CN1897961A - 预防和治疗炎性疾病或病症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗或预防患者炎性疾病或病症的方法和组合物，包括给予患者治疗有效量的包含谷胱甘肽供体、5－氨基4－咪唑羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)、3－羟基－3－甲基戊二酸单酰－辅酶A(HMG－CoA)还原酶抑制剂、D－苏－1－苯基－2－癸酰基氨基－3－吗啉代－1－丙醇盐酸盐(D－PDMP)和/或1，5－(丁基亚氨基)－1，5－二脱氧－D－山梨醇(Miglustat)或它们的衍生物的组合物。

Description

预防和治疗炎性疾病或病症的方法和组合物
本申请要求2004年4月2日提交的美国临时申请60/559,112，和2003年12月23日提交的美国临时申请60/531,828的优先权。这些临时申请被纳入本文作为参考。
发明背景
A.发明领域
本发明总地涉及生物科学领域。更具体地说，本发明涉及用于治疗或预防炎性疾病的组合物及其使用方法。
B.相关领域的描述
炎性疾病和病症构成了现代社会的严重健康问题。目前治疗这种疾病和病症的方法对患者以及整个卫生保健体系来说是巨大的金融负担。当存在多种不同类型的炎性疾病，如中风、阿耳茨海默病、帕金森病、多发性硬化、病毒性脑炎、获得性免疫缺陷(AIDS)相关性痴呆、肌萎缩性侧索硬化、脑外伤、脊髓疾病和其它神经退行性疾病时，上述情况尤为突出。
例如，中风是美国第三大致死原因，伴有严重的长期身体和认知失能，尤其对于老年患者(Feigin等.2003；Sarti等.2000)。中风是部分脑的局部血流减少的结果。接近85％的中风的本质是缺血，在这种情况下，缺氧的脑细胞，主要是缺血中心(核心)的神经元，由于ATP耗竭和离子衰竭而快速坏死。核心被环状半影包围(Leker和Shohami 2002)，该环状半影中风时电静息但存在明显血流。半影功能在中风最初几小时内随着血供的恢复(再灌注)而复原。半影细胞通过凋亡而死亡且较慢。延迟的氧合作用、凋亡和再灌注使得该区域易于受炎症和自由基的侵袭。最终，损伤导致神经退变和脑功能的丧失。利用中脑动脉闭塞(MCAO)技术形成的局灶性脑缺血大鼠模型被广泛接受作为人中风临床表现的最佳模型(Ginsberg和Busto 1989)。
中枢神经系统中，凋亡在神经退行性疾病如缺血损伤和白质疾病中起到重要的病理作用(Thompson，1995；Bredesen，1995)。X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)和多发性硬化(MS)是脱髓鞘病，其中促炎细胞因子参与白质炎症表现。X-ALD脑的星形胶质细胞和小胶质细胞中免疫反应性肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素1(IL-1β)的存在表明，这些细胞因子参与X-ALD的免疫病理学，使得X-ALD与人CNS中最常见的免疫介导脱髓鞘病MS相一致(Powers，1995；Powers等，1992；McGuinnes等，1995；McGuiness等，1997)。一些研究证明，MS患者脑脊液和脑组织中在蛋白或mRNA水平诱导促炎细胞因子建立了促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IFN-γ)与MS中炎症灶的关联(Maimone等，1991；Tsukada等，1991；Rudick和Ransohoff，1992)。
X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)，一种遗传性隐性过氧化物酶紊乱，其特征是进行性脱髓鞘和肾上腺皮质功能不全(Singh，1997；Moser等，1984)。它是最常见的过氧化物酶紊乱，影响1/15,000到1/20,000的男孩，表现是不同程度的神经失能。儿童X-ALD(X-ALD的主要形式)约在4-8岁发病，2-3年内死亡。虽然X-ALD具有各种临床表型，包括儿童X-ALD、肾上腺脊髓神经病(AMN)和阿狄森病，但所有形式的X-ALD都伴有作为胆固醇酯、磷脂和神经节苷脂成分的饱和长链脂肪酸(VLCFA)(22个碳原子以上)的特殊病征蓄积(Moser等，1984)和次级神经炎性损伤(Moser等，1995)。X-连锁的肾上腺脑白质营养不良中坏死性损伤可通过激活星形胶质细胞和诱导促炎细胞因子来介导。由于血浆和X-ALD的成纤维细胞中中VLCFA以相似浓度存在，成纤维细胞通常用作出生前和出生后疾病的诊断(Singh，1997；Moser等，1984)。
与从X-ALD成纤维细胞分离的纯化过氧化物酶体中二十四酰基-CoA的正常氧化相比，二十四酰基-CoA连接酶氧化活性的缺陷表明，VLCFA的氧化异常可能是由于二十四烷酸活化形成二十四酰基-CoA所需的二十四酰基-CoA连接酶活性的缺陷(Hashmi等，1986；Lazo等，1988)。虽然这些代谢研究表明二十四酰基-CoA连接酶基因是X-ALD基因，定位克隆研究鉴定了编码蛋白(ALDP)的基因，该基因与转运蛋白超家族的ATP-结合盒(ABC)具有明显的同源性(Mosser等，1993)。转染X-ALD基因后(Cartier等，1995)X-ALD细胞中脂肪酸的标准化支持ALDP在脂肪酸代谢中的作用；然而，目前尚不知道ALDP在VLCFA代谢中的确切功能。
与其它影响中枢神经系统的遗传病类似，X-ALD的基因治疗似乎不是近期可实现的方法，并且在没有这种治疗的情况下，已研究了许多治疗应用(Singh，1997；Moser，1995)。与X-ALD相关的肾上腺皮质功能不全易于响应类固醇替代疗法，但尚不存在神经失能的确实疗法(Moser，1995)。将单烯脂肪酸(例如，油酸)加入到培养的X-ALD患者皮肤成纤维细胞中，可能由于对相同链延长酶的竞争而导致饱和VLCFA的降低(Moser，1995)。用三油酸酯治疗X-ALD患者可使VLCFA降低50％。后续用三油酸酯和三芥酸酯(通常称为Lorenzo′s油)的化合物治疗X-ALD患者也可使血浆VLCFA水平降低(Moser，1995；Rizzo等，1986；Rizzo等，1989)。X-ALD相关的肾上腺皮质功能不全对类固醇替代治疗容易地起反应，然而，对神经失能仍然没有经证实的疗法(Moser，1995)。将单烯脂肪酸加入培养的X-ALD患者的皮肤成纤维细胞中引起饱和VLCFA降低，估计是由竞争相同的链延长酶引起(Moser，1995)。用三油酸酯治疗X-ALD患者导致VLCFA降低50％。随后用三油酸酯和三芥酸酯的混合物(俗称为洛伦佐油(Lorenzo’s oil))治疗X-ALD患者也导致VLCFA血浆浓度降低(Moser，1995；Rizzo等，1986；Rizzo等，1989)。令人遗憾的是，临床效果还不令人满意，因为尚未观察到通过缓解X-ALD患者髓鞘溶解性炎症达到有益效果的证据(Moser，1995)。而且，从外部加入不饱和VLCFA可诱导人中性粒细胞产生超氧化物，一种高反应性氧自由基(Hardy等，1994)。由于X-ALD大脑脱髓鞘与吞噬细胞大量浸润损伤部位有关(Powers等，1992)，所以不饱和脂肪酸治疗对X-ALD患者甚至可能有毒。骨髓治疗的价值似乎也有限，因为方案复杂且改善患者临床状态的效果不明显(Moser，1995)。
实验性变应性脑脊髓炎(EAE)是一种中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘病，用作人脱髓鞘病、多发性硬化(MS)的模型。研究表明，大部分炎症细胞由T-淋巴细胞和巨噬细胞构成(Merrill和Benveniste，1996)。这些效应细胞和星形胶质细胞通过分泌用作炎症中介体和/或组织损伤剂如一氧化氮(NO)的许多分子，导致发病。NO是一种同时具有有益和有害作用的分子。在神经炎性疾病如EAE中，诱生型一氧化氮合酶(iNOS)长期产生的大量NO用作神经元细胞的细胞毒剂。过去的研究已表明，NO本身或其反应活性产物(ONOO-)可能负责少突胶质细胞(CNS的髓鞘质产生细胞)死亡，导致神经炎性疾病进程中的脱髓鞘(Merrill等，1993；Mitrovic等，1994)。
EAE中的浸润T-淋巴细胞产生促炎细胞因子，例如IL-12、TNF-α和IFN-γ(Merrill和Benveniste，1996)。除T-细胞和巨噬细胞以外，发现星形胶质细胞也可产生TNF-α(Shafer和Murphy，1997)。存在可信的证据，支持TNF-α和IFN-γ在EAE的发病中起作用(Taupin等，1997；Villarroya等，1996；Issazadeh等，1995)。抗TNF-α的抗体研究表明，这些抗体可保护小鼠不患活性和适应性转移的EAE病(Klinkert等，1997)。EAE病期间TNF-α和IFN-γ的表达可导致巨噬细胞和星形胶质细胞中iNOS上调，因为已证明TNF-α和IFN-γ在培养的巨噬细胞和星形胶质细胞中是iNOS的强效诱导剂(Xie等，1994)。诱导iNOS可产生NO，产生大量NO时可导致细胞毒作用。已在MS和EAE CNS中鉴定了过氧亚硝酸根(ONOO-)(Hooper等，1997；van der Veen等，1997)。尿酸(一种过氧亚硝酸根清除剂)抗EAE的有益效果，以及后续研究表明MS患者与对照组相比血清尿酸水平明显较低，都支持过氧亚硝酸根在EAE发病机制中的作用(Hooper等，1998)。然而，NOS活性抑制剂导致EAE恶化(Ruuls等，1996)，在iNOS基因敲除的动物模型(Fenyk-Melody等，1998)中表明，NO可能不是EAE疾病进程中唯一的病理中介体。除NO外，细胞因子还可刺激其它自由基如活性氧中间体(O2 -、H2O2和OH-)(Merrill和Benveniste，1996)。认为活性氧中间体(ROI)和NO是炎性疾病进程中发生病理生理变化的关键中介体。ROI，如超氧化物阴离子、羟自由基和过氧化氢也可由TNF-α刺激(Merrill和Benveniste，1996)。因此，可能促炎细胞因子直接调节细胞功能以及ROI和活性氮的毒性都在EAE疾病发病机制中起作用。
一些对来自MS患者的血浆、脑脊液(CSF)、脑组织和培养的白细胞的蛋白和/或mRNA水平的研究已经建立了促炎细胞因子(TNF-α，IL-1和IFN-γ)与MS的关联(Taupin等，1997；Villarroya等，1996；Issazadeh等，1995)。在MS和EAE脑中都可检测到iNOS的mRNA(Bagasra等，1995；Koprowski等，1993)。从MS脑中iNOS mRNA的半定量RT-PCRTM中明显看出，MS脑中iNOS mRNA的表达显著高于对照脑(Bagasra等，1995)。对MS患者CSF的分析也显示与正常对照组相比，亚硝酸盐和硝酸盐水平增加(Merrill和Benveniste，1996)。过氧化亚硝酸根ONOO-是能够将蛋白质的酪氨酸残基亚硝化为硝基酪氨酸的强效亚硝化试剂。MS脑和患EAE小鼠脊髓的脱髓鞘损伤中发现硝基酪氨酸水平增加(Hooper等，1998；Hooper等，1997)。MS患者中，CSF细胞因子水平、血脑屏障破坏与循环系统中高水平的细胞因子之间存在强相关性(Villarroya等，1996；Issazadeh等，1995)。TNF-α和IFN-γ水平提高似乎能预测MS复发，并且循环系统中IFN-γ阳性血细胞数量与失能的严重程度相关。这些结果支持了在MS和EAE中，诱导促炎细胞因子和由iNOS产生NO在这些疾病的发病机制中起作用的观点。
阿耳茨海默病(AD)是一种常见的退行性痴呆，主要影响老年人群。该疾病的特征为多种认知功能下降和中枢神经系统中神经元的进行性损失。β-淀粉样肽的沉积也与AD有关。许多研究者注意到，AD脑含有许多免疫介导损伤的经典标记。包括小胶质细胞和星形胶质细胞数量的增加，认为小胶质细胞是外周血巨噬细胞的内源性CNS形式。尤其重要的是，AD脑中免疫组化检测到补体蛋白，它们似乎大多与含β-淀粉样蛋白的病理学结构(称为老年斑)相关(Rogers等，1992；Haga等，1993)。
这些初步观察结果表明，AD中发现的神经退变炎性组分的存在可延伸至临床。使用非甾体消炎药吲哚美辛的小型临床研究表明，吲哚美辛明显减缓疾病进程(Neurology，43(8)：1609(1993))。此外，在AD发病相隔3年或更多年的50对老年双胞胎患者中研究发明年龄，结果表明，消炎药可防止或延迟AD症状的初次发作(Neurology，44：227(1994))。
许多年来，研究了许多疗法抗EAE或MS疾病的有益效果，但得到复杂的结果(Cross等，1994；Ruuls等，1996)。虽然氨基胍(AG)被描述为一种iNOS竞争性抑制剂和iNOS表达的阻抑剂(Corbett和McDaniel，1996；Joshi等，1996)，但迄今为止，很少能鉴定到具有抑制iNOS的潜在治疗价值的化合物。这种缺陷在iNOS介导的一氧化氮毒性导致的明显细胞损伤时，特别是慢性炎性疾病状态中尤其麻烦。
                           发明概述
本发明者发现了可在人体中用于治疗或预防炎性疾病的具体化合物。这些化合物包括：谷胱甘肽供体、5-氨基4-咪唑羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)、AMP-活化激酶激活剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-苏(threo)-1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇盐酸盐(D-PDMP)和/或1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇(Miglustat)。这些化合物的衍生物也可用于治疗或预防炎性疾病。
本发明一方面包括预防或治疗患者炎性疾病或病症的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶激活剂(非限制性的例子包括HMG-CoA还原酶抑制剂)、D-PDMP、和/或1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇、或是它们的衍生物。在具体实施方式中，谷胱甘肽供体可以与AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇一起给予。谷胱甘肽供体的非限制性例子包括：S-硝基谷胱甘肽(GSNO)、L-2-氧代-噻唑烷4-羧酸酯(丙环司坦)、N-乙酰基半胱氨酸(NAC)和N-乙酰基谷胱甘肽。在具体实施方式中，考虑到谷胱甘肽供体不是GSNO。HMG-CoA还原酶抑制剂可以是他汀类。可用于本发明的他汀类的非限制性例子包括：阿托伐他汀、洛伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、西立伐他汀或它们的衍生物。可将谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶激活剂、HMG-COA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或Miglustat配制入药学上可接受的运载体中。
在非限制性的方面，可将谷胱甘肽供体包含入药学上可接受的组合物中。AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat可包含入药学上可接受的组合物中。在另一个实施方式中，谷胱甘肽供体和AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat可包含入相同或不同的组合物中。
在本发明的具体方面中，可在给予患者AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇之前、期间和/或之后，给予患者谷胱甘肽供体。类似地，可在给予患者谷胱甘肽供体之前、期间和/或之后给予患者AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇。
本发明方法还可包括确定患者是否需要预防或治疗。确定患者是否需要预防或治疗可包括确定患者是否有患上炎性疾病或病症的风险。确定患者是否有患上炎性疾病或病症的风险可包括检查家族史和患者病史。
可用本发明治疗或预防的炎性疾病或病症非限制性的例子包括：中风、X-肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)、癌症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、心肌炎、关节炎、自身免疫疾病、炎性肠病、炎性神经系统疾病、炎性肺病、炎性眼病、慢性炎性牙龈病、慢性炎性关节病、皮肤病、骨病、心脏病、肾衰竭、慢性脱髓鞘病、内皮细胞疾病、心血管疾病、肥胖、普通感冒、狼疮、镰状细胞贫血、糖尿病、眼病、子宫内/全身感染、脑发育(如大脑性瘫痪)、疱疹痴呆，器官移植/旁路病症或神经退行性疾病。例如，神经退行性疾病可以是阿耳茨海默病、帕金森病、兰-格-巴-斯四氏综合征、多发性硬化、病毒性脑炎、获得性免疫缺陷(AIDS)-相关性痴呆、肌萎缩性侧索硬化、脑外伤或脊髓疾病。在其它实施方式中，本方法也包括给予用于治疗或预防炎性疾病或病症的第二疗法。
本发明的另一方面包括药学上可接受的组合物，所述组合物包含：谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶(如HMG-CoA还原酶抑制剂)、D-PDMP和/或1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇或它们的衍生物。在具体方面，谷胱甘肽供体不是GSNO。可将本发明组合物配制入药学上可接受的介质或运载体中。在具体方面，组合物可包含谷胱甘肽供体和AICAR、谷胱甘肽供体和AMP-活化激酶激活剂(如HMG-CoA还原酶抑制剂)、谷胱甘肽供体和D-PDMP、或谷胱甘肽供体和1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇。谷胱甘肽供体非限制性的例子包括S-硝基谷胱甘肽(GSNO)、丙环司坦、N-乙酰基半胱氨酸或N-乙酰基谷胱甘肽。AMP-活化激酶可以是他汀类。他汀类可以是阿托伐他汀、洛伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀或西立伐他汀。在具体方面，本发明组合物可包含谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶激活剂、HMG-COA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或Miglustat。
在另一实施方式中，提供了在患者中预防或治疗炎性疾病或病症的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的谷胱甘肽供体、5-氨基4-咪唑羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)、他汀类、D-PDMP和/或它们的衍生物。本发明者还考虑包含谷胱甘肽供体、5-氨基4-咪唑羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)、他汀类和D-PDMP或它们的衍生物的药学上可接受的组合物。在具体实施方式中，谷胱甘肽供体不是GSNO。
衍生物的非限制性例子包括仍然保留治疗或预防炎性疾病或病症所需效果的谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶(如HMG-CoA还原酶抑制剂)、D-PDMP和/或Miglustat的化学修饰化合物。这些衍生物可在母体分子上加成、除去或取代一个或多个化学部分。修饰非限制性的例子包括：加成或除去低级烷烃如甲基、乙基、丙基，或取代的低级烷烃如羟甲基或氨基甲基；羧基和羰基；羟基；硝基，氨基，酰胺和偶氮基；硫酸酯、磺酸酯、嗍砜基(sulfono)、巯基、磺酰基、亚砜基、磷酸酯、膦酰基、磷酰基和卤素取代基。其它修饰可包括加成或删除一个或多个原子构架上的原子，例如用丙基取代乙基；用更大或更小的芳香基团取代苯基。或者，在环状或双环结构中，杂原子如N、S或O可取代该结构中的碳原子。这种衍生物可通过本领域技术人员已知的任何方法制备。可通过本文所述任何方法或本领域技术人员已知的方法来测定这些衍生物的所需特性。
本发明其它非限制性的方面包括将上述组合物和方法与一氧化氮合酶和/或细胞因子的一种或多种诱导抑制剂组合。这种诱导抑制剂的例子可参见，例如美国专利6,551,800，特别包括在此作为参考。诱导抑制剂非限制性的例子包括：N-乙酰基半胱氨酸、咯利普兰、西洛司特、罗氟司特、福斯高林、PDTC和4PBA。可与本发明联用和单独使用的其它化合物包括β-干扰素(非限制性例子包括干扰素β-1b(betaseron)、干扰素β-1a(rebif)等)、单克隆抗体、促炎细胞因子与其受体间相互作用的抑制剂、TNFα与其受体间相互作用的抑制剂、依那西普(Enbrel)、英利昔单抗(Remicade)、克帕松(copaxone)、利妥昔、IL-1与其受体间的抑制剂、T细胞受体或其片段、治疗疫苗、半胱天冬酶抑制剂或PDE-4抑制剂，用于治疗炎性疾病或病症。可与本发明联用的单克隆抗体非限制性的例子包括：抗促炎细胞因子、促炎细胞因子与其受体间相互作用的抑制剂、细胞表面分子或细胞表面受体分子、T或B细胞表面标记或独特型、TNFα分子或TNFα受体、癌细胞的细胞表面标记的抗体。
在本发明的又一个实施方式中，提供了在患者中预防或治疗炎性疾病或病症的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的一氧化氮合酶和/或细胞因子的诱导抑制剂。考虑其它化合物也可与该诱导抑制剂联用。其它化合物的非限制性例子包括整篇说明书讨论的化合物(例如，β-干扰素单克隆抗体、促炎细胞因子与其受体间相互作用的抑制剂、TNFα与其受体间相互作用的抑制剂、依那西普、英利昔单抗、克帕松、利妥昔、IL-1与其受体间相互作用的抑制剂、T细胞受体或其片段、治疗疫苗、半胱天冬酶抑制剂或PDE-4抑制剂)。本发明组合物可包括这些化合物的任何组合。
“类似物″包括结构等价物或模拟物。
″患者″或“对象”可以是动物。优选动物是哺乳动物，包括但不限于人、猪、猫、狗、啮齿动物、马、牛、绵羊、山羊和奶牛。优选患者和对象是人。
当在权利要求书和/或说明书中使用时，术语“抑制”、“降低”、“治疗”或“预防”或这些术语的任何变体包括任何可测量的降低或完全抑制，以达到所需结果。
单词“一个”或“一种”在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”联用时，可能表示“一”，但也可表示“一个或多个”、“至少一个”和“一个或一个以上”。
认为本文所述任何实施方式均可用于实施任何本发明方法或组合物，反之亦然。而且，本发明组合物和试剂盒可用于实现本发明方法。
整篇申请中，术语“约”用于表示，值包括测定该值所采用的装置或方法的标准差。
权利要求书中的术语“或”用于表示“和/或”，除非特别说明仅指替代或代替是相互排他性的，但是本文支持仅指替代及“和/或”的定义。
如本说明书和权利要求书中所用，单词“包含”(以及任何形式的包含)、“具有”(以及任何形式的具有)、“包括”(以及任何形式的包括)或“含有”(以及任何其它形式的含有)是包括性或开放式的，不排除其它、未叙述的元素或方法步骤。
从下面的详细说明，本发明的其它目的、特征和优点将显而易见。然而应理解，虽然阐述了本发明具体实施方式，但给出的详细说明和具体实施例仅是示例性的，本领域技术人员从详细说明中会明白在本发明的精神和范围内的各种改变和改进。
                          附图简要说明
下面的附图构成本说明书的一部分，以进一步证明本发明的某些方面。通过参考一幅或多幅附图，结合本文所述具体实施方式的详细描述，可更好地理解本发明。
图1A-1D。在原代星形胶质细胞中，鞘糖脂调节LPS-诱导的iNOS基因表达和NO产生。LPS/IFN□(1μg/ml；10U/ml)处理6小时(iNOS mRNA水平)或24小时(iNOS蛋白和NO水平)后，测定D-PDMP(10、25和50μM)对NO产生(A)和诱导iNOS mRNA和蛋白表达(B)的影响。LPS/IFN□处理前用D-PDMP预处理细胞0.5小时。也测定星形胶质细胞中LacCer对D-PDMP介导的iNOS基因表达抑制的影响。LPS/IFN□刺激前，用D-PDMP(50μM)和/或LacCer(5和10μM)预处理细胞0.5小时。LPS/IFN□刺激6小时和24小时后，分别定量NO产生(C)以及iNOSmRNA和蛋白水平(D)。用总蛋白量标准化亚硝酸盐水平。GAPDH水平用作mRNA水平的内标。测定mRNA及蛋白质和NO的过程如材料和方法中所述。数据表示为3个独立实验的±S.D。***与未刺激对照相比p＜.001(A和C)；％与LPS/IFN□刺激细胞相比p＜.01和#与LPS/IFN□刺激细胞相比p＜.001(A)。#与LPS/IFN□刺激细胞相比p＜.001(B)；@，％与D-PDMP处理细胞相比p＜.001(B)。
图2A-2E。鞘糖脂途径的各种代谢物对D-PDMP介导的LPS-诱导的iNOS基因表达抑制的影响。在用LPS/IFN□刺激之前，用各自浓度为5和10μM的D-PDMP和/或Glucer(A)、GalCer(B)、GM1(C)、GM3(D)和GD3(E)预处理原代星形胶质细胞0.5小时。LPS/IFN□刺激后24小时测定NO产量，如图1图例所述。
图3A-3D。LPS/IFN□刺激对胞内LacCer生物合成的影响。用14C半乳糖处理原代星形胶质细胞过夜，然后用PBS洗去多余的量。LPS/IFN□刺激前用D-PDMP预处理0.5小时，在指定的时间点上收集细胞，如材料和方法中所述通过HPLC分析LacCer(A)。用总蛋白量标准化LacCer的量。使用来自LPS/IFN□刺激不同时间的细胞的细胞裂解物，体外试验测定乳糖基神经酰胺合酶(GalT-2)的酶活，如(B)所示。酶试验如材料和方法中所述。将酶活标准化到总蛋白量上。为敲减GalT-2表达，用GalT-2反义DNA寡聚物或乱序DNA寡聚物转染细胞，如材料和方法中所述。转染细胞2天后，用LPS/IFN□刺激细胞，并测定NO产生(C)及iNOS的蛋白和mRNA水平(D)。数据表示为三次独立实验的±S.D。***与未刺激对照相比p＜.001(A)和***与未刺激对照相比p＜.001(B)。***与刺激、未转染细胞相比p＜.001(C)；#与不含LacCer的转染细胞相比p＜.001(C)。
图4A-4D。C6胶质瘤细胞中，LacCer调节LPS-诱导的iNOS基因表达。LPS刺激之前，用增加剂量的D-PDMP(10、25、50μM)预处理细胞0.5小时。增加剂量的D-PDMP抑制LPS/IFN-α诱导的NO产生、iNOS蛋白和mRNA水平(A)。用LacCer和D-PDMP预处理6小时(iNOS mRNA)和24小时(NO产生和iNOS蛋白水平)时检测到，钝化D-PDMP导致LPS-诱导的NO产生、iNOS蛋白和mRNA水平的抑制，如材料和方法中所述。然而，用GluCer预处理没有LacCer相同的效果(B)。数据表示为三次独立实验的±S.D。***与未刺激对照相比p＜.001(A)；#与刺激细胞相比p＜.001(A)；&与刺激细胞相比p＜.001(B)，**与D-PDMP处理的细胞相比*p＜.001(B)。补充外源性LacCer可逆转NO产生(C)以及iNOS mRNA和蛋白表达(D)的抑制，而GluCer没有这种作用。
图5A-5D。小GTP酶Ras和ERK1/2参与LacCer介导的LPS-诱导iNOS基因表达的调节。用GST标记的Raf-1Ras结合域测定Ras活化，如材料和方法中所述。LPS/IFN□刺激后Ras活化的时程(A)。用LacCer和/或D-PDMP(50μM)预处理后，用LPS/IFN□刺激5分钟，将细胞裂解物用于测定活化Ras水平。将Ras活性标准化到总蛋白量上。蛋白质印迹法检测GST-Rafl结合的Ras，放射自显影的光密度测定如(B)所示。用MEK1/2抑制剂PD98059测定LacCer介导的iNOS表达中ERK1/2的参与。用LPS刺激之前，用PD98059预处理0.5小时，测定刺激后24小时的NO产生和iNOS蛋白水平(C)。用LacCer和/或D-PDMP预处理细胞后，再用LPS/IFN□刺激20分钟，免疫印迹法测定细胞裂解物中活化的ERK1/2水平，如材料和方法中所述(D)。
图6A-6C。LacCer参与LPS/IFNα-介导的NFκB活化和iNOS基因表达。用κB-荧光素酶基因构建物瞬时转染细胞24小时后，在LPS/IFN-α刺激之前0.5小时，用D-PDMP预处理细胞。细胞荧光素酶活性的测定如材料和方法中所述。数据表示为三次独立实验的±SD(A)。用LacCer和/或增加剂量的D-PDMP预处理细胞0.5小时，然后用LPS/IFNα刺激45分钟，用10μg此细胞的核提取物通过凝胶移位试验检测NF-κB DNA结合活性(B)。用抗磷酸化I□B抗体通过免疫印迹检测细胞质提取物中磷酸化I□B水平和总I□B水平(C)。
图7A-7B。SCI后，损伤部位处iNOS mRNA和蛋白表达。iNOS mRNA(A)和蛋白水平(B)显著高于介质(VHC)处理的大鼠的假处理(sham)值。与介质处理的大鼠相比，D-PDMP处理的大鼠的mRNA和蛋白表达明显较低。数据表示为±SD。***与VHC假处理值相比p＜.001(A)；#与VHC处理12小时相比p＜.001。
图8A-8L。通过损伤中心处脊髓切片的双重免疫荧光染色测定iNOS/GFAP共表达。如材料和方法中所述，用iNOS抗体(绿色)和GFAP抗体(红色)染色得到来自SCI大鼠的脊髓切片免疫荧光显微镜照片。(A-C)显示介质假处理组中GFAP(A)、iNOS(B)及其重叠(C)。(D-F)显示VHC处理的SCI中GFAP(D)、iNOS(E)及其重叠(F)。(G-I)显示D-PDMP假处理组中GFAP(G)、iNOS(H)及其重叠(I)。(J-L)显示D-PDMP处理的SCI大鼠中GFAP(J)、iNOS(K)及其重叠。
图9A-9L。通过损伤部位脊髓切片的双重免疫荧光染色测定TUNEL阳性细胞核和神经元细胞核(NeuN)：如材料和方法中所述，用APOPTAG检测试剂盒染色TUNEL阳性细胞和神经元特异性标记物NeuN的抗体得到来自SCI大鼠的脊髓切片免疫荧光照片。(A-C)显示介质假处理组中NeuN(A)、TUNEL(B)及其重叠(C)。(D-F)显示介质处理的SCI中NeuN(D)、TUNEL(E)及其重叠(F)。(G-H)显示D-PDMP假处理组中NeuN(G)、TUNEL(H)及其重叠(I)。(J-L)显示D-PDMP处理的SCI大鼠中NeuN(J)、TUNEL(K)及其重叠(L)。
图10A-10H。SCI大鼠的损伤部位脊髓切片的组织学和髓鞘质含量测定。(A-D)显示介质假处理组(A)、SCI组(B)、D-PDMP假处理组(C)和SCI组(D)的脊髓切片的H&E检测。(E-H)显示介质假处理组(E)、SCI组(F)、D-PDMP假处理组(G)和SCI组(H)中髓鞘质的LFB-PAS染色。
图11。LacCer介导的LPS/IFNα-诱导iNOS基因表达调节模型的示意图。
图12A-12C。每组的两种TTC染色脑切片(从头到尾六个连续区域中的#3和#4)(A)，梗死容量(B)和神经学评分(C)。照片是再灌注24小时时显示的，说明发生MCAO(20分钟)后给予GSNO能降低梗死、梗死容量并提高神经学评分。纹状体和皮层区域中，盐水处理的缺血脑切片(介质)中显示的梗死为未染色白色。GSNO处理的脑切片(GSNO)显示染色大大增加，因而小得多的梗死和梗死容量(p＜0.0001)。如材料和方法中所述，记录神经学评分。GSNO处理可将评估分从2.7(介质)降低至1.1(p＜0.0001)。结果来自7次不同的实验(每组中n＝7)。
图13。MCAO 20分钟后再灌注24小时，大鼠脑的免疫组化显微照片。提增强的反应(棕色DAB染色)显示，未处理(介质)比处理(GSNO)的动物中TNF-、IL-1和iNOS表达更高。TUNEL试验表明，比起处理(GSNO)的动物，未处理(介质)动物细胞死亡明显。(放大倍数400X)。
图14A-14B。MCAO 20分钟后再灌注24小时，大鼠脑的蛋白质印迹。三组不同实验的代表性蛋白质印迹表明，未处理动物(介质)的同侧半球中存在iNOS表达。假处理的动物(假处理组)和处理动物(GSNO)脑中不显示任何明显iNOS表达(A)。(B)是(A)中所示结果的图表。
图15A-15F。MCAO 20分钟后再灌注24小时，大鼠脑免疫组化的显微照片。假处理的动物(假处理组)不显示巨噬细胞/小胶质细胞的活化标记物ED 1染色(A)。未处理(介质)动物中ED 1表达(棕色)增加(B)。GSNO处理(C)可降低ED 1表达。(放大倍数400X)。GFAP染色显示介质组中存在大量的活化星形胶质细胞(E)，绿色荧光。GSNO处理的动物中活化星形胶质细胞数量减少(F)。假处理动物中没有活化星形胶质细胞的存在(D)。(放大倍数400X)。
图16A-16L。GFAP和ED I阳性细胞中iNOS的表达，以及MCAO 20分钟后再灌注24小时TUNEL和神经元的共定位。半影部分中iNOS(B)和GFAP(C)的免疫染色共定位且为淡黄色(A)。并非所有GFAP阳性细胞不与iNOS共定位。类似地，半影同侧切片中iNOS(E-H)和ED 1(F和I)共定位(D和G)。组合图片中共定位区域显示黄色。半影区切片中TUNEL阳性细胞(K)和NSE(神经元标记物)阳性细胞(L)共定位(J)。(放大倍数(A-I)400X和(J)L200X)。
图17。MCAO 20分钟后再灌注24小时，大鼠脑中半胱天冬酶-3的活性。测定大鼠脑匀浆物的胞质部分中半胱天冬酶-3的活性，如材料和方法中所述。未处理(介质)动物中半胱天冬酶-3活性显著增加。处理动物(GSNO)具有如假处理(假处理组)动物的基础活性。
图18A-18D。原代星形胶质细胞和小胶质细胞系(BV2)中，GSNO抑制LPS或LPS/IFNy-介导的iNOS基因表达。用所示不同浓度的GSNO培养原代大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞BV2 30分钟，然后用LPS(1mg/ml)或LPS/IFN□(1mg/50U/ml)处理24小时。为了通过免疫印迹检测iNOS蛋白表达，从星形胶质细胞(A)或BV2(C)制备细胞裂解物，用iNOS抗体检测iNOS条带，如材料和方法中所述。印迹代表两次不同的实验。根据生产商的说明书，用lipofectamine2000(用于原代星形胶质细胞)或lipofectamine Plus(用于BV2)将1.5□g iNOS-荧光素酶瞬时转染到原代星形胶质细胞(B)和BV2(D)中，然后用GSNO和LPS或LPS/IFN□处理刺激6小时。数据是三次不同值的平均值+SD。
图19A-19F。原代星形胶质细胞和小胶质细胞系(BV2)中，GSNO抑制LPS或LPS/IFNy-介导的NF-κB报告活性。根据生产商的说明书，用lipofectamine2000(用于原代星形胶质细胞)或lipofectamine Plus(用于BV2)将1.5μg p(NF-κB)3LdLuc瞬时转染到原代星形胶质细胞(A)和BV2(D)中，然后用GSNO和LPS或LPS/IFNα处理刺激4小时。数据是三次不同值的平均值+SD。用1.5□g p(NF-κB)3LdLuc与0.5mg p65和p50及0.Lmg pCMV-□-gal/孔瞬时共转染原代星形胶质细胞(B)和BV2(E)。如上所述处理细胞和测定荧光素酶活性。数据是三次实验的平均值±SD。用1.5μg iNOS-荧光素酶与0.5mg p65和p50及0.1mg pCMV.-□-gal/孔瞬时共转染原代星形胶质细胞(C)和BV2(F)。如上所述处理细胞和测定荧光素酶活性。数据是三次实验的平均值±SD。在所有共转染试验中，总DNA保持不变(总2.5mg/孔)，为了标准化总DNA，使用pcDNA3(Invitrogen)。为标准化转染效率，转染0.1mg pCMV-□-gal/孔，并通过□-半乳糖苷酶测定试剂盒(Invitrogen)检测□-半乳糖苷酶活性。
图20A-20C。AICAR以剂量依赖方式抑制LPS-诱导的细胞因子合成。将原代大鼠星形胶质细胞(A)、原代小胶质细胞(B)和腹膜巨噬细胞(C)与所示不同浓度的AICAR孵育2小时，然后LPS(1μg/ml)处理24小时。本发明者用ELISA测定释放入培养基中的TNFα(左)、IL-1β(中)和IL-6(右)的浓度。对于TNFα水平，LPS处理6小时时取出培养基，对于IL-1β和IL-6为24小时。结果是四次测定的平均值±SD。*与LPS处理相比p＜0.001，#与对照相比p＜0.001。
图21A-21E。在原代星形胶质细胞、小胶质细胞和腹膜巨噬细胞中，AICAR抑制iNOS的表达。LPS/AICAR处理24小时后，测定原代星形胶质细胞、小胶质细胞(A)和腹膜巨噬细胞(B)上清液中的NO。数据是四次不同实验的平均值±SD。*与LPS处理相比p＜0.001，#与对照相比p＜0.001。为通过免疫印迹检测响应AICAR处理的iNOS蛋白表达，用LPS处理24小时后从星形胶质细胞制备细胞裂解物(C)。印迹代表三次不同实验。为检测iNOS信息，用LPS处理6小时后从星形胶质细胞分离RNA，加工用于Northern印迹分析，如“材料和方法”中所述(D)。*与LPS处理相比p＜0.001，#与对照相比p＜0.001。印迹代表三次不同的实验。用lipofectamine 2000试剂将含有1.□g/孔iNOS-荧光素酶报告载体与0.1□g/孔pCMV-□-gal瞬时转染到原代星形胶质细胞中。转染24小时后，用所示浓度的AICAR预处理细胞2小时，然后用LPS(1□g/ml)处理4小时。裂解细胞，加工用于测定荧光素酶活性(Promega)和-半乳糖苷酶(Invitrogen)。将荧光素酶活性参照-半乳糖苷酶活性标准化，表示为与对照的相对活性。数据是三次不同实验的平均值±SD。***与对照相比p＜0.001，@与LPS处理相比p＜0.001(e)。如上所述瞬时转染原代星形胶质细胞，并用GGPP(10□M)、FPP(10□M)、甲羟戊酸酯(10mM)、AICAR(1mM)和LPS(1□gml-1)处理细胞，测定荧光素酶活性(f)。结果是三次不同值的平均值±SD。***与对照相比p＜0.001，#与LPS处理相比p＜0.001，NS，与LPS处理相比无显著性差异，！与LPS/AICAR处理相比p＞0.05(无显著性差异)。
图22。AICAR通过激活AMPK在神经胶质细胞中抑制NO产生和iNOS基因表达：用AICAR(1mM)预处理原代星形胶质细胞2小时后，用[14C]-醋酸酯脉冲处理2小时。分离脂质，用HP-TLC分析胆固醇和脂肪酸中掺入的标记醋酸酯(a)。数据是三次不同值的平均值±SD。***与未处理细胞相比p＜0.001。加入AICAR(1mM)之前，预孵育腺苷激酶抑制剂(5′-碘代杀结核菌素和IC-51，0.1μM)30分钟。与AICAR孵育2小时后，处理原代星形胶质细胞，用于免疫印迹测定p-AMPK□□□p-Thr 172□□AMPK□□□p-ACC和β-肌动蛋白(上样量相等)，如“材料和方法”中所述(b)。进行光密度测定分析，估计p-AMPK□与AMPK□或p-ACC与β-肌动蛋白的比值。印迹代表两次不同实验。在星形胶质细胞中，用含或不含LPS(□g/ml)的5′-碘代杀结核菌素/IC-51/AICAR处理细胞后24小时，测定细胞裂解物中iNOS蛋白的表达(c)。印迹代表两次不同实验。将原代大鼠星形胶质细胞与反义或错义寡聚物(25μM)以及oligofectamine转染试剂一起孵育48小时，免疫印迹分析测定AMPK□水平(d-i)。用LPS(1□g/ml)处理细胞，裂解用于通过免疫印迹检测iNOS(ii)和AMPK□蛋白(d)，如上所述。进行光密度测定分析，估计AMPK□或iNOS与β-肌动蛋白的比值。印迹代表两次不同实验。如上所述存在或不存在显性负AMPK□2(DN)(0.5□g/ml)时，用lipofectamine Plus将带有□-gal的iNOS-荧光素酶瞬时转染到小胶质细胞(BV2)中。pcDNA3空载体用于在共转染研究中标准化总DNA含量。转染48小时后，用所示AICAR(1mM)和LPS(1□gml)处理细胞，LPS刺激6小时后测定荧光素酶活性(e)。将荧光素酶活性参照-半乳糖苷酶活性标准化。数据是三次不同值的平均值±SD。***与对照相比p＜0.001，#与LPS处理细胞相比p＜0.001，！与LPS/AICAR(0.5mM)处理相比p＜0.001，@与LPS/AICAR(1mM)处理相比p＜0.01。
图23。在原代星形胶质细胞中AICAR抑制LPS诱导的促分裂原活化蛋白激酶(ERK1/2、p38和JNK1/2)：将原代星形胶质细胞与不同浓度的AICAR(0.5-1mM)孵育2小时，然后用LPS处理(1□g/ml)30分钟。用预冷PBC洗细胞，刮入裂解缓冲液中，如材料和方法中所述。将50g总蛋白上样到SDS-PAGE上，然后用抗p42/44、JNK1/2和p38的磷酸化特异性抗体进行免疫印迹分析。洗提相同印迹，用p42/44、JNK1/2和p38总抗体(pan antibody)对相等上样量进行再探测。印迹代表两次不同实验。
图24。在原代星形胶质细胞和BV2细胞中AICAR抑制LPS诱导的NF-κB转录反应。从LPS/AICAR处理原代星形胶质细胞制备核提取物，EMSA分析NF-κB(a)。EMSA数据代表两次不同实验。用1.5μg p(NF-κB)3LdLuc与0.5μgAMPKα2显性负或pcDNA3瞬时共转染小胶质细胞细胞(BV2)，然后用AICAR(1mM)和LPS(b)处理刺激4小时。将荧光素酶活性参照-半乳糖苷酶活性标准化。数据是三次不同值的平均值±SD。***与对照相比p＜0.001，#与LPS处理相比p＜0.001，！与LPS/AICAR(0.5mM)处理相比p＜0.05，@与LPS/AICAR(1mM)处理相比p＜0.05，NS，与LPS处理相比无显著性差异。用LPS与AICAR或LPS独自刺激原代星形胶质细胞，免疫印迹测定其核提取物中的p65和p50(c)。印迹代表两次不同实验。处理原代星形胶质细胞总细胞裂解物，以在所示时间上通过免疫印迹测定IkBα(d)。印迹代表两次不同实验。用1.5μg iNOS(-234/+31)-荧光素酶或iNOS(-331/+31NF-□B突变)-荧光素酶瞬时转染小胶质细胞(BV2)，然后用AICAR(1mM)和LPS处理刺激4小时(e)。将荧光素酶活性参照-半乳糖苷酶活性标准化。数据是四次不同值的平均值±SD。***与对照相比p＜0.001，#与LPS处理细胞p＜0.001。NS：与对照相比无显著性差异，@与LPS处理相比p＜0.001(iNOS(-234/+31)-荧光素酶转染细胞)。
图25。在原代星形胶质细胞和BV2细胞中AICAR抑制LPS诱导的IKKα/□活性和IKK□介导的NF-□B-荧光素酶活性：LPS(1□gml-1)处理之前，将原代星形胶质细胞与AICAR(1mM)孵育。30分钟后，测定IKK□□□活性，如“材料和方法”中所述。进行光密度测定分析，表示为任意单位(a)。数据是三次不同值的平均值±SD。***与对照相比p＜0.001，#与LPS处理相比p＜0.001。用1.5μgp(NF-κB)3LdLuc与0.5μg HA-IKK□或pcDNA3和0.□g pCMV-□-gal/孔瞬时共转染小胶质细胞(BV2)和原代星形胶质细胞。如上所述测定荧光素酶和-半乳糖苷酶活性(b&c)。结果是三次实验的平均值±SD。***与对照相比p＜0.001，#与LPS处理相比p＜0.001，！与LPS处理和□□□□□转染的细胞相比p＜0.001。
图26。AICAR通过下调C/EBP-□的表达抑制LPS-诱导的核转运。按照指示从LPS/AICAR处理的原代星形胶质细胞制备核提取物，EMSA分析C/EBP(a)。EMSA数据代表两次不同实验。在超移位实验中采用C/EBP-□、-□、-□和-□的特异性多克隆IgG，所用核提取物来自LPS-处理(3h)的原代大鼠星形胶质细胞和32P-标记的C/EBP寡聚物。放射自显影图表示在分别制备的核提取物上进行的两次独立实验(b)。将各种处理的核提取物进行免疫印迹，测定C/EBP-□和-□蛋白(c)。将原代星形胶质细胞与包括或不包括1mM AICAR的LPS(1μgml-1)一起孵育。在指定的时间，分离RNA，用于Northern印迹以分析C/EBP-□和-□(d)。印迹代表两次不同实验。用1.5μg iNOS(-1486/+145)-荧光素酶或iNOS-C/EBP去-荧光素酶瞬时转染小胶质细胞(BV2)，然后用AICAR(1mM)和LPS处理刺激4小时(e)。将荧光素酶活性参照-半乳糖苷酶活性标准化。数据是四次不同值的平均值±SD。***与对照相比p＜0.001，#与LPS处理相比p＜0.001，*与对照相比p＜0.05，@与LPS处理相比p＜0.05，&与LPS处理相比p＜0.01(iNOS(-1486/+145)-荧光素酶转染细胞)。
图27。在LPS注射大鼠的血清和大脑皮层中AICAR抑制促炎中介体的表达。给予LPS(0.5mg/kg)1小时之前，腹膜内给予大鼠含或不含AICAR(100mg/kg)的盐水。注射LPS 6小时后取血和器官。ELISA测定血清中NO(i)、TNF□(ii)、IFN□(iii)和IL-1β(iv)的水平(a)，如“材料和方法”中所述。结果是六次测定的平均值±SD。*与LPS处理相比p＜0.001，#与对照相比p＜0.001，NS，无显著性差异。免疫印迹分析6小时分离的腹膜巨噬细胞中的iNOS蛋白(b)。为检测细胞因子的表达，从处理的大鼠中分离脾，用Trizol试剂(Life Technologies)分离总RNA用于基因阵列(Superarray)(c)。结果代表两次独立的实验。如上所述从处理的大鼠分离大脑皮层并分离总RNA。用RT-PCR检测iNOS、TNFα和IL-1β的表达(d)，如“材料和方法”中所述。印迹代表两次不同实验。
图28。各种细胞类型(血管和脑细胞)以及这些细胞分泌的炎症中介体参与神经炎性疾病的示意图。
图29。辛伐他汀治疗多发性硬化的效果。数据是平均临床评分，其中：0＝正常；1＝竖毛，2＝丧失尾部张力，3＝后肢麻痹；4＝截瘫，5＝濒临死亡。
图30A-F。洛伐他汀抑制EAE的临床症状。患病动物的平均临床评分为(A)、(C)和(E)，体重为(B)、(D)和(F)。(A)：在髓鞘质PLP139-151肽的CFA溶液免疫接种SJL/J小鼠上诱导主动EAE。(C)和(E)：在将髓鞘质-PLP139-151致敏的T细胞过继转移入受体SJL/J小鼠上诱导被动EAE。(A)和(C)：诱导EAE后从第0-60天每天用t或5mg/kg的洛伐他汀腹腔注射处理小鼠(每组六只)；(E)从第10天开始给予洛伐他汀。(A)、(C)和(E)：洛伐他汀处理小鼠的疾病严重性明显较低(p＜0.001)。(B)、(D)和(F)：两周一次测定主动和被动EAE小鼠的体重。数据代表三次具有一致结果的独立实验。
图31A-B。从过继性EAE和洛伐他汀处理的SJL/J小鼠腰区(每只小鼠6个)制备，并固定在10％缓冲甲醛中的脊髓切片的组织病理学。将组织包埋在石蜡中，以5-μm厚度切片。(A)：H&E染色组织，放大倍数×100。(B)分离脊髓细胞，染色CD4+和MHC II型细胞，由FACS获得并由CellQuest分析。
图32。DAPI染色的浸润细胞的统计学分析。浸润细胞的定量表明，与对照和洛伐他汀处理(LN)动物相比，EAE动物脊髓中存在大量单核细胞/巨噬细胞及神经胶质细胞和炎症细胞。
图33A-I。大鼠脊髓腰区中ED 1和IL-1β(A-C)、LFA-1(D-F)和CD3(G-I)的免疫荧光检测。Lewis大鼠脊髓切片(腰区)中对IL-1β和ED 1表达的双重免疫荧光染色显示，与对照(A)或处理动物(C)相比，EAE动物(B)表达增加。IL-1β和ED1的共定位显示仅EAE(B)动物中有黄色/橘色。对照(A)和处理(C)动物脊髓切片不显示共定位。
图34A-I。他汀类抑制TNF-α、IFN-γ和iNOS在小鼠CNS中的表达。
图35A-J。洛伐他汀诱导Th2细胞因子。(A)、(C)、(E)、(G)和(I)：第10天从PLP139-151免疫的SJL/J小鼠分离，在PLP139-151(5μg/ml)和洛伐他汀(10和20μM)的存在下以5×106细胞/ml体外培养的DNL细胞。(B)、(D)、(F)、(H)和(J)：从淋巴结分离，以1×106细胞/ml与洛伐他汀(10和20μM)一起在抗-CD3和抗-CD28-预包被板中培养的幼稚T细胞(纯度98％)。48小时(IFN-γ和TNF-α)和120小时(IL-4、IL-5和IL-10)后收集上清液，用于细胞因子测定。(A-D)：PLP-致敏和幼稚T细胞中，IFN-γ和TNF-α显著降低(p＜0.0001)。(E-J)：IL-10、IL-5和IL-4显著增加(p＜0.0001)。值是各点三次测定的平均值，误差线表示+/-SD。数据代表四次具有一致结果的不同实验。
图36A-F。Th1和Th2细胞中，洛伐他汀对GATA-3和T-bet表达的影响。在PLP139-151特异性和幼稚细胞中，体内分析GATA3和T-bet。第10天从免疫的和洛伐他汀处理的小鼠收集DLN，蛋白质印迹分析T-bet(A)和GATA3(B)。将PLP139-151特异性细胞与洛伐他汀(10和20μM)一起孵育48小时。(C)和(D)蛋白质印迹分析T-bet和GATA3，用光密度计扫描条带，以任意单位作图。在rmIL-12或rm-IL-4(10ng/ml)和洛伐他汀(10和20μM)的存在下，用抗-CD3和CD28刺激幼稚T细胞48小时。收集并裂解细胞，分析50μg蛋白质，印迹到膜上，用抗-T-bet(E)和抗-GATA3(F)探测。数据代表三次具有一致结果的独立实验。
图37A-D。在刺激T细胞中，洛伐他汀抑制NF-κβ的核转运。用不同浓度的洛伐他汀预处理幼稚T细胞(纯度98％)2小时，用板结合的抗-CD3和CD28(2μg/ml)刺激4h(NF-κβ)和30分钟(Iκβα)。(A)：用凝胶移位分析NF-κβ的表达。(B)观察到剂量依赖方式的进一步抑制(5-50μM)。(C)制备核提取物，用TranSignal阵列分析NF-κβ的核转运。(D)为测定pIκβα和Iκβα，收集上述刺激的T细胞，使用胞质部分检测pIκβα和Iκβα。光密度计扫描条带，用pIκβα/Iκβα比率作图。数据代表两次具有一致结果的独立实验。
图38A-F。Th1和Th2细胞中，洛伐他汀对GATA-3和T-bet表达的影响。在PLP139-151免疫(100μg/小鼠)和洛伐他汀处理(2和5mg/kg)的小鼠体内分析GATA3和T-bet，在PLP139-151特异和幼稚T细胞中体外测定。第10天从免疫的和洛伐他汀处理的小鼠收集DLN，蛋白质印迹分析T-bet(A)和GATA3(B)。将PLP139-151特异性T细胞与10和20μM洛伐他汀一起孵育48小时。(C)和(D)：蛋白质印迹分析T-bet和GATA3，光密度计扫描条带，以任意单位作图。在rmIL-12或rmIL-4(10ng/ml)和洛伐他汀(10和20μM)的存在下，用抗-CD3和CD28刺激幼稚T细胞48小时。收集并裂解细胞，分析50μg蛋白质，印迹到膜上，用抗-Tbet(E)和抗-GATA3(F)探测。数据代表三次具有一致结果的独立实验。
图39。脊髓损伤(SCI)动物的组合血脑屏障(BBB)运动评分与挫伤天数作图，表示为+/-SD(21表示正常运动。0表示无可见运动)。
图40。从血管浸润到损伤脊髓的单核细胞的免疫荧光染色。
图41。反应性神经胶质增生的免疫荧光染色。
图42。假处理、未处理和处理模型中，少突角质细胞凋亡的结果。
图43。抗氧化剂和消炎药在动物中风模型(中脑动脉闭塞)中的疗效。
图44。抗氧化剂和消炎药在动物中风模型(中脑动脉闭塞)中的疗效。
图45。使用他汀类治疗奎尼酸诱导的癫痫发作(癫痫模型)的实验设计。
图46。大鼠海马中，阿托伐他汀对KA-诱导的神经元细胞死亡的影响(甲酚紫染色)。他汀类抑制海马中海马细胞死亡诱导的KA。给予KA(10mg/kg，i.p.)之前，用阿托伐他汀(LP；10mg/kg)口服预处理(7天之前)大鼠。注射KA 3天后，利用甲酚紫染色检测海马中神经元细胞死亡。
图47。，阿托伐他汀对CA3区中KA-诱导的ED-1表达的影响。阿托伐他汀抑制海马中KA诱导的巨噬细胞浸润。给予KA(10mg/kg，i.p.)之前，用阿托伐他汀(LP；10mg/kg)口服预处理(7天之前)大鼠。注射KA 3天后，利用ED-1的免疫荧光标记作为单核细胞的标记物，检测海马CA1和CA3区中巨噬细胞的浸润。
图48A-B。大鼠海马中，阿托伐他汀对KA-诱导的CA1神经元细胞死亡的影响(tunnel染色)。阿托伐他汀抑制海马中KA诱导的凋亡。给予KA(10mg/kg，i.p.)之前，用阿托伐他汀(LP；10mg/kg)口服预处理(7天之前)大鼠。注射KA 3天后，采用TUNNEL试验检测海马CA1(A)和CA3(B)区中神经元细胞的死亡。
图49。大鼠海马中，洛伐他汀对KA-诱导的神经元细胞死亡的影响(甲酚紫染色)。洛伐他汀抑制海马中神经元细胞死亡。给予KA(10mg/kg，i.p.)之前，用洛伐他汀(Lov；10mg/kg)口服预处理(7天之前)大鼠。注射KA 3天后，利用甲酚紫染色检测海马中神经元细胞的死亡。
图50A-C。大鼠海马中，阿托伐他汀对KA-诱导的TNF-α、IL-1β和iNOS表达的影响。阿托伐他汀抑制海马中KA诱导的炎症基因的表达。给予KA(10mg/kg，i.p.)之前，用阿托伐他汀(LP；10mg/kg)口服预处理(7天之前)大鼠。注射KA 3天后，采用实时PCR检测海马中炎症基因(TNF-α、IL-1β和iNOS)的表达。用GAPDH表达标准化各基因表达。
图51A-C。大鼠海马中，洛伐他汀对KA-诱导的TNF-α、IL-1β和iNOS表达的影响。洛伐他汀抑制海马中KA诱导的炎症基因的表达。给予KA(10mg/kg，i.p.)之前，用洛伐他汀(Lov；10mg/kg)口服预处理(7天之前)大鼠。注射KA 3天后，采用实时PCR检测海马中炎症基因(TNF-α、IL-1β和iNOS)的表达。用GAPDH表达标准化各基因表达。
图52A-D。大鼠中，阿托伐他汀(LP)和洛伐他汀(lov)对KA-诱导的癫痫发作反应的影响。癫痫发作指数：1期，面部痉挛；2期，点头；3期，前肢痉挛；4期，前肢痉挛，站立；5期，站立、跳跃和跌倒。给予KA(10mg/kg，i.p.)之前，用洛伐他汀或阿托伐他汀(Lov或LP；10mg/kg)口服预处理(7天之前)大鼠。
                     说明性实施方式的描述
如上所述，炎性疾病和病症对患有该疾病的人群来说是巨大的经济和健康负担。过去尝试治疗某些炎性疾病，如中风和阿耳茨海默病，但没能完全成功。而且，治疗可能对患者有害并使患者虚弱。
本发明公开了一种治疗和预防所有种类的炎性疾病和病症的新型组合物及其使用方法。本发明组合物可包括以下成分中的任何一种或其组合：谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶激活剂、HMG-COA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或Miglustat。下面将更详细地描述本发明的这些和其它方面。
A.炎性疾病
可考虑用本发明所述方法和组合物治疗和/或预防的炎性疾病或病症包括但不限于：银屑病(Ruzicka等，1994；Kolb-Bachofen等，1994；Bull等，1994)；葡萄膜炎(Mandia等，1994)；I型糖尿病(Eisieik & Leijersfam，1994；Kroncke等，1991；Welsh等，1991)；感染性休克(Petros等，1991；Thiemermann & Vane，1992；Evans等，1992；Schilling等，1993)；疼痛(Moore等，1991；Moore等，1992；Meller等，1992；Lee等，1992)；偏头痛(Olesen等，1994)；类风湿性关节炎(Kaurs & Halliwell，1994)；骨关节炎(Stadler等，1991)；炎性肠病(Miller等，1993；Miller等，1993)；哮喘(Hamid等，1993；Kharitonov等，1994)；Koprowski等，1993)；免疫复合物病(Mulligan等，1992)；多发性硬化(Koprowski等，1993)；缺血脑水肿(Nagafuji等，1992；Buisson等，1992；Trifiletti等，1992)；中毒性休克综合征(Zembowicz & Vane，1992)；心力衰竭(Winlaw等，1994)；溃疡性结肠炎(Boughton-Smith等，1993)；动脉粥样硬化(White等，1994)；肾小球肾炎(Muhl等，1994)；佩吉特病和骨质疏松症(Lowick等，1994)；病毒感染的炎性后遗症(Koprowski等，1993)；视网膜炎(Goureau等，1992)；氧化剂诱导的肺损伤(Berisha等，1994)；湿疹(Ruzica等，1994)；急性同种异体移植物排斥(Devlin，J.等，1994)；和产生NO的入侵微生物引起的感染(Chen，Y和Rosazza，J.P.N.，1994)。
考虑本说明书讨论的和本领域普通技术人员已知的其它炎性疾病也是本发明所述方法和组合物能够治疗或预防的。
B.谷胱甘肽供体
谷胱甘肽是一种三肽，包括氨基酸γ-谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。谷胱甘肽也可称为γ-谷氨酰半胱氨酸甘氨酸或GSH。GSH存在于人肝中。可用作谷胱甘肽供体的分子的非限制性例子包括：L-2-氧代-噻唑烷4-羧酸酯(丙环司坦)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)、N-乙酰谷胱甘肽和S-硝基谷胱甘肽(GSNO)。本发明还考虑，可运载谷胱甘肽或可用作谷胱甘肽生产前体的任何分子可用作谷胱甘肽供体。
例如，N-乙酰半胱氨酸(NAC)是简单氨基酸半胱氨酸的预-乙酰化形式。NAC是已知的抗氧化剂，天然存在于食物中。NAC是体内谷胱甘肽合成重要的前体。L-2-氧代-噻唑烷4-羧酸酯(丙环司坦)是氨基酸半胱氨酸的修饰形式。丙环司坦在谷胱甘肽合成中起作用。N-乙酰谷胱甘肽用作谷胱甘肽的运载体。
GSNO是谷胱甘肽的生理学代谢物(GSH和NO(Megson 2000；Schrammel等.2003)，涉及几种药理学活性(Chiueh 2002)。GSNO能降低栓塞信号的频率(Kaposzta等.2002a；Kaposzta等.2002b；Molloy等.1998)，并可逆转急性血管收缩并防止蛛网膜下出血后的缺血脑损伤(Sehba等.1999)。而且，GSNO对抗由ONOO-引起的氧化应激比GSH要强几倍(Rauhala等.1998)。GSNO可以是有机硝酸盐或组织血纤蛋白溶解酶原激活剂(tPA)有用的替代物；因为它是内源性的，所以不产生耐受。
在GSH的存在下，在NO的氧依赖性氧化期间形成GSNO。GSNO的分解不是自发的，需要添加剂或酶，包括GSNO还原酶或硫氧还蛋白系统(Steffen等.2001；Zeng等.2001)。硫醇、抗坏血酸盐或铜的存在也加速其降解。认为中枢神经系统中的GSNO及相关S-亚硝基硫醇(nitrosothiol)用作内皮细胞或星形胶质细胞与神经元之间的信号传导分子(Chiueh和Rauhala 1999；Lipton 2001)。GSNO介导的S-亚硝基硫醇信号传导在对缺氧的正常反应中尤其重要(Lipton等.2001)。大鼠脑中GSNO以微摩尔浓度存在(Kluge等.1997)。而且，说明蛋白S-亚硝基化/脱亚硝基化可用作凋亡(Gu等.2002)或其它信号传导通路(Choi和Lipton 2000；Stamler等.1997)的组分。
C.5-氨基4-咪唑羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)
5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷(AICAR)已广泛用于在多种细胞型中激活AMPK(Sullivan等，1994；Corton等，1995)。一旦进入细胞，AICAR就被磷酸化为ZMP，模拟AMP对AMPK变构激活的多种作用而不改变核苷酸水平(Corton等，1995)。它不仅诱导变构激活，而且促进上游激酶、AMPK激酶的磷酸化和活化(Moore等，1991；Sullivan等，1994)。已报道在发育小鼠脑中有AMPKα1和α2催化亚基的表达(Turnley等，1999)，但它们的功能有待研究。
考虑可单独使用AICAR，或与本说明书所述其它化合物联用，来治疗或预防炎性疾病和病症。
D.HMG-CoA还原酶抑制剂
HMG-CoA还原酶催化羟甲基戊二酸单酰-CoA转化为甲羟戊酸，这是胆固醇生物合成中的早期限速步骤。可用于本发明的特定HMG-CoA还原酶抑制剂包括他汀类。在临床研究中，他汀类能降低总胆固醇、LDL胆固醇、载脂蛋白B和甘油三酯水平。他汀类也可提高HDL水平。考虑可用于本发明的他汀类包括但不限于：阿托伐他汀、洛伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀和西立伐他汀。这些他汀的化学式包括：
洛伐他汀(MEVACOR)                                                   辛伐他汀(ZOCOR)
                           
Figure A20048003840000283
普伐他汀钠(PRAVACHOL)                                              罗苏伐他汀钙(CRESTOR)
           
氟伐他汀钠(LESCOL)                                                阿托伐他汀钙(LIPITOR)
Figure A20048003840000291
                 西立伐他汀钠(BAYCOL)
考虑单独使用HMG-CoA还原酶抑制剂，或与本说明书所述其它化合物联用，来治疗或预防炎性疾病和病症。
E.D-苏-1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇盐酸盐(D-PDMP)
D-PDMP是葡糖基神经酰胺合酶和乳糖基神经酰胺合酶的抑制剂。D-PDMP的分子式为C23H38N203HCl。D-PDMP的分子量为427.1，可溶于水。D-PDMP的化学式为：
考虑单独使用D-PDMP，或与本说明书所述其它化合物联用，来治疗和预防炎性疾病和病症。
F.1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇(Miglustat)
1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇(Miglustat)是葡糖基神经酰胺合酶(在许多鞘糖脂合成中起作用的葡糖基转移酶)的抑制剂。Miglustat可溶于水。Miglustat的分子式为C10H21NO4，分子量为219.28。Miglustat的化学式为：
Figure A20048003840000293
考虑单独使用Miglustat，或与本说明书所述其它化合物联用，来治疗和预防炎性疾病和病症。
G.第二代化合物
除上述化合物以外，本发明者还考虑到，可制成其它空间相似化合物来模拟这些化合物的关键部分。可以谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶激活剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或Miglustat相同的方式，使用这些模拟化合物。
可通过本领域技术人员已知的建模或化学设计技术产生其它结构等价物或模拟物。现在基于计算机的化学建模技术是公知的。使用这种方法，可设计并合成以与谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶激活剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或Miglustat相似方式起效的化合物。应理解，所有这些空间类似的构建物和第二代分子都落在本发明的范围内。
H.疗法优化
可由单独或与另一这种化合物联用的最佳治疗剂量，测定所鉴定的能够在对象中治疗或预防炎性疾病的化合物。这种测定是本领域技术人员熟知的，包括可用这些药剂治疗的各种疾病的组织培养或动物模型。
上述测定的例子包括本文所述和美国专利5,696,109所述测定。例如，确定脑缺血(中风)时分子治疗潜能的测定评价在生理条件下维持的脑切片中药物防止缺氧事件诱发的不可逆损伤的能力。涉及神经毒素MPTP产生医原性羟自由基的帕金森病动物模型(Chiueh等，1992，包括再此作为参考)可用于评价iNOS或促炎细胞因子诱导抑制剂的保护作用。已知神经毒素MPTP可导致脑中多巴胺能神经元的退化，因而提供实验性诱导帕金森病(如医原性毒性)的优质模型。描述了缺血和再灌注损伤的动物模型，采用分离的铁载荷过多的大鼠心脏测定试剂的保护或治疗益处。简单地说，大鼠接受铁-右旋糖酐溶液肌内注射，以实现心脏组织中明显的铁载荷过多。然后分离心脏，进行总的正常温度全心缺血(globalnormothermic ischemia)，用最初使用的灌注介质再灌注。再灌注期间，监测心率及舒张压和收缩压。对心脏组织样品进行电镜评价，测定线粒体损伤，例如溶胀和膜破裂以及细胞坏死。缺血/再氧合后，比较有药物或没有药物或铁载荷过多时测定的心脏功能和细胞结构损伤，用于确定该药物的疗效。
I.纯化技术
适用于纯化本发明化合物的各种技术是本领域技术人员熟知的。这些技术包括(例如)：聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、凝胶色谱或分子筛色谱和亲和色谱。可用于本发明的这些和其它技术的例子参见Sambrook等，2001。
本文所用术语“纯化”指可从其它化合物分离的化合物，其中，该化合物相对于其天然可获得状态纯化到任意程度。因此，纯化的化合物指从其可能天然存在的环境中游离的化合物。
J.药物组合物和给药途径
本发明的一个实施方式包括，通过将谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶、HMG-COA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或Miglustat中的任一种递送给需要的患者，治疗或预防炎性疾病的方法。这些化合物可以在独立的介质中或包含在一种组合物中递送。通常，有效量的本发明药物化合物和组合物被定义为足以可检测地和重复地缓解、降低、减小或限制疾病或其症状程度的量。更严格的定义可以是包括消除、根除或治愈疾病。
1.药物组合物
本发明药物组合物可包括谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶激活剂、HMG-COA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或Miglustat。短语“药学或药理上可接受”指给予动物，如人时，不产生副作用、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。根据本说明书，本领域技术人员将明白包含谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶激活剂、HMG-COA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或Miglustat的药物组合物的制备，如《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版。Mack Printing Company，1990所述。而且，对于动物(如人)给药，应理解制剂应符合无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA生物标准办公室(Office of Biological Standards)所要求。
“治疗有效量”指在受体动物或患者中可有效产生有益效果的量。可通过查阅出版文献、通过进行体外试验或通过在健康实验动物中进行代谢试验初步确定该量。临床使用之前，宜在动物模型，优选待治疗具体疾病的广泛接受的动物模型中进行确认研究。在某些实施方式中，优选动物模型是啮齿类动物模型，因为它们使用经济，尤其因为所得结果被广泛接受为对临床价值的预测。
如本文所用，“药学上可接受的运载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等物质及其组合，如本领域普通技术人员所了解的那样(Remington’s，1990)。除了在任何常规运载体与活性成分不相容的情况下，考虑其在治疗或药物组合物中的应用。
可通过身体和生理学因素如体重、疾病严重性、待治疗疾病的类型、先前或并行治疗干预、患者特发症和给药途径，确定给予动物患者的本发明组合物的实际剂量。在任何情况下，负责给药的人员将确定组合物中活性成分的浓度和给予个体对象的适当剂量。
在某些实施方式中，药物组合物可包含(例如)至少约0.1％的活性化合物。在其它实施方式中，活性化合物可包括约2％-75％的单位重量，或约25％-约60％以及由其衍生的任何范围。在其它非限制性例子中，每次给药的剂量也可包括约1μg/kg/体重、约5μg/kg/体重、约10μg/kg/体重、约50μg/kg/体重、约100μg/kg/体重、约200μg/kg/体重、约350μg/kg/体重、约500μg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、约10mg/kg/体重、约50mg/kg/体重、约100mg/kg/体重、约200mg/kg/体重、约350mg/kg/体重、约500mg/kg/体重、到约1000mg/kg/体重或更高以及由其衍生的任何范围。在可由上述数字衍生的范围的非限制性例子中，基于上述数字，可给予约5mg/kg/体重-约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重-约500mg/kg/体重等。
在任何情况下，组合物可包含各种抗氧化剂以阻止一种或多种成分的氧化。此外，可通过防腐剂如各种抗菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合来实现防止微生物活动的目的。
根据是否以固体、液体或气溶胶形式给予，以及这种给药途径如注射是否需要无菌，本发明组合物可包含不同类型的运载体。
可将组合物配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，与无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如醋酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的酸加成盐。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸和普鲁卡因。
在组合物是液体形式的实施方式中，运载体可以是溶剂或分散介质，其中包含但不限于：水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)以及它们的组合。例如，可通过使用包衣剂如卵磷脂；通过分散在运载体如液体多元醇或脂质中维持所需的粒度；通过使用表面活性剂如羟丙基纤维素；或这些方法的组合，来维持适当的流动性。
在其它实施方式中，本发明中可使用滴眼剂、鼻溶液剂或喷雾剂、气雾剂或吸入剂。这些组合物通常被设计成与靶组织类型相容。在非限制性例子中，鼻溶液剂通常被设计为水性溶液，以液滴或喷雾形式从鼻孔给药。制备鼻溶液剂，使其在许多方面类似于鼻腔分泌物，以便维持正常纤毛作用。因此，在优选的实施方式中，水性鼻溶液剂通常是等渗或略微缓冲以将pH维持在约5.5-6.5。此外，制剂中可包含抗微生物性防腐剂(类似于眼用制剂中所述)、药物或适当的药物稳定剂(需要时)。例如，已知多种市售鼻制剂，包含药物如抗生素或抗组胺药。
在某些实施方式中，制备口服途径给药的组合物。在这些实施方式中，固体组合物可包含，例如溶液剂、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊(例如硬或软壳明胶胶囊)、缓释制剂、含服组合物、含片、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂或其组合。口服组合可直接掺入食物。口服给药的优选运载体包括惰性稀释剂、可吸收的食用运载体或其组合。在本发明的其它方面，可将口服组合物制备成糖浆剂或酏剂。糖浆剂或酏剂可包括(例如)至少一种活性物质、甜味剂、防腐剂、矫味剂、染料、防腐剂、或是它们的组合。
在某些实施方式中，口服组合物可包含一种或多种粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂或其组合。在某些实施方式中，组合物可包含一种或多种以下成分：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；矫味剂，例如薄荷油、冬青油、樱桃矫味剂、橙矫味剂等；或上述成分的组合。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的物质以外，还可包含运载体如液体运载体。可存在各种其它物质作为包衣剂，或用于改良剂量单位的物理形式。例如，可用虫胶、糖或两者来包衣片剂、丸剂或胶囊。
适合其它给药模式的其它制剂包括栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂型，用药时通常插入直肠、阴道或尿道。插入后，栓剂变软，融化或溶解在腔液中。通产对于栓剂来说，传统运载体可包括(例如)聚烷撑二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方式中，可由含有(例如)约0.5％-10％，优选约1％-2％活性成分的混合物形成栓剂。
将所需量的活性化合物掺入具有上述各种其它成分(需要时)的适当溶剂中并过滤除菌，制备无菌注射溶液。通常，通过将各种无菌活性成分掺入含基本分散介质和/或其它成分的无菌介质中，制备分散剂。对于用于制备无菌注射溶液、悬浮剂或乳剂的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，从之前过滤除菌的液体介质得到活性成分和任何添加的所需成分的粉末。需要时液体介质应适当缓冲，注射前先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。也考虑用于直接注射的高度浓缩组合物的制剂，其中，考虑使用DMSO作为溶剂以获得极快渗透，将高浓度活性成分递送至小区域。
组合物在生产和储存条件下应稳定，并能抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。应理解，应尽可能地将外毒素污染控制在安全水平，例如小于0.5ng/mg蛋白质。
2.给药途径
可静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、伤口内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、子宫内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊泡内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部、局部地、吸入(例如气雾吸入剂)、注射、输注、连续输注、直接靶向细胞的局部灌流浴、通过导管、通过灌洗、霜剂、脂质组合物(例如脂质体)或通过其它方法或上述任何组合给予本发明，如本领域普通技术人员所了解的那样(Remington’s，1990)。
K.联合疗法
为增加本发明组合物，例如包含谷胱甘肽供体、AICAR、AMP-活化激酶激活剂、HMG-COA还原酶抑制剂、D-PDMP和/或Miglustat的任何组合的组合物的治疗有效性，需要将这些组合物与有效治疗炎性疾病或病症的其它疗法联合。
本发明组合物可在其它药剂治疗之前或之后给予，间隔几分钟至几星期。考虑以相互间隔约12-24小时内，更优选约6-12小时内给予两种药物。在一些情况下，当各次给药间存在几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)的间隔时，可能需要显著延长治疗时间。
可采用各种组合，其中，包含本发明组合物的组合物为“A”，第二种药物为“B”：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A    B/B/A/B    A/A/B/B    A/B/A/B    A/B/B/A    B/B/A/A
B/A/B/A    B/A/A/B    A/A/A/B    B/A/A/A    A/B/A/A    A/A/B/A
                            实施例
包括下面的实施例来说明本发明优选实施方式。本领域技术人员应理解，以下实施例中所述技术代表本发明者发现的适用于实施本发明的技术，因此，可认为构成其实施的优选实施模式。然而，本领域技术人员根据本说明书应明白，所述具体实施方式中可进行许多改变且仍然得到相同或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
                          实施例1
                        材料和方法I
试剂。重组大鼠γ干扰素(IFN□)和抗小鼠巨噬细胞iNOS的抗体得自Calbiochem(CA)。DMEM和FBS来自Life Technologies Inc。脂多糖(来自大肠杆菌血清型0111:B4)来自Sigma(MO)。葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基神经酰胺、神经节苷脂和D-PDMP(C23H38N2O3盐酸盐；D-苏-1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇盐酸盐)来自Matreya Inc(PA)。14C-半乳糖和3HUDP-半乳糖得自American Radiolabeled Chemicals(MO)。
细胞培养。从1日龄Sprague-Dawley大鼠全皮层制备富含原代星形胶质细胞的培养物，如过去所述(Pahan等，1998)。简单地说，在不含钙/镁的冰冷Hanks平衡盐溶液pH7.4(HBSS)(Gibco，Grand Island，NY)中快速分离皮层，如过去所述(Won等，2001)。然后切碎组织，在含胰蛋白酶(2mg/ml)的HBSS中孵育20分钟，在含10％FBS和10□g/ml庆大霉素的接种培养基中洗涤2次，然后，通过巴斯德吸管研磨分散细胞，再将细胞接种到75-cm2培养瓶中(Falcon，Franklin，NJ)。37℃、5％CO2孵育1天，将培养基完全换为培养用培养基(含5％FBS和10□g/ml庆大霉素的DMEM)。一周两次更换一半培养液。14-15天后，定轨振荡器上振荡细胞至少1天以除去小胶质细胞，然后接种到多孔组织培养板上。与药物一起孵育前，将细胞与无血清DMEM一起孵育24小时。
将得自ATCC的C6大鼠胶质瘤细胞维持在含10％胎牛血清(FBS)(GIBCO)和10-μg/ml庆大霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基中(DMEM)(GIBCO，CA)。所有培养细胞维持在37℃、5％CO2/95％空气中。80％汇合时，在与LPS/IFN□和其它化合物孵育之前，细胞与无血清DMEM培养基一起孵育24小时。
NO产生试验。细胞在12-孔塑料组织培养板中培养。适当处理后，通过测定培养上清液中的亚硝酸盐，确定产生的NO(Green等，1982)。简单地说，将100μl培养上清液与100μl Griess试剂反应。分光光度法测定试验样品在570nm处的光密度。由获自新鲜培养基中NaNO2反应的标准曲线计算亚硝酸盐浓度。
蛋白质印迹分析。对于iNOS蛋白，用冷Tris缓冲盐水(TBS；20mM Trizma碱和137mM NaCl，pH7.5)洗涤细胞，细胞在1×SDS上样缓冲液(62.5mMTrizma碱，2％w/v SDS，10％甘油)中裂解，然后超声处理，1,5000×g离心5分钟，上清液用于iNOS蛋白质免疫印迹测定。用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，用去污剂相容蛋白质测定试剂(Bio-Rad Laboratories，CA)确定样品的蛋白质浓度。样品与0.1体积的10％β-巯基乙醇和0.5％溴酚蓝混合物煮沸3分钟。通过电泳在8或12％聚丙烯酰胺凝胶中分析50μg细胞总蛋白，电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)滤膜，并用含吐温20和5％脱脂奶粉的Tris-缓冲盐水[TBST；10mMTrizma碱(pH7.4)，1％吐温20和150mM NaCl]封闭。与抗iNOS(BDPharMingen，CA)或hRas(Upstate Biotechnology，CA)或磷酸化-特异性MAPK(p42/44)(Signal Transduction)的抗血清在PVDF缓冲液中孵育2小时后，用TBST缓冲液洗涤滤膜3次，然后与辣根过氧化物酶偶联的抗-兔或小鼠IgG孵育1小时。TBST缓冲液洗涤后，用ECL-plus(Amersham Pharmacia Biotech)使膜放射自显影。
核提取和电泳迁移率变动分析。使用过去公开的方法(Dignam等，1983)，少许改进后，从细胞(1×107细胞)制备核提取物。收集细胞，用冰冷TBS洗两遍，在含10mM KCl、2mM MgCl2、0.5mM二硫苏糖醇、蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)和0.1％Nonidet P-40的10mM HEPES溶液，pH7.9的400μl缓冲液A中冰浴裂解10分钟。5,000×g离心10分钟后，用不含Nonidet P-40的缓冲液A洗涤沉淀的细胞核，重悬于含25％(v/v)甘油、0.42M NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、0.5mM二硫苏糖醇和CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的20mM HEPES溶液，pH7.9的40μl缓冲液B中，冰浴30分钟。15,000×g离心裂解物15分钟，将含核蛋白的上清液储存在-70℃备用。10μg核蛋白用于电泳迁移率变动分析，以测定AP-1、NFκB和C/EBP DNA结合活性。室温下，在10mM Trizma碱(pH7.9)、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM二硫苏糖醇、1μg聚(dI-dC)、5％(v/v)甘油和用末端脱氧核苷酸转移酶(Roche)标记DIG-ddUTP的NFκB(Santa Cruz Biotech)约0.3pmol中进行DNA-蛋白质结合反应20分钟。室温下，在5％聚丙烯酰胺凝胶上，50mM Tris、pH8.3、0.38M甘氨酸和2mMEDTA中分析蛋白-DNA复合物与不含蛋白的DNA，并将DNA-蛋白复合物电印迹到带正电荷的尼龙膜上。DIG标记探针的化学发光检测法与上述非同位素northern印迹分析方法相同。
瞬时转染和报告基因试验。转染前将3×105细胞/孔在6孔板中培养1天。以恒定的质粒浓度(2.5μg/转染)，8μl Fugene转染试剂(Roche Molecular Biochemicals)进行转染。转染后1天，将细胞置于无血清培养基中过夜。适当处理后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞，刮下细胞，然后用100μl裂解缓冲液(40mM Tricine pH7.8、50mM NaCl、2mM EDTA、1mM MgSO4、5mM二硫苏糖醇和1％TritonX-100)重悬。不时涡旋，室温下孵育15分钟后，离心样品。分别用荧光素酶测定试剂盒(Stratagene，CA)和β-gal测定试剂盒(Invitrogen，CA)测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。用Spectra Max/Gemini XG(Molecular Device，CA)和SpectraMax190(Molecular Device)测定发射光和吸光度。
定量Ras活化。刺激后，用PBS洗涤6孔板中的原代星形胶质细胞，在膜裂解缓冲液(MLB；0.5ml 25mM HEPES、pH7.5、150mM NaCl、1％Igepal CA-630、0.25％去氧胆酸钠、10％甘油、10mM MgCl2、1mM EDTA、25mM NaF、1mM原钒酸钠和不含EDTA的CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物)中裂解细胞。4℃离心(5,000×g)5分钟后，用上清液进行Ras活化测定。使用100μg上清液与琼脂糖偶联的Raf-1的Ras-结合域(RBD)结合，该结合域在转化了pGEX-2T-GST-RBD的BL21(Invitrogen)大肠杆菌株中在0.1mM IPTG的存在下表达，如过去所述(Herrmann等，1995)。4℃下在MLB中进行结合反应30分钟。用MLB洗涤三次后，通过加入2×SDS样品缓冲液使Ras-RBD复合物变性。用得自UpstateBiotechnology的Ras抗体进行蛋白质免疫印迹分析，以鉴定Ras蛋白。
测定乳糖基神经酰胺合成。将培养细胞在含[14C]半乳糖(5□Ci/ml)的生长培养基中孵育24小时，如前所述。除去培养基，用无菌PBS洗涤细胞单层以除去非特异性吸收的放射性，加入新鲜无血清培养基。用LPS/IFN□(1□g/ml；10U/ml)刺激细胞不同时间后，收集细胞并用冰冷洗涤，超声裂解细胞。蛋白质定量后，使用氯仿∶甲醇∶HCl(100∶100∶1)从200□g蛋白质中提取脂质。氮气下干燥有机相。高效薄层色谱分析鞘糖脂，用氯仿/甲醇/0.25％KCl(70∶30∶4，v/v/v)作为展开剂。空气中干燥色谱板，碘蒸汽染色。剪下对应于LacCer的凝胶区域，使用“liquiscint”(NEN Life Science Products)作为闪烁液，测定放射性。
鉴定和分析从C6细胞纯化的乳糖基神经酰胺。用硅胶60TLC板分析来自LPS处理细胞的乳糖基神经酰胺。如前所述(Khan等，1998；Pahan等，1998)制备脂肪酸甲酯(FAME)。用气相色谱法(Shimadzu，GC 17A gas chromatograph)在二氧化硅毛细管柱上分析FAME，定量为鉴定的总脂肪酸的百分数。质谱数据记录为经典Finnegan LCQ(四级离子阱)质谱。
GalT-2活性试验。用[3H]UDP-半乳糖作为半乳糖供体，GlcCer作为受体，测定GalT-2活性，如过去所述(Yeh等，2001)。简言之，将细胞收集到PBS中，细胞沉淀重悬于Triton X-100裂解缓冲液中。超声处理细胞裂解物，蛋白质定量后，将100□g细胞裂解物加入到总体积100□l的含20μM甲次砷酸盐缓冲液(pH6.8)、1mM Mn/Mg、0.2mg/ml Triton X-100(1∶2 v/v)、30nmol GluCer和0.1mmolUDP-[3H]半乳糖的反应混合物中。通过加入10□l 0.25M EDTA、10□l 0.5MKCl和500□l氯仿/甲醇(2∶1v/v)终止反应，离心分离产物。收集下面的相，氮气下干燥。HPTLC板上分离后，切下凝胶，在闪烁计数器中测定放射性。不含外源性GluCer的试验用作空白，所有各数据点都要减去空白的放射性计数。
Gal T-2反义寡核苷酸。用整合DNA技术合成靶向大鼠乳糖基神经酰胺合酶(GalT-2)的以下序列(5’-CGCTTGAGCGCAGACATCTT-3’)20-mer反义寡核苷酸。也合成乱序寡核苷酸(5’-CTGATATCGTCGATATCGAT-3’)，用作对照。转染前1天细胞计数和接种，第二天在无血清条件下用Oligofectamine(Invitrogen)-寡核苷酸复合物(200nM oligo)处理。转染2天后，用LPS/IFN(1□g/ml)刺激转染细胞，刺激后24小时检查一氧化氮水平。刺激转染细胞后，分别在6和24小时检查iNOS mRNA和蛋白水平。
RT-PCR扩增。按照生产商的方案，用TRIzol(GIBCO)提取总RNA后，从总RNA合成单链cDNA。室温下，在18ul含1×PCR缓冲液和2mM MgCl2的溶液中用2U DNA酶I(牛胰脏，Sigma)处理5□g总RNA 15分钟。然后，65℃，与2□l25mM EDTA孵育15分钟灭活。根据生产商的方案，加入2□l随机引物并退火到RNA上。在50□l含5□g总RNA和50-100U逆转录酶的反应中，通过在42℃下将反应管孵育45分钟，合成cDNA。在25□l反应混合液中进行PCR扩增，条件是含有1.0□l cDNA、0.5mM各引物和生产商Taq聚合酶条件(Takara，takara ShuzoCo.Ltd，Japan)。用于PCR扩增的引物序列如下：iNOS(正向-5′CTC CTT CAAAGA GGC AAA AAT A 3′，反向-5′CAC TTC CTC CAG GAT GTT GT 3′)、GalT-2(正向-5′TGG TAC AAG CTA GAG GC 3′，反向-5′GCA TGG CAC ATT GAA C-3′)、GAPDH(正向-5′CGG GAT CGT GGA AGG GCT AAT GA 3′，反向-5′CTTCAC GAA GTT GTC ATT GAG GGC A3′)。PCR程序包括95℃预孵育4分钟；94℃1分钟，加50℃退火1分钟，加74℃延伸1分钟，以此扩增30个循环；以及最后74℃延伸1分钟。1.2％琼脂糖凝胶上分离10ul PCR产物，UV下观察。
实时PCR。根据生产商的方案，使用Trizol(GIBCO，BRL)进行大鼠脊髓切片总RNA的分离。使用Biorad iCycler(iCycler iQ Multi-Color实时PCR检测系统；Biorad，Hercules，California，USA)进行实时PCR。从总RNA合成单链cDNA。室温下，18ul含1×PCR缓冲液和2mM MgCl2的溶液中，用2U DNA酶I(牛胰脏，Sigma)处理5□g总RNA 15分钟。然后65℃下与2μl 25mM EDTA孵育15分钟灭活。设计(OligoperfectTM设计仪，Invitrogen)并由整合DNA技术(IDT，Coralville，IA，USA)合成引物组。引物序列：iNOS(正向)5′-GAA AGA GGAACA ACT ACT GCT GGT-3′，iNOS(反向)5′-GAA CTG AGG GTA CAT GCT GGAGC，GAPDH(正向)5′-CCT ACC CCC AAT GTA TCC GTT GTG-3′和GAPDH(反向)5′-GGA GGA ATG GGA GTT GCT GTT GAA-3′。IQTM SYBR Green Supermix购自BIO-RAD(BIO-RAD Laboratories，Hercules，CA)。热循环条件如下：95℃活化DNA聚合酶10分钟，95℃30秒、58.3℃30秒扩增40个循环。采用MicrosoftExcel电子数据表计算所有样品中根据GAPDH标准化的靶基因表达。
在大鼠中诱导SCI。购买Sprague-Dawley雌性大鼠(225-250g重)(Harlanlaboratories，Durham，NC)，用于诱导SCI。所有大鼠随意摄入水和食物，根据美国健康和人类服务部(US Department of Health and Human Services)(NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，USA)的“实验室动物的护理和使用指南”(“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”)饲养动物。为在大鼠中诱导SCI，使用临床相关落重(weight-drop)装置，如过去所述(Gruner，1992)。简言之，腹膜内(i.p.)给予氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉大鼠，然后在T12处进行椎板切除术。用立体定向装置固定脊柱，将5gm重量从6cm高处落到轻轻放置在脊髓上的承受件上，以诱导损伤(30g/cm力)。假处理动物只进行椎板切除术。麻醉恢复后，神经学评价动物并监测水和食物的摄取。然而，未使用预防性抗生素或镇痛药，以避免它们与SCI实验疗法可能的相互作用。
治疗SCI。诱导SCI 10分钟后，给予大鼠鞘糖脂抑制剂，D-PDMP(MatreyaInc，Pleasant Gap，PA)。将D-PDMP溶解在5％吐温80的盐水溶液中，腹膜内(i.p.)给予SCI大鼠时用无菌盐水(0.85％NaCl)稀释。随机选择动物(每组六只)，形成4个不同的组：介质(5％吐温80的盐水溶液)治疗的假处理组(仅行椎板切除术)、SCI组(5％吐温80的盐水溶液)和D-PDMP(20mg/kg的5％吐温80溶液)治疗的假处理组、SCI组。损伤后，首剂量(SCI后10分钟给予)后每24小时给予单剂量D-PDMP直到72小时。治疗1h、4h、12h、24h、48h和72h后麻醉状态下处死动物。
制备脊髓切片。麻醉大鼠并断颈处死。从介质治疗的假处理组和SCI组以及D-PDMP治疗的假处理组和SCI组动物中小心提取损伤部位作为中心的脊髓切片。在Trizol(GIBCO，BRL)中立即匀浆准备用于提取RNA和蛋白质的组织，在液氮中快速冷冻，-80℃储存备用。根据生产商的方案提取总RNA，用于cDNA合成，如前所说。将准备用于组织学检查和免疫组化的脊髓切片固定在10％缓冲至中性的甲醛(Stephens Scientific，Riverdale，NJ)中。组织包埋在石蜡中，以4-μM厚度切片。
免疫组化分析。将脊髓切片去石蜡化，在梯度百分数的醇中逐步再水化。然后在抗原暴露液(unmasking fluid)(Vector Labs，Burlingame，CA)中煮沸载玻片10分钟，在相同溶液中再冷却20分钟，然后在含0.05％吐温-20(TNT)的Tris-钠缓冲液(0.1M Tris-HCL，pH-7.4，0，15M NaCl)中洗涤3次，每次5分钟。用胰蛋白酶(0.1％10分钟)处理切片，3％过氧化氢中浸泡10分钟以清除内源性过氧化物酶活性。在含0.5％封闭剂(TNB)的Tris钠缓冲液(由TSA-Direct试剂盒提供，NEN Life Sciences，Boston MA)中封闭切片30分钟，以减少非特异性染色。对于免疫荧光双标记，将切片与抗-iNOS抗体(1∶100，小鼠单克隆，SantaCruz，CA)孵育过夜，然后与抗星形胶质细胞标记物的抗体GFAP(1∶100，兔多克隆，DAKO，Japan)孵育1小时。用荧光素-异硫氰酸酯(FITC)偶联的抗-小鼠IgG(1∶100，Sigma)使抗-iNOS发色，用四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)偶联的抗-兔IgG(1∶100，Sigma)使GFAP发色。在封固剂(EMS，Fort Washington，PA)中制作切片标本，用Adobe Photoshop软件通过免疫荧光显微镜(Olympus)观察。用兔多克隆IgG作为对照第一抗体。也将切片与不含第一抗体的FITC偶联的抗-兔IgG(1∶100，Sigma，St.Louis，MO)或TRITC偶联的IgG(1∶100)一起孵育，作为阴性对照。如(Kiernan，1990)所述，进行H&E染色。根据(Lassmann和Wisniewski，1979)，进行Luxol快速蓝PAS(Luxol fast blue PAS)。
荧光TUNEL试验。根据生产商的方案，使用APOPTAG荧光素原位凋亡检测试剂盒(Serological Corporation，Norcross，GA)进行TUNEL试验。对于双标记，将切片与小鼠抗-神经元核1∶100(NeuN，Chemicon，USA)一起孵育。将切片与TRITC偶联的小鼠IgG 1∶100(Sigma)一起孵育，在封固剂中制成标本，荧光显微镜观察。
统计学分析。通过进行Student Newman-Keuls检验，对数据进行统计学分析。
                          实施例2
                           结果I
GSL介导LPS/IFN□-诱导的NO产生和iNOS基因表达。LPS/IFN□刺激原代星形胶质细胞导致iNOS基因表达是一个复杂的过程。本试验研究GSL是否以某种方式参与其中。用几种浓度的鞘糖脂抑制剂D-PDMP(0、10、25和50μM)预处理原代星形胶质细胞0.5小时后，用LPS/IFN□(1□g/ml；10U/ml)刺激表明，一氧化氮(NO)的产生(图1A)和iNOS mRNA和蛋白水平(图1B)均剂量依赖性降低。然而，在增加剂量的LacCer存在下，D-PDMP介导NO产生(图1C)和iNOS基因表达(图1D)的抑制被钝化。为证明这是一种LacCer特异性结果，也外源性补充其它鞘糖脂衍生物。然而，Glucer(图2A)、GalCer(图2B)和各种神经节苷脂-GM1(图2C)、GM3(图2D)和GD3(图2E)的存在不能像LacCer补充物那样，逆转D-PDMP介导的LPS/IFN□诱导的NO产生的抑制。这些研究表明，鞘糖脂途径的代谢物LacCer可能在LPS/IFN□介导的诱导iNOS基因表达和NO产生中起作用。
LPS/IFN□刺激导致乳糖基神经酰胺的水平和脂质组成改变。
为理解LPS/IFN□通过LacCer诱导iNOS基因表达的机制，定量乳糖基神经酰胺原位水平。分析14C标记的LacCer，采用市售的标准LacCer通过高效薄层色谱法由Rf值进行特征鉴定，如材料和方法中所述。如图3A所示，LPS/IFN□刺激后2-5分钟内可观察到LacCer水平急剧增加。通过LPS/IFN□刺激，LacCer水平是未刺激细胞中观察到的～1.5倍。LPS/IFN□刺激后，在LacCer的生物合成中，D-PDMP对乳糖基神经酰胺合酶(GalT-2，负责LacCer生物合成的酶)的抑制抑制了这种增加。此外，当LPS/IFN□刺激后分析GalT-2活性时，酶活性快速增加，观察到LPS/IFN□刺激后5分钟出峰(图3B)。通过以乱序寡聚物作为对照，使用针对大鼠GalT-2 mRNA的反义DNA寡聚物，可进一步证实GalT-2及其产物LacCer在iNOS基因调节中的作用。如图3C所示，反义DNA寡聚物显著降低LPS/IFN□-介导的NO产生以及iNOS mRNA和蛋白水平(图3D)。而且，为研究LacCer和GalT-2在iNOS基因调节中的可能作用，也研究确认了由这些实验分离和纯化的LacCer的组成和结构。来自刺激细胞的LacCer的质谱分析与LacCer中的3种主要脂肪酸(18∶0，56.2％；18∶1，26.4％；16∶0，12.9％)相一致。18∶0构成的LacCer的诊断特征表现为m/z 889(M，1.1％)、m/z 890(M+H，1.4％)和m/z740(M-[5×OH+2×CH3OH]，41.6％)。类似地，16∶0类LacCer在m/z 861(M+，0.8％)、862(M+H，1.2％)、m/z 860(M-H，1.1％)和m/z 711(860-[5×OH+2×CH3OH]，51.9％)处具有明显的峰。油酸(18∶1)构成的LacCer在m/z888(M+H，1.8％)和m/z 739(888-[5×OH+2×CH3OH]，100％)处具有明显的峰。两个更重要的峰位于m/z 342(M-鞘酯骨架，4.4％)和m/z 529(M-Lac骨架-H2O，1.5％)。LPS/IFN□刺激的细胞具有改变的脂肪酸特征，如气相色谱分析脂肪酸甲酯所揭示的那样。发现与对照细胞相比，所有饱和长链脂肪酸都增加，包括14∶0(167％)、16∶0(65.8％)，18∶0(7.3％)和20∶0(5.7％)。总之，GC和MS的数据确证并证实具有主要脂肪酸如硬脂酸、油酸和棕榈酸的纯化化合物LacCer的结构。
LacCer在C6胶质瘤细胞中调节LPS/IFN□-诱导的iNOS表达。为比较LacCer在C6胶质瘤细胞的iNOS基因表达中的作用，LPS/IFN□刺激前，用增加剂量的D-PDMP(10、25、50μM)预处理C6细胞0.5小时。C6细胞与LPS/IFN□孵育后，测定NO产生以及iNOS蛋白和mRNA水平，如图4的图注所示。增加剂量的D-PDMP的存在下，可抑制LPS/IFN□诱导的NO产生(图4A)以及iNOS蛋白和mRNA水平(图4B)。然而，通过补充外源性LacCer，可明显逆转对NO产生(图4C)以及iNOS mRNA和蛋白表达(图4D)的抑制，GluCer则没有这种作用。这些研究表明，在星形胶质细胞和C6神经胶质细胞中，LacCer介导的LPS-诱导的iNOS的调节是相似的。
小GTP酶Ras和ERK1/2的活化参与LacCer-介导的iNOS基因表达调节。为理解LacCer在LPS/IFN□诱导的诱导iNOS的细胞信号传导中的作用，研究了LacCer对小GTP酶活化的影响。已知小GTP酶Ras活化对
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诱导的iNOS基因表达很重要(Pahan等，2000)。用GST-偶联的Raf-1 RBD(Ras结合域)研究Ras的活化。通过LPS/IFN□刺激，观察到Ras快速活化(图5A)。通过用D-PDMP预处理降低了LPS/IFN□介导的Ras最大活化(刺激后2-5分钟内观察到)，外源性补充LacCer可完全逆转这种作用(图5B)。这些研究表明，LacCer在通过LPS/IFN□活化Ras中起作用，这导致iNOS基因表达被诱导。而且，LPS/IFN□刺激后还可观察到细胞外调节激酶1&2的活化(Ras的下游靶)。用D-PDMP预处理能抑制LPS/IFN□诱导的ERK 1/2磷酸化，外源性LacCer的存在可逆转这种作用(图5D)。此外，通过PD98059抑制负责ERK磷酸化和活化的激酶MEK1/2能抑制NO产生和iNOS表达，证明ERK途径参与iNOS基因表达(图5C)。补充外源性LacCer对PD98059抑制iNOS基因表达无作用，因而使LacCer上游成为通过Ras/MEK/ERK介导的LPS/IFN□诱导的iNOS基因表达调节的第二信使分子。
NF-κB在LacCer介导的iNOS基因表达调节中的作用。为进一步理解LacCer-介导的iNOS基因调节机制，研究I□B/NF-κB途径(已知是诱导iNOS所必需的)的参与(Nunokawa等，1996；Pahan等，1998；Taylor等，1998；Keinanen等，1999)。为评价这种可能性，在κB-重复荧光素酶转染细胞中观察D-PDMP对荧光素酶活性的作用。D-PDMP处理使LPS/IFN□诱导的荧光素酶活性消失，外源性LacCer也有效绕过该活性(图6A)，如图6B所示，通过增加剂量的D-PDMP能抑制电泳迁移率变动分析测定的NF-κBDNA结合活性，但在外源性LacCer的存在下该活性被逆转。使用50×冷探针证明NF-κB探针结合的特异性，优于(out-compete)标记的NF-κB结合活性。由于NF-κB活化和转运至核需要I□B磷酸化和降解，也检测磷酸化I□B水平。D-PDMP存在下，观察到磷酸化I□B降低。然而，当加入LacCer时，磷酸化I□B水平增加，与增加的NF-κB核转运和DNA结合活性相关(图6C)。这些研究阐明了LacCer介导的LPS/IFN□诱导iNOS基因表达的转录调节是通过I□B/NF-κB途径的机制。
脊髓损伤(SCI)中，D-PDMP控制iNOS诱导的效力。为评价上述观察的生理学相关性和进一步研究LacCer在神经-炎性疾病中诱导iNOS的作用，检测D-PDMP在大鼠脊髓损伤模型中的作用。已显示大鼠脊髓损伤能导致iNOS阳性反应性星形胶质细胞和巨噬细胞快速侵入病灶和周围区域(Wada等，1998a；Wada等，1998b)。如图7所示，与原始或假操作的动物相比，SCI 12小时后实时PCR测定的iNOS mRNA(图7A)的强效诱导并观察到iNOS蛋白表达(图7B)。SCI后10分钟内D-PDMP(20mg/kg)处理可显著抑制这种iNOS表达的增加。对来自介质(VHC)和D-PDMP处理的SCI大鼠的损伤部位的脊髓切片进行双重免疫荧光分析显示，损伤后24小时GFAP(图8D)和iNOS(图8E)水平及其共定位(图8F)显著增加，而D-PDMP处理的SCI大鼠显示GFAP(图8J)和iNOS(图8K)表达显著降低，表明D-PDMP体内控制iNOS基因表达和星形胶质细胞反应性转化的效力。这些研究表明，在SCI和可能的其它神经-炎性疾病的体内模型中，鞘糖脂通过损伤部位处的反应性星形胶质细胞参与iNOS基因表达，以及D-PDMP导致鞘糖脂耗竭在抑制iNOS诱导(一种使次级损伤恶化的炎症事件)中的效力。
通过用D-PDMP抑制SCI后iNOS基因表达来缓解凋亡和脱髓鞘。对于创伤后分子水平的脊髓损伤，已报道NO与创伤后空腔形成、神经元死亡、轴突退变和髓鞘质破坏密切相关。SCI后显著量的TUNEL-阳性细胞分散在病灶中(图9E)，其中一些也可通过双重免疫荧光染色用抗-神经元细胞核(NeuN)抗血清鉴定为神经元(图9D和9F)。SCI大鼠模型中，D-PDMP具有双重有益效果。它可抑制SCI后iNOS表达，而且如图9J-9L所示，可保护神经元和其它细胞免予凋亡。这非常重要，因为在假操作动物中未观察到D-PDMP对神经元存活的副作用(图9G-9I)，表明该给予剂量有效抑制iNOS而无任何明显副作用，这使得由神经元损失引起的SCI相关病减少。而且，如图10所示，受损大鼠脊髓切片(图10B)的组织学检查观察到SCI大鼠切片中，SCI诱导的白质空泡化和组织坏死被抑制，其中D-PDMP抑制iNOS(图10D)。已知落重损伤也引起髓鞘质空泡化，导致后肢运动功能障碍(Suzuki，等，2001)。对介质治疗的SCI大鼠脊髓切片中的髓鞘质进行LFB染色显示严重的脱髓鞘作用(图10F)，该作用也可由D-PDMP介导的iNOS抑制来减轻(图10H)。总之，这些研究证明，抑制炎症事件如本研究中D-PDMP抑制iNOS表达对SCI动物模型有有益效果。它们也说明鞘糖脂在神经-炎性疾病中的重要性。
                           实施例3
                            讨论I
一氧化氮介导的病理生理学常见于许多神经炎性疾病中，包括中风和脊髓损伤(SCI)。因为尚未完全了解哪些因子在炎症疾病中诱导和调节iNOS基因表达，所以本研究在原代星形胶质细胞中研究了鞘糖脂的作用，并阐明通过参与Ras/ERK1/2和I□-B/NF-κB途径的LacCer介导的事件调节iNOS基因的新途径。这些结论基于以下发现。(1)D-PDMP(一种鞘糖脂合成抑制剂)抑制LPS/IFN□诱导的iNOS基因表达和LacCer生产。加入外源性乳糖基神经酰胺，而不是任何其它鞘糖脂可逆转D-PDMP对iNOS基因表达的抑制。(2)LPS/IFN□在5分钟内刺激GalT-2活性，且迅速提高胞内乳糖基神经酰胺的水平。而且，用反义寡核苷酸敲减GalT-2导致NO产生和iNOS表达降低。(3)小GTP酶-Ras触发参与LacCer调节iNOS的途径，由于D-PDMP消除了LPS诱导的Ras活化。ERK1/2激酶进一步介导iNOS表达，而MEK1/2抑制剂PD98059抑制LPS/IFN□介导的iNOS基因表达。(4)LacCer介导的iNOS转录调节是通过I□-B/NF-κB途径进行的。D-PDMP抑制LPS/IFN□-介导的□B重复最小启动子报告基因的诱导，以及NF-κB转活化(transactivation)和I□B降解。如图11所示，对于与LacCer介导的LPS/IFN□诱导的iNOS基因调节相关的事件，提出了下面的模型。LPS/IFN□刺激活化的LacCer合酶(GalT-2)并增加胞内LacCer水平。这就激活了小G-蛋白Ras和下游胞外调节激酶1&2(ERK1/2)，过去已证明这两种物质介导了细胞因子诱导的iNOS基因表达和NF-κB活化(Pahan等，1998；Marcus等，2003)。此外，是通过Ras活化还是通过其本身介导的事件，使LacCer能够启动I□B-NFκB途径。NF-κB是已建立的iNOS基因表达的主要转录因子(Pahan等，1998)。I□B的磷酸化导致其降解，从而使胞质中被I□□隔离(sequestered)的NF-κB转运入核，启动iNOS基因表达。本研究数据将神经酰胺衍生物LacCer鉴定为iNOS基因表达中的信号传导分子。
由于发现了鞘磷脂(SM)循环，表明一些诱导剂(1a，25二羟维生素D3、放射、抗体交联、TNF□、IFN□、IL-1β、神经生长因子和布雷菲德菌素A)与鞘磷脂-神经酰胺信号事件偶联(Hannun，1994；Kolesnick等，1994；Kanety等，1995；Linardic等，1996)。一些研究支持SM的水解作用是在多种细胞类型包括神经胶质细胞和神经元细胞的生长抑制和凋亡中，神经酰胺起到作用的应激活化的信号传导机制(Brugg等，1996；Wiesner和Dawson，1996)。线粒体功能受损导致活性氧(ROS)产生增加，线粒体谷胱甘肽降低，从而产生氧化应激，认为氧化应激是神经酰胺-诱导细胞毒性/凋亡的主要原因之一。鉴定SM信号转导途径诱导超氧化锰歧化酶(MnSOD)是原代星形胶质细胞中神经酰胺-诱导氧化应激受到控制的途径之一(Pahan等，1999)。在引起氧化应激的试剂中，NO产生可抑制生长，并且是神经退行性疾病中诱导神经元细胞和少突胶质细胞凋亡/细胞毒的重要候选物。近来证明，神经鞘磷脂酶活化产生的神经酰胺使得在星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中LPS-和细胞因子-介导iNOS诱导成为可能(Pahan等，1998)。而且，证明神经酰胺-介导的iNOS基因表达是通过Ras/ERK/NF-κB途径(Pahan等，1998)。虽然神经酰胺本身不诱导iNOS基因表达和NO产生，它可显著刺激细胞因子-诱导的iNOS表达和NO产生，这提示鞘磷脂-衍生的神经酰胺的产生可能是神经炎性疾病中神经元细胞和少突胶质细胞中细胞因子-介导的细胞毒性的重要因素。而且，星形胶质细胞中，NF-κB活化的抗氧化抑制剂(例如，N-乙酰基半胱氨酸和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)能抑制LPS-和神经酰胺-诱导的iNOS表达说明细胞氧化还原反应在神经酰胺-LPS或促炎细胞因子诱导的NF-κB活化和iNOS诱导中的作用(Singh等，1998)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)用作ROS和GSH(天然抗氧化剂)前体的清除剂，维持硫醇/氧化剂平衡，它也通过SM水解阻断细胞因子-介导的iNOS表达和神经酰胺生产，从而防止神经酰胺和NO导致的原代星形胶质细胞和少突胶质细胞死亡(Singh等，1998)。而且，也证明了NAC处理在局灶性脑缺血大鼠模型中通过抑制促炎细胞因子如TNF的表达来防止损伤，诱导iNOS和细胞死亡的效力(Sekhon等，2003)。
不是将鞘酯代谢酶视作独立的信号模块，而是认为这些途径与一种用作另一种酶的底物的酶产物高度相关的。这对于通过SM循环或从头合成产生的神经酰胺也是正确的，因为神经酰胺可转化为其它生物活性分子如鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸酯或鞘糖脂。越来越多的证据表明神经酰胺和其它衍生物如LacCer和神经节苷脂存在于膜内富含脂质的微结构域中，强调了这些生物活性鞘脂的复杂性。这些微结构域(称为“脂质筏”)的内部定位有或结合了具有许多受体和信号分子，因而使它们成为信号传导事件研究的热点(Hakomori和Handa，2003)。神经酰胺和其它脂质中介物如鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸酯(S-1-P)和鞘糖脂的代谢相互关系使得预测这些中间体的特定作用和调节其水平的酶变得相当复杂。例如，虽然鞘氨醇对某些细胞类型具有类似神经酰胺的促凋亡作用(Spiegel和Merrill，1996)，但其快速转化为S-1-P具有增殖特性，拮抗鞘氨醇和神经酰胺的作用(Spiegel和Milstien，2000)。已分别证明鞘糖脂、葡糖基神经酰胺和乳糖基神经酰胺能促进耐药性状态(Liu等，1999)，并在主动脉平滑肌细胞中介导氧化的LDL和TNF□对形成超氧化物、活化MAP激酶和诱导增殖的作用(Chatterjee，1998)。探索揭示细胞因子-介导的iNOS基因表达的复杂性并进一步阐明鞘脂在该过程中的作用。这些研究定义了鞘糖脂除了在其它细胞系统中的其它已知功能以外，在iNOS基因调节中的关键作用。发现GalT-2活化和LacCer生物合成对LPS-和细胞因子-诱导的iNOS表达是关键的。虽然已阐明LacCer在其它细胞系统中介导炎症事件并影响ROS产生、凋亡和细胞增殖，但目前尚未确立LacCer在iNOS基因表达中的作用。
本研究中提出的LacCer介导iNOS基因调节的新机制发现，在脊髓损伤大鼠模型中，当D-PDMP抑制脊髓中iNOS表达时，CNS创伤的生理学相关性。D-PDMP也能抑制神经元细胞凋亡损失和减轻脱髓鞘。正如在大多数神经退行性疾病包括脊髓损伤中的那样，发现与凋亡阻断治疗相伴的损伤后备用组织的量对行为结果和损伤后恢复是有益的(Blight，1983；Young，1993；Liu等，1997)，鉴定LacCer是细胞因子-诱导的iNOS基因表达的关键中介体，这强调了在神经疾病中具有阻断凋亡和iNOS表达治疗潜力的主要靶点。
其它报道的LacCer生物学功能，包括在炎症事件如产生活性氧中介导细胞因子作用(Yeh等，2001)，中性粒细胞通过粘附分子表达粘附于内皮细胞(Arai等，1998；Bhunia等，1998)，细胞增殖(Bhunia等，1997)和中性粒细胞活化(Iwabuchi和Nagaoka，2002)是神经炎症中常见的功能。因此，LacCer参与这些事件可能涉及调节的粘附分子表达，导致血脑屏障瓦解和合成促炎细胞因子并活化固有(resident)小胶质细胞和星形胶质细胞的免疫细胞如中性粒细胞浸润，导致ROS产生、NO产生、神经元凋亡、脱髓鞘和神经胶质过多，这些在损伤和后继的功能恢复中具有深远负面作用(Hays，1998；Akiyama等，2000a；Akiyama等，2000b)。由于已知用NAC的抗氧化疗法和他汀类对免疫反应的免疫调节，以及疾病如缺血和EAE的有益作用(Stanislaus等，2001；Sekhon等，2003)，除本研究所述iNOS诱导中的作用外，还确立LacCer在介导神经炎症事件如ROS产生、中性粒细胞活化和浸润中的作用，这使得LacCer水平调节成为抑制神经炎症的多功能工具。
总之，本研究首次报道了乳糖基神经酰胺在炎症疾病中iNOS的诱导中的作用。这些研究鉴定了鞘糖脂调节的新治疗靶点，用于在神经炎性疾病中改善病理生理学。
                        实施例4
                      材料和方法II
试剂。ApopTagplus过氧化物酶原位检测试剂盒(S7101)得自Intergen(CITY，NY)。小鼠单克隆TNF-抗体(SC-7317)和兔多克隆IL-1抗体(SC-7884)得自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)。兔多克隆iNOS抗体(N32030-050)得自Transduction Laboratories(San Diego，CA)。GSNO购自World Precision Instruments，Inc.(Sarasota，Florida)。DMEM(4.5gm葡萄糖/L)，RPMI 1640培养基，胎牛血清和Hanks平衡盐溶液来自Life Technologies(GrandIsland，NY)。除非另有说明，使用的所有其它化合物和试剂购自Sigma(St.Louis，MO)。
动物。本研究中共使用60只重250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。根据南卡罗来纳医学院指南和“实验室动物的护理和使用指南”中所列国家研究委员会的人性化护理标准，人性化护理所有动物。直肠探棒监测体温并用恒温毯控制单元(Harvard Apparatus，Holliston，MA)将体温维持在37±0.5℃。分别用HSE Plugsys TAM-D和TCAM(Harvard Apparatus)测定颅脑温度和平均动脉压。
实验设计和给药。所有动物试验方法由南卡罗来纳医学院动物检查委员会(Animal Review Committee)批准，依据为国立卫生研究院(National Institute ofHealth)出版的动物使用指导。将动物分成三组：(i)对照(假操作)组(假操作，n＝20)；(ii)缺血(20分钟)和再灌注(24小时)组(介质，n＝20)；(iii)GSNO处理组(GSNO，n＝20)。在处理组中，再灌注时，由股静脉插管缓慢输注GSNO(1mg/kg体重)的盐水溶液(～250l)。将相同体积的盐水代替GSNO给予缺血(介质)和对照(假处理)组大鼠。
局灶性脑缺血模型。实验前，大鼠禁食过夜但允许自由进水。腹膜内注射赛拉嗪(10mg/kg体重)和肌内注射盐酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉大鼠。插入直肠温度探针，并用热垫将体温维持在37±0.5℃。如本发明者以前的发表物所述(Sekhon等.2003)闭塞右MCA。15分钟内完成外科手术且不引起明显的失血。缺血期终止时，取出尼龙单纤丝，除去颈总动脉钳，显微镜下限定通过颈总动脉的再灌注。然后，在热垫上使动物从麻醉中苏醒。特定时间的再灌注后处死动物。将大鼠的脑分成两半，鉴定为缺血半球(同侧)和缺血-未影响(对侧)区域，然后立即用于分析或冷冻在液氮中，-70℃储存备用。
测定生理学变量。MCA闭塞前、闭塞期间、再灌注时和再灌注后30分钟，测定生理学变量。监测直肠温度，维持在约37-37.6℃。在实验动物和假操作对照中，使用激光Doppler流量计(Perimed Sweden and Oxford Optronix Ltd.，Oxford，UK)检测局部脑血流量(rCBF)。
评价缺血梗死和神经学评分。使用2，3，5，-三苯氯化四唑(TTC)染色技术评价缺血梗死，然后用计算机获取图像。简言之，给予过量戊巴比妥后，再灌注24小时后断颈处死大鼠。快速取出脑，置于冰冷盐水中5分钟。用Brain Matrix在额顶以2mm间隔制作六个连续脑切片(Brain Tree Scientific)。将切片在2％TTC(Sigma，MO)中孵育，37℃溶解在盐水中15分钟。将染色脑切片储存在10％甲醛中，置于4℃冰箱中，用于进一步加工和保存。将脑切片(2mm)置于连接计算机的平板床彩色扫描仪上(HP scan jet 5400C)。通过图像分析软件(Photoshop 4.0Adobe System)获得梗死区(表示为白色)并通过NIH图像软件测定。不知道各组身份的观察者进行神经学评价。再灌注后30分钟、24小时和72小时评价神经缺陷(处死前)，评分如下：0，未观察到神经缺陷(正常)；1，用尾巴提起整个身体左前肢不能伸展(轻度)；2，向对侧绕圈(中度)；3，静止时偏向对侧或无自发运动活性(严重)。将在上述时间点不表现神经缺陷的动物排除在试验外，如本发明者以前的发表物(Sekhon等.2003)所述。在用盐水或GSNO处理的动物亚组中，MCAO前、MCAO时和再灌注开始后3小时，测定CBF。麻醉下，将各动物置于立体定位仪中，根据以下坐标(前后-1.0mm，-4.0mm)将针型探针置于前囟上。
测定大鼠脑中半胱天冬酶-3活性。如过去所述(Haq等.2003)进行半胱天冬酶-3酶活测定。简言之，反应混合物是含有50g从大鼠脑匀浆物制备的胞质蛋白质和500M Ac-DEVD-AMC(半胱天冬酶-3底物II，产生荧光；Caibiochem目录号235425)的900l缓冲液B(100mM HEPES，pH7.4；20％甘油；和2mM二硫苏糖醇)。将底物加入到组织提取物中，37℃孵育，开始酶反应。采用荧光分光光度计，在激发波长380nm、发射波长460nm处测定半胱天冬酶-3样活性，用于检测切割掉AMC荧光团后的荧光改变。
细胞培养。从出生后1-3天的Sprague-Dawley大鼠制备原代大鼠星形胶质细胞，维持在含10％胎牛血清(FBS)和抗生素的DMEM(4.5gm葡萄糖/L)中。基于GFAP(神经胶质纤丝酸性蛋白)阳性免疫染色，确定星形胶质细胞的纯度大于95％。BV2细胞是衍生自Dr.Michael McKinney提供的鼠原代小胶质细胞的小胶质细胞系，维持在补充有10％FBS和抗生素的DMEM(4.5gm葡萄糖/L)中。用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)和LDH释放测定(Roche)测量细胞代谢活性，以此确定处理的细胞毒作用。
蛋白质印迹分析。使用新鲜或冷冻的脑组织或培养细胞进行蛋白质印迹分析。在含有20mM Tris.pH7.4；150mM NaCl；1mM EDTA；1mM EGTA；1％Triton；2.5mM焦磷酸钠；1mM钒酸盐；1g亮抑肽酶的冰冷缓冲液中匀浆组织(脑)。用冷丙酮处理匀浆物(各160g蛋白质)，涡旋，-70℃储存4小时。12,000×g离心样品10分钟，以沉淀蛋白质。然后，在加样缓冲液中将干燥沉淀煮沸5分钟。将等量(每道40g蛋白)蛋白进行SDS-PAGE分析，转移至硝酸纤维素膜(Amersham)上。如过去所述(Giri等.2002)，从培养细胞制备样品用于免疫印迹。简言之，收集细胞，然后在冰冷的裂解缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH7.4，含50mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、10％甘油和蛋白酶抑制剂混合物)裂解细胞。SEE P.12离心样品10分钟。SDS-PAGE分析上清液(50g蛋白/道)，印迹至硝酸纤维素膜(Amersham)上。将印迹在5％脱脂奶粉-TBS-0.1％吐温20中封闭1小时，洗涤，然后4℃下与iNOS抗体(1∶1000)在5％BSA-TBS-0.1％吐温20中孵育过夜，然后洗涤。然后，与兔第二过氧化物酶偶联抗体(1∶5,000，Sigma)孵育1小时。用增强的化学发光检测法，根据生产商的说明书(Amersham PharmaciaBiotech)检测免疫反应活性，然后使膜曝光X射线胶片。在Bio-Rad光密度计(Model GS-670，成像光密度计)上进行光密度分析。用Bio-Rad出售的蛋白质测定染料(Bradford试剂)测定蛋白质浓度。
转录分析。根据生产商的说明书，在12-孔板中用带有□-半乳糖苷酶的NF-B-或iNOS-荧光素酶报告基因(1.5g/孔)瞬时转染原代星形胶质细胞或小胶质细胞(BV2)，其中用lipofectamine-2000(Invitrogen)转染星形胶质细胞，用lipofectamine-Plus(Invitrogen)转染BV2细胞，如(Giri等，通讯)所述。在共转染研究中，在存在或不存在HA-IKKa或HA-IKK或p65或p50表达载体的情况下，用报告基因转染细胞。总DNA(3g/孔)不变，用pcDNA3将所有组标准化为等量的DNA。采用荧光素酶试剂盒(Promega)测定荧光素酶活性。
TUNEL分析凋亡。TUNEL(TdT-介导的dUTP缺口末端标记)测定检测凋亡。简言之，用二甲苯使切片去石蜡化，通过梯度醇的三次改变再水化，室温下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育15分钟，然后室温下直接在20g/ml蛋白酶K中孵育15分钟。采用ApopTagplus过氧化物酶试剂盒(Intergen Company)检测凋亡。与3％H2O2的PBS溶液孵育5分钟，再与平衡缓冲液孵育10秒，阻断脑切片中内源性过氧化物酶的活性。
37℃，将切片在反应缓冲液中与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)孵育60分钟。室温下用终止/洗涤缓冲液孵育终止反应。然后在室温下将切片与过氧化物酶偶联的抗-异羟基洋地黄毒苷抗体(亲和纯化的绵羊多克隆抗体)孵育30分钟，室温下用二氨基联苯胺(DAB)底物发色4分钟。用甲基绿反染色切片30秒，固定于Permount(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)中。采用双标记来鉴定TUNEL阳性细胞，即使过氧化物酶与代替DAB的荧光底物Cyanine 3 Tyramide(TSA-Direct试剂盒提供的过氧化物酶底物，NEN Life Sciences，Boston，MA)反应，然后与神经元特异性烯醇酶抗体(兔多克隆1∶100，Chemicon，Temecula，CA)孵育，用抗-兔FITC(1∶100，Vector Labs，CA)显色。
免疫组化。使用特异性抗体，由免疫组化分析检测细胞因子(TNF-&IL-1)和iNOS表达。对来自甲醛固定脑组织的石蜡包埋切片中的TNF-、IL-1和NOS进行染色。简言之，使脑组织切片去石蜡化，在梯度醇中连续再水化，然后浸没在磷酸盐缓冲盐水中(PBS，pH7.4)。然后在抗原暴露溶液(Vector Labs，CA)中微波处理载片2分钟，冷却，PBS中洗三次，2分钟。将切片浸没在3％过氧化氢的蒸馏水溶液中25分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，然后在免疫组化级1％牛血清白蛋白的PBS溶液中封闭1小时，在稀释的山羊血清中30分钟以减少非特异染色。将切片与稀释在封闭缓冲液中的第一小鼠单克隆TNF-抗体(1∶50，BioSource)、IL-1抗体(1∶25，Santa Cruz Biotechnology，CA)和兔多克隆iNOS抗体(1∶10，Transduction Labs，CA)孵育过夜，接着在含有0.1％吐温-20的PBS中冲洗3次，6分钟。用抗-兔生物素化抗体检测iNOS和IL-1，用抗小鼠抗体检测TNF-，然后用亲和素-生物素HRP复合物(Vectastain ABC-Elite试剂盒，Vector Labs，CA)处理，二氨基联苯作为底物。然后，通过一系列梯度的醇再水化切片，并固定于Permount中，盖上盖玻片。用Olympus显微镜分析所有切片，用AdobePhotoshop(Adobe Systems，CA)控制的数码相机(Optronics)拍照。
对于免疫荧光双重标记，先将切片与抗-iNOS(1∶10)孵育，再与巨噬细胞标记物ED 1(1∶100，小鼠单克隆，来自Biosource，Camarillo，CA的ARU0151)或星形胶质细胞标记物GFAP(1∶100，小鼠单克隆，来自Accurate，Westbury，NY的克隆6F-O1，目录号YM-3012)孵育。用得克萨斯红偶联的抗-兔IgG(1∶100，VectorLabs，CA)使抗-iNOS显色，用FITC偶联的抗-小鼠IgG(1∶100，Vector Labs，CA)使ED 1或GFAP显色。兔或小鼠多克隆IgG用作对照第一抗体。也将切片与不含第一抗体的FITC或得克萨斯红偶联的IgG一起孵育，作为阴性对照。洗涤后，空气干燥载片，并用水性固定介质制成标本(Vector Labs)。采用装有双波长滤光片以进行落射荧光的Olympus显微镜和Adobe Photoshop软件检测载片的免疫荧光。用Adobe Photoshop软件分离各颜色通道(红或绿)。
统计学分析。所有值表示为平均值±SD。采用双末端Student′s t检验非配对变量以比较各组平均值。当p＜0.05时认为组间存在显著性差异。
                            实施例5
                            结果II
GSNO对降低梗死和恢复神经学评分的影响。来自盐水处理的缺血脑(介质)和GSNO-处理的(GSNO)缺血脑的TTC-染色代表性切片(从头到尾共安排6个切片中的第3个和第4个)如图12A所示。与介质相比，GSNO处理降低梗死，如脑白色区域显著面积消失所测定的那样。发现基于所有6个切片的梗死容量(图12B)明显降低。缺血和GSNO-处理动物间的神经学评分存在显著性差异(图12C)。MCA闭塞20分钟，再灌注24小时，神经学评分为2.70±0.48。GSNO-处理动物的平均神经学评分为1.10±0.32。GSNO剂量的选择(1mg/kg体重)取决于最大脑保护(梗死容量)。该剂量对静止血压、颅内压和其它生理参数无影响。然而，发生缺血后给予GSNO伴随有大脑血流量(CBF)明显增加128.0％，而缺陷后3小时为11.2％(各组2只动物的平均值)。也监测GSNO-处理和未处理组中，缺血后长达7天时动物的存活。虽然所有处理动物(n＝7)存活长达7天且保持健康而无神经缺陷，但未处理动物(n＝7)缺血3天后死亡。
GSNO对诱导细胞因子和iNOS的影响。脑缺血和再灌注后TNF-α-介导的iNOS诱导与大量NO的产生有关。然后NO与O2-反应形成ONOO-(一种强效抗氧化剂)，它可直接导致细胞死亡和通过产生羟自由基间接导致死亡。再灌注24小时后，在缺血脑同侧半球(主要是皮质)中发现TNF-α(图13A-C)和IL-1β(图13D-F)高表达，GSNO-处理动物中这种表达显著降低。再灌注24小时后免疫染色检测iNOS的表达(图13G-I)与TNF-α和IL-1β模式相似，GSNO处理显著降低iNOS阳性细胞的数目。假操作组在脑的任何检查区域中无iNOS阳性细胞存在。蛋白质印迹分析证明，同侧半球中存在iNOS表达以及在GSNO-处理的缺血脑同侧半球中不存在iNOS，如图14A和14B所示。发现iNOS的表达主要在巨噬细胞/小胶质细胞中，如iNOS染色与ED-1的表达合并所示(图16D-16I)。表达iNOS的巨噬细胞/小胶质细胞存在于皮质区域(图16G-16I)和血管中(图16D-16F)。iNOS的表达也与GFAP合并，GFAP是活化的星形胶质细胞的标记物(图16A-16C)，因而说明活化的星形胶质细胞参与iNOS-诱导的亚硝基化应激。
GSNO对ED-1和GFAP表达的影响。实验证据表明，缺血损伤和梗死进程以慢节奏发展直到炎症中介体的参与。炎症中介体是由浸润血源性细胞或活化神经胶质细胞分泌的，能提高氧化和亚硝基化应激并诱导凋亡性细胞死亡。EDI用于检测单核细胞来源的细胞，包括活化的小胶质细胞。同侧半球的半影区(介质)中存在明显的EDI特异性染色(图15B)。GSNO处理能减少EDI阳性细胞的数目(图15C)。假处理组没有EDI染色(图15A)。缺血时，梗死被大量表达高水平胶质原纤维酸性蛋白(GFAP，一种星形胶质细胞-特异性细胞骨架蛋白)的肥大星形胶质细胞所包围。缺血皮质区中发现GFAP-阳性星形胶质细胞显著增加，如图15E所示。GSNO处理能减少活化星形胶质细胞的数目(图15F)。
GSNO对凋亡性细胞死亡和半胱天冬酶-3活性的影响。用转录酶-介导的d-UTP-标记缺口末端标记(TUNEL)实验测定作为凋亡指标的DNA片段化。同侧半球，尤其是在梗死边界周围的DNA片段化显著增加(图13J-13L)。GSNO处理导致凋亡细胞数量减少。对照脑以及缺血脑的对侧半球中没有TUNEL阳性细胞。通过将TUNEL染色与神经元特异性标记物NSE合并，证实TUNEL阳性细胞主要是神经元(图16J-16L)。而且，与假操作组相比，发现缺血脑的同侧半球中半胱天冬酶-3活性显著增加，并且该活性在GSNO处理脑中恢复至基础水平(图17)。
在大鼠原代星形胶质细胞和小胶质细胞(BV2)中，GSNO对细胞因子-诱导的iNOS表达的影响。已证明，在脑缺血的病理生物学中，响应细胞因子产生NO是重要的。为研究GSNO处理导致iNOS抑制所涉及的机制，用大鼠原代星形胶质细胞和小胶质细胞进行体外研究，因为这些细胞参与缺血损伤后脑中炎症的增加。用不同浓度(0.1-2mM)的GSNO预处理细胞，然后用LPS(1μg LPS/ml)(对于BV2)或LPS(1μg LPS/ml)+IFN-γ(50U IFN-γ/ml)(对于星形胶质细胞)处理。24小时后，蛋白质印迹测定细胞的iNOS蛋白。GSNO预处理在星形胶质细胞(图18A)和BV2(图18C)中以剂量依赖性方式抑制iNOS的表达。仅GSNO(1mM)对iNOS表达无影响。GSNO对细胞因子-诱导的iNOS表达的抑制作用可进一步通过星形胶质细胞(图18B)和BV2(图18D)细胞中的iNOS荧光素酶活性实验所证实。
大鼠原代星形胶质细胞和BV2中，GSNO对细胞因子-诱导的NF-κB荧光素酶活性的影响。为理解GSNO-介导的iNOS表达下调机制，分别在星形胶质细胞和BV2细胞中研究GSNO对LPS/IFN-γ或LPS-介导NF-κB活化的影响。NF-κB由p65/p50异源二聚体构成，通过与未刺激细胞中的IγB结合保留在胞浆中。刺激细胞后，胞质NF-κB/IγB复合物分离，游离NF-κB转运入核，调节NF-κB反应性基因(包括iNOS)的转录。上游激酶IKK使IγB磷酸化对IγB与NF-κB解离是必需的。已证明NF-κB活化和转运入核(Hallenbeck 2002；Han等.2003)对iNOS和促炎细胞因子(TNFα、IL-1β和IL-6β)的表达是关键的。在NF-κB荧光素酶载体转染的细胞中，通过监测响应LPS/IFN-γ或LPS刺激的报告基因活性，进一步研究GSNO对NF-κB活性的抑制作用。在大鼠原代星形胶质细胞和BV2细胞中，用不同浓度的GSNO(0.1-2MM)处理分别降低了NF-κB荧光素酶报告活性的LPS/IFN-γ或LPS-依赖性激活(图19A，19D)。为研究GSNO对NF-κB荧光素酶活性的直接作用，将NF-κB的p65和p50亚基的表达载体和NF-κB荧光素酶报告基因共转染到原代星形胶质细胞和BV2细胞中。转染48小时后，用不同浓度的GSNO处理细胞，再用LPS或LPS/IFNγ处理5小时。原代星形胶质细胞和BV2细胞系中，GSNO处理以剂量依赖性方式抑制p65/p50介导的荧光素酶活性(图19B，19E)。GSNO也在这些细胞中减弱p65/p50介导的iNOS-荧光素酶(图19C，19F)，进一步表明GSNO也介导其对NF-κB亚基的直接作用并改变它们结合DNA以转录参与损伤的促炎基因的能力。也在星形胶质细胞和BV2细胞中研究GSNO对IKK或IKK-介导的iNOS-和NF-κB荧光素酶活性的影响。GSNO处理星形胶质细胞和BV2细胞能以剂量依赖性方式抑制IKK和IKK介导的iNOS-荧光素酶和NF-κB荧光素酶活性(数据未示出)，这说明GSNO可能影响IKK上游以抑制NF-κB通路。
                           实施例6
                           讨论II
实验性中风大鼠模型中，GSNO处理抑制脑同侧半球中TNF-α、IL-1β和iNOS表达并减少凋亡性神经元细胞死亡。这进而产生减少梗死(图12A-12B)和改善神经学评分(图12C)的保护作用。GSNO神经保护的结论基于以下观察：GSNO处理抑制星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞的活化并降低炎症。处理也抑制iNOS表达的诱导并减少神经元凋亡。而且，在大鼠原代星形胶质细胞和BV2细胞中，体外用GSNO处理抑制细胞因子-诱导的iNOS诱导以及细胞因子-介导的NF-κB荧光素酶活性(图18-19)。
现在有证据表明，中风有炎症组分，应该服从消炎药治疗(Barone和Feuerstein，1999)。认为TNF-α(Hallenbeck，2002)和IL-1β(Rothwell，2003)负责受损脑中炎症细胞的蓄积，在中风病理生物学中起着复杂而重要的作用。事实上，在局灶性脑缺血模型中，已鉴定炎症是再灌注期间损伤的主要机制(Kato等.1996；St oll等.1998)。本发明者已证明抗氧化剂、N-乙酰基半胱氨酸抑制细胞因子和iNOS具有神经保护作用(Sekhon等，2003；Sekhon 2002)。这也由其它研究进一步证实，这些研究表明，抑制iNOS的化合物在局灶性脑缺血中是保护性的，即使是损伤后给予(Ding-Zhou等，2002；Zhu等，2002)。iNOS基因缺陷的小鼠(Zhao等，2000)与各自的对照相比，梗死容量降低。选择性iNOS抑制剂氨基胍在患脑缺血的小鼠中将iNOS活性抑制到等于iNOS敲除小鼠的水平，这确认该酶参与缺血损伤(Sugimoto和Iadecola 2002)。显示在野生型小鼠而不是iNOS缺陷小鼠中L-精氨酸增加缺血损伤，这说明iNOS用于产生NO的L-精氨酸对缺血损伤有毒(Zhao等，2003)。缺血/再灌注后，脑中许多细胞类型中显示出iNOS表达(Dirnagl等，1999)。证据延伸到在缺血梗死后人脑中iNOS表达的存在(Forster等，1999)。在缺血动物的同侧半球中，通过免疫组化鉴定巨噬细胞/小胶质细胞(EDI)和活化星形胶质细胞(GFAP)中iNOS的表达(图16A，16G)。显示iNOS表达的EDI阳性细胞也存在于血管中(图16D)，如其它人所观察到的那样。通过消炎药/神经保护剂包括NO供体iNOS抑制剂来抑制炎症是脑缺血方面有吸引力的假设。在局灶性脑缺血的大鼠模型中，硝普钠(SNP)和精胺/NO能保护脑免受损伤(Salom等，2000)。SNP是可能通过鸟苷酸环化酶和cGMP的NO作用保护脑的盐(Zhang等，1994a)。对于SIN-1(NO和O′的供体)提供的保护作用是否依赖于缺血脑酸中毒还有争议和争论(Coert等，2002)。本研究中使用神经保护剂GSNO。它被看作NO-供体、抗氧化剂和S-亚硝基化剂(Chiueh 2002)。结果表明，在局灶性脑缺血中，GSNO处理不仅能够保护脑免受缺血损伤，而且能够通过抑制TNF-α、IL-1β和iNOS在脑固有活化细胞和浸润的血源性细胞中的表达来缓解炎症。
GSNO是谷胱甘肽和NO的稳定代谢物，它在GSH的存在下于NO的氧依赖性氧化期间形成(Hogg，2000；Jourd′heuil等，2003；Schrammel等，2003)。它在大鼠脑中以高浓度存在，生理条件下缓慢释放NO并调节亚硝基化/脱亚硝基化(Kluge等，1997)。认为其衰变复杂且取决于多种因素(Ford等，2002；Zeng等，2001)。已证明GSNO是血小板聚集的强效抑制剂(Langford等，1994)，并在人体中减少血栓形成(Molloy等，1998)。设定患者组中，它在快速降低栓塞信号的频率方面高度有效(Kaposzta等，2002a；Kaposzta等，2002b)。它可逆转急性血管收缩并防止蛛网膜下出血后的缺血性脑损伤(Sehba等.1999)。猪中，泡沫化损伤(balloon injury)期间全身给予GSNO和冠状动脉内辐射可导致血栓形成率降低(Vodovotz等，2000)。GSNO抑制凝血因子XIII，以防止血小板聚集(Catani等，1998)。此外，在对抗ONOO-和HO中，GSNO是比GSH更强效的抗氧化剂。许多证据表明，在含NOS细胞和其它细胞中，通过细胞内信号传导，S-亚硝基化/转亚硝基化(transnitrosylation)可用作NO-相关生物活性的重要中介物。近来，证明了GSNO，类似于NO、O2和H2O2，是内皮细胞或星形胶质细胞与神经元之间的信号传导分子(Chiueh和Rauhala 1999)。Rauhala等也证明了氧化应激的脑多巴胺神经元的GSNO有神经保护作用(Rauhala等，1998)。在本研究中，即使是在阻塞发生后给予GSNO，不仅能够保护脑以免梗死而且能够改善神经学评分。急性中风模型中GSNO提供的保护作用可解释为GSNO本身及其代谢物(包括NO和GSH)的多重参与(Chiueh和Rauhala 1999)。GSNO具有调节血管张力(tone)的能力(Rodriguez等，2003)。从GSNO释放的NO可通过与鸟苷酸环化酶结合保留(至少部分地保留)内皮功能，从而增加cGMP水平和脑血流量。缺血后长达3小时监测脑血流量，发现脑血流量明显增加(数据未示出)。NO信号传导的新尺度一般指RSNO，具体指GSNO通过S-亚硝基化/脱亚硝基化和转亚硝基化的直接cGMP依赖性作用(Foster等.2003)。然而，主要焦点是研究GSNO在急性中风中的消炎作用。根据这一目的，处理脑细胞，包括大鼠原代星形胶质细胞和BV2细胞系(小胶质细胞系)。GSNO剂量依赖地抑制iNOS的表达，如图18所示。抑制作用可进一步由iNOS-荧光素酶活性所证实(图18C-18D)。而且，本发明者研究了GSNO对iNOS的抑制机制，发现这是由NF-κB介导的，如GSNO以剂量依赖方式抑制NF-κB荧光素酶活性所示。大鼠原代星形胶质细胞和BV2细胞中，GSNO抑制细胞因子-诱导的iNOS基因表达，这可能涉及NF-κB失活的机制。该作用可通过NF-κB反应性炎症基因减少细胞损伤。在鼠巨噬细胞和人呼吸细胞中证明，通过用S-亚硝基半胱氨酸S-亚硝基化p50巯基抑制了NF-κB(Marshall和Stamler，2001)。存在至少两个NF-κB活化途径的NO抑制靶点，一个在胞浆中(可能是IKK复合物)，另一个在核中(p50-p65)，这取决于细胞类型(Marshall和Stamler2002)。在这种情况下，假定GSNO亚硝基化p50-p65。p50的亚硝基化抑制p50-p65与iNOS启动子区域中DNA的结合，如图7所示。这可能是说明在包括NF-κB通路的大鼠原代星形胶质细胞中GSNO抑制iNOS表达的第一次报道。虽然过去已报道了角质形成细胞中，GSNO抑制细胞因子介导的NF-κB和趋化因子的活化(Giustizieri，2002)。局灶性脑缺血/再灌注中通过坏死和凋亡发生细胞死亡(Kametsu等，2003；Yao等，2001)。坏死与凋亡的比率取决于一些主要因素。缺血事件的时间、阻塞类型、年龄和风险因素易患体质是中风严重性和凋亡性细胞死亡的主要决定因素(Love，2003)。NO对凋亡或抗-凋亡的调节作用是复杂的，涉及不同的机制(Chung等，2001；Kim等，2001；Kim等，1999)。抗-凋亡药物干预防止细胞凋亡是临床上初步可达到的目标之一(Waldmeier 2003)。因为实验性中风后，大鼠脑中氧化性DNA损伤先于DNA片段化(Cui等，2000)，可使用抗氧化剂和神经保护剂防止DNA氧化和片段化。该目的导致使用具有抗缺血性质与抗凋亡性质的药物。实验性脑缺血中(Namura等.1998)，半影中观察到大量凋亡神经元(图16J-16L)，如TUNEL(图13J-13L)和作为线粒体-凋亡途径的标志的半胱天冬酶-3活化(图17)所示(Davoli等．2002；Mohr等．1997)。半胱天冬酶-3的活化包括其脱亚硝基化。已证明半胱天冬酶-3在其亚硝基化形式中保持失活。证明Fas凋亡途径能激活半胱天冬酶-3的脱亚硝基化(Mannick等．1999)，导致其活化。本发明模型中GSNO处理可减少缺血/再灌注-诱导的半胱天冬酶-3活化(图17)并减少TUNEL阳性神经元的数量，如图13和16所示。为检查GSNO的作用是否通过谷胱甘肽(GSH)介导，本发明者用外源性GSH处理动物。缺血发生后直接给予GSH(高达150mg/kg体重)无保护作用。脑缺血促进神经胶质细胞(固有小胶质细胞和星形胶质细胞)的活化和血源性细胞(包括中性粒细胞和巨噬细胞)的浸润(Stoll等，1998)。梗死和近-梗死区中发现活化星形胶质细胞(GFAP阳性)和活化小胶质细胞/巨噬细胞(ED-1阳性)(图15)。因为已鉴定正常星形细胞功能在急性中风中是支持神经元存活的关键(Anderson等，2003)，所以认为星形细胞代谢包括活化中的异常与损伤有关。巨噬细胞和中性粒细胞的浸润取决于内皮功能，内皮功能在缺氧和缺血条件下受损，并可由NO和NO供体维持(Johnson等，1998)。在低或无氧/葡萄糖条件下，eNOS不能提供所需的NO以维持适当的内皮功能。eNOS产生的皮摩尔量的NO通过鸟苷酸环化酶-cGMP途径和/或蛋白质和小肽的半胱氨酸残基的亚硝基化/转亚硝基化，参与维持内皮功能、脑血流量和血管舒张(Tseng等，2000)。在内皮功能受损的再充氧的缺血脑中，活化星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞成为除细胞因子和类花生酸外iNOS和ROS的主要来源。一旦诱导，iNOS爆发性释放NO(纳摩尔量)，它可与O′反应形成ONOO-。现在清楚，在与生理水平的ROS/O2 -′相比过量的ROS/O2′存在下，NO的作用不同(Davis等，2001)。不存在O2 -′时，NO通过几种机制终止自由基包括脂质过氧化物的启动和增加，这些机制包括调节脂质代谢酶的酶活，参与细胞信号传导和结合于氧化还原活性金属中心以抑制羟自由基的产生。另一方面，NO可与ROS协同作用或与ROS/O2反应产生ONOO-和HO′。在缺血损伤中后两种自由基可主动破坏DNA、蛋白质和脂质导致细胞死亡。即使发生局灶性脑缺血后给予低剂量GSNO(1mg/kg体重)提供的保护作用说明，GSNO能够抑制炎症细胞的活化(图15)和炎症中介体的产生(图13)。体外研究中的确发现抑制NF-κB亚基与DNA的结合。除涉及NF-κB外，认为GSNO还可通过亚硝基化NMDA受体和半胱天冬酶-3行使其消炎作用。NMDA(Lipton等，2002)受体和半胱天冬酶-3(Mannick等，2001)的S-亚硝基化是脑缺血中公认的损伤抑制机制。在细胞培养物中通过NF-κB的亚基p65/p50抑制iNOS的表达清楚表明，神经保护作用不仅依赖于GSNO对血管和循环系统细胞的潜在作用，而且可产生直接消炎作用。而且，GSNO体内处理抑制缺血/再灌注-诱导的半胱天冬酶-3活性，从而说明GSNO能够抑制半胱天冬酶-3介导的细胞死亡。后来，在该模型中检测GSNO所提供的防止脑损伤的治疗窗(长达6小时)与保护。发生缺血后1.5小时内，以1mg/kg体重的剂量给予时，从梗死和神经学评分(数据未示出)来看，GSNO仍然具有高度保护性。
不管GSNO抗中风的确切保护机制怎样，GSNO都是良好的神经解救剂，因为它容易获得和给药，无毒，最重要地，能抗凋亡和消炎。之前已使用GSNO，它在动物和人中耐受良好。虽然缺血时GSNO消炎且抗凋亡，但GSNO神经保护作用的机制还需要更多体内和体外研究。
                           实施例7
                         材料和方法III
细胞培养和试剂：从1-3日龄Sprague-Dawley大鼠制备原代大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞(McCarthy和de Vellis，1980)，并维持在含10％胎牛血清(FBS)和抗生素的DMEM(4.5gm葡萄糖/L)中。根据GFAP(胶质原纤维酸性蛋白)和MAC1染色，星形胶质细胞和小胶质细胞的纯度大于95％。分离腹膜巨噬细胞并培养在补充有热灭活1％FBS的RPMI 1640培养基中(Pahan等，1997)。BV2是衍生自鼠原代小胶质细胞的小胶质细胞细胞系，由Dr.Michael McKinney(Mayo Clinic，Jacksonville，FL)提供，维持在补充有10％FBS和抗生素的DMEM(4.5gm葡萄糖/L)中。DMEM(4.5gm葡萄糖/L)、RPMI 1640培养基、胎牛血清和Hanks平衡盐溶液来自Life Technologies(Grand Island，NY)。LPS(大肠杆菌，血清型055:B5)、GGPP、FPP、AICAR、甲羟戊酸酯和蛋白酶抑制剂混合物来自Sigma(St.Louis，MO)。抗iNOS抗体得自Upstate(Waltham，MA)。[γ-32P]ATP(3000Ci/mmol)和[γ-32P]dCTP(3000Ci/mmol)来自NEN(Boston，MA)。p65、p50、IKKα、C/EBP-α、-β、-γ、-δ的抗体以及用于NF-κB和C/EBP的寡核苷酸来自Santa Cruz(Santa Cruz，CA)。重组TNF-α、IL-1β、IFN-γ和用于TNFα、IL-1β、IL-6和IFN-γ的ELISA试剂盒来自R&D Systems(Minneapolis，MN)。TRIZOL和转染试剂(lipofectamine2000，lipofectamine Plus和oligofectamine)来自Invitrogen(Carlsbad，California)。CAT ELISA、β-半乳糖苷酶、MTT和LDH试剂盒得自Roche(Nutley，NewJersey)。增强的化学发光(ECL)-检测试剂购自Amersham PharmaciaBiotech(Arlington Heights，IL)。荧光素酶测定系统来自Promega(Madison，WI)。炎症细胞因子的基因表达阵列来自Superarray(Bethesda，MD)。特异性抗磷酸化和非磷酸化的p42/44、p38、JNK1/2和AMPK的抗体来自Cell Signaling(Beverly，MA)。NF-κB-荧光素酶、iNOS-荧光素酶(3.2kb)和AMPKα2显性负表达载体(D157A)分别由Dr.W.J.Murphy、Dr.Zhang和Dr.David Carling友情提供。HA-IKKα的表达载体由Dr.Zheng-Gang Liu无偿提供。iNOS(-1486/+145)-荧光素酶和iNOS-C/EBPdel-荧光素酶由Dr.Bruce C.Kone(Houston)友情提供。iNOS(-234/+31)-荧光素酶和iNOS(-331/+31NF-γB突变)-荧光素酶由Dr.Mark A.Perrella(Boston)无偿提供。
亚硝酸盐浓度：通过测定培养上清液中的亚硝酸盐(NO与分子氧的稳定反应产物)确定NO合成，如前所述(Pahan等，1997；Giri等，2002)。简言之，在96孔板中将上清液与等体积的Griess试剂混合，轻轻振荡，在微板阅读器中570nm处读数。在实验中，用来自NaNO2反应的标准曲线计算亚硝酸盐浓度。
免疫印迹分析：细胞收集于冰冷裂解缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH7.4，含有50mM NaCl，1mM EDTA，0.5mM EGTA，10％甘油和蛋白酶抑制剂混合物)，用Bradford试剂(Bio-Rad，USA)估计蛋白质。50μg总蛋白/道用SDS-PAGE分离，印迹到硝酸纤维素膜(Amersham Pharmacia Biotech)上。在5％脱脂奶粉-TBS-0.1％吐温20中封闭印迹1小时，4℃下与第一抗体(1∶1000)在5％BSA-TBS-0.1％吐温20中孵育过夜。然后与合适的过氧化物酶偶联第二抗体(1∶10,000，Sigma)孵育1小时。根据生产商的说明书(Amersham Pharmacia Biotech)，采用增强的化学发光检测法测定免疫反应性，然后使膜曝光X-射线胶片。
脂肪酸和胆固醇生物合成：星形胶质细胞生长在6孔板(～80％汇合)中，在含AICAR的无血清培养基中预孵育2小时，加入[2-14C]醋酸酯(5μCi/孔)。2小时后，用PBS洗涤细胞两次，刮下细胞。如前所述(Khan等，2000)，分析脂肪酸和胆固醇中标记醋酸酯的掺入。
反义试验：为降低内源性AMPK的水平，用25μm直接针对AMPK的α1和α2亚基的磷酸硫酯化(phosphorthiorated)反义(AS)寡核苷酸(5’CGCCCGTCGTCGTGCTTCTGC-3’)预处理星形胶质细胞48小时(Culmsee等，2001)，对照培养物中使用□错义(MS)寡核苷酸(5’CTCCCGGCTTGCTGCCGT-3’)。根据生产商的说明书，用OligofectamineTM试剂转染寡核苷酸。
AMPK和IKKα/□测定：在原代大鼠星形胶质细胞中测定AMPK活性，如(Kim等，2001)所述。对于IKKα/□测定，用AICAR(1mM)预处理原代星形胶质细胞，然后用LPS(1□g/ml-1)刺激30分钟。用冷PBS洗涤细胞，在裂解缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH7.4，含有50mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、10％甘油和蛋白酶抑制剂混合物)中裂解细胞。将约200μg细胞提取物与抗-IKKα/β抗体(Santa Cruz)孵育2小时，然后加入30μl蛋白A/G PLUS琼脂糖4℃下再孵育1小时。将免疫复合物在裂解缓冲液中洗两次，在激酶缓冲液(20mM HEPES，pH7.5，10mM MgCl2)中洗两次，30℃下在含有20mMβ-甘油磷酸酯、20mM对硝基苯基磷酸酯、1mM二硫苏糖醇、50μM Na3VO4、20μM ATP和5μCi[γ-32P]ATP的30μl激酶缓冲液中孵育。各个反应中用约2μg GST-IκBα融合蛋白(Santa Cruz)作为底物。30分钟后，通过在SDS加样缓冲液中变性以终止反应。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质，通过放射自显影观察底物磷酸化。
电泳迁移率变动分析(EMSA)：从刺激或未刺激星形胶质细胞制备核提取物。进行EMSA，如过去所述(Giri等，2002)，NF-kB和C/EBP共有序列末端标记有[γ-32P]ATP。基于蛋白浓度标准化核提取物，上样等量蛋白(5μg)。在5％非变性PAGE上，45mM Tris、45mM硼酸、1mM EDTA(0.5×TBE)中以11V/cm跑胶来分析DNA-蛋白复合物。干燥凝胶，然后用X-射线胶片在-70℃放射自显影。
细胞因子表达的Northern印迹、基因阵列分析和RT-PCR：根据生产商的方案，用Trizol(Gibco)提取总RNA。用15μg RNA/反应进行iNOS的Northern印迹，如过去所述(Pahan等，1997)。β-肌动蛋白用作RNA上样的对照。根据生产商的方案(Superarray)，使用炎症细胞因子(TNFα、IL-1β、IL-6和IFN-γ)的基因表达阵列。使用成像光密度计(Bio-Rad Lab，Hercules，California)测定信号量。对于RT-PCR，通过如上述Trizol提取从处理的大鼠大脑皮层分离RNA。根据生产商的说明书，使用聚dT作为引物，莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Promega)，从5μg总RNA制备cDNA。用2μl cDNA扩增以下产物[给出了产物名称、预计大小以及使用的正向(F)和反向(R)引物]：iNOS，730bp.(F)5’-CTCCTTCAAAGAGGCAAAAATA-3’，(R)5’-CACTTCCTC CAGGATGTTGT-3’；IL-1β，623bp.(F)5’GCTGACAGACCCCAAAAGATT-3’，(R)5’-TGTGCAGACTCAAACTCCACTT-3’；TNF-α，473bp.(F)5’-CAGGGCAATGATCCCAAAGTA-3’，(R)5’-GCAGTGAGATCATCTTCTCGA-3’；GAPDH，528bp.(F)5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3’，(R)5’-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3’。通过在含0.5μg溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶中电泳和UVP Bio-doc系统拍照(Upland，CA)来观察PCR产物。
细胞因子测定。根据生产商(R&D Systems，MN)提供的方案，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定培养上清液和血清中TNFα、IL-1β和IFN-γ的水平。
转录分析：根据生产商的说明书，在存在或不存在显性负AMPKα2或HA-IKK□的情况下，用lipofectamine-2000(星形胶质细胞)和lipofectamine-Plus(BV2，Invitrogen)将带有□-半乳糖苷酶的NF-κB-或iNOS-荧光素酶报告基因瞬时转染到原代星形胶质细胞或小胶质细胞系(BV2)中。用pcDNA3将所有组标准化为等量DNA。用荧光素酶试剂盒(Promega)检测荧光素酶活性。
动物和LPS处理：根据实验动物的护理和使用指南(National Institute ofHealth，Pub.No.86-23)以及南卡罗来纳医学院，研究用动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))使用动物。室温下，分组饲养雌性Sprague-Dawley大鼠(200-250g；Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)，条件是12小时光线：12小时黑暗，随意进食和进水。动物腹膜内注射(i.p.)AICAR(100mg/kg体重)，30分钟后用溶解在0.9％盐水中的LPS或仅0.9％无菌盐水处理(0.5mg/kg体重)。6小时后，分离大脑皮层，经液氮冷冻，然后在-70℃备用。
细胞活力：通过用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)和LDH释放试验(Roche)测定细胞代谢活性，确定处理的细胞毒作用。
统计学分析：结果表示为平均值±S.D.。采用GraphPad InStat软件(SanDiego，CA)，通过Student-Neuman-Keuls检验的ANOVA进行统计学分析。
                           实施例8
                           结果III
脑神经胶质细胞和腹膜巨噬细胞中，AICAR下调LPS-诱导的促炎细胞因子的表达：活化的星形胶质细胞、小胶质细胞和巨噬细胞是NO和细胞因子产生的主要来源，它们主动参与炎性疾病(Benveniste，1997)。用不同浓度的AICAR预处理大鼠原代星形胶质细胞、小胶质细胞和腹膜巨噬细胞，然后暴露于LPS(1μg/ml)。经ELISA测定，在星形胶质细胞(图20a)、小胶质细胞(图20b)和巨噬细胞(图20c)中，细菌LPS明显诱导促炎细胞因子(TNFα、IL-1β和IL-6)的产生。仅AICAR对细胞因子的产生无影响；然而，它以剂量依赖方式强烈抑制这些细胞的上清液中LPS-诱导的TNFα、IL-1β和IL-6的产生(图20)。抑制细胞因子产生伴随着mRNA表达降低(数据未示出)。有趣的是，与星形胶质细胞和小胶质细胞相比，巨噬细胞对AICAR更敏感，微摩尔浓度的AICAR足以抑制促炎细胞因子产生(图20c)。如LDH和MTT试验所测定的那样(数据未示出)，AICAR或LPS对细胞活力无影响。
脑神经胶质细胞中，AICAR抑制LPS-诱导的NO产生和iNOS基因表达：伴随着促炎细胞因子的产生，已证明响应细胞因子产生NO在许多炎性疾病的病理生理学中是重要的(Smith等，1999)。用不同浓度的AICAR预处理大鼠原代星形胶质细胞、小胶质细胞和巨噬细胞，然后暴露于LPS(1μg/ml)。LPS诱导的NO产生(以亚硝酸盐测定)比未处理细胞高10倍。在原代星形胶质细胞、小胶质细胞和腹膜巨噬细胞中，AICAR处理以剂量依赖方式抑制LPS-诱导的亚硝酸盐产生(图21A和B)。类似于细胞因子产生，与原代星形胶质细胞和小胶质细胞相比，巨噬细胞对AICAR处理更敏感(图20c)。
为理解AICAR对LPS-介导的亚硝酸盐产生的抑制机制，在原代大鼠星形胶质细胞中检测AICAR对iNOS蛋白和mRNA水平的影响。与亚硝酸盐的产生一致，AICAR在mRNA和蛋白水平抑制LPS-诱导的iNOS表达(图21C和D)。然后本发明者在原代星形胶质细胞中检测了响应LPS处理iNOS启动子的活化，以及AICAR对该活性的影响。通过瞬时转染，将含有与荧光素酶基因(iNOS-Luc)连接的大鼠iNOS启动子的3.2-kb部分的质粒引入原代星形胶质细胞的亚汇合培养物中。24小时后，用不同浓度AICAR(0.25-1mM)预处理培养物，然后再用LPS处理6小时(图21E)。通过与LPS孵育大大刺激了iNOS启动子活性(2.5-倍)(图21e)。然而，它被AICAR处理以剂量依赖方式明显抑制。过去报道(Hardie，1992)以及本发明者的实验表明，原代星形胶质细胞中AICAR显著抑制胆固醇生物合成(图22a)。而且，本发明者研究了胆固醇生物合成途径的中间体或代谢物是否可能负责AICAR的消炎作用。原代星形胶质细胞中加入甲羟戊酸酯、焦磷酸忙牛儿基忙牛儿酯(GGPP)和焦磷酸法尼酯(FPP)不能逆转AICAR对LPS诱导的iNOS-荧光素酶活性的抑制作用(图21f)。
AICAR通过活化AMP-活化蛋白激酶(AMPK)抑制iNOS基因表达：AICAR通过活化AMPK介导其作用；必须建立AMPK在调节炎症过程中的作用。一旦活化，AMPK通过磷酸化乙酰基-CoA-羧化酶(ACC)和HMG-CoA还原酶下调ATP消耗途径，如脂肪酸和胆固醇合成。本发明者观察到，用AICAR(1mM)处理原代星形胶质细胞明显抑制胆固醇和脂肪酸生物合成(～80％)(图22a)。AICAR处理星形胶质细胞也诱导ACC磷酸化(图22b)，这表明AICAR诱导AMPK活性。AMPK不仅可被AMP变构活化，而且是上游激酶AMP-活化蛋白激酶激酶(AMPKK)的靶点，并且，由AMPKK磷酸化AMPK是其全部活性所必需的(Moore等，1991；Hawley等，1996；Hardie等，1998；Stein等，2000)。AICAR处理星形胶质细胞中AMPK的磷酸化清楚表明，AICAR不仅诱导AMPK活性(诱导ACC磷酸化)，而且诱导上游激酶(AMPKK)活性(诱导AMPK磷酸化)(图22b)。AICAR处理星形胶质细胞诱导AMPK和ACC磷酸化(图23b)，这可被5-碘代杀结核菌素和IC51所阻断，5-碘代杀结核菌素和IC51是阻断从AICAR形成ZMP(AICAR的5′-磷酸化形式)的腺苷激酶(ADK)抑制剂。ZMP模拟AMP在AMPK变构激活中的作用，而不改变AMP、ADP和ATP水平(Corton等，1995)。AICAR诱导的AMPK磷酸化可被ADK抑制剂阻断(图22b)，进而逆转AICAR对LPS诱导的iNOS蛋白表达的抑制作用(图22c)。
为进一步阐明AMPK在调节iNOS表达中的作用，本发明者采用针对编码催化亚基(AMPK的AMPKα1和α2(Culmsee等，2001))的mRNA的翻译起始位点附近序列的反义寡核苷酸。用25μM磷酸硫酯化(phosphorthiorated)反义(AS)转染原代星形胶质细胞能减少AMPKα1催化亚基，而错义(MS)无作用[图22d(i)]。其次，本发明者检测了AMPKα2亚基反义寡核苷酸对LPS介导的iNOS基因表达的作用。原代星形胶质细胞中，仅AMPKα2亚基反义处理对iNOS表达没有任何作用，但它明显诱导LPS介导的iNOS蛋白质表达[图22d(ii)]。这些实验清楚表明，AMPK参与炎症反应的调节。为确定AMPK在炎症过程中的直接作用，并阐明AMPK在该功能中的分子机制/途径，采用小胶质细胞系(BV2)。该细胞系衍生自小鼠原代小胶质细胞，容易转染，响应LPS产生促炎细胞因子和中介体(Kim等，2002；Su等，2003)。在瞬时转染研究中，LPS显著诱导(～4倍)BV2细胞系中的iNOS-luc活性，AICAR预处理以剂量依赖方式降低荧光素酶活性(图22e)。在共转染实验中，本发明者检测了显性负(DN)AMPK α2 D157A的表达(Stein等，2000)对iNOS启动子活性的影响。DN AMPK α2不仅导致LPS诱导的iNOS-Luc活性明显增加，而且显著逆转AICAR诱导的iNOS-Luc活性抑制(图22e)。这些实验清楚说明在脑神经胶质细胞中，AMPK与炎症中介体表达相关。
已知促分裂原活化蛋白激酶(ERK1/2、p38和JNK1/2)在促炎中介体的表达中起调节作用(Arbabi和Maier，2002)。因此，研究了在大鼠原代星形胶质细胞中AICAR对LPS-介导的ERK1/2、JNK1/2和p38MAPK活化的影响。与MAPK的已有作用相一致，LPS诱导所有三种MAPK的磷酸化，而AICAR将LPS介导的这些激酶的磷酸化抑制了40-60％(图23)。仅AICAR对这些MAP激酶的磷酸化没有作用。
AICAR通过抑制LPS-诱导的NF-κB和C/EBP核转运减轻炎症反应：为理解AICAR介导的炎症过程下调机制，本发明者研究了AICAR对LPS介导的NF-κB活化的作用。在未刺激细胞中，NF-kB由p65/p50异源二聚体构成，通过与IκB结合而保留在胞浆中。用各种试剂刺激细胞后，胞质NF-κB/IκB复合物解离，游离NF-κB转运入核，调节各种基因的翻译。上游激酶IKK磷酸化IκBα是IκBα与NF-kB解离及其降解所必需的(Ghosh和Karin，2002)。已证明NF-κB的活化对iNOS和促炎细胞因子(TNFα和IL-6)的表达很关键(Zagariya等，1998；Zhang等，1998；Hu等，2000)。原代星形胶质细胞中研究AICAR在LPS介导的NF-κB活化中的作用。如图24a所示，LPS处理在30分钟内活化NF-κB并将其转运入核，处理后长达3小时中保持这种作用。AICAR预处理明显降低LPS诱导的NF-κB的DNA结合活性(图24a)。在BV2细胞中，通过编码显性负AMPK的表达载体与NF-κB-依赖性转录报告基因(3xNF-κB-luc)的共转染，研究AMPK在调节NF-κB转录活性中的可能作用。如图24b所示，AICAR预处理显著抑制LPS诱导的NF-κB-Luc活性。虽然显性负AMPKα2对LPS诱导的NF-κB-Luc活性没有作用，但它明显逆转了AICAR诱导的抑制(图24b)。LPS介导的NF-κB核转运中AICAR诱导的抑制与p65和p50(NF-κB家族成员)核提取物的免疫印迹分析结果相一致(图24c)。而且，通过AICAR处理抑制IκBα的降解进一步支持了这些结论(图24d)。
除此以外，用iNOS-luci(-234/+31)载体(严格依赖NF-kB活化的构建物)转染小胶质细胞(BV2)。如图24e所示，AICAR完全消除了LPS处理诱导的荧光素酶活性。有趣的是，使用k-luci]中缺失的NOS-2启动子片段完全消除了启动子活性，这反映该基序在响应LPS刺激表达报告基因中的必要性(图24e)，AICAR通过下调NF-κB途径介导其作用。
通过含催化亚基(IKKα和β)和IKKγ或NEMO调节亚基的IKK复合物在触发其泛素依赖性降解的位点磷酸化IκBα(Ghosh和Karin，2002)。为确定IKKα/β是否可能是AICAR作用靶点，用AICAR(1mM)预孵育星形胶质细胞，再用LPS处理。如图25a所示，LPS刺激IKKα/β活性，且AICAR处理明显地阻断了这种刺激。为证实这些观察结果，本发明者将NF-κB-Luc与IKKβ野生型表达载体共转染到小胶质细胞(BV2)和原代星形胶质细胞中。在BV2细胞和原代星形胶质细胞中，AICAR处理明显抑制IKKβ介导的NF-κB-Luc活性(图25b和c)。这些观察结果清楚表明，AICAR通过抑制IKK的一些未知上游分子，抑制NF-κB的DNA结合及其转录活性。
除NF-κB以外，在各种促炎基因如IL-6、IL-1β、TNFα、IL-8、IL-12、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、iNOS、溶菌酶、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶和粒细胞-巨噬细胞受体的功能调节区域中鉴定了C/EBP-结合基序(Poli，1998)。因此，在LPS和/或AICAR处理的原代星形胶质细胞中，在不同时间(从0.5到3小时)用EMSA检测C/EBP的DNA结合活性。LPS诱导C/EBP核转运，AICAR消除LPS诱导的C/EBP DNA结合活性，而单用AICAR对C/EBP核转运无作用(图26a)。而且，为鉴定负责C/EBP复合物的C/EBP蛋白，用C/EBP-α、-β、-δ和-ε特异性抗体进行超移位分析。仅C/EBP-β和-δ特异性IgG明显使C/EBP复合物超移位(图26b)。通过LPS和LPS/AICAR处理的原代星形胶质细胞的核提取物的免疫印迹，检测C/EBP-β和-δ的核转运。C/EBP-β为组成性表达，位于未处理细胞的核中，LPS和/或AICAR不能调节其水平(图26c)。另一方面，与未处理细胞相比，在LPS处理细胞的核提取物中中观察到高水平C/EBP-δ，并且，AICAR处理完全抑制C/EBP-δ的转运(图26c)。有兴趣检测AICAR是否在原代大鼠星形胶质细胞中抑制C/EBPδ转运入核或其表达。为此，本发明者检测了C/EBP-δ在LPS和AICAR处理的原代星形胶质细胞中的表达。LPS诱导C/EBP-δ的mRNA表达，AICAR减少LPS介导的C/EBP-δ表达(图26d)。为证明在神经胶质细胞中C/EBP对iNOS基因表达的调节起重要作用，本发明者采用缺少-150到-142C/EBP框的iNOS2启动子(iNOS-C/EBPdel-luc)。用iNOS-luc转染并用LPS处理的小胶质细胞(BV2)显示出，标准化荧光素酶活性显著增加，而AICAR处理完全消除这种荧光素酶活性(图26e)。相反，转染iNOS-C/EBPdel-luc的细胞经LPS刺激后，标准化荧光素酶活性稍有增加(图26e)。这些结果表明，C/EBP响应于LPS在调节iNOS基因表达中起作用。总之，这些观察结果证明，AICAR通过下调C/EBPδ的表达抑制LPS-诱导的C/EBP核转运。
在LPS-处理大鼠中，AICAR抑制促炎细胞因子和亚硝酸盐的产生：由于AICAR在培养细胞中显示消炎性质(通过抑制NF-κB和C/EBP的核转运)，因而更有兴趣体内研究AICAR的相同作用。众所周知，体内腹膜内注射LPS诱导促炎细胞因子如TNFα、IL-1β和IFN-γ的表达(Hesse等，1988)。因此，本发明者在LPS注射大鼠中检测AICAR对血清细胞因子水平的影响。LPS注射后6小时测定血清中TNFα、IL-1β和IFN-γ的水平。如图27a所示，LPS有效诱导促炎细胞因子(TNFα、IL-1β和IFN-γ)，而AICAR预处理几乎消除了LPS介导的血清中IL-1β和IFN-γ水平提高。然而，它对TNFα水平无影响。在分离自这些动物的腹膜巨噬细胞中，AICAR处理也显著抑制了LPS诱导的iNOS表达(图27b)。并且，本发明者通过基因阵列分析研究了AICAR对这些细胞因子在脾中表达的影响。类似于血清中的观察结果，腹膜内注射LPS明显诱导脾中TNFα、IL-1β和IFN-γ信使的表达(图27c)。AICAR处理使得IL-1β和IFN-γ的mRNA表达显著降低，而未观察到脾中TNFα的表达明显改变(图27c)。盐水或单用AICAR都不能诱导这些细胞因子可检测的信号。
已证明外周免疫刺激或外周炎症的模型能诱导脑内促炎细胞因子的表达(Pitossi等，1997)，因此，本发明者检测了用AICAR处理或未用AICAR处理的LPS注射大鼠的大脑皮层中TNFα、IL-1β和iNOS的表达。在大脑皮层中LPS诱导TNFα、IL-1β和iNOS的表达，而AICAR处理显著降低这些分子的表达(图27d)。这些发现类似于培养的神经胶质细胞，在动物模型中，AICAR也有效减少了促炎分子的表达(除了TNFα)(图27)。
                           实施例9
                           讨论III
通过其磷酸化和抑制生物合成途径中所涉及的关键酶，如乙酰基CoA-羧化酶(脂肪酸合成)和HMG CoA-还原酶(类异戊二烯和胆固醇生物合成)的能力，首次鉴定了AMP-活化蛋白激酶(AMPK)(Moore等，1991；Vincent等，1991；Hardie和Carling，1997；Hardie等，1998；Winder和Hardie，1999)。由于近来报道胆固醇代谢物能减轻炎症过程(Pahan等，1997；Kwak等，2000)，本发明者在培养细胞和LPS注射动物中检测了AMPK在诱导炎症过程中的可能作用。本说明书中的一些证据明确支持以下结论：在大鼠原代星形胶质细胞、小胶质细胞和腹膜巨噬细胞中，AICAR对AMPK的活化通过抑制NF-κB和C/EBP转录因子的核转运能下调对LPS介导的促炎细胞因子、iNOS和一氧化氮(NO)产生的诱导，从而说明AMPK参与调节炎症中介体的表达。本研究也表明，AICAR或其它AMPK药用激活剂在炎性疾病中有治疗应用。虽然AICAR在LPS注射大鼠的组织培养物和CNS中抑制促炎细胞因子，但它为何不影响LPS诱导的血清TNF□水平，现在尚不能解释。
AICAR诱导AMPK的磷酸化和活化以及ACC和HMG-CoA还原酶的抑制，这表明AMPK及其上游激酶(AMPKK)的活化。已报道HMG-CoA还原酶抑制剂如他汀类具有免疫调节和消炎作用(Pahan等，1997；Kwak等，2000)。然而，本发明者发现，AICAR/AMPK的作用机制不通过甲羟戊酸酯途径，因为加入甲羟戊酸酯和其它代谢物不能逆转AICAR对LPS-诱导的NO产生的抑制作用。由于已知MAPK在促炎分子如TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8、COX-2和iNOS的表达中起重要作用(Arbabi和Maier，2002)，观察到的AICAR抑制LPS诱导的所有三种MAPK(ERK1/2、p38和JNK1/2)的活化表明，AMPK在调节这些信号通路中起作用。已报道AMPK通过磷酸化Raf-1 Ser621调节内皮生长因子(EGF)和胰岛素生长因子(IGF)介导的ERK通路(Sprenkle等，1997；Kim等，2001)。与本发明者的观察结果不同，在大鼠肝衍生的非转化细胞系中，AMPK激活了p38 MAPK的活性(Xi等，2001)。这可能是AMPK的细胞特异性功能之一。
在本发明者的试验条件中，通过以下试验编号记录AICAR激活AMPK的特异性：i.)AMPK□的显性负形式逆转AICAR诱导的iNOS-和NF-κB-荧光素酶活性抑制。ii.)腺苷激酶抑制剂(5’-碘代杀结核菌素和IC51)不仅能够逆转AICAR诱导的iNOS蛋白表达的抑制，而且能够抑制AICAR诱导的AMPK和ACC磷酸化。iii.)反义寡核苷酸下调AMPK催化亚基能够在原代星形胶质细胞中诱导iNOS蛋白水平的表达。近来，报道了AMPK□2敲除小鼠(Viollet等，2003)，在这些小鼠中进行的研究将确切定义AMPK在调节炎症细胞因子中的作用。
AMPK作为转录调节复合物的组分的可能性仍有待探索。近来有报道称，转录共激活物(coactivator)p300在体内和体外是AMPK的底物，磷酸化可显著降低它与其它核受体如PPARγ、甲状腺受体、RAR和RXR的相互作用(Yang等，2001)。本发明者的研究清楚表明，AMPK调节NF-κB和C/EBP的转录活性。AMPK的活化通过抑制LPS-诱导的IKKα/□活性和IκBα的磷酸化/降解，抑制NF-κB核转运和转录活性，这表明AMPK靶向IKK上游的NF-κB途径。另一方面，在原代星形胶质细胞中，AICAR不仅抑制C/EBP的核转运，而且下调LPS-诱导的C/EBP-δ的表达。这些观察结果表明，C/EBP途径是治疗炎性疾病的可能的候选方式之一，因为已知C/EBP能调节TNFα、IL-1β、IL-6、iNOS、IL-8、IL-12和GM-CSF的表达(Poli，1998)。
既然促炎细胞因子(TNFα、IL-1β和IL-6)和NO与脱髓鞘和神经退行性疾病的发病机制有关(Benveniste，1997；Smith等，1999；Torreilles等，1999；Bauer等，2001)，本发明者的结果提供了AMPK激活剂可防止或减轻神经损伤的潜在重要机制。AMPK是异源三聚体蛋白激酶，由催化亚基α和非催化亚基β和γ构成(Hardie和Carling，1997；Hardie等，1998；Winder和Hardie，1999)。各亚基存在不同的异构体，称为α1或α2、β1或β2和γ1、γ2或γ3(Kemp等，1999)。AMPK的免疫染色证明，α2 AMPK亚基在脑中的表达主要限制在神经元和白质星形胶质细胞中(Turnley等，1999)。一般，大多数星形胶质细胞表达低水平AMPK，但当代谢活性增加例如反应性神经胶质过多期间其表达增加(主要是□2和□2)(Turnley等，1999)，其中，星形胶质细胞变大，迁移至损伤部位并释放各种细胞因子和生长因子。观察到反应性星形胶质细胞中AMPK表达较高和鉴定到核中AMPK异构体的共定位表明，AMPK除调节能量代谢外还可具有其它功能(Salt等，1998；Turnley等，1999)。这些发现与本研究报道的AMPK在炎症过程中的作用相一致。近来报道AMPK在葡萄糖缺乏期间，在神经元中具有保护功能(Culmsee等，2001)，且已证明能保护星形胶质细胞(Blazquez等，2001)和胸腺细胞(Stefanelli等，1998)以免凋亡和坏死。近来，在果蝇(Drosophila)中证明AMPK在神经退变和APPL/APP进程中有新功能，这种功能可通过HMG-CoA还原酶和胆固醇酯介导(Tschape等，2002)。所有这些观察结果提示，AMPK在CNS中的重要作用，并支持本发明。强烈表明，作为消炎分子，AMPK起着重要作用，可利用AMPK作为消炎药如AICAR的靶分子。而且，以前已使用AICAR作为药物，在相对高剂量(100mg/kg体重)下安全而无副作用地治疗Lesch-Nyhan综合征(Page等，1994)。以前已报道AICAR在健康人体中10-100mg/kg静脉剂量下的安全性、耐受性和药代动力学特性(Dixon等，1991)。AICAR具有高清除率，口服给药的生物利用度差。
总之，本说明书所述研究证明了AMPK在炎性疾病中的新作用。AMPK可以是炎性疾病如多发性硬化、阿耳茨海默病、中风和其它神经退行性疾病中感兴趣的神经保护药物靶点。
                           实施例10
                       他汀类治疗炎性疾病
本实施例提供说明他汀类可用于治疗或预防炎性疾病的数据等。例如，表1显示，在大鼠原代星形胶质细胞、小胶质细胞和巨噬细胞中，联用洛伐他汀和FPP脱羧酶抑制剂(如NaPA)能抑制LPS诱导的一氧化氮、TNF-α、I1-1β和IL-6的产生。。
                                   表1*
  细胞   NO或细胞因子的产生   仅LPS   LPS+洛伐他汀   LPS+NaPA
  星形胶质细胞   NO   25.3+/-3.2   5.2+/-0.4   5.4+/-0.6
  TNF-α   5.3+/-0.8   0.3+/-0.05   0.4+/-0.06
  Il-1β   10.4+/-1.5   0.8+/-0.1   1.1+/-0.2
  IL-6   136.5+/-16.8   0.8+/-0.1   1.1+/-0.2
  小胶质细胞   NO   81.2+/-6.9   5.9+/-0.4   6.9+/-0.9
  TNF-α   14.5+/-2.1   0.9+/-0.1   1.3+/-0.2
  Il-1β   28.2+/-3.4   2.1+/-0.3   2.4+/-0.2
  IL-6   295.6+/-33.5   7.8+/-1.1   9.3+/-1.2
  细胞   NO或细胞因子的产生   仅LPS   LPS+洛伐他汀   LPS+NaPA
  巨噬细胞   NO   118.5+/-12.5   7.2+/-0.9   9.5+/-0.7
  TNF-α   18.6+/-2.3   1.2+/-0.1   1.7+/-0.2
  Il-lβ   34.6+/-4.5   2.3+/-0.3   3.1+/-0.4
  IL-6   350.0+/-27.6   8.3+/-0.6   10.2+/-1.4
*将细胞与10μM洛伐他汀或5mM NaPA在无血清条件下预孵育8小时，用1.0μg/ml LPS刺激。孵育24小时后，如上所述测定上清液中NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。NO表示为nmol/24h/mg蛋白，而TNF-α、IL-1β和IL-6表示为ng/24h/mg蛋白。数据表示三次不同实验的平均值+/-SD。
图28-52提供了其它数据，显示他汀类能有效治疗各种炎性疾病如多发性硬化、脊髓损伤、中风和奎尼酸诱导的癫痫发作。此外，表2提供了与另两种批准的MS药物相比，关于用他汀类治疗多发性硬化(MS)的数据。使用的已知药物是IFN-β和醋酸格拉默(glatiramer acetate，GA)，并比较它们与他汀类+GSNO联用在中风模型中的效果。
                   表2
 生物学 IFN-β   GA  他汀类+GSNO
 抗原递呈   减少
 MHC II表达降低   是   否   是
 共刺激分子水平降低   是   否   是
 抑制共刺激分子的克隆表达   是   是   是
 干扰T-细胞活化   是   是   是
 减少炎症细胞因子   是   是   是
 Th1至Th2偏差   是   是   是
 白细胞跨血脑屏障(BBB)运输   是   否   是
 粘附分子表达降低   是   否   是
 抑制趋化因子表达   是   否   是
 抑制MMP   是   否   是
 生物学   IFN-β   GA  他汀类+GSNO
 阻止白细胞进入CNS   是   否   是
 保护BBB   是   否   是
 下调细胞因子、iNOS和CNS的表达   是
 抗体   中和   插入   惰性
 神经保护   不清楚   是   是
对于脊髓损伤，优选的模型是sprague-dawley大鼠。通过使5gm重量从6cm高处落下诱导损伤，产生约30g-c力的治疗相关损伤。通过血脑屏障神经学评分21分来评价损伤和恢复的程度。然后提取脊髓，加工用于免疫细胞化学和mRNA蛋白表达。接着，实验步骤如下所述：
Figure A20048003840000721
D-PDMP的给药途径是腹膜内(IP)，阿托伐他汀是灌胃。损伤1h、4h、24h、48h和1周后从动物提取脊髓组织。持续15天观察损伤动物的神经学评分。图39-42包括关于阿托伐他汀对大鼠脊髓损伤的作用的数据。
                           **************
根据本文公开内容，不需过多实验就可制成和实施本文所述和要求权利的所有组合物和/或方法和/或装置。虽然以优选实施方式描述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人员应该知道，可对此组合物和/或方法和/或装置，以及本文所述方法的步骤或步骤顺序进行修改，但这并不脱离本发明的概念、构思和范围。更具体说，显然可用某些化学和生理学上相关的物质替换本文所述的物质，而可获得相同或相似的结果。本领域技术人员应知道，所有这些相似的替代或修改都应认为属于本文所附权利要求书限定的本发明的构思、范围和概念之内。
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Claims (54)

1.一种预防或治疗患者炎性疾病或病症的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的：
(a)谷胱甘肽供体；和
(b)5-氨基4-咪唑羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂、D-苏-1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇盐酸盐(D-PDMP)或1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇(Miglustat)或它们的衍生物。
2.如权利要求1所述的方法，还包括确定患者需要预防或治疗。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述确定患者需要预防或治疗包括确定患者是否有发生炎性疾病或病症的风险。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，确定患者是否有发生炎性疾病或病症的风险包括检查家族史或患病史。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽供体被配制在药学上可接受的介质中。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat被配制在药学上可接受的介质中。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在给予患者AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat之前、期间或之后给予患者GSNO。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在给予患者GSNO之前、期间或之后给予患者AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在给予患者AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat之前、期间或之后给予患者谷胱甘肽供体。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在给予患者谷胱甘肽供体之前、期间或之后给予患者AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽供体是包含谷胱甘肽的分子。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽供体是谷胱甘肽前体分子。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽供体是S-硝基谷胱甘肽(GSNO)、L-2-氧代-噻唑烷4-羧酸酯(丙环司坦)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)或N-乙酰谷胱甘肽。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽供体是S-硝基谷胱甘肽(GSNO)。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，给予患者所述谷胱甘肽供体和AICAR。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，给予患者所述谷胱甘肽供体和HMG-CoA还原酶抑制剂。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述HMG-CoA还原酶抑制剂是他汀类。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述他汀类是阿托伐他汀、洛伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀或西立伐他汀。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述他汀类是阿托伐他汀。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，给予患者所述谷胱甘肽供体和D-PDMP。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，给予患者所述谷胱甘肽供体和Miglustat。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，给予患者所述谷胱甘肽供体、AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP和Miglustat。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述炎性疾病或病症是：中风、X-肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)、癌症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、心肌炎、关节炎、自身免疫疾病、炎性肠病、炎性神经系统疾病、炎性肺病、炎性眼病、慢性炎性牙龈病、慢性炎性关节病、皮肤病、骨病、心脏病、肾衰竭、慢性脱髓鞘病、内皮细胞疾病、心血管疾病、肥胖、普通感冒、狼疮、镰状细胞贫血、糖尿病或神经退行性疾病。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述炎性疾病或病症是中风。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述炎性疾病或病症是神经退行性疾病。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病是：阿耳茨海默病、帕金森病、兰-格-巴-斯四氏综合征、多发性硬化、病毒性脑炎、获得性免疫缺陷(AIDS)-相关性痴呆、肌萎缩性侧索硬化、脑外伤或脊髓疾病。
27.如权利要求1所述的方法，还包括给予用于治疗或预防炎性疾病或病症的第二疗法。
28.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽供体包含在药学上可接受的组合物中。
29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat包含在药学上可接受的组合物中。
30.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽供体与所述AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat包含在独立的组合物中。
31.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽供体与所述AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat包含在同一组合物中。
32.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽供体不是GSNO。
33.一种组合物，所述组合物包含：
(a)谷胱甘肽供体；和
(b)5-氨基4-咪唑羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂、D-苏-1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇盐酸盐(D-PDMP)或1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-山梨醇(Miglustat)或它们的衍生物。
34.如权利要求33所述的组合物，还包括药学上可接受的组合物。
35.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述谷胱甘肽供体与所述AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP或Miglustat被配制在药学上可接受的介质中。
36.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述谷胱甘肽供体是S-硝基谷胱甘肽(GSNO)、L-2-氧代-噻唑烷4-羧酸酯(丙环司坦)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)或N-乙酰谷胱甘肽。
37.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述谷胱甘肽供体是S-硝基谷胱甘肽(GSNO)。
38.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含谷胱甘肽供体和AICAR。
39.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含谷胱甘肽供体和HMG-CoA还原酶抑制剂。
40.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述HMG-CoA还原酶抑制剂是他汀类。
41.如权利要求40所述的组合物，其特征在于，所述他汀类是阿托伐他汀、洛伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀或西立伐他汀。
42.如权利要求41所述的组合物，其特征在于，所述他汀类是阿托伐他汀。
43.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含谷胱甘肽供体和D-PDMP。
44.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含谷胱甘肽供体和Miglustat。
45.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述组合物包含谷胱甘肽供体、AICAR、HMG-CoA还原酶抑制剂、D-PDMP和Miglustat。
46.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述谷胱甘肽供体不是GSNO。
47.一种预防或治疗患者炎性疾病或病症的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的谷胱甘肽供体、5-氨基4-咪唑羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)、他汀类、D-PDMP或Miglustat，或它们的衍生物。
48.一种包含谷胱甘肽供体和他汀类或它们的衍生物的药学上可接受的组合物。
49.如权利要求48所述的药学上可接受的组合物，其特征在于，所述谷胱甘肽供体是S-硝基谷胱甘肽(GSNO)、L-2-氧代-噻唑烷4-羧酸酯(丙环司坦)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)或N-乙酰谷胱甘肽。
50.如权利要求49所述的药学上可接受的组合物，其特征在于，所述谷胱甘肽供体是S-硝基谷胱甘肽(GSNO)。
51.如权利要求50所述的药学上可接受的组合物，其特征在于，所述他汀类是阿托伐他汀、洛伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀或西立伐他汀。
52.如权利要求51所述的药学上可接受的组合物，其特征在于，所述他汀类是阿托伐他汀。
53.如权利要求48所述的药学上可接受的组合物，其特征在于，所述谷胱甘肽供体是L-2-氧代-噻唑烷4-羧酸酯(丙环司坦)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)或N-乙酰谷胱甘肽。
54.一种药学上可接受的组合物，其特征在于，所述谷胱甘肽供体不是GSNO。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103154742A (zh) * 2010-06-20 2013-06-12 佐拉生物科学公司 用于鉴定高风险冠状动脉疾病患者的脂质组学标志
CN106074500A (zh) * 2016-07-08 2016-11-09 重庆医药高等专科学校 脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用
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CN115707472A (zh) * 2021-08-19 2023-02-21 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 C16 Laccer在制备修复脊髓损伤的药物中的用途

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