CN1888880A - 增加基于基质的离子源的高分辨率成像的景深 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种方法，用于产生离子源的样品板上区域的对焦图像，该离子源例如是基于基质的离子源、或采用了其上沉积有样品的样品板的任意其他类型的离子源。该方法一般包括：a)在成像设备的视场中定位样品板的一个区域；b)产生该区域的具有不同对焦区的多个图像；以及c)使用这多个图像生成该区域的对焦图像。该对焦图像可以是二维的或三维的。本发明还提供了用于执行这些方法的系统和程序。

Description

增加基于基质的离子源的高分辨率成像的景深
技术领域
本发明涉及增加基于基质的离子源的高分辨率成像的景深。
背景技术
质谱分析是用于定性和定量确定化学和生物样品中的化合物的分析方法。样品中的分析物被电离，根据它们的质量被质谱仪所分离，并被检测以产生质谱。质谱提供关于质量的信息，并且在某些情况下，还提供关于构成样品的各种分析物的量的信息。在特定实施例中，质谱分析可以被用于确定样品中的分析物的分子量或分子结构。因为质谱分析快捷、清楚、灵敏，因此质谱仪设备已被广泛应用于生物分析物的快速识别和表征。
在过去几年间，基于基质的电离方法(例如基质辅助激光解吸/电离(MALDI)方法)已被证明对样品的电离很有价值，并且已经发现其被广泛应用于诸如基因学和蛋白质组学之类的各种领域。在执行基于基质的方法时，与样品共结晶的有机基质与样品相结合，然后将样品沉积在样品板上。样品板被放置在离子源中，并且诸如激光束之类的能量源使样品汽化。在样品汽化期间，形成分析物离子。基质的出现被认为使分析物能够被电离，从而解决了其他方法的问题。
在很多情况下，基于基质的离子源与分析设备(例如质谱仪)集成在一起，以研究被电离的分析物。在大多数情况下，飞行时间质谱仪(“TOF-MS”)被用于此目的，但是，也可以使用多种其他质谱仪，包括离子回旋加速共振质谱仪(例如傅立叶变换离子回旋加速共振质谱仪)、离子阱质谱仪(例如高频四极离子阱质谱仪)或者混合仪器(例如四极/飞行时间质谱仪，或Q-TOF)。
在使用基于基质的电离方法使样品电离时，一般需要查看样品板上的某个区域，以确保样品已被沉积在该区域上，并确保激光实际上将要撞击该样品。具体而言，需要一个提供样品详细图像(具体而言，示出分析物晶体区域的图像)的成像系统。
现有技术的成像系统能够捕获到基于基质的离子源的样品板上的样品的图像，并将该图像传输到监视器，以使该样品可以被查看。但是，由于在这些成像系统中采用了光学器件，而它们通常受到限制，这是因为它们无法产生在整个视场(或者至少视场的扩展区域)上对焦的高分辨率、高对比度的图像。
例如，产生基于基质的离子源中的样品板的某个区域的高分辨率图像是很有挑战性的，因为该区域通常无法从上方(即在x和y方向与样品板的表面共面时从z方向)直接查看。在大多数情况下，在产生离子源中的样品板的某个区域的图像时，必须以一定角度从侧面查看该区域，该角度可能依赖于所使用的特定离子源和成像系统而差别很大。因为所使用的成像系统所固有的限制，所以使用这种系统产生高分辨率图像是很有挑战性的。
因此，仍需要新型的基于基质的样品板成像系统。本发明满足该需求以及其他需求。
发明内容
本发明提供了用于产生离子源的样品板上某个区域的对焦图像的方法。该方法一般包括：a)在成像设备的视场中定位某个区域；b)产生该区域的具有不同对焦区的多个图像；以及c)使用这多个图像生成该区域的对焦图像。对焦图像一般是包含这多个图像的对焦区的合成图像，并且可以是二维或三维图像。所述具有不同对焦区的多个图像可以使用多种方法来获得，例如通过在样品板的平面中移动所述区域，通过改变成像设备的焦距，或通过它们的组合。本发明还提供了用于执行上述方法的系统和程序。本发明可用于多种分析方法。例如，本发明可用于化学、环境、法医、食品、药品和生物研究应用。
这里描述的本发明可以用于产生为用于离子源而配置的样品板的表面上的样品的对焦高分辨率图像。包含了包含晶体的分析物的样品区域可以通过使用本发明被识别出。在某些实施例中，可以在基于基质的离子源中移动样品板，以使离子源的电离激光撞击分析物包含晶体，从而促进分析物离子的产生。
本发明可以应用在采用了在其上沉积有样品的样品板的任意类型离子源中。下面将更详细描述采用了用于基于基质的离子源的样品板的示例性实施例。
附图说明
图1示意性地示出了离子源的样品板表面上的某个区域，该区域是由成像设备以相对于样品板表面一定角度捕获的。
图2示意性地示出了本发明的第一实施例。
图3A示意性地示出了本发明的第二实施例。
图3B示意性地示出了本发明的第三实施例。
图4示意性地示出了本发明的第一示例性离子源。
图5示意性地示出了本发明的第二示例性离子源。
图6示意性地示出了本发明的质谱分析系统。
图7示出了本发明的第四实施例。
图8A到图8D示出了本发明的示例。
具体实施方式
术语定义
除非另外定义，否则这里使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员所公知的相同意义。而且，下面的某些元素是出于简化和易于参考的目的而定义的。
这里使用的术语“使用”与其传统意义相同，同样指采用(例如交付使用)方法或构成以达到目的。例如，如果程序被用于创建文件，则程序被执行以创建文件，该文件通常是该程序的输出。在另一示例中，如果文件被使用，则它被访问、读取，并且存储在该文件中的信息被采用以达到目的。
“离子源”是可以产生离子以用于质谱分析系统中分析的任何装置。示例性的离子源包括电子撞击(EI)和基于基质的离子源以及其他离子源。离子源可以工作于任意环境压力(例如大约10-8Torr到大约2,500Torr之间)，其中“环境压力”是离子源外壳内的压力。离子源内的环境压力例如可以是高于或低于100mTorr的任意压力，在100mTorr到大约2,500Torr或者高真空(例如从大约10-8Torr到大约10-4Torr)范围内的任意压力，包括大气压(大致760Torr)。换句话说，离子源可以工作于大气压、高于大气压或者低于大气压。
术语“基于基质的离子源”指的是这样的离子源，在该离子源中，样品与基质(一般是有机基质)相结合，并在其被电离之前被沉积在样品板上。基于基质的离子源不依赖于用于电离的挥发溶剂。示例性的基于基质的离子源包括快原子轰击电离(FAB)离子源和基质辅助激光解吸电离(MALDI)离子源。这里使用的术语“MALDI”包含大气压MALDI(AP-MALDI)以及低于大气压的MALDI(例如真空或中间压力MALDI)。因此，对MALDI设备(例如MALDI离子源或MALDI样品板)的引用指示该设备适合与AP-MALDI方法一起使用，或者适合与低于大气压的MALDI(例如真空或中间真空MALDI)方法一起使用。
“离子源样品板”或“被配置为在离子源中使用的样品板”是适合在质谱分析系统的离子源中使用的样品板。离子源样品板可以具有任何形状，例如圆形、方形、矩形、椭圆形等等，并且可以由任何材料(例如任何金属)构成。在离子源样品板的表面上的样品在离子源中被电离。
术语“相邻的”指的是附近的、紧接着的或者邻接的。相邻的某物也可以是与另一组件相接触、围绕另一组件、与另一组件相隔或者包含另一组件的一部分。
“远端位置”指的是除离子源所在位置之外的位置。例如，远端位置可以是同一建筑物中的另一房间，或者同一城市中的另一建筑物、不同城市中的另一位置、不同州中的另一位置、不同国家中的另一位置等等。当一个项目被指示为位于另一项目的“远端”时，意味着这两个项目可能在同一房间中，但被分离开，或者至少在不同的房间或不同的建筑物中，并且可能至少相距1英里、10英里或至少100英里。“传输”信息指的是通过合适的通信信道(例如专用或公共网络)将代表该信息的数据作为电信号传送。“转发”项目指的是无论通过物理地运输该项目还是利用其他方法(在该方法可能的情况下)将该项目从一个位置转移到下一位置的任何手段，并且至少在该项目为数据的情况下，包括物理地运输携带数据的介质或传输该数据。传输介质的示例包括去往另一计算机或联网设备的无线电或红外传输信道以及网络连接，以及包括了电子邮件传输和记录在网站上的信息的因特网或内联网等等。“多个”至少是2个，例如2、3、4、6、8、10、12或大于12。短语“多个”和“多重”可互换使用。多个元件至少包含第一元件和第二元件。
术语“光圈数”指的是成像设备的光圈大小的量度。光圈数越大，光圈越小。
作为其他图像的“组合”的图像是由来自两个或更多个其他图像中的每个图像的至少一部分构成的图像。
“二维图像”是可以利用x和y坐标来描述的图像。二维图像是平面的并且没有深度。
“三维图像”是可以参考x、y和z坐标来描述的图像。三维图像具有深度并且可以在任何一个维度上旋转。
术语“定位”指物体在一维、二维或三维中的任意方向上的移动。当第一物体相对于第二物体定位时，第一物体可以移动，第二物体可以移动，或者两个物体都可以移动。
本发明的具体描述
本发明提供了产生基于基质的离子源的样品板上的某个区域的对焦图像的方法。该方法一般包括：a)在成像设备的视场中定位某个区域；b)产生该区域的具有不同对焦区的多个图像；以及c)使用这多个图像生成该区域的对焦图像。该对焦图像一般是包含了多个图像的对焦区的合成图像，并且可以是二维的或者三维的图像。具有不同对焦区的多个图像可以使用多种方法来获得，例如通过在样品板的平面上以彼此相对的方式移动该区域和成像设备，通过改变成像设备的焦距或者通过这些方法的组合。用于执行这些方法的系统和程序已被提供。本发明可用于多种分析方法。例如，本发明可用于化学、环境、法医、食品、药品和生物研究应用。本发明尤其可用于MALDI(例如AP-MALDI)方法中。
这里叙述的方法可以以被叙述事件的任意逻辑上可能的顺序来执行，也可以以事件的叙述顺序来执行。此外，当提供了值的范围时，应该理解，该范围的上限和下限之间的所有中间值，以及在所述范围中的任意其他已述值或中间值都被包含在本发明内。
提供所引用的项目仅仅是因为在本申请的申请日前它们已公开。这里任何内容都不应解释为许可由于在先发明而使本发明无权使这些材料的日期提前。
对单数项目的引用包括出现多个相同项目的可能性。更具体而言，这里以及在所附权利要求中使用的单数形式“所述”等包括多个指示物，除非上下文另外明确指示。还要注意，权利要求可能被撰写为排除任何可选元素。这种陈述正如其所表示的一样，是要结合权利要求元素的引述、或者“否定”限制的使用，作为诸如“仅仅”、“唯一”等这种排他术语使用的在前基础。
用于产生样品板的某个区域的对焦图像的方法
在理想设置中，用于产生基于基质的离子源的样品板的某个区域的图像的成像系统应该具有尽可能开启(open)的物镜(例如设置为具有小光圈数，并因此具有大数值孔径)，以便提供最大的分辨率。但是，由于景深(DOF；即图像的对焦区的大小)与数值孔径的平方成反比(即遵循等式DOF＝λ/n2，其中λ是光的波长，而n是所使用透镜的数值孔径)，因此采用开启的物镜的成像系统通常具有非常小的景深。代表由具有开启的物镜的系统产生的典型图像的图示如图1所示。参考图1，图像2一般包含视场4，视场4包含样品板6的某个区域。视场4包含三个区：对焦区8和两个离焦区10和12。视场4是以透视图的方式示出的，如图所示该区域具有梯形的形状。离焦区10最接近成像设备，而离焦区12远离成像设备。因此，使用采用开启的物镜的成像系统产生的样品板的某个区域的图像通常包含具有高清晰度和对比度的对焦区和大量模糊的离焦区。这种图像通常不适合于识别被沉积样品的小的结构特征，例如包含了样品晶体的区域，因为这些特征可能出现在图像的离焦区中。
相反，物镜光圈尽可能紧缩(close)(即设置在最大的光圈数)的成像系统可以被用于产生在其整个视场上完全对焦的样品板上某个区域的图像。但是，由于通过紧缩物镜降低了分辨率，因此由这种系统产生的图像通常不适合于识别小的结构特征。虽然由这种系统产生的图像可以完全对焦，但是图像的分辨率可能低到不足以识别这些特征。
鉴于以上论述，这里描述的方法提供了一种使用可以采用开启物镜(例如光圈数为大约1.0到大约8.0的物镜，例如光圈数是1.0、1.4、2、2.8、4、5.6或8或者等同的数值孔径值)的成像系统来产生样品板的某个区域的对焦图像的装置。所产生的图像通常是对焦的(即清晰且锐利)，并且具有足够高的分辨率和对比度以识别样品板表面(例如包含分析物晶体的区域)上的小特征。在某些实施例中，可以认为本发明的方法在不用紧缩成像设备的光圈的情况下延长了成像设备的景深。
本发明的方法的一般特征在图2中示出。参考图2，该方法一般包括产生多个(即至少2个)图像，例如MALDI样品板的区域19的图像20、24和28。所产生的具有不同对焦区(例如对焦区22、26和30)的图像被组合在一起以生成该区域的对焦图像32。因此，利用该方法产生的对焦图像32是包含了多个图像的对焦区的合成图像。
一般而言，方法是利用由计算机的处理器执行的计算机可执行指令(即程序)来执行的。用于执行该方法的计算机可执行指令一般存储在计算机可读介质中，该计算机可读介质可以与包含样品板成像系统的离子源相分离，也可以可操作地与之相连接。换句话说，计算机可执行指令可以与离子源相关联或不相关联。该样品板成像系统将在下面更详细的描述。
取决于采用哪种具体方法，下面还将更详细描述，对焦图像可以是高分辨率的二维图像或三维图像，这些图像允许在二维或三维空间中容易地识别特征(例如分析物晶体包含区域)。
在执行所述方法时，所产生的图像的数目一般依赖于将被成像的区域的大小以及所采用的成像系统的景深。此外，可以使用该系统产生任意数目的具有不同对焦区的图像，并且所产生的任意数目的图像可以被组合以生成对焦图像。例如，在某些实施例中，可以产生2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个或者10000个或更多个具有不同对焦区的图像。来自所产生的图像的全部或任意部分的对焦区可以被组合以产生对焦图像。此外，由于在这些图像的对焦区之间可能存在大量重叠，因此不是所产生的图像中的每个图像的所有对焦区都可以被用于产生对焦图像。换句话说，来自所产生的任意多个图像的对焦区的任意两个或更多个区域可以被组合以生成对焦图像。
在某些实施例中，将被组合的对焦区的位置和大小可能在产生包含这些区的图像之前就已知道。例如，图像的对焦区的位置可以凭经验确定或使用已知的公式来计算(例如通过计算所使用的成像系统的景深，并使景深与图像相关)。在这些实施例中，多个图像的对焦区可以以预定的方式被组合。需要产生其对焦图像的区域的不同图像的数目也可以被容易地计算出。例如参考图2，如果所使用的成像系统的景深不改变(即是固定的)，则需要产生其对焦图像的区域的图像数目可容易地计算出(在此情况下，需要3个图像)。此外，由于对焦区22、26和30的大小和位置因为景深已知而可以容易地计算出，因此这些区域可以以预定方式(即无需任意进一步的分析来识别每个图像中的对焦区)被组合以得到对焦图像32。
在其他实施例中，将被组合的图像的对焦区的位置和大小在它们被产生时可能是未知的。在这些实施例中，可以采用图像分析软件来识别将被组合的图像的对焦区。适用于这些实施例的图像分析方法是本领域公知的，并且包括基于对比度的方法(例如参见US 6,320,979)和基于金字塔的方法(例如参见Ogden等人的RCA Engineer 1984 30-5：4-15、Adelson等人的RCA Engineer 1984 29-4：33-41和US专利4,797,942、6,661,986和4,498,843，这里通过参考而将这些参考资料结合于此)以及当前在共焦显微镜中采用的其他方法。用于执行这种图像分析方法的软件可以从多个供应商(包括Sun Microsystems(Santa Clara，CA))处购买并且容易适用于此。
因为基于金字塔的方法可被用于产生二维和三维图像，因此它们尤其适用于即时方法。基于金字塔的方法可以是低通的(或者基于“高斯金字塔”)，也可以是带通的(或者基于“拉普拉斯金字塔”)。虽然关于这些方法存在若干变体，但是这些方法可以包含使具有不同对焦区的多个原始图像模糊以产生多个模糊的图像，从它们相应的原始图像中减去模糊的图像以产生一组其中显示有“边沿”(即定义的特征)的图像。这些边沿指示原始图像的对焦区，并且这些对焦区的组合产生完全对焦的图像。例如，多个连续的对焦二维图像可以被堆叠在彼此的顶上或旁边，以得到对焦三维图像。
基于金字塔的方法将图像表示为空间上带通的多个图像之和，同时在每个频带中保留局部空间信息。金字塔可以通过利用紧凑的二维滤波器对图像G0进行低通滤波而创建。然后，经滤波的图像通过每隔一个像素和每隔一行执行删除而被子采样，从而获得简化图像G1。该过程被重复，以形成高斯金字塔G0、G1、G2、G3...Gn：
G k ( i , j ) = Σ m Σ n G k - 1 ( 2 i + m , 2 + n ) , k = 1 . . . N
将G1扩展到与G0相同的大小并且相减，从而产生带通图像L0。可以构建包含递减的大小和空间频率的带通图像的拉普拉斯金字塔L0、L1、L2，...Ln-1：
Lk＝Gk-Gk+1，k＝0...N-1
其中经扩展的图像G由下式给出：
G k , l ( i , j ) = 4 Σ m Σ n G k , l - 1 [ ( 2 i + m / 2.2 j + n ) / 2 ] f ( m , n )
原始图像可以从经扩展的带通图像重建：
G0＝L0+L1，1+L2，2+...+LN-1，N-1+GN，N
在逐渐降低的空间频率上，高斯金字塔包含原始G0的低通版本。当高斯金字塔的层级被扩展到与G0相同的大小时，可以清楚地看到这种效果。拉普拉斯金字塔包含G0的带通拷贝。每个拉普拉斯层级包含某个大小的边沿，并且在空间频率上大致跨越一个倍频程。
在将图像合并之前先将它们分解成一组带通分量。然后，宽交换域(transition zone)被用于低频分量，而窄交换域被用于高频分量。为了具有平滑的混合，在给定频带中的转换域宽度应该大约是频带中心频率的一个波长。然后，经合并的带通分量被重组以获得最终的图像镶嵌。
令S0、S1、S2...Sk是一组K个源图像。一组二进制掩码(mask)图像M0、M1、M2...Mk确定源图像可以被如何组合。当源图像Sk有效时Mk为“1”，否则为“0”。通过将Sk与Mk相乘，并在k上求和，从而提供带有阶梯边沿的“剪贴”合成。可替换地，可以产生每个源图像的拉普拉斯金字塔Lkl、以及每个掩码图像的高斯金字塔Mkl。通过利用每个源金字塔层级的相应掩码图像对该源金字塔层级进行加权，从而通过在每个空间尺度上“剪贴”来形成合成的拉普拉斯金字塔Lcl：
Lcl(i，j)＝Mk(i，j)Lkl(i，j)
最终的图像是通过扩展每个层级并求和而从Lc重建的。由于在每个金字塔层级中的交换域与该层级的中心频率的波长具有可比性，因此实现了平滑混合。某些类型的信息可以被逐个节点地合并到金字塔中，并被节点自己的值所引导。
在一个示例中，两个源图像的拉普拉斯金字塔LA和LB被采用。由于焦距的改变对图像的低频分量几乎没有影响，因此这些金字塔的低频层级应该具有几乎相等的值。焦距的改变将影响编码高空间频率信息的金字塔层级中的节点值。在两个图像中的相应节点一般将代表场景的同一特征，并且其差别将主要在于由于模糊而引起的衰减。具有最大幅度的节点将在最接近对焦的图像中。“对焦”图像分量可以在金字塔中逐个节点地选出，而不是在原始图像中逐个区地选出。通过将每个节点设置为等于具有较大绝对值的LA或LB中的相应节点来构建合成图像的金字塔LC：
如果：LAl(i，j)＞LBl(i，j)
那么：LCl(i，j)＝LAl(i，j)
否则：LCl(i，j)＝LBl(i，j)
最终的对焦图像是通过将LC的层级扩展并相加而获得的。
有多种方法可以被用于产生具有不同对焦区的多个图像。这些方法一般可以包括：a)相对于样品板表面上的某个区域改变成像设备的视场(例如通过在样品板的x-y平面上在朝着和/或远离成像设备的方向上移动样品板，通过相对于样品板移动成像设备或者通过移动成像设备和样品板两者)，b)改变成像设备的焦距，或者c)例如相对于样品板表面上的某个区域改变成像设备的视场并且改变成像设备的焦距。在使用在其他光学装备(例如数码相机等等)中常用的对焦装置和/或机动化的样品板托架的离子源中，可以容易地实现这些方法。示例性的方法如图3A和图3B所示。
在图3A所示的一个示例性实施例中，成像设备40被对焦在样品板44的区域42上。如双向箭头所指示，样品板可以在其样品包含表面的平面中在朝着和/或远离成像设备移动。在该示例性实施例中，样品板朝向成像设备(在图3A中从右到左)移动，并且在位置46、48和50处，产生样品区域42的图像。图像以透视的方式被分别示为元素52、54和56。区域42是相对于成像设备的视场(被示为梯形)被示出的。图像52、54和56的阴影区域代表这些图像的对焦区。图像52、54和56的对焦区通过使用上述方法被组合，从而产生对焦图像58。
在图3B所示的另一示例性实施例中，成像设备60被对焦在样品板44的区域42上。如双向箭头所指示，成像设备60的焦距可以改变(实际上是改变物镜和该区域之间的距离)。在该示例性实施例中，成像设备的焦距被改变以产生图像62、64和66，其中每个图像具有不同对焦区。区域42是相对于成像设备的视场(被示为梯形)被示出的。本领域技术人员清楚，在该实施例中，视场通常是固定的，并且改变的是成像设备的焦距，以产生具有不同对焦区的多个图像。图像62、64和66的阴影区域代表这些图像的对焦区。图像62、64和66的对焦区通过使用上述方法被组合，从而产生对焦图像68。
在另一实施例中，采用图3A和图3B所示方法的组合。换句话说，在某些实施例中，通过既移动成像设备的视场(例如通过相对移动样品板和成像设备，例如通过移动样品板和/或成像设备)也改变成像设备的焦距来产生多个图像。
上述方法可以被用于产生样品板的某个区域的二维或三维图像。通过朝着和/或远离成像设备移动样品板并且改变成像系统的焦距来产生多个图像的方法的实施例尤其适用于生成三维图像。在一个示例性实施例中，可以通过如上所述那样生成一系列二维图像，并且利用软件将这些图像按顺序彼此相邻对齐(即“堆叠”)，从而产生三维图像。这些方法容易从例如共焦显微镜和医疗成像(例如磁共振成像(MRI)或计算机化X线断层照相扫描(CAT扫描))中已经采用的那些方法中修改而来。在某些实施例中，三维图像可以被存储在计算机可读介质中，以使其可以被图像分析软件所访问。三维图像可以在监视器上查看。
在一个实施例中，本发明可以被用于产生样品板表面上的三维样品的三维图像。三维图像一旦产生，就可以对其进行检查(例如自动地使用图像分析软件、利用监视器手工查看图像或其组合)以识别样品内的物体。在特定实施例中，三维图像可以被检查以识别呈现在三维样品中的感兴趣的特征(例如晶体)。
一旦感兴趣的特征被识别出，就可以产生关于该特征的位置信息(例如该特征相对于样品板上的固定位置的x、y和z坐标)，并且该位置信息可以被用于在离子源的电离激光的路径中定位该特征。这可以通过移动样品板和/或通过移动激光来实现，从而使激光照射该特征。该特征内的分析物可以通过用电离激光照射该特征而被电离。
因此，如上所述，本发明提供了多种用于分析在样品板表面上的三维样品的方法。样品的三维图像可以通过使用上述方法产生，并且上述方法可以被用于识别和/或电离样品内的特征。
上述方法还可以包括校正由于从侧面对该区域成像而导致的对焦图像失真。例如，几何失真(例如透视失真)和/或对比度失真可以被校正，从而产生看起来好像是从某区域上方直接对该区域成像的图像。用于执行这种校正的软件是本领域公知的。
计算机可读介质
本发明还提供了用于执行以上方法的计算机可执行指令(即程序)。计算机可执行指令被记录在计算机可读介质上。因此，本发明提供了包含如下程序的计算机可读介质，所述程序用于产生离子源(例如MALDI离子源)中的样品板上某个区域的对焦图像。所述程序包括：用于产生该区域的具有不同对焦区的多个图像的指令；以及用于利用这些图像来生成该区域的对焦图像的指令。所述指令可以控制样品板在离子源中其x-y平面中的移动，可以控制成像设备的焦距和/或可以控制图像捕获的时刻。该程序还可以包括用于校正该程序产生的对焦图像的任意失真的指令。
这里使用的术语“计算机可读介质”指的是参与向计算机提供指令和/或数据以用于执行和/或处理的任意存储设备或传输介质。存储介质的示例包括软盘、磁带、CD-ROM、硬盘驱动器、ROM或集成电路、磁光盘或诸如PCMCIA卡之类的计算机可读卡等等，这些设备可以位于计算机内部或外部。包含信息的文件可以被“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”的意思是记录信息，以使其能够随后被计算机访问和获取。
关于计算机可读介质，“永久存储器”指的是永久不变的存储器。永久存储器不会由于向计算机或处理器的供电终止而被擦除。计算机硬件ROM(即没有被用作虚拟存储器的ROM)、CD-ROM、软盘和DVD都是永久存储器的示例。随机访问存储器(RAM)是非永久存储器的一个示例。在永久存储器中的文件是可以被编辑和重写的。
在一个实施例中，计算机可读介质是计算机的存储器。在另一实施例中，计算机可读介质是便携式存储设备，例如CD-ROM等等。
离子源
本发明一般地提供产生离子源(例如基于基质的离子源)的样品板的某个区域的对焦图像的系统。该系统一般包含基于基质的离子源，该离子源包含用于对样品板成像的成像设备。在该系统中，成像设备可操作地链接到包含上述计算机可读介质的计算机。如上所述，计算机可读介质一般包含用于产生某个区域的具有不同对焦区的多个图像的指令；以及用于利用这些图像生成该区域的对焦图像的指令。
在操作期间，离子源可能具有至少100mTorr(例如大气压)或小于100mTorr的环境压力(并且，在某些实施例中，可能是大气压、真空或中间真空MALDI离子源)。成像设备一般在离子源内，并且直接朝向(经由任意反射镜和/或其他光学组件)将被成像的区域。离子源还可以包括照明设备，例如离子源内的灯泡或者具有离子源外部光源的光纤照明器，以用于照亮该区域。成像设备可以被连接到显示器(例如视频监视器)以用于查看该区域的对焦图像。被成像的样品板的区域可能包含激光在样品板上的撞击点，并且该区域还可以包含被沉积的样品。
在图4中示意性地图示出了示例性系统。参考图4，示例性系统70包含离子源72，该离子源72包含成像设备74。该成像设备一般包含光电传感器阵列(例如像素阵列)76和物镜(它也被称为“成像”透镜)78。成像设备74产生离子源内的样品板82上的区域80的图像。成像设备的视场在图4中被示为元素84。该成像设备被连接到包含上述程序的计算机86。线缆88可以将成像设备连接到计算机。
成像设备74可以是任意类型的照相机，但是提供数字化输出的照相机(例如数码相机)最容易被采用。在某些实施例中，所采用的照相机可以是电荷耦合设备(CCD)或者互补金属氧化半导体(CMOS)照相机。如上所述，这些成像设备一般包含光电传感器阵列。该阵列的方向可以与进入成像设备的光线呈任意角度。在一个实施例中，光电传感器阵列的方向可以被确定为在通常垂直于(即在垂线旁1°以内)进入成像设备的光线的方向上，以确保高分辨率和对比度。在某些实施例中，成像设备是可对焦的(如双向箭头90所示)，并且成像设备的焦距可以受控于计算机86的指令。在其他实施例中并如双向箭头92所示，样品板可以在其x-y平面中(即在其样品包含表面的平面中)朝着和/或远离成像设备移动。样品板朝着和/或远离成像设备的移动可以受控于计算机86的指令。计算机86的指令一般可以控制系统的多个方面，例如成像设备74的焦距和/或样品板92的移动，成像设备74捕获图像的时刻，以及对每个区域产生多少图像。一旦多个图像被系统产生，计算机就利用上述方法而使用这些图像来产生对焦图像，并将该图像(该图像可以是二维或三维图像)显示在显示器上。在显示器上还可以示出电离激光的撞击点。在图5所示的一个实施例中，本发明提供了包含图4所示元件的系统以及用于以光线96照亮区域80的照明设备94。在某些实施例中，照明设备可以经由光导(例如光纤光导)100被连接到离子源外部的光源98(例如卤素或LED灯)。离子源还可包含电离激光102，该电离激光被引导到区域80内的激光撞击点104。离子源还可以包含置于激光撞击点104上方的离子出口管106，其用于将离子传出离子源。离子源还可以包含X-Y台以用于移动样品板。
在某些实施例中，所述区域可以通过使用掠射角照明系统而被照亮，该系统在2005年6月8日递交的题为“ION SOURCE SAMPLE PLATEILLUMINATION SYSTEM”的共同待决美国专利申请中有所描述，这里为了所有目的而将该专利申请的全部内容结合于此。
使用上述系统产生的对焦图像可以被用于多个目的。在一个实施例中，该图像被用于确保电离激光将撞击样品板表面上的所需区域。因此，如上所述，本发明还提供了使样品电离的方法。该方法一般包括：在成像设备的视场中定位样品；产生样品的具有不同对焦区的多个图像；利用这些图像生成样品的对焦图像；定位样品板以使离子源的电离激光将撞击该样品以及使样品电离。
质谱分析系统
本发明还提供了质谱分析系统，其包含上述用于产生样品板的某个区域的对焦图像的系统。包含离子源的质谱分析系统一般是本领域公知的，因此在这里无需对其进行详细描述。一般而言，质谱分析系统包含离子源和包含离子检测器的质量分析仪，它们通过一个或多个中间腔体相连。图6示出了本发明的示例性质谱分析系统。本领域常见离子源72和质量分析仪通过至少一个中间真空腔体118相分离，通过该中间真空腔体，离子在已经经由离子出口管退出离子源之后被传输。依赖于系统需求，可以采用一个或多个真空级。如上面详细描述的，计算机116处理由成像设备114产生的图像以产生样品板112的某个区域的对焦图像。
质量分析仪和检测器122可以例如包括四极、三组四极、三维离子阱、线性离子阱、飞行时间(TOF)、磁区、傅立叶变换离子回旋加速共振(FTICR)或其他本领域公知的质荷分析仪。
在使用中，如果离子源72保持在大气压，则中间腔体118保持在比环境压力低大约2个数量级的压力，而质量分析仪122保持在比中间腔体的压力低大约2到4个数量级的压力。离子经由离子收集管退出离子源72，并且由于离子源72和腔体118之间的压力差而通常经由漏勺(skimmer)以气体流的形式冲入真空腔体118。离子穿过腔体118(以及任意离子导引120，和可能存在的离子束成形或对焦透镜)并且进入质量分析仪122。质量分析仪122确定离子的m/z比，因此它可用于确定样品中的分析物的分子量。离子导引120可以是多极离子导引、分段的多极离子导引、连续盘状RF离子导引、离子漏斗或其他本领域公知的离子导引。离子导引120可以连续延伸到一个或多个真空抽运级，或者可以在单个真空级中开始和结束。
效用
上述方法一般地提供了离子源的样品板某个区域的高分辨率对焦图像。该对焦图像一般示出成像区域内特征的详细结构，并且可以容易地区分样品包含区域、包含分析物晶体的区域以及其他结构。由上述方法产生的对焦图像可以以各种不同的方式被采用。
例如，在一个实施例中，该方法可以被用于产生样品板的某个区域的二维或三维图像，并且在显示器(例如监视器)上示出该图像。在某些实施例中，还可以在显示器上示出离子源的激光撞击点(即离子源的电离激光在样品板表面上的撞击点)。因此，可以与电离激光在样品板上的撞击点相关地查看样品板的样品包含区域的位置，并且可以据此调整(例如手工地或通过使用软件)样品板的位置，以确保激光被发射时撞击样品包含区域(或样品包含区域的任意特征)。
在本实施例中，可以在样品板的被照亮区域中的样品被电离之前、期间或之后对该区域成像。此外，当样品板被成像时，样品板可以在样品板表面的平面(即x-y平面)内移动，从而允许操作者识别希望电离的区域(例如样品包含区域或样品包含区域内的晶体包含区域)并且无需太多努力就可以将电离激光引导至这些区域。
在另一实施例中，例如，可以对图像进行分析，并且可以确定(手工或使用软件)用于描述样品板上的样品的二维或三维形状、尺寸和位置的样品参数。样品板的样品参数可以被存储在文件或存储器中，并被离子源用于将激光引导至该样品板上的样品包含区域。这样的方法在2003年5月2日递交的公布为US20040217278的共同待决美国专利申请10/429,234中作了一般性地详细描述，这里为了所有目将该专利申请的全部内容结合于此。
在特别感兴趣的实施例中，所述方法被用在所谓的“成像质谱分析”方法中，在该方法中，生物样品(例如可以是单个细胞或组织切片)被固定在基于基质的离子源的样品板上。该样品可以利用任意可获得的手段获取，包括切片或激光捕获显微解剖。基质被添加到样品中，并且可以使用能与基质相容的染色剂对样品染色。利用本发明的方法产生的样品的对焦图像一般可以具有足够细节(即可以具有足够高的分辨率)以允许样品的特定区域被识别和电离。例如，对焦图像可以示出染色区域、未染色区域、细胞器官、细胞、细胞类型或感兴趣的切片的特定区域。该区域可以使用上述方法来电离，以提供关于该区域中的分子(例如多肽)的质量的信息。在替换实施例中，样品的区域可以被随意(例如随机地)电离，并且从这些区域获得的质量概况可以与在图像上识别出的结构相关。成像质谱分析方法的细节可以在多种出版物中找到，包括但不局限于：Rubakhin等的(Anal.Chem.2003 75：5374-5380)；Chaurand等的(Anal.Chem.2004 76：1145-1155)；Stoechli等的(Nat.Med.200 17：493-496)；Masumori等的(Cancer Res.2001 61：2239-2249)；Chaurand等的(Proteomics 2001 1：1320-1236)和Palmer-Toy等的(Clin.Chem 200046：1513-1516)，通过参考将这些出版物结合于此。这些方法可以被用于检查正常和患病的细胞，例如包括癌细胞和患病细胞。
在另一实施例中，如图7所示，本发明的方法可以被用于产生包含在存在于样品板的表面上的三维透明样品内的物体(例如植入样品)的二维或三维高分辨率图像。该物体可以使用本发明的方法来识别，并且该物体可以在离子源的激光下移动并被电离。如图7所示，成像设备136结合上述方法被用于产生物体134的对焦图像，该物体134处于在样品板130上的三维透明基板132内部。
本发明通常被用在样品质量分析的方法中，其中样品可以是沉积或结晶在样品板表面上的任意物质或多种物质的混合物。样品通常包含一种或多种感兴趣的成分。样品可以从多种来源获得，例如来自食品、环境物质、诸如从物体(例如植物体或动物体)分离的组织或流体之类的生物样品或其任意生化片段，其中所述生物样品例如包括但不局限于，血浆、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮肤的外切片、呼吸、肠内和泌尿生殖器的器官系统、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官以及生物体外的细胞培养菌成分的样品(包括但不局限于来源于细胞培养基成长过程中的条件培养基、推定被病毒感染的细胞、重组细胞和细胞成分)。
工具包
与本发明结合使用的工具包也被提供。这种工具包包括上述组成部分中的任意一种，包括计算机可读介质或可对焦的成像设备。该工具包还可以包含用于改进带有成像设备的基于基质的离子源的指令或用于执行任意上述方法的指令，其中这些指令通常出现在与该工具包相关的材料上，例如一张或多张纸。
用于实施这些方法的指令通常被记录在合适的记录介质上。例如，指令可以被打印在诸如纸或塑料等的材料上。同样，指令可以作为包装说明书存在于工具包中，或存在于工具包的包装物标签中或其组件(即与包装或分包装相关联)中等等。在其他实施例中，指令作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如CD-ROM、磁盘等)上的电子存储数据文件而出现。在其它实施例中，实际指令没有存在于工具包中，而是提供例如经由因特网从远端源获得指令的装置。该实施例的示例是包括web地址的工具包，在所述web地址处可以查看指令和/或从其下载指令。对于指令，这种用于获取指令的手段被记录在合适的材料上。
实验方式
以下示例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何实现和使用本发明的某些实施例的描述而提出的，并且这些示例不是要限制发明人所认为的其发明的范围。
示例1
以下方法使用了AP-MALDI样品板的三个单独的图像。AP-MALDI样品板被放置在AP-MALDI离子源内。这些图像是使用黑白CCD照相机捕获的，并被发送到程序以用于在个人计算机上显示图像。可以通过使用控制样点位置的程序利用光标按钮来移动样品板(通过控制机动台)。
第一图像是在对焦到沉积的样品的最左侧部分时被拍摄的(参见图8A)。样品板并重新定位，并且在对焦到样点中心区域时拍摄第二图像(参见图8B)。样品板并重新定位，并且在对焦到样点的最右侧部分时拍摄第三图像(参见图8C)。
在个人计算机上，通过使用标准图像分析软件PAINTSHOP PROTM来可视化地检查所有三个图像。通过复制和粘贴将样点的被认为对焦的部分组合起来以产生样品在整体上对焦的图像。最终的对焦图像如图8D所示。
然后，最终图像被馈送到在个人计算机上运行的另一程序，该程序用于自动监测样点位置。然后，该程序能够找到样点的确切中心位置，这在图像没完全对焦的情况下利用同样程序无法实现的。
从上述结果和论述中显而易见，本发明提供了一种用于产生样品板上的样品的对焦图像的重要手段。因此，本发明代表了对质谱分析领域的重大贡献。
本说明书中引用的所有出版物和专利都通过参考结合于此，就好像专门单独指示出每个单独的出版物或专利都通过参考结合于此一样。引用任意公开物是因为该公开物在申请日前已公开，而不应解释为许可由于在前发明而使本发明无权使该公开物的日期提前。
虽然已经参考本发明的特定实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以作出各种改变并且可以对等同物进行替换。另外，可以作出很多修改，以使特定情形、材料、物质组合、过程、过程步骤或步骤适于本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都是在所附权利要求的范围内。

Claims (27)

1.一种用于产生基于基质的离子源的样品板上的区域的对焦图像的方法，包括：
在成像设备的视场中定位所述区域；
使用所述成像设备产生具有对焦区和离焦区的第一图像；
使用所述成像设备产生具有对焦区和离焦区的第二图像；以及
使用所述第一和第二图像的所述对焦区生成最终对焦图像。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括产生多于两个具有对焦区的图像。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述最终对焦图像包括多个所述对焦区。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一图像和所述第二图像是通过改变所述成像设备相对于所述区域的位置而产生的。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述视场通过在所述样品板表面的平面中移动所述样品板而被改变。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述方法包括改变所述成像设备的焦距。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述方法包括：
相对所述成像设备移动所述样品板；以及
改变所述成像设备的焦距。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述最终对焦图像是二维图像。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述最终对焦图像是三维图像。
10.如权利要求1所述的方法，其中预定数目的图像被组合以产生所述最终对焦图像。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述第一图像和所述第二图像的图像在预定位置上被组合在一起，以产生所述最终对焦图像。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述第一图像和所述第二图像的对焦区是使用图像分析软件选择出的，并且被组合以产生所述最终对焦图像。
13.如权利要求1所述的方法，还包括在显示器上显示所述最终对焦图像。
14.一种使基于基质的离子源中的样品板上的样品电离的方法，包括：
在成像设备的视场中定位所述样品；
使用所述成像设备产生具有对焦区和离焦区的第一图像；
使用所述成像设备产生具有对焦区和离焦区的第二图像；
使用所述第一和第二图像的所述对焦区生成所述样品的最终对焦图像；以及
使所述样品电离。
15.如权利要求14所述的方法，还包括在所述基于基质的离子源中移动所述样品板，以使所述样品可以被电离。
16.一种计算机可读介质，其包含用于产生基于基质的离子源中的区域的对焦图像的程序，所述程序包括：
用于产生所述区域的具有不同对焦区的多个图像的指令；以及
用于使用所述图像来生成所述区域的对焦图像的指令。
17.如权利要求16所述的计算机可读介质，其中所述指令使成像设备相对于所述区域移动。
18.如权利要求16所述的计算机可读介质，其中所述指令改变所述成像设备的焦距。
19.如权利要求16所述的计算机可读介质，还包括用于校正所述对焦图像的任意几何失真的指令。
20.如权利要求16所述的计算机可读介质，还包括用于校正所述对焦图像中的任意对比度差异的指令。
21.一种用于产生样品板的区域的对焦图像的系统，该系统包括：
包括成像设备的基于基质的离子源；以及
包含程序的计算机，所述程序包括：
用于产生所述区域的具有不同对焦区的多个图像的指令；以及
用于通过使用所述多个图像来生成所述区域的对焦图像的指令。
22.如权利要求21所述的系统，还包括连接到所述成像设备的显示器。
23.一种质谱分析系统，包括：
包括成像设备的基于基质的离子源；
可操作地链接到所述基于基质的离子源的离子传输设备；
链接到所述离子传输设备的质谱仪；以及
包含程序的计算机，所述程序包括：
用于产生样品板的区域的具有不同对焦区的多个图像的指令；以及
用于使用所述多个图像来生成所述区域的对焦图像的指令。
24.如权利要求23所述的质谱分析系统，其中所述质谱仪是单组四极质谱仪、三组四极质谱仪、二维离子阱质谱仪、三维离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪、磁区质谱仪或傅立叶变换离子回旋加速共振质谱仪。
25.如权利要求23所述的质谱分析系统，其中所述基于基质的离子源是基质辅助激光解吸/电离离子源。
26.如权利要求23所述的质谱分析系统，其中所述基质辅助激光解吸/电离离子源工作于至少100mTorr的压力。
27.如权利要求23所述的质谱分析系统，其中所述基质辅助激光解吸/电离离子源工作于小于100mTorr的压力。
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