立即添加无菌液体载体即可。疫苗制剂也可包括提高制剂免疫原性的辅料系统，如水包油(oil-in water)系统和现有技术中已知的其它系统。剂量将取决于疫苗的特异性活性并且可通过常规试验很容易地测定。
在本发明的上下文中，治疗剂量的所述本发明的治疗性的免疫原性膜蛋白的将有效地抑制瘤前病变发展成肿瘤病变，且副作用最小。
本发明的另一个实施方案涉及至少一种所述免疫原性膜蛋白、片段、衍生物或其同系物，或者含有和/或表达至少一种述免疫原性膜蛋白、或片段、衍生物或其同系物的细胞在制备免疫受试者的药物组合物中的用途。
在优选的实施方案中，本发明提供抑制上皮细胞增殖、分化或迁移的方法，包括使上皮细胞显示异常高增殖率、异常分化和/或迁移的组织，如在肿瘤发生期间的组织与本发明的治疗剂接触。预期通过在本发明试验中鉴定的特定治疗剂的抗增殖、抗分化和/或抗迁移效应抑制非类固醇依赖性癌的发展。
在本发明的上下文内，异常增殖、分化或迁移的细胞是存在于乳腺、肺、食管、胃、小肠、结肠、直肠、胰腺、肝、胆囊、胆管、前列腺、卵巢、子宫颈和子宫内膜组织的上皮细胞。
可用于治疗由本发明所述的免疫原性膜蛋白的异常表达所致的非类固醇依赖癌的方法是，例如，使用反义、siRNA、和/或三螺旋分子在多核苷酸水平上抑制基因表达，或者使用在由本发明提供的各种筛选方法中鉴定的治疗剂。此外，根据本发明也可使用对特定多肽特异的抗体治疗非类固醇依赖性癌。这种抗体能特异性结合本发明的免疫原性膜蛋白并且对本发明多肽的亲和力基本上高于它们对现有技术中其它相关多肽的亲和力。
可以向受试者施用治疗有效剂量的鉴定为降低/抑制所述免疫原性膜蛋白的治疗剂以治疗非类固醇依赖性癌。
本发明也提供包括通过本发明方法鉴定的治疗剂的药物组合物。最初鉴定的治疗剂可通过现有技术中的已知方法对其活性、毒性、稳定性、副作用或者物理和/或化学特性等进一步优化。因此，根据本发明的药物组合物可含有由本发明方法所鉴定的试剂的片段、衍生物或同系物。
肽，如免疫原性膜蛋白的可溶型，以及激动剂和拮抗剂、肽、抗体或小分子可联合适当的药学载体进行配制。这种制剂包括治疗有效量的多肽或化合物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于，盐、缓冲盐、葡萄糖、水、甘油、乙醇及它们的组合。制剂应当适合于给药方式，其最优化在本领域技术人员中是公知的。本发明进一步涉及药物包装和试剂盒，包括填充一种或多种本发明上述组合物成分的一种或多种容器。
本发明的多肽和其它化合物可单独或联合其它化合物使用，如治疗性化合物。药物组合物全身给药的优选形式包括注射，典型地通过静脉内注射。可使用其它途径，如皮下、肌肉内、或者腹膜内。全身给药的可选择的方法包括经粘膜和经皮给药，使用渗透剂如胆汁盐或梭链孢酸或者其它去污剂。另外，如果适当地制备成肠溶的或胶囊包裹的制剂，那么口服给药也是可能的。这些化合物的施用也可以是局部的和/或局限化的，以油膏、糊剂、凝胶等的形式。
需要的剂量范围取决于分子的选择、给药途径、制剂的性质、受试者的情况以及主治医师的判断。然而，适当的剂量是在患者每公斤体重0.1-100μg的范围。然而，鉴于可得化合物的种类和各种给药途径效率的差异，预期所需的剂量变化很大。例如，预计口服给药将需要比通过静脉注射给药更高的剂量。可使用标准的经验途径调整这些剂量水平中的差异以进行最优化，这在现有技术中是公知的。
也可在受试者中内源性地产生治疗中所使用的多肽，如上所述在治疗形式中常常称作“基因治疗”。因此，例如，可用多核苷酸，如DNA或RNA改造受试者的细胞以便先体外后体内编码多肽，例如，通过使用逆转录病毒质粒载体。然后将细胞引入到受试者内。
因此，本发明也提供根据本发明方法鉴定的治疗剂、或衍生物或其同系物，或者含有和/或表达所述治疗剂或衍生物或其同系物的递送复合物在制备用于治疗非类固醇依赖性癌的药物组合物的用途。
诊断学
本发明的另一个方面涉及测定生物样品(例如，血液、血清、细胞、组织)中本发明的免疫原性膜蛋白的表达，或者编码所述膜蛋白的多核苷酸的诊断试验，测定个体是否患有非类固醇依赖性癌，或者是否有发展成由于这种免疫原性膜蛋白的异常表达或生物学活性所致的非类固醇依赖性癌的风险。本发明也提供确定个体是否有发展成非类固醇依赖性癌风险的预后(或预言性)试验。例如，可分析生物样品中的基因表达水平，以确定生物样品中是否可能存在与标准相比水平增加的特定蛋白。这种试验可用于预后或预测的目的，因而可在形成非类固醇依赖性癌前对个体进行预防性地治疗。
一种检测生物样品中是否存在或缺乏本发明的免疫原性膜蛋白或者编码其的多核苷酸的方法，包括从试验受试者中获得生物样品以及将生物样品与能检测特定多肽或多核苷酸(例如，mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触，这样可直接标记是否存在特定的多肽或多核苷酸。实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗，以及用生物素末端标记DNA探针，这样其可用荧光标记的链霉抗生物素进行检测。即，可使用本发明的检测方法在体外以及在体内检测生物样品中的mRNA、蛋白或基因组DNA。例如，体外检测mRNA的技术包括，但不限于，Northern杂交、原位杂交、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR，见下面的实施例)或者差异显示。体外检测免疫原性膜蛋白的技术包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISAs)、Western印迹、免疫沉淀法、免疫荧光或者使用对所述膜蛋白或其片段特异性抗体的组织阵列分析(蛋白表达谱)。体外检测基因组DNA的技术包括Southern杂交。此外，体内检测所述免疫原性膜蛋白的技术包括向受试者引入针对特定多肽或其片段的标记抗体。
在一个实施方案中，生物样品含有来自试验受试者的蛋白分子。可选择地，生物样品含有试验受试者的mRNA分子或者试验受试者的基因组DNA分子。优选的生物样品包括，但不限于，通过常规方法从受试者中分离的血液、血清、血浆、乳头抽吸物、尿、精液、精液、精浆、前列腺液、排泄物、泪液、唾液、汗液、活检、腹水、脑脊液、乳汁、淋巴或者组织提取物样品。
在另一个实施方案中，该方法进一步包括从对照受试者中获得对照生物样品，将该对照样品与能检测所述多肽、或mRNA或编码所述多肽的基因组DNA的化合物或试剂接触，结果可在生物样品中检测是否存在多肽、或mRNA或者编码所述多肽的基因组DNA，以及将对照样品中存在的所述多肽或mRNA或编码所述多肽的基因组DNA与试验样品中存在的多肽或mRNA或者编码所述多肽的基因组DNA进行比较。
在另一个实施方案中，使用编码所述免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列作为产生用于在其它细胞类型中鉴定和/或克隆免疫原性膜蛋白同系物的探针和引物的模板，例如其它组织的同系物，以及其它哺乳动物生物体的同系物。
在本发明的优选实施方案中，使用包括基本上纯化的寡核苷酸的探针/引物，其中寡核苷酸包括在严紧条件下与编码所述免疫原性膜蛋白的正义或反义序列的至少约15个，优选约25个，更优选地约40、50或75个连续的核苷酸杂交的核苷酸序列区。例如，可在PCR反应中使用基于编码所述膜蛋白的多核苷酸序列的引物用以克隆同系物，例如特异性等位基因。优选地在不与其它基因显著同源的区域中选择这种引物。同样地，可使用基于所述序列的探针检测编码相同或同源蛋白的转录本或基因组序列。在优选的实施方案中，探针进一步包括附着其上并可被检测的标记基团，例如，标记基团选自放射性同位素、荧光化合物、酶和酶的辅因子。
此外，这种探针也可用作诊断试验试剂盒的一部分，用于鉴定过量表达本发明的免疫原性膜蛋白的细胞或组织，如通过测量患者细胞样品中编码特定多肽的多核苷酸序列的水平；例如，检测mRNA水平。简要地说，可从所述基因(见表1)中产生特异性核苷酸探针，便于组织学筛选完整组织和组织样品中是否存在免疫原性膜蛋白。可使用针对本发明免疫原性膜蛋白的mRNAs或者针对基因组序列的探针，用于预测性和治疗性的评价，其中特定多肽的表达或存在表现为，例如组织内不需要的细胞生长、异常分化或细胞迁移的激活。联合使用这里所述的免疫测定，寡核苷酸探针可有助于便于测定基于与所述免疫原性膜蛋白的表达相关癌症的分子。测定受试者是否有发展成由本发明免疫原性膜蛋白的异常表达(过表达)和/或生物学活性所致或起作用的非类固醇依赖性癌风险的试剂盒也在本发明的范围内。
在优选的实施方案中，该方法可用于确定受试者是否有发展成非类固醇依赖性癌的风险。在同一实施方案中，本发明提供附带基于上述方法如何使用试剂盒说明的试剂盒。
反义多核苷酸序列
本发明的另一个方面涉及“反义”治疗。如这里所使用的，“反义”治疗指施用或原位产生反义多核苷酸序列或其衍生物，其在细胞环境中与细胞mRNA和/或编码本发明的免疫原性膜蛋白的基因组DNA特异性杂交(例如，结合)以至于，例如通过抑制转录和/或翻译抑制该蛋白的表达。结合可通过典型的碱基对互补性，或者，例如，在结合DNA双螺旋的情况中，通过在双螺旋大沟中的特异性相互作用。总的来说，“反义”治疗指通常在现有技术中所使用的技术范围，并且包括依赖反义多核苷酸序列特异性结合其靶多核苷酸序列的任何治疗。
可递送本发明的反义构建体，例如，作为表达质粒，当在细胞中转录时其产生与编码本发明的免疫原性膜蛋白的细胞mRNA的至少独特部分互补的RNA。可选择地，反义构建体是先体外后体内产生的核酸分子，并且当引入细胞时其通过与所述膜蛋白基因的mRNA和/或基因组序列杂交导致表达的抑制。优选地修饰这种反义多核苷酸序列使得它们抗内源核酸酶，例如，核酸外切酶和/或核酸内切酶，因而在体内稳定。用作反义多核苷酸序列的分子选自，但不限于DNA的二氨基磷酰胺酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)和甲基膦酸酯类似物(Froehler等(1988)NucleicAcids Res.16，4831-4839；Hyrup和Nielsen(1996)Bioorg.Med.Chem.4，5-23；Sarin等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，7448-7451；Stein等(1988)Nucleic Acids Res.16，3209-3221；Summerton J.(1999)Biochim.Biophys.Acta 1489，141-158；Summerton和Weller(1997)Antisense polynucleotide sequences Drug Dev.7，187-195；Orum和Wengel(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.3，239-243；Wahlestedt等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，5633-5638)。另外，在Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6553-6556；Summerton和Weller(1997)Antisense polynucleotide sequences Drug Dev.7，187-195；Froehler等(1988)Nucleic Acids Res.16，4831-4839中已综述了构建可用于“反义”治疗的反义多核苷酸序列的一般方法。
反义方法包括设计与编码本发明的免疫原性膜蛋白的mRNA互补的寡核苷酸(DNA或RNA，或者其衍生物)。反义多核苷酸序列将结合本发明所述免疫原性膜蛋白的mRNA转录本并阻止翻译。尽管优选，但是不需要绝对的互补性。与RNA的一部分“互补”的序列，如这里所指的，意思是具有足够的互补性以至于能与RNA杂交，形成稳定双螺旋的序列；在双链反义多核苷酸序列的情况中，可能因而检验双螺旋DNA的单链，或者可能分析三螺旋形成。杂交的能力将既依赖互补性的程度也依赖反义多核苷酸序列的长度。通常，杂交的多核苷酸序列越长，其可能含有的与RNA错配的碱基就越多，仍然能形成稳定的双螺旋(或三螺旋，可能根据情况而定)。本领域技术人员通过使用标准方法确定杂交复合物的解链温度，能确定可接受的错配程度。
与mRNA的5′端，例如，5′UTR向上并包括AUG翻译起始密码子互补的反义多核苷酸序列，将在抑制翻译上最有效。然而，最近已经证明与mRNAs的3′UTR互补的序列在抑制mRNAs的翻译上也有效(Wagner，R.(1994)Nature 372，333-335)。因此，在反义方法中可使用与编码本发明的所述免疫原性膜蛋白基因的5′UTR、3′UTR或非编码区互补的反义多核苷酸序列以抑制内源性mRNA的翻译。与mRNA的5′UTR互补的反义多核苷酸序列应当包括AUG起始密码子的补体(例如，-20到+20核苷酸)。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸序列是欠有效的翻译抑制剂，但是根据本发明可以使用。无论是设计成与编码所述至少一种本发明的免疫原性膜蛋白mRNA的5′、3′或非编码区杂交，反义多核苷酸序列应当至少长10个核苷酸，优选地长度从15到约50个核苷酸范围的多核苷酸序列。在某个实施方案中，反义多核苷酸序列长至少15个核苷酸、至少18个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25该核苷酸、至少30个核苷酸、至少35个核苷酸、至少40个核苷酸或者至少50个核苷酸。
不管如何选择靶序列，优选首先进行体外研究以定量反义多核苷酸序列抑制基因表达的能力。优选这些研究利用区分反义多核苷酸序列的反义基因抑制和非特异性生物效应的对照。也优选这些研究将靶RNA或蛋白的水平与内对照RNA或蛋白的水平进行比较。另外，可以预见将使用反义多核苷酸序列所获得的结果与使用对照序列所获得的那些结果进行比较。优选地对照寡核苷酸序列的长度与试验反义多核苷酸序列大致相同并且应当具有相似的核苷酸组成、分子量和解链温度。然而，这些参数间的不同不足以阻止与靶序列的特异性杂交。这些序列可是有义的、反义的或者混和的。
反义多核苷酸序列可以DNA或RNA，或者嵌合混合物、或者其衍生物、单链的或双链的、或者形成三螺旋的寡核苷酸。可在碱基部分、糖部分或者磷酸主链上修饰反义多核苷酸序列，例如，改善分子的稳定性、杂交等。反义多核苷酸序列可包括其它附加基团如肽(例如，用于体内靶向宿主细胞受体)、或者便于跨细胞膜转运的试剂(见Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6553-6556；Lemaitre等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，648-652；于1988年12月公开的PCT公开No.WO 88/09810)或者穿过血脑屏障转运的试剂(见1989年11月公开的PCT公开No.WO 89/10134)、杂交引发裂解剂(vander Krol等(1988)Biotechniques 6，958-976)或者嵌入剂(Zon，G.(1988)Pharm.Res.5，539-549)。为了这个目的，可将反义多核苷酸序列与其它分子结合，例如，肽、杂交引发交联剂、转运剂、引发裂解剂等。例如，在2001年五月公开的Morcos等美国专利No.6,228,392和Morcos，P.A.(2001)Genesis 30，94-102中描述了使用乙氧基聚氮丙啶(EPEI)的便于吗啉转运的特殊给药系统。
优选地，根据本发明所使用的反义多核苷酸分子选自RNAi、吗啉、PNAs、形成三螺旋的寡核苷酸、双链和单链的多核苷酸序列。
反义多核苷酸序列可包括至少一种修饰的碱基部分，其选自下组包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mainnosylqueosine、5′-甲氧基羟甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2，6-二氨基嘌呤。
反义多核苷酸序列也可包括至少一种修饰的糖部分，其选自包括，但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，缺乏戊糖部分的反义多核苷酸序列也在本发明的范围内。在另一个实施方案中，反义多核苷酸序列包括至少一种修饰的磷酸主链，其选自硫代磷酸酯(Stein和Cohen(1989)在：Oligonucleotides：Antisense Inhibitorsof Gene Expression.pp.97-117，J.Cohen编辑(Boca Raton，FL：CRCPress，Inc.))、硫代磷酸酯、硫代氨基磷酰胺酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯(Froehler等(1988)NucleicAcids Res.16，4831-4839)、二氨基磷酰胺酸酯、甲基膦酸酯(Miller，P.(1989)在：Oligonucleotides：Antisense Inhibitors of GeneExpression，pp.85-92)、烷基磷酸三酯(Miller，P.(1989)在：Oligonucleotides：Antisense Inhibitors of Gene Expression.pp.82-85)、formacetal或其类似物，以及α-DNA(Rayner等(1989)在：Oligonucleotides：Antisense Inhibitors of Gene Expression，pp.119-136，J.Cohen编(Boca Raton，FL：CRC Press，Inc.))，2′-O-甲基RNA(Shibahara等(1989)Nucleic Acids Res.17，239-252)、吗啉主链(Summerton和Weller(1997)Antisense polynucleotide sequencesDrug Dev.7，187-195)、通过肽键连接的重复的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单位(肽核酸；PNAs)(Hanvey等(1992)Science 258，1481-1485；Nielsen等(1993)Anticancer Drug Des.8，53-63；Nielsen，P.E.(2000)Curr.Opin.Mol.Ther.2，282-287)、或者闭锁核酸(LNAs)(Kumar等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8，2219-2222；Petersen等(2000)J.Mol.Recognit.13，44-53)。
本发明的反义多核苷酸可通过现有技术中已知的标准方法合成。作为实例，可通过Stein等(1988)Nucleic Acids Res.16，3209-3021)的方法合成硫代磷酸酯寡聚体，可通过使用可控多孔玻璃多聚体支持物制备甲基膦酸酯寡聚体(Sarin等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，7448-7451)。可通过Summerton和Weller，美国专利Nos.5,217,866(于1993年6月公开)和5,185,444(1993年2月)等的方法合成吗啉寡聚体。
此外，使用RNA干扰(RNAi)改变本发明免疫原性膜蛋白的翻译后表达也在本发明的范围内(Boutla等(2001)Curr.Biol.11，1776-1780；Moss，E.G.(2001)Curr.Biol.11，R772-R775；Bernstein等(2001)RNA 7，1509-1521)。RNAi是一种序列特异性转录后基因沉默的方法，由在序列上与所沉默的基因同源的双链RNA(dsRNA)引发。序列特异性信使RNA降解的介质是由核糖核酸酶III裂解较长dsRNAs所产生的小干扰RNAs(siRNAs)。通常，siRNAs的长度在20-25个核苷酸之间(Elbashir等(2001)Nature 411，494-498)。
形成三螺旋的寡核苷酸以修饰编码本发明的免疫原性膜蛋白基因的表达也在本发明的范围内。使用三螺旋结构抑制双螺旋足以对聚合酶、转录因子或者调控分子的结合开放的能力。已文在献中描述了最近使用三螺旋DNA的治疗进展(Gee，J.E.等(1994)在：Huber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and Immunologic Approaches，FuturaPublishing Co.，Mt.Kisco，N.Y.)。
此外，本发明也包括使用环形RNA(即，RNA套索)抑制已知功能的特异性蛋白的翻译。
本发明上述实施方案的优选的反义多核苷酸序列包括沉默(RNAi)反义多核苷酸、吗啉寡聚体(Summerton和Weller(1999)Antisense polynucleotide sequences Drug Dev.7，187-195)、肽核酸(PNAs)(Egholm等(1992)J.Am.Chem.Soc.114，1895-1897)和/或闭锁核酸(LNAs)(Kumar等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8，2219-2222；Petersen等(2000)J.Mol.Recognit.13，44-53)。
在具体实施方案中，将反义多核苷酸序列递送到在体内表达本发明免疫原性膜蛋白的细胞中。已研发了许多方法用于将反义DNA或RNA递送到细胞中；例如，可将反义分子直接注射到组织部位，或者可全身施用设计成靶向期望细胞的修饰的反义多核苷酸序列，例如，与靶细胞表面上的受体或所表达的抗原特异性结合的肽或抗体反义连接。
在本发明的优选实施方案中，从病毒载体中表达反义多核苷酸序列。适当载体的实例是，但不限于，痘苗病毒、反转录病毒、腺病毒或它们的组合。
反义多核苷酸序列也可包含在递送复合物中，如例如，固醇、脂质、病毒等。细胞也可作为递送复合物。本发明因此提供治疗特征为表达所述至少一种免疫原性膜蛋白或其片段的非类固醇依赖性癌的方法，包括分离细胞、使所述细胞与本发明的反义分子接触以及向患非类固醇依赖性癌的受试者递送所述细胞的步骤。
也可使用本发明的反义分子或表达和/或含有所述反义分子的细胞制备治疗非类固醇依赖性癌的药物组合物。优选地所述细胞来自被治疗的受试者。
探针和引物
在本发明的上下文中，编码本发明的人免疫原性膜蛋白(见表1)的多核苷酸序列将进一步允许产生用于在其它细胞类型中鉴定和/或克隆同系物的探针和引物，例如，其它组织的同系物以及其它哺乳动物的免疫原性膜蛋白同系物。
用作探针的优选的多核苷酸序列，根据本发明的方法，包括具有编码本发明的免疫原性膜蛋白(见表1)或其片段的多核苷酸序列中至少约15、至少约30、优选地至少约50、更优选地至少约100、甚至更优选地至少约200个连续核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸序列。在优选的实施方案中，多核苷酸序列的一部分与所述膜蛋白基因的完整编码序列的任何片段一致。可选择地，该部分可以是编码人免疫膜蛋白保守基序或区域的特异性多核苷酸序列，例如，细胞外域。可选择地，该部分可以是位于编码人免疫原性膜蛋白保守基序的多核苷酸序列之间的多核苷酸序列。
本发明进一步涉及用作探针/引物的多核苷酸序列分子(即，非编码的多核苷酸序列分子)，其可包括至少约15、18、20、25、30、40、50、100、125、150或200个核苷酸或碱基对。其它优选的多核苷酸序列包括各自cDNAs的至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或者至少约600个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸序列与编码本发明的免疫原性膜蛋白(见表1)的多核苷酸序列的5′部分一致。
在本发明中也使用能与编码所述膜蛋白的多核苷酸序列杂交，特别是，在各种严紧条件下与表1中所示的那些序列及其片段杂交的多核苷酸序列。促进多核苷酸序列杂交的条件是本领域技术人员已知的(见Current Protocols in Molecular Biology(1989，John Wiley &Sons，N.Y.6.3.1-6.3.6；Jowett，T.(2001)Methods 23，345-358)。
在优选的实施方案中，本发明也提供包括基本上纯化的寡核苷酸的探针/引物，其中寡核苷酸包括在严紧条件下与编码免疫原性膜蛋白(见表1)，或其天然存在的突变体的多核苷酸序列的正义或反义序列的至少约15、优选地约30、更优选地约500、100或者200个连续核苷酸杂交的多核苷酸序列区域。例如，可在PCR反应中使用基于特定多核苷酸序列的引物以克隆同系物。优选地在不与其它基因显著同源的区域中选择这种引物。同样地，可使用基于编码受试者膜蛋白的多核苷酸序列的探针检测编码相同或同源蛋白的转录本或基因组序列。在优选的实施方案中，探针进一步包括附着其上并可被检测的标记基团，例如，标记基团选自放射性同位素、荧光化合物、酶和酶的辅因子。
这种探针也可作为诊断试验试剂盒的一部分，用于鉴定过量表达本发明免疫原性膜蛋白的细胞或组织，如通过测量患者细胞样品中各自多核苷酸序列(见表1)的水平；例如，检测mRNA水平。可使用针对受试者多核苷酸序列或针对受试者基因组序列的探针，用以对改变的基因表达水平进行预测性和治疗性评价，其可表现在例如，组织的不需要的细胞生长或异常分化。用于确定受试者是否有发展成由编码本发明免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列过量表达所致的非类固醇依赖性癌风险的试剂盒也在本发明的范围内。该试剂盒可包括对编码所述膜蛋白的特定多核苷酸序列特异的探针/引物、反应液和如何使用试剂盒的说明。
载体
可使用含有编码拮抗性多肽、肽的多核苷酸序列或者本发明免疫原性膜蛋白或多核苷酸序列的反义多核苷酸序列，并可操作地与至少一个转录调控序列相连的表达载体实施本发明。调控序列是本领域技术人员公知的，并且特异性地选取以抑制内源性免疫原性膜蛋白的表达和/或生物学活性。在Rodriguez和Chamberlin编辑(1982)Promoters：Structure and function.NY.Praeger；Khoury和Gruss(1983)Cell 33，313-314中描述了这些调控序列。在一个实施方案中，表达载体包括编码用于抑制免疫原性膜蛋白基因表达目的的反义多核苷酸序列的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，表达载体含有编码可用于抑制所述免疫原性膜蛋白的生物学活性的多肽或肽的多核苷酸序列。这种表达载体可作为基因治疗方案的一部分。因此，本发明另一个方面的特色是用于取消所述免疫原性膜蛋白生物学活性(例如，上皮或癌细胞的分化)的拮抗性多肽、肽或反义多核苷酸序列体内、体外、或者先体外后体内转染和表达的表达载体。这可能是期望的，例如，当蛋白的天然型过量表达时；或者递送改变组织分化(例如，抑制癌细胞的细胞转化、分化或增殖)的蛋白型。
除了病毒转移法，也可使用非病毒法使拮抗性肽或多肽在动物的组织中表达。基因转移的绝大多数非病毒法依赖于哺乳动物细胞所使用的摄取和细胞内转运高分子的正常机制。在优选的实施方案中，非病毒靶向方法依赖于靶细胞摄取拮抗性肽或多肽编码基因的内吞途径。这种类型的示范性的靶向方法包括源自脂质体的系统、聚赖氨酸偶合物以及人工病毒包膜。
抗体
可使用常规方案，通过向动物，优选地非人，施用多肽或带有表位的片段、类似物或细胞，获得产生抗本发明的免疫原性膜蛋白的抗体，抗体可以是任何同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等)。抗体片段可通过现有技术中的公知常规技术生产，如用某种蛋白酶的消化。因此，该术语包括抗体分子的蛋白酶剪切或重组制备部分的片段，其能选择性地与某种蛋白反应。这种蛋白水解的和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、F(ab′).sub.2、Fab′、Fv以及含有通过肽接头连接的V[L]和/或V[H]区的单链抗体(scFv)。scFv′s可共价或非共价连接形成具有两个或多个结合位点的抗体。本发明包括多克隆抗体、单克隆抗体或者抗体的其它纯化制品和重组抗体。
为了制备单克隆抗体，可使用提供由连续细胞系培养物生产抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256：495-497)、三瘤体(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunology Today(1983)4：72)和EBV杂交瘤技术(Cole等，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
也可将生产单链抗体的技术(例如，在美国专利No.4,946,778中所描述的方法)进行修改以生产抗本发明多肽的单链抗体。同样地，可使用转基因小鼠，或者包括哺乳动物的其它生物表达人源化的抗体。
本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或者具有更多特异性。针对本发明的免疫原性膜蛋白并可用于癌症检测的抗体可用单独的抗体检测，或者可用相同的抗体检测。可选择地，多特异性抗体可显示对同一蛋白上不同表位具有不同的特异性。在本发明中也包括结合多肽分子的抗体，其中该多肽分子由一个或多个与本发明的免疫原性膜蛋白的序列互补或杂交的核酸序列编码或者由一个或多个与编码所述膜蛋白的核酸序列互补或杂交的序列编码。
可用于癌症检测的本发明的抗体可进一步用作与其结合的多肽分子活性的激动剂或拮抗剂，因而可用作癌症治疗或预防的治疗性分子。抗体不一定要单独使用，可与其它多肽融合，包括抗体多肽序列N或C末端的异种多肽。例如，可将在本发明中有用的抗体与可检测的标记融合以便于当结合靶多肽时检测抗体。本领域技术人员已知可检测地标记抗体多肽的方法。
为了生产本发明中有用的抗体，可通过注射本发明候选基因的蛋白产物(或者保留免疫原性性质的任何部分、片段或其寡核苷酸)免疫各种宿主包括山羊、兔子、大鼠、小鼠等。视宿主物种而定，可使用各种佐剂以提高免疫反应。这种佐剂包括但不限于弗氏佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、以及表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白以及二硝基酚。BCG(bacilliCalmette-Guerin)和小棒杆菌都是潜在有用的人用佐剂。
可用现有技术中的已知方法制备多克隆抗血清或单克隆抗体。可用本发明免疫原性膜蛋白、片段、衍生物的免疫原性型或其变体型免疫哺乳动物如小鼠、仓鼠或兔。对这种分子赋予免疫原性的技术包括与载体偶联或者现有技术中的其它公知技术。例如，可在存在上述佐剂时施用免疫原性分子。可通过检测血浆或血清中的抗体滴定监控免疫。可使用标准免疫测定步骤，用免疫原作为抗原来评价抗体的水平和特异性。免疫后，可获得抗血清，如果期望的话，从血清中分离多克隆抗体。
嵌合抗体，即，结合非人动物可变区和人恒定区的抗体分子，也在本发明的范围内。嵌合抗体分子包括，例如，小鼠、大鼠或其它物种抗体的抗原结合区，和人恒定区。可使用标准方法制备含有识别本发明免疫原性膜蛋白的免疫球蛋白可变区的嵌合抗体(见，例如Morrison等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851；Takeda等，1985，Nature 314：452；美国专利No.4,816,567；美国专利No.4,816,397)。
可在文献中发现将分子标签与结合的化合物，如抗体共价连接的广泛指导，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，(AcademicPress，New York，1996)等。在本发明的一个方面，将一个或多个分子标签直接或间接附着到结合化合物上的常用反应基团。常用的反应基团包括胺、硫醇、羰化物、羟基、醛、酮等，可通过可买到的交联剂与分子标签结合，例如，Hermanson(上面所引用的)；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products，Ninth Edition(Molecular Probes，Eugene，Oreg.，2002)。
如在现有技术中公知的，抗体也可与选自包括色素原、催化剂、酶、荧光团、化学发光分子、生物素和放射性同位素的标签偶联。在美国专利No.4,366,241、美国专利No.4,843,000和美国专利No.4,849,338中公开了大量适于用作标签的酶，这些专利中的每一个在此引作参考。可在本发明中使用的合适的酶标记包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。酶标记可单独使用或联合溶液中的第二种酶使用。优选地用于治疗性目的，将抗体与细胞毒性部分偶联。
荧光团可选自包括荧光素异硫氰酸(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸(TRITC)、别藻蓝蛋白(APC)、德克萨斯红(TR)、Cy5或R-藻红蛋白(RPE)的基团。可在，例如美国专利No.4,520,110和美国专利No.4,542,104中发现有用荧光团的实例，其在这此引入作为参考。
与一个或多个前体药物偶联的抗体也在本发明的范围内。“前体药物”指药物分子的药学上无活性的衍生物，其需要在体内转化以释放活性药物。典型地，设计前体药物以克服将限制药物临床应用的，与亲本药物分子相关的基于药学和/或药物动力学的问题。
也可将本发明的抗体与光敏剂偶联，其反过来提供对用某种波长光治疗的灵敏度。
得到FDA批准的第一个光敏剂是Photofrin，由加拿大QLT PhotoTherapeutics生产。另一种广泛研究的光敏剂是氨基乙酰丙酸。在临床试验中其它分子是SnET2，其是作为Purlytin由Pharmacia/Upjohn生产的二氯卟酚光敏剂。另一种分子是作为Foscan由ScotiaPharmaceuticals生产的mTHPC，其是metatetrahydroxyphenylchlorin。已通过使用光敏剂Verteporfin，一种血卟啉衍生物，抑制斑点退化。Stewart和同事(Radiother Oncol 1998；48：233)以及Dougherty和同事(J Natl Cancer Inst 1998；90：889)已综述了这些光敏剂和作为光敏剂的几种其它分子。
可使用上述抗体分离或鉴定表达多肽的克隆或者通过层析纯化多肽。优选地，也可使用抗本发明多肽的抗体治疗或诊断肿瘤病。
通过下列实施例进一步举例说明本发明，其不应当被解释为以任何方式限制。所有所引用的参考(包括文献参考、授权的专利、公开的专利申请)的内容，如在整个本申请中所引用的，均引入作为参考。除非有其它说明，本发明的实施将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些对于本领域技术人员来说都是已知的。这些技术已在文献中充分说明。
实施例
实施例1.从结肠组织中分离RNA以及cDNA的标记法
为了诊断和治疗各种类型的非类固醇依赖性癌，特别是那些源自上皮细胞的致瘤性转化的癌，疾病特异性分子标记的鉴定就极其重要。在肿瘤组织和那些从健康个体中分离的组织之间，成功鉴定基于分子差异的先决条件在于从健康的和发生肿瘤的组织中分离的上皮细胞中差异性调控基因的对比转录分析。
对于这个目的，从处于疾病不同阶段的结肠癌患者中收集组织样品，连同从远位点采集的健康结肠组织(样品集)。在Cottbus(Carl-Thiem-Klinikum Cottbus，Chirurgische Klinik，03048 Cottbus，Germany)、Magdeburg(Otto-von-Guericke-Klinik，Leipziger Strasse44，39120 Magdeburg，Germany)和Erlangen(Friedrich-Alexander-Universitat，Chirurgische Klinik，91023 Erlangen，Germany)的医院中，从不同年龄的男性和女性患者中收集组织样品。
根据在专利W098/43091“上皮细胞异常的诊断”中所描述的方法分离上皮细胞。
最初通过与RNAlaterTM(Ambion，UK)在冰上孵育15分钟制备组织样品。孵育后，使用解剖刀降低组织样品的大小(约1mm)并用300μM的钢网机械分离。分离后，将细胞用50ml 1X PBS、50mlRNAlaterTM(Ambion，UK)，以及0.8mM苯脒、3mM EDTA、5mg/100ml Leupeptin和2mM Pefabloc(洗涤缓冲液)洗涤，在4℃以300g离心10分钟并在4ml洗涤缓冲液中悬浮。为了从周围细胞中分离上皮细胞，将细胞悬液与和磁珠共价连接的上皮细胞特异性的抗体(抗BerEP4)接触。更具体地，将细胞悬液与80μl抗BerEP4 Dynabead(Deutsche Dynal GmbH，Germany)混合并在洗涤缓冲液中在2-8℃孵育30分钟。使用磁铁(Deutsche Dynal GmbH，Germany)收集结合Dynabead的上皮细胞、在冰上分成等份并贮藏在-80℃。
根据生产商的说明，使用RNAeasy(Qiagen，Germany)分离总RNA。使用RNA 6000 Nano Lab Chips(Agilent，Palo Alto)和Agilent′s2100 Bioanalyzer系统确定RNA的质量。使用cDNA标记和清除的LabelStarTM试剂盒(Qiagen，Germany)，根据生产商的说明，将来自每种组织样品的10μg总RNA进行逆转录以产生花菁(Cy-3)和花菁(Cy-5)标记的cDNA靶并制备用于微阵列。
为了鉴定哪种基因在肿瘤对健康组织样品中差异性表达，使用含有表达12000个以上人序列的微阵列(人-1cDNA微阵列，AgilentTechnologies，USA)分析每种样品集。将从非肿瘤组织中分离的Cy-3标记的上皮细胞cDNAs与从肿瘤组织中分离的Cy-5标记的上皮细胞cDNAs混合，并在65℃与微阵列过夜杂交(根据生产商的说明，人-1cDNA微阵列试剂盒，Agilent Technologies，USA)。进行所有杂交作为荧光逆转对。杂交后，洗涤微阵列以除去任何未结合的分子，随后使用Agilent Technologies的双激光微阵列扫描仪(AgilentTechnologies，USA)扫描与它们互补序列杂交的cDNAs。随后，使用Agilent Technologies的Feature Extraction软件(Version A6.1.1)将各种芯片特征的位置(点)与微阵列上注释的编码序列联系起来。为了提供关于其各自编码序列在肿瘤和健康组织中表达水平的信息，也可使用该软件计算单个芯片特征的信号强度(图1)。提取特征后，使用Rosetta Resolver系统(Rosetta Inpharmatics.Kirkland，WA)进行数据分析。
实施例2.使用Rosetta Resolver(Rosetta Inpharmatics.Kirkland，WA)进行数据分析
使用Rosetta Resolver平台(Rosetta Inpharmatics.Kirkland，WA)研究编码血浆膜蛋白或血浆膜相关蛋白基因的表达。使用公众可获得的LocusLink数据库(NCBI)，可将所有编码所提取的已知血浆膜蛋白或血浆膜相关蛋白基因的基因名称和数据库鉴定物定位到它们在人-1cDNA微阵列(Agilent Technologies，USA)上经鉴定的相应的特征。在研究期间，在所使用的cDNA微阵列上存在1480个在LocusLink(NCBI)中登记的已知血浆膜蛋白或相关蛋白的1147个编码序列。在Rosetta Resolver(Agilent Technologies，USA)内在生物集中结合这些1147个基因并且在15个结肠样品(肿瘤和健康样品)中分析它们的表达。基于所观察到的差异性基因表达，鉴定特别感兴趣的蛋白编码基因，其中在正常对肿瘤组织中基因表达的差异(倍数改变)至少1.5倍。此外，也考虑显示关于基因表达测量具有极大可信度的蛋白编码基因。使用评估特定测量总误差的特异性误差模型(通过Rosetta Resolver完成)测量可信度。该特异性误差模型解释随机误差以及任何未被解释的系统误差，并且计算特定无效(统计学的)假设的P值，可信度的测量值。仅选择满足上述标准(P值为0.01)的那些基因，以及在30％或更多所研究的患者中发现差异表达的那些基因(表1)。
实施例3.用于诊断目的的患者中差异性基因表达的检测
可通过实时定量RT(反转录)-PCR(聚合酶链反应)(参考)分析本发明蛋白的免疫原性膜蛋白的表达模式。简要地，使用随机六聚体将感兴趣组织的最少20个肿瘤和非肿瘤对(分离的上皮细胞)以及3-4个不同细胞系(试验内变异的对照)的总RNA一式三份进行反转录，然后在存在SYBR绿I时，使用感兴趣序列的特异性引物对，通过实时定量PCR进行平行扩增。使用Applied Biosystems′PrimerExpress 2.0软件设计这些引物；它们应当跨越内含子以避免检测到污染的DNA，并且不应当与如进行BLAST搜索所检测到的人基因组的任何其它序列互补。使用28S rRNA作为内参考对数据进行标准化(校正样品与样品由于吸移所致的差异等)。扩增以及当SYBR绿插入到最近扩增的序列的双链内时，使用ABI Prism 7000序列检测系统和Applied Biosystems的相关软件(v.1.0)常规进行所产生的荧光信号的实时检测和分析。每个样品的值通常表示为Ct(阈值周期)值，即，在这个周期中，一旦背景信号固定，首先检测某种阈值上的荧光信号。适当标准曲线的每个Ct值(通过从总RNA样品的一系列已知稀释物中扩增靶和参考基因所获得的量与Ct值的图)的外推将提供特定复制的样品中所述免疫原性膜蛋白基因和参考基因的相对量，而[均值±SD]靶基因 /[均值±SD]参考基因的比将使该特定样品内特定靶的量标准化，使得可在样品之间进行比较。因此，一旦标准化，将每个肿瘤中的特定靶(编码所述免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列)的量与相应的非肿瘤样品中同一靶的量进行比较，看其在特定样品中是否过量或低量表达，或者其表达是否不改变(见表2)。最后，对所有样品中特定靶表达的分析将提供关于在某种肿瘤类型中其是否全面或部分(和以何种频率)过(或低)表达的信息。
表2：与非癌性疾病相比，在患结肠直肠癌的同一患者的肿瘤组织(T)与正常组织(NT)中免疫原性膜蛋白的差异表达。当与正常组织标准化时，表达水平表示为表达倍数。
  阶段   组织   CLNS1A   ITM1   ITM2B   LRP4   OPRL1   PTPRO   STOML2   SYPL   TLR3   TM4SF6   TM9SF2   ZP3
憩室炎   C119NTC119TC122NTC122T   1,000,521,001,58   1,000,641,001,27   1,000,391,001,34   1,000,241,001,21   1,000,471,000,73   1,000,151,001,98   1,000,581,001,53   1,000,451,001,64   1,000,191,001,53   1,000,301,001,63   1,000,501,001,56   1,000,311,001,37
  上皮内瘤   B105NTB105T   1,004,82   1,003,82   1,001,13   1,003,26   1,002,10   1,003,70   1,003,41   1,004,90   1,000,80   1,003,28   1,002,02   1,008,95
UICC I   C314NTC314T   1,003,18   1,001,54   1,000,92   1,001,95   1,002,82   1,001,58   1,002,05   1,002,33   1,000,59   1,003,16   1,001,14   1,006,03
UICC II   B034NTB034TB089NTB089TC089NTC089TC128NTC128TMD135NTMD135T   1,003,011,007,751,001,711,001,981,005,58   1,004,201,008,861,001,951,001,741,008,55   1,001,681,001,781,002,191,001,431,001,84   1,000,601,0010,031,000,671,004,081,002,41   1,002,391,002,981,001,011,001,371,008,48   1,000,701,0011,771,003,071,006,351,0077,53   1,004,811,0010,201,003,461,002,801,0013,96   1,008,341,009,471,002,801,002,401,005,71   1,000,851,003,611,001,131,001,671,006,36   1,0019,251,0020,071,004,071,004,401,00110,92   1,002,261,004,381,003,591,002,631,004,73   1,0030,461,0043,921,004,261,001,431,0038,59
UICC III   C118NTC118TC150NTC150TC171NTC171TC310NTC310TMD142NTMD142TMD150NTMD150T   1,002,701,002,861,003,171,001,951,003,661,004,34   1,002,411,003,901,002,601,001,521,006,821,0012,38   1,001,151,001,531,001,871,001,691,002,901,003,14   1,007,441,009,501,001,271,000,581,000,841,0013,24   1,009,931,002,251,001,421,003,211,002,631,0030,63   1,008,871,0027,831,001,871,001,931,0037,271,005,68   1,002,271,003,511,003,711,001,451,007,821,006,25   1,002,861,003,341,004,681,001,581,0011,181,0011,67   1,000,241,001,741,000,541,001,191,000,861,000,74   1,004,161,001,831,005,891,001,641,0018,511,0074,03   1,002,111,002,001,002,261,001,631,006,641,005,57   1,0016,201,0020,751,009,981,003,381,0020,441,0011,31
UICC IV   C111NTC111TMD214NTMD214T   1,001,781,003,77   1,002,911,005,22   1,002,171,003,85   1,000,901,0018,64   1,001,761,002,27   1,000,751,004,24   1,002,981,006,29   1,002,461,003,98   1,002,231,003,17   1,003,111,0010,10   1,001,901,002,96   1,003,711,0017,39
所有癌症病例经过鉴定，至少一种本发明的免疫原性膜蛋白在肿瘤组织中的表达比在正常组织中至少高两倍。图2显示基于TM4SF6表达的诊断结果。
实施例4.蛋白表达的反义抑制
为了降低过量表达所述蛋白的细胞的致瘤性潜在性，可特异性下调本发明的所述免疫原性膜蛋白的基因表达。这种最近研发的和广泛应用的技术使用短的(21bp)合成的双链RNA双螺旋(沉默子RNA，siRNA)，其与靶基因mRNA的编码序列互补并引发特异性mRNA降解。使用siRNA转染到肿瘤细胞系内，已经“敲除”了许多哺乳动物的基因，并且已经描述了所得的表型。
简要地，对于上述蛋白基因(SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3和ZP3)中的每一种，在它们相应mRNAs上的不同位置设计3到5个siRNA，使用Dharmacon“siDESIGN Center”软件以及人Unigene中的另外的BlastN2以便将离靶(off-target)同源性降到最低。合成的siRNAs购自Dharmacon或MWG biotech。将不同的人类肿瘤细胞系一式三份用每种siRNA 50nM连续转染(使用Lipofectamine 2000，Invitrogen)三天，在基因敲除的第一次转染后的第4天进行分析。通过定量RT-PCR，或者如果可获得抗特定蛋白的抗体则通过Western印迹进行基因敲除的分析。
图3显示通过RT-PCR定量的，用TM4SF6特异的siRNAs，SF1和SF2敲除的结果。
在有效的基因敲除与细胞增殖降低一致的那些情况中，可进行进一步的表型分析，例如，用于分析凋亡的染色(Annexin V)、细胞周期分析(使用RNA酶处理和碘化丙锭染色)以及代谢活性测定(WST-1，Roche)。可选择地，为了从试验中排除非转染的细胞，这些分析将用相应的siRNA表达质粒(Ambion的pSilencer或者GenScript的pRNA)在G418(新霉素)选择下进行。编码本发明的免疫原性膜蛋白基因的表达抑制将增加凋亡、细胞周期停止和/或代谢活性降低。
表4：能抑制本发明的免疫原性膜蛋白表达的治疗性siRNA分子。
Figure A20048003408500451
实施例5.本发明免疫原性膜蛋白特异性抗体的鉴定
至少部分基于前面实施例中所描述的结果，治疗剂将与所述免疫原性膜蛋白相互作用并因此能够用于治疗非类固醇依赖性癌。将特异性抗体作为与特定分子相互作用的试剂广泛使用。
通过在大肠杆菌中表达编码TM4SF6的基因片段制备所述蛋白的可溶性的结合片段。
TM4SF6的EC2环的克隆：
使用pfu聚合酶以及引物EC2-a(ggatccagacatgagattaagaac)和EC2-b(aagcttattctgactctataatgg)从基因TM4SF6的已证实序列的克隆中扩增感兴趣的DNA序列。使用TA克隆策略将PCR产物亚克隆到载体pCR2.1内。使用限制性酶Bam HI(在引物EC2-a中)和Hind III(在引物EC2-b中)将感兴趣的DNA序列克隆到Qiagen的细菌表达质粒PQE-30中，产生表达质粒pQE-415-EC2。序列证实后，将载体转化到BL21(DE3)内。
TM4SF6表达：
在30℃在LB-NZ培养基(5g NaCl、5g酵母提取物、10g NZ胺)中培养BL21(Amp.)中的pQE-415-EC2过夜培养物，第二天早上接种450ml LB-NZ(在1L烧瓶内)(到OD600为0.05-0.1)，在37℃培养到OD600为0.5-0.6。
将培养物用5mM(终浓度)IPTG诱导；5-6小时后收获细胞，在3个试管内分成3等份，用20mM磷酸缓冲液pH 8洗涤并在-80℃贮藏用于进一步使用。
制备细胞提取物：
将细胞解冻并添加30ml 20mM磷酸缓冲液pH 8；添加溶菌酶到终浓度为1mg/ml，将混合物在冰上轻轻摇动孵育30分钟，随后添加尿素到终浓度为5M。将DNA通过超声破裂并使用MLA-80超速离心机转子将提取物在25,000rpm离心30分钟。
使用AKTA FPLC的柱层析：
第一次电泳：将上清液加样到Sigma的Ni-琼脂糖柱后，将柱用5倍柱体积的100％缓冲液A1(20mM磷酸缓冲液pH 8、200mM NaCl、5M Harnstoff)洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液B1(20mM磷酸缓冲液pH 8、200NaCl、5M Harnstoff、1M咪唑)洗涤。将蛋白用100％缓冲液B1洗脱。
第二次电泳：对于再层析，用缓冲液A2(20mM磷酸缓冲液pH6.3、250mM NaCl)1∶10稀释感兴趣的流分。将新的Ni-琼脂糖柱用10倍柱体积的0-30％梯度的缓冲液B2(20mM磷酸缓冲液pH 6.3、250mM NaCl、1M咪唑)洗涤。将蛋白用100％缓冲液B2洗脱。
使用资源S的层析：将第二次电泳中的感兴趣的流分在缓冲液A3(20mM MES，pH 6)中1∶20稀释并加样到1ml Respurce S柱上。将蛋白在30分钟内(流速1ml/分)用0-100％梯度的缓冲液B3(20mMMES、500mM NaCl，pH 6)洗脱。
图4显示用考马斯蓝染色的纯化流分的SDS-PAGE。
另外，用根据表5的跨越某种区域的合成肽免疫兔：
表5：用于免疫兔的肽
  基因                   靶区   位置(氨基酸)
TM4SF6    第二个(大的)胞外域(115-208)[EC2环]   122-131
  187-195
  136-148183-196
            第9非-TM区ITM1第14非-TM区   333-347655-669
ZP3       胞外域(23-387)   175-189368-380
            第一囊状区SYPL第二囊状区   77-91183-196
TM9SF2    第一(长)1umenal区(29-300)   45-59102-115
KLH偶联
将100mg匙孔血蓝蛋白(KLH)溶于2ml水中并对2L 0.1M磷酸钠pH 7.8过夜透析。这将除去任何污染的硫醇或氨基化合物。在微离心机中全速离心10分钟除去聚集物。
对于-NH2偶联，向一半KLH中添加5mg肽，随后添加戊二醛到0.1％终浓度，如果必要的话使用NaOH将pH调整到7.8。在4℃，轻轻旋转孵育8-12小时。
添加很少的一撮NaBH4后，将混合物在4℃孵育8-12小时。
对于-SH偶联，将另一等份KLH加热到室温。添加1/9体积溶于DMSO的100mg/ml碘乙酸N-羟基琥珀酰胺酯(Sigma)。在室温下放置10分钟后，KLH将开始变得轻微混浊。将其在用0.1M磷酸钠pH 7.8平衡的P-10柱上纯化。通过颜色汇集含有KLH的流分，添加5mg肽并在4℃轻轻旋转孵育至少8小时。
在第0、14和28天用450-600μg偶联KLH的肽免疫兔子，初次注射用完全弗氏佐剂，强化注射用不完全佐剂。
抗体的纯化
根据生产商的说明，将各自肽与AF-Amino Toyopearl 650M偶联，并在PBS中用于批层析，随后用PBS洗涤5次。
特异性结合基质的抗体用100mM甘氨酸pH 2.5洗脱。
将纯化的抗体在-20℃贮藏在PBS/0.01％叠氮钠/1％BSA/50％甘油中。
实施例6：组织切片的免疫组化
免疫组化是一种现有技术中公知的体外诊断方法。使用下列方案对石蜡包埋的组织切片进行TM4SF6染色，使用EP03-415抗体。
Pre-预孵：                 TBS/0.1％Triton-X-100(30分钟)；rt
POX-抑制：                 3％H2O2(10分钟)
抑制：                     SEA-封闭(10分钟)
一抗孵育：                 在TBS中1∶200稀释/10％SEA封闭(30分钟)
洗涤：                     TBS/0.05％Tween 20(3×10分钟)；rt
二抗和显色                 En Vision，POD(DAKO)；30分钟；rt
                           DAB；5分钟；rt
图5显示患结肠癌和黑素瘤患者的免疫组化结果。染色模式允许区分健康的、非转化的组织和癌细胞。因此，可对活检和/或手术样品进行免疫组化用于诊断目的。

Claims (33)

1.筛选治疗非类固醇依赖性癌治疗剂的方法，其中非类固醇依赖性癌的特征是至少一种选自TM4SF6、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽和/或其片段的免疫原性膜蛋白的异常表达和/或生物学活性发生改变。
2.权利要求1的方法，包括：
a.在允许特异性结合和/或相互作用的条件下，使在所述免疫原性膜蛋白启动子控制下的报告分子构建体与试验分子或化合物、或者试验分子或化合物的文库接触；
b.检测报告分子构建体的表达水平，
其中相对于对照，表达水平的改变表明具有潜在的治疗活性。
3.权利要求1的方法，包括：
a.在使特异性结合和/或相互作用的条件下，使所述至少一种免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段与试验分子或化合物、或者试验分子或化合物的文库接触；
b.检测特异性结合和/或相互作用的水平，
其中相对于对照，相互作用水平的改变表明具有潜在的治疗活性。
4.权利要求1-3中任何一项的方法，其中治疗剂抑制所述至少一种免疫原性膜蛋白的表达和/或生物学活性。
5.权利要求1-4中任何一项的方法，其中试验分子或化合物的文库选自DNA和/或RNA分子、肽、激动剂、拮抗剂、单克隆抗体、免疫球蛋白、小分子药物、药剂及它们的组合。
6.一种药物组合物，包括由权利要求1-5中任何一项方法鉴定的治疗剂、或片段、衍生物或其同系物。
7.权利要求6的药物组合物，进一步包括药学上可接受的载体。
8.通过权利要求1-5中任何一项鉴定的治疗剂、或衍生物或其同系物、或者含有和/或表达所述治疗剂或衍生物或其同系物的递送复合物在制备治疗非类固醇依赖性癌的药物组合物中的用途。
9.一种抑制编码所示至少一种免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列的方法，用于调节靶细胞的增殖和/或分化或细胞死亡的目的，包括：
a.提供权利要求6-8中任何一项的组合物，或者包括通过权利要求1-5中任何一项方法鉴定的治疗剂的组合物，和
b.将治疗有效量的(a)的组合物与所述靶细胞接触。
10.权利要求9的方法，其中所述靶细胞是肿瘤细胞。
11.一种治疗由所述至少一种免疫原性膜蛋白的异常表达和/或生物学活性改变所致的非类固醇依赖性癌的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求6-8中任何一项的药物组合物，或者通过权利要求1-5中任何一项方法鉴定的治疗剂。
12.权利要求9-11中任何一项的方法，其中治疗剂是与所述至少一种免疫原性膜蛋白或其片段互补的反义多核苷酸序列。
13.权利要求10-12中任何一项的方法，其中所述反义多核苷酸序列的结合有效地改变编码所述至少一种免疫原性膜蛋白或其片段的mRNA在表达所述mRNA的宿主细胞中的转录或翻译。
14.权利要求10-13中任何一项的方法，其中从病毒载体中表达反义多核苷酸序列。
15.权利要求14的方法，其中病毒杂体是痘苗病毒、反转录病毒、腺病毒或它们的组合。
16.权利要求18的任何一项的方法，其中反义多核苷酸序列位于递送复合物内。
17.权利要求19的方法，其中递送复合物是固醇、脂质、病毒。
18.一种治疗以表达所述至少一种免疫原性膜蛋白或其片段为特征的非类固醇依赖性癌的方法，包括下列步骤：
a.分离细胞
b.使所述细胞与权利要求12-17中所定义的反义分子接触，和
c.向患非类固醇依赖性癌的患者施用所述的细胞。
19.如在权利要求12-17中所定义的反义分子或者表达和/或含有所述反义分子的细胞在制备治疗非类固醇依赖性癌的药物组合物中的用途。
20.权利要求18的方法或权利要求19的用途，其中所述细胞来自治疗的受试者。
21.至少一种所述的免疫原性膜蛋白、片段、衍生物或其同系物，或者含有和/或表达至少一种所述免疫原性膜蛋白、或片段、衍生物或其同系物的细胞在制备用于接种受试者的药物组合物中的用途。
22.筛选特异性结合编码所述至少一种免疫原性膜多肽的多核苷酸或者结合至少一种免疫原性膜多肽的试剂的方法，包括：
a.在使特异性结合和/或相互作用的条件下，使所述至少一种免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段与试验分子或化合物、或者试验分子或化合物的文库接触；
b.检测特异性结合和/或相互作用的水平。
23.权利要求22的方法，其中试验分子或化合物文库选自DNA和/或RNA分子、肽、激动剂、拮抗剂、单克隆抗体、免疫球蛋白、小分子、药剂及它们的组合。
24.一种特异性结合编码所述至少一种免疫原性膜多肽的多核苷酸或者结合所述至少一种免疫原性膜多肽的试剂。
25.权利要求24的试剂，其是抗体，优选地是单克隆抗体。
26.权利要求24的试剂或权利要求25的抗体，包括另外的部分。
27.权利要求24-26中任何一项的试剂或抗体在制备用于非类固醇依赖性癌的治疗、诊断或显现的药物组合物中的用途。
28.权利要求1-27中任何一项的用途、方法、试剂或药物组合物，其中非类固醇依赖性癌是乳腺癌、肺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、皮肤癌和/或上皮组织引起的其它癌。
29.权利要求28的用途、方法、试剂或药物组合物，其中非类固醇依赖性癌是皮肤癌，特别是黑素瘤或结肠直肠癌。
30.一种确定受试者是否有发展成非类固醇依赖性癌的风险或者患有该病的方法，包括：
a.测定所述受试者的样品中编码所述至少一种免疫原性膜多肽的多核苷酸的量或所述免疫原性膜多肽的量，和
b.将所述多核苷酸或多肽的量与代表健康受试者的对照量进行比较。
31.一种鉴定受试者是否有发展成非类固醇依赖性癌的风险或者患该病的试剂盒，其中非类固醇依赖性癌由编码SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽的多核苷酸序列的异常表达所致，试剂盒包括测量所述受试者的细胞样品中编码SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3的多核苷酸序列(分别是X68194、AF190167、BC006433、X91788、M13667、BC000214、U31382、NM 021999、L38961、U81006、AF043906、U30185、AB011540、U20489、U88879、X56777)水平的方法以及使用该试剂盒的说明。
32.一种鉴定受试者是否有发展成非类固醇依赖性癌的风险或患该病的试剂盒，其中非类固醇依赖性癌由SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽的生物学活性改变所致，该试剂盒包括测量所述受试者的细胞样品中SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽水平的方法以及使用该试剂盒的说明。
33.权利要求1-30中任何一项的药物组合物、方法、用途或试剂盒，其中所述至少一种免疫原性膜蛋白是人源的。
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WO (1) WO2005026735A2 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102395682A (zh) * 2007-09-06 2012-03-28 生物治疗诊断股份有限公司 肿瘤分级和癌症预后
CN104204805A (zh) * 2012-03-14 2014-12-10 萨克生物研究学院 腺病毒肿瘤诊断法
CN109646685A (zh) * 2017-10-12 2019-04-19 北京医院 stomatin蛋白及其编码基因在肺癌诊断治疗中的应用
CN111394370A (zh) * 2020-03-03 2020-07-10 华南农业大学 一种猪RagA基因及其应用
CN114540349A (zh) * 2020-11-27 2022-05-27 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 结合yb-1蛋白的核酸分子
CN116482367A (zh) * 2023-05-04 2023-07-25 中国中医科学院望京医院(中国中医科学院骨伤科研究所) 一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006093337A1 (ja) * 2005-03-03 2006-09-08 Takeda Pharmaceutical Company Limited 癌の予防・治療剤
US7897583B2 (en) 2005-05-24 2011-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to PTPRU
WO2007058536A1 (en) * 2005-11-16 2007-05-24 Pantarhei Bioscience B.V. Pharmaceutical composition for treating or preventing ovarian cancer
US20100028335A1 (en) * 2007-02-02 2010-02-04 Novartis Ag Compositions and Methods to Treat Bone Related Disorders
JP2010527633A (ja) * 2007-05-25 2010-08-19 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド Ｔｏｌｌ様受容体３モジュレーター及びその使用
US8158373B2 (en) * 2008-03-25 2012-04-17 Case Western Reserve University Method of detecting cancer and evaluating cancer prognosis
WO2010056993A2 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Emory University Prostate cancer biomarkers to predict recurrence and metastatic potential
US9492472B2 (en) 2008-12-23 2016-11-15 Case Western Reserve University Compositions and methods of treating cancer
WO2011008631A2 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Omnova Solutions Inc. Protective coating compositions
EP2975399B1 (en) 2010-09-15 2022-05-11 Almac Diagnostic Services Limited Molecular diagnostic test for cancer
EP2809800A1 (en) 2012-01-30 2014-12-10 VIB vzw Means and method for diagnosis and treatment of alzheimer's disease
JP6327662B2 (ja) * 2012-09-26 2018-05-23 学校法人藤田学園 細胞表面タンパクを抗原とする抗体を測定する方法
WO2016080830A2 (en) * 2014-11-18 2016-05-26 Pantarhei Bioscience B.V. Immunotherapeutic method for treating pancreatic cancer
AU2021241355A1 (en) 2020-03-23 2022-10-13 Hdt Bio Corp. Compositions and methods for delivery of RNA
AU2022348995A1 (en) * 2021-09-22 2024-04-11 Hdt Bio Corp. Cancer therapy compositions and uses thereof

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54117459A (en) 1978-01-20 1979-09-12 Glaxo Group Ltd Novel lactam compound
US4849338A (en) 1982-07-16 1989-07-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay
US4843000A (en) 1979-12-26 1989-06-27 Syntex (U.S.A.) Inc. Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4520110A (en) 1981-10-06 1985-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing a phycobiliprotein labeled ligand or receptor
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4542104A (en) 1983-04-06 1985-09-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. Phycobiliprotein fluorescent conjugates
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB9705949D0 (en) 1997-03-21 1997-05-07 Electrophoretics International Diagnosis of tumours and other abnormalities of body cells
US6197543B1 (en) * 1997-10-28 2001-03-06 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human vesicle membrane protein-like proteins
US6902898B2 (en) * 1998-11-16 2005-06-07 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Human derived bradeion proteins, DNA coding for the proteins, and uses thereof
EP1033404A1 (en) * 1999-01-29 2000-09-06 F. Hoffmann-La Roche Ag New gene with down-regulated expression in metastatic human melanoma cells
US6228392B1 (en) 1999-04-29 2001-05-08 Gene Tools, Llc Osmotic delivery composition, solution, and method
EP1265582A2 (en) * 1999-09-29 2002-12-18 Human Genome Sciences, Inc. Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides
US20030104413A1 (en) * 2000-07-14 2003-06-05 Tang Y. Tom Novel Nucleic acids and polypeptides
US20030108926A1 (en) * 2000-03-15 2003-06-12 Eos Biotechnology, Inc. Novel methods of diagnosing colorectal cancer, compositions, and methods of screening for colorectal cancer modulators
CA2411278A1 (en) * 2000-06-09 2001-12-20 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
JP2004512029A (ja) * 2000-08-16 2004-04-22 カイロン　コーポレイション ヒト遺伝子および遺伝子発現産物
US20030134283A1 (en) * 2000-10-03 2003-07-17 Peterson David P. Genes regulated in dendritic cell differentiation
US20020160382A1 (en) * 2000-10-11 2002-10-31 Lasek Amy W. Genes expressed in colon cancer
AU2002343443A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Classification of lung carcinomas using gene expression analysis
EP1308459A3 (en) * 2001-11-05 2003-07-09 Research Association for Biotechnology Full-length cDNA sequences
EP1560597A4 (en) * 2002-10-29 2007-06-27 Pharmacia Corp DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES INVOLVED IN CANCER, POLYPEPTIDES CODED THEREWITH, AND METHODS OF USING GENES

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102395682A (zh) * 2007-09-06 2012-03-28 生物治疗诊断股份有限公司 肿瘤分级和癌症预后
CN104204805A (zh) * 2012-03-14 2014-12-10 萨克生物研究学院 腺病毒肿瘤诊断法
CN104204805B (zh) * 2012-03-14 2017-08-01 萨克生物研究学院 腺病毒肿瘤诊断法
CN109646685A (zh) * 2017-10-12 2019-04-19 北京医院 stomatin蛋白及其编码基因在肺癌诊断治疗中的应用
CN111394370A (zh) * 2020-03-03 2020-07-10 华南农业大学 一种猪RagA基因及其应用
CN111394370B (zh) * 2020-03-03 2022-03-25 华南农业大学 一种猪RagA基因及其应用
CN114540349A (zh) * 2020-11-27 2022-05-27 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 结合yb-1蛋白的核酸分子
CN116482367A (zh) * 2023-05-04 2023-07-25 中国中医科学院望京医院(中国中医科学院骨伤科研究所) 一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0414446A (pt) 2006-11-14
IL174047A0 (en) 2006-08-01
JP2007521015A (ja) 2007-08-02
WO2005026735A3 (en) 2005-11-03
EP2050827A2 (en) 2009-04-22
SG146622A1 (en) 2008-10-30
CA2539490A1 (en) 2005-03-24
EP2050827A3 (en) 2009-09-02
AU2004272747A1 (en) 2005-03-24
WO2005026735A2 (en) 2005-03-24
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