CN1878767B - 唑基激酶抑制剂 - Google Patents
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Abstract
Description
发明领域
本发明涉及蛋白酪氨酸激酶抑制剂领域。
发明背景
蛋白激酶是催化蛋白中特定残基磷酸化的酶家族。通常蛋白激酶分成几组；优先磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸残基的组，优先磷酸化酪氨酸残基的组以及磷酸化酪氨酸和Ser/Thr残基的组。因此蛋白激酶是信号转导途径中的关键因素，其负责将包括细胞因子对其受体的作用在内的细胞外信号转导到细胞核，触发各种生物学事件。蛋白激酶在正常细胞生理中的许多作用包括细胞周期控制以及细胞生长、分化、凋亡、细胞迁移和分裂。
蛋白激酶例如包括但不限于蛋白酪氨酸激酶家族(PTK)，其又可分为细胞质PTK和受体PTK(RTK)。细胞质PTK包括SRC家族(包括BLK；FGR；FYN；HCK；LCK；LYN；SRC；YES和YRK)；BRK家族(包括BRK；FRK、SAD和SRM)；CSK家族(包括：CSK和CTK)；BTK家族(包括：BTK；ITK；TEC；MKK2和TXK)；Janus激酶家族(包括JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2)；FAK家族(包括FAK和PYK2)；Fes家族(包括FES和FER)；ZAP70家族(包括ZAP70和SYK)；ACK家族(包括ACK1和ACK2)；和Ab1家族(包括ABL和ARG)。RTK家族包括EGF-受体家族(包括EGFR、HER2、HER3和HER4)；胰岛素受体家族(包括INS-R和IGF1-R)；PDGF受体家族(包括PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、KIT、FLK2)；VEGF受体家族(包括：FLT1、FLK1和FLT4)；FGF受体家族(包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4)；CCK4家族(包括CCK4)；MET家族(包括MET和RON)；TRK家族(包括TRKA、TRKB和TRKC)；AXL家族(包括AXL、MER和SKY)；TIE/TEK家族(包括TIE和TIE2/TEK)；EPH家族(包括EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6)；RYK家族(包括RYK)；MCK家族(包括MCK和TYRO10)；ROS家族(包括ROS)；RET家族(包括RET)；LTK家族(包括LTK和ALK)；ROR家族(包括ROR1和ROR2)；Musk家族(包括Musk)；LMR家族(包括LMR1、LMR2和LMR3)；和SuRTK106家族(包括SuRTK106)。
类似地，丝氨酸/苏氨酸特异性激酶包括许多不同的亚家族，包括细胞外信号调节激酶(p42/ERK2和p44/ERKI)；c-Jun NH2-末端激酶(JNK)；cAMP反应元件结合蛋白激酶(CREBK)；cAMP依赖性激酶(CAPK)；促分裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶(MAPK及其近亲物(relative))；应激活化蛋白激酶p38/SAPK；促分裂原和应激活化激酶(MSK)；蛋白激酶PKA、PKB和PKC等。
另外，许多病原生物的基因组具有编码蛋白激酶的基因。例如疟原虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和病毒如HPV和肝炎病毒显示具有激酶相关基因。
不适当高的蛋白激酶活性参与了由异常细胞功能导致的许多疾病.这可能由下述原因而直接或间接地引起：例如因对激酶正常控制机制的失败，其例如与酶的突变、过度表达或不适当的激活有关；或者因也参与激酶的上游或下游信号转导的细胞因子或生长因子的过度产生或产生不足.在所有的这些情况中，选择性抑制激酶的作用可能期望具有有益的效果.其中异常激酶活性参与的疾病包括：糖尿病；再狭窄；动脉粥样硬化；肝和肾纤维化；眼病；骨髓增殖和淋巴增殖疾病；癌症如前列腺癌、大肠癌、乳癌、头和颈部癌症、白血病和淋巴瘤；和自身免疫性疾病如特应性皮炎、哮喘、类风湿性关节炎、克隆氏病、银屑病、克鲁宗综合征、软骨发育不全和致死性发育异常.
蛋白酪氨酸激酶(PTK)的JAK家族在免疫系统的一些重要细胞类型的增殖和终末功能的细胞因子依赖性调节中起着主要的作用。
目前已知的哺乳动物的四个JAK家族成员的直接比较揭示存在七个高度保守的结构域(Harpur等，1992)。在寻求PTK这一家族的高度保守结构域特征的命名时，使用的分类参照Pawson及其同事(Sadowski等，1986)在他们处理SRC同源(SH)结构域中的方法。因此这些结构域用多数称为JAK同源结构域1(JH1)的C-末端同源结构域计数。与JH1的N-末端紧接的结构域是激酶相关结构域，这里称为JH2结构域。然后计数每个结构域直至位于N-末端的JH7。这些JAK同源(JH)结构域的高度保守程度表明它们在这些蛋白操纵的细胞过程中每个都可能起重要的作用。然而JAK同源结构域的界线是不定的，不一定能定义功能结构域。尽管如此，它们的描绘仍是有助于考虑这类蛋白整体结构相似性的有用工具。
PTK的JAK家族最典型的特征是具有两个激酶相关结构域(JH1和JH2)(Wilks等，1991)。JAK的推定PTK结构域(JH1)含有PTK结构域典型的高度保守的基序，包括存在位于C-末端11位残基的1022位的酪氨酸残基至亚结构域VII，其被认为是酪氨酸特异性蛋白激酶类成员的特征。人JAK1 PTK结构域(225个氨基酸)与其它蛋白的PTK类蛋白成员的排比揭示与其它功能性PTK具有同源性(例如与c-fes具有28％的相同性(Wilks and Kuran，1988))，与TRK具有37％的同源性(Kozma，等，1988)。每个JAK家族成员的JH1结构域在高度保守的亚结构域VIII基序(在JAK2中的残基1015-1027)中具有令人感兴趣的特性，认为该高度保守的亚结构域VIII基序与活性位点邻近且决定底物特异性。在该基序中的保守色氨酸两侧的苯丙氨酸和酪氨酸残基对于PTK的JAK家族是独特的。除了该元件外，JAK家族的每个成员的JH1结构域均是典型的PTK结构域。
蛋白酪氨酸激酶的JAK家族在一些重要细胞类型的增殖和终末功能的细胞因子依赖性调节中所起的主要作用表明抑制JAK的活性剂在依赖于这些酶的疾病状态的预防和化学治疗中是有用的。目前已知的四类JAK家族成员每类的潜在和特异性抑制剂将提供抑制那些驱动免疫病理如哮喘(如IL-13；JAK1、JAK2)和白血病/淋巴瘤(如IL-2；JAK1和JAK3)的细胞因子的作用的方法。
另外，某些类型的癌症如前列腺癌自分泌地产生某些细胞因子，这些细胞因子作为生长和潜在转移的可选择的机制。其实例是前列腺癌，其中前列腺癌细胞系如TSU和TC3产生IL-6，并且其刺激前列腺癌细胞系如TSU和TC3的生长(Spiotto MT，and Chung TD，2000)。令人感兴趣的是，在转移的前列腺癌病人的血清中IL-6的水平升高。
大量的文献涉及细胞因子信号领域。本发明的发明人关注细胞因子受体与靶基因(例如细胞周期调节子(如p21))和抗细胞凋亡基因(如Bcl-XL)的直接连接中所涉及的JAK/STAT途径。
JAK/STAT途径
近来已经对非蛋白酪氨酸激酶细胞因子受体下游的信号转导途径进行了极好的描述.在此途径中，关键的组分是：(i)细胞因子受体链如白介素-4受体或干扰素γ受体；(ii)PTK的JAK家族成员；(iii)转录因子的STAT家族成员；和(iv)活化的STAT将会与之结合的序列特异性DNA元件.
对JAK/STAT文献的综述为该途径对针对环境损害如病毒和细菌感染的宿主免疫应答中的募集和集结是重要的这一提议提供了有力的支持。这在表1和表2中给出了很好的例证。从基因敲除实验收集的信息强调JAK家族成员对由许多重要的免疫调节细胞因子触发的细胞内信号转导是重要的。因此，因抑制(或增强)JAK/STAT途径的治疗可能性主要在于免疫调节方面，并因此有可能成为治疗该领域中多种病理的有前景的药物。除了表1和表2中列出的疾病外，JAK抑制剂可以用作器官移植以及自身免疫性疾病如狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、阿尔茨海默氏病和其它自身免疫性疾病的免疫抑制剂。此外，表明JAK抑制剂用于治疗癌症，如前列腺癌。
表1
| 疾病类型 | 涉及的细胞类型 | 特征 |
| 特应性反应变应性哮喘特应性皮炎(湿疹)变应性鼻炎 | (肥大细胞(嗜酸性粒细胞(T-细胞(B-细胞 | B-细胞的-T细胞活化之后IgE介导的原位肥大细胞和嗜酸性粒细胞的活化 |
| 细胞介导的过敏反应变应性接触性皮炎过敏性肺炎 | (T-细胞(B-细胞 | T-细胞超敏感性 |
| 风湿性疾病系统性红斑狼疮(SLE)类风湿性关节炎青少年型关节炎干燥综合征硬皮病多发性肌炎强直性脊柱炎银屑病关节炎 | (单核细胞(巨噬细胞(中性粒细胞(肥大细胞(嗜酸性粒细胞(T-细胞(B-细胞 | 细胞因子产生(如TNE、IL-1、CSP-1、GM-CSF)T-细胞活化JAK/STAT活化 |
| 疾病类型 | 涉及的细胞类型 | 特征 |
| 病毒性疾病E-B病毒(EBV)乙型肝炎丙型肝炎HIVHTLV 1水痘-带状疱疹病毒(VZV)人乳头瘤病毒(HPV) | 淋巴细胞肝细胞肝细胞淋巴细胞淋巴细胞成纤维细胞上皮细胞 | JAK/STAT活化JAK/STAT活化JAK/STAT活化JAK/STAT活化JAK/STAT活化JAK/STAT抑制JAK/STAT抑制 |
| 癌症白血病淋巴瘤 | 白细胞淋巴细胞 | 细胞因子产生JAK/STAT活化 |
| 神经变性性疾病运动神经元病 | 神经元 | 突变的SOD1 |
| 心血管疾病动脉粥样硬化&动脉硬化心脏肥大缺血肺动脉高压 | (淋巴细胞(巨噬细胞(肌上皮细胞心肌细胞心肌细胞肺上皮 | JAK/STAT活化JAK/STAT活化JAK/STAT活化JAK/STAT活化JAK/STAT活化 |
表2：通过JAK-基药物治疗可能能够治疗的疾病
发明内容
本发明的发明人发现一组基于二取代吡嗪骨架I的化合物是酪氨酸激酶抑制剂。
因此，本发明第一方面提供一种下述通式的化合物或其药学可接受的前药、盐、水合物、溶剂合物、晶形或非对映异构体，
其中：
D为选自如下的杂环：
其中X1、X2、X3、X4为任选取代的C，或者X1、X2、X3、X4之一为N，而其余为任选取代的C；
R2为0-3个独立地选自H、卤素、C1-4烷基、CF3、OCF3、OCHF2、CN、芳基、杂芳基、C1-4烷基OH、C1-4烷基NR3R4、C1-4烷基杂芳基、OC1-4烷基、OC1-4烷基NR3R4、OC1-4烷基杂芳基、OC1-4烷基OH、CO2R3、CONR3R4、NR3R4、硝基、NR3COR4、NR5CONR3R4、NR3SO2R4、C1-4烷基NR3COR4、C1-4烷基NR5CONR3R4、C1-4烷基NR3SO2R4的取代基；
R3、R4各自独立地为H、C1-4烷基、C1-4烷基OH、C1-4烷基NR19R20、C1-4烷基环烷基、C1-4环杂烷基、芳基、C1-4烷基芳基、杂芳基、C1-4烷基杂芳基，或者可以连接形成任选取代的任选含有选自O、S、NR6的原子的3-8元(饱和或不饱和)环；
且R5选自H、C1-4烷基、芳基或杂芳基；
R6选自H、C1-4烷基、C1-4烷基NR19R20、芳基、杂芳基、C1-4烷基芳基、C1-4烷基杂芳基；
R19、R20各自独立地选自H、C1-4烷基；
R1为H、C1-4烷基、C1-6环烷基，或者可形成5-8元环连在环A的邻位上；
Q为键、CH2、C1-4烷基；
A为任选被0-3个取代基取代的芳基、杂芳基，所述取代基独立地选自卤素、C1-4烷基、CF3、OCF3、CN、NR8R9、芳基、杂芳基、C1-4芳基、C1-4杂芳基、C1-4烷基NR8R9、OC1-4烷基NR8R9、硝基、NR10C1-4NR8R9、NR8COR9、NR10CONR8R9、NR8SO2R9、CONR8R9、CO2R8；
R8和R9各自独立地为H、C1-4烷基、芳基，或者一起形成任选取代的可含有选自O、S、NR11的杂原子的4-8元环；
R10选自H、C1-4烷基；
R11选自H、C1-4烷基；
W选自H、C1-4烷基、C2-6烯基，或者可形成5-8元环连在环A的邻位上；其中C1-4烷基或C2-6烯基可任选被C1-4烷基、OH、OC1-4烷基、NR12R13取代；
R12和R13各自独立地为H、C1-4烷基，或者可以连接形成任选取代的任选含有选自O、S、NR14的原子的3-8元环；
R14选自H、C1-4烷基；
Y为0-2个选自H、C1-4烷基、NR15R16的取代基；
R15和R16独立地选自H、C1-4烷基。
本发明第二方面提供一种包含载体和至少一种本发明第一方面的化合物的组合物。
本发明第三方面提供一种治疗个体中酪氨酸激酶相关疾病状态的方法，所述方法包括给予治疗有效量的至少一种本发明第一方面的化合物或者治疗有效量的本发明第二方面的组合物。
具体实施方式
本发明的发明人发现一组基于二取代吡嗪骨架I的化合物是酪氨酸激酶抑制剂。
因此，第一方面，本发明提供以下通式的化合物或其药学可接受的前药、盐、水合物、溶剂合物、晶形或非对映异构体，
其中：
D为选自如下的杂环：
其中X1、X2、X3、X4为任选取代的C，或者X1、X2、X3、X4之一为N，而其余为任选取代的C；
R2为0-3个独立地选自H、卤素、C1-4烷基、CF3、OCF3、OCHF2、CN、芳基、杂芳基、C1-4烷基OH、C1-4烷基NR3R4、C1-4烷基杂芳基、OC1-4烷基、OC1-4烷基NR3R4、OC1-4烷基杂芳基、OC1-4烷基OH、CO2R3、CONR3R4、NR3R4、硝基、NR3COR4、NR5CONR3R4、NR3SO2R4、C1-4烷基NR3COR4、C1-4烷基NR5CONR3R4、C1-4烷基NR3SO2R4的取代基；
R3、R4各自独立地为H、C1-4烷基、C1-4烷基OH、C1-4烷基NR19R20、C1-4烷基环烷基、C1-4环杂烷基、芳基、C1-4烷基芳基、杂芳基、C1-4烷基杂芳基，或者可以连接形成任选取代的任选含有选自O、S、NR6的原子的3-8元(饱和或不饱和)环；
且R5选自H、C1-4烷基、芳基或杂芳基；
R6选自H、C1-4烷基、C1-4烷基NR19R20、芳基、杂芳基、C1-4烷基芳基、C1-4烷基杂芳基；
R19、R20各自独立地选自H、C1-4烷基；
R1为H、C1-4烷基、C1-6环烷基，或者可形成5-8元环连在环A的邻位上；
Q为键、CH2、C1-4烷基；
A为任选被0-3个取代基取代的芳基、杂芳基，所述取代基独立地选自卤素、C1-4烷基、CF3、OCF3、CN、NR8R9、芳基、杂芳基、C1-4芳基、C1-4杂芳基、C1-4烷基NR8R9、OC1-4烷基NR8R9、硝基、NR10C1-4NR8R9、NR8COR9、NR10CONR8R9、NR8SO2R9、CONR8R9、CO2R8；
R8和R9各自独立地为H、C1-4烷基、芳基，或者一起形成任选取代的可含有选自O、S、NR11的杂原子的4-8元环；
R10选自H、C1-4烷基；
R11选自H、C1-4烷基；
W选自H、C1-4烷基、C2-6烯基，或者可形成5-8元环连在环A的邻位上；其中C1-4烷基或C2-6烯基可任选被C1-4烷基、OH、OC1-4烷基、NR12R13取代；
R12和R13各自独立地为H、C1-4烷基，或者可以连接形成任选取代的任选含有选自O、S、NR14的原子的3-8元环；
R14选自H、C1-4烷基；
Y为0-2个选自H、C1-4烷基、NR15R16的取代基；
R15和R16独立地选自H、C1-4烷基。
可以理解在上面的描述中：
C1-4烷基是指未取代的或任选取代的直链或支链烷基链；
芳基是指未取代的或任选取代的苯基或萘基；
杂芳基是指未取代的或任选取代的含有一个或多个选自O、N、S的杂原子的5-或6-元杂芳环；
环烷基是指3-8元饱和环；
环杂烷基是指含有1-3个选自O、S、NR17的杂原子的3-8元饱和环，
其中R17为H、C1-4烷基、芳基、杂芳基。
在另一个优选实施方案中，所述化合物是选自通式II的化合物或其药学可接受的前药、盐、水合物、溶剂合物、晶形或非对映异构体，
其中：
D是选自如下的杂环：
其中X1、X2、X3、X4为任选取代的C，或者X1、X2、X3、X4之一为N，而其余为任选取代的C；
R2为0-3个独立地选自H、卤素、C1-4烷基、CF3、OCF3、OCHF2、CN、芳基、杂芳基、C1-4烷基OH、C1-4烷基NR3R4、C1-4烷基杂芳基、OC1-4烷基、OC1-4烷基NR3R4、OC1-4烷基杂芳基、OC1-4烷基OH、CO2R3、CONR3R4、NR3R4、硝基、NR3COR4、NR5CONR3R4、NR3SO2R4、C1-4烷基NR3COR4、C1-4烷基NR5CONR3R4、C1-4烷基NR3SO2R4的取代基；
R3、R4各自独立地为H、C1-4烷基、C1-4烷基OH、C1-4烷基NR19R20、C1-4烷基环烷基、C1-4环杂烷基、芳基、C1-4烷基芳基、杂芳基、C1-4烷基杂芳基，或者可以连接形成任选取代的任选含有选自O、S、NR6的原子的3-8元(饱和或不饱和)环；
且R5选自H、C1-4烷基、芳基或杂芳基；
R6选自H、C1-4烷基、C1-4烷基NR19R20、芳基、杂芳基、C1-4烷基芳基、C1-4烷基杂芳基；
R19、R20各自独立地选自H、C1-4烷基；
R1为H、C1-4烷基、C1-6环烷基，或者可形成5-8元环连在环A的邻位上；
A为任选被0-3个取代基取代的芳基、杂芳基，所述取代基独立地选自卤素、C1-4烷基、CF3、OCF3、CN、NR8R9、芳基、杂芳基、C1-4芳基、C1-4杂芳基、C1-4烷基NR8R9、OC1-4烷基NR8R9、硝基、NR10C1-4NR8R9、NR8COR9、NR10CONR8R9、NR8SO2R9、CONR8R9、CO2R8；
R8和R9各自独立地为H、C1-4烷基、芳基，或者一起形成任选取代的可含有选自O、S、NR11的杂原子的4-8元环；
R10选自H、C1-4烷基；
R11选自H、C1-4烷基；
W选自H、C1-4烷基、C2-6烯基，或者可形成5-8元环连在环A的邻位上；其中C1-4烷基或C2-6烯基可任选被C1-4烷基、OH、OC1-4烷基、NR12R13取代；
R12和R13各自独立地为H、C1-4烷基，或者可以连接形成任选取代的任选含有选自O、S、NR14的原子的3-8元环；
R14选自H、C1-4烷基；
Y为0-2个选自H、C1-4烷基、NR15R16的取代基；
R15和R16独立地选自H、C1-4烷基。
可以理解在上面的描述中：
C1-4烷基是指未取代的或任选取代的直链或支链烷基链；
芳基是指未取代的或任选取代的苯基或萘基；
杂芳基是指未取代的或任选取代的含有一个或多个选自O、N、S的杂原子的5-或6-元杂芳环；
环烷基是指3-8元饱和环；
环杂烷基是指含有1-3个选自O、S、NR17的杂原子的3-8元饱和环，
其中R17为H、C1-4烷基、芳基、杂芳基。
本发明的化合物包括所有的构象异构体(如顺式和反式异构体)。本发明的化合物具有不对称中心，因此存在不同的对映异构体和非对映异构体。本发明涉及本发明的化合物的所有旋光异构体和立体异构体及其混合物的应用，还涉及可以含有它们的所有药物组合物或可以应用它们的治疗方法。因此，本发明包括E和Z构型。式I的化合物还可以以互变异构体存在。本发明涉及所有这些互变异构体及其混合物的应用。
本发明还包括含有式I的化合物的前药的药物组合物。本发明还包括治疗或预防个体中能够通过抑制蛋白激酶如JAK而治疗或预防的疾病的方法，所述方法包括给予式I的化合物的前药。具有游离氨基、酰氨基、羟基或羧基的式I的化合物可以转化成前药。前药包括其中氨基酸残基或两个或多个(例如2、3或4个)氨基酸残基的多肽链通过肽键共价地与式I的化合物的游离氨基、羟基或羧酸基团连接的化合物。氨基酸残基包括20种通常用三个字母符号表示的天然存在的氨基酸，并且还包括4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素(demosine)、异锁链素(isodemosine)、3-甲基组氨酸、正缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸和甲硫氨酸砜。前药还包括其中碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯通过羰基碳前药侧链共价地与式I的上述取代基键合的化合物。前药还包括通过磷氧键与式I的化合物的游离羟基键合而连接的式I的化合物的磷酸衍生物(如酸、酸式盐或酯)。
在另一个优选实施方案中，该化合物在带有W的手性碳处具有S手性，其中W为C1-4烷基。该化合物可以作为纯异构体或任意比例的异构体的混合物使用。然而优选混合物包含至少70％、80％、90％、95％或99％的优选异构体。
本发明第二方面提供包含载体和至少一种本发明第一方面的化合物的组合物。
本发明第三方面提供一种治疗个体中酪氨酸激酶相关疾病状态的方法，所述方法包括给予治疗有效量的至少一种本发明第一方面的化合物或者治疗有效量的本发明第二方面的组合物。
在另一个优选实施方案中，所述疾病状态涉及JAK1、JAK2、JAK3或TYK2。
在本发明的优选实施方案中，所述疾病状态选自特应性反应，如变应性哮喘、特应性皮炎(湿疹)和变应性鼻炎；细胞介导的过敏反应，如变应性接触性皮炎和过敏性肺炎；风湿性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、幼年性关节炎、干燥综合征、硬皮病、多发性肌炎、强直性脊柱炎和银屑病关节炎；其它自身免疫性疾病，如I型糖尿病；自身免疫性甲状腺疾病，和阿尔茨海默氏病；病毒性疾病，如E-B病毒(EBV)、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、HTLV-1、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人乳头瘤病毒(HPV)；癌症，如白血病、淋巴瘤和前列腺癌；神经变性性疾病，如运动神经元病；心血管疾病，如心脏肥大、缺血、肺动脉高压、动脉粥样硬化和动脉硬化。
如本文所用，术语“酪氨酸激酶相关疾病状态”是指那些由异常的酪氨酸激酶活性，特别是JAK活性导致，和/或通过抑制这些酶中的一种或多种而减轻的疾病。
在另一方面，本发明提供所述化合物在制备用于治疗JAK相关疾病状态的药物中的应用。
如本文所用，术语“JAK”、“JAK激酶”或“JAK家族”是指具有本文描述的JAK1、JAK2、JAK3和TYK特征的蛋白酪氨酸激酶。
本发明提供药物组合物，所述组合物包含至少一种以其有效量能够治疗JAK相关疾病的本发明的化合物和药学可接受的载体或稀释剂。本发明的组合物可以包含下述的其它治疗活性剂，并且可以例如通过使用常规的固体或液体载体或稀释剂以及适于所希望的给药方式的药学添加剂(例如赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)根据如那些药学制剂领域公知的技术来配制。
本发明的化合物可经任何合适的方式给药，例如经口服，如片剂、胶囊剂、颗粒剂或粉剂形式；舌下；口含；肠胃外，如皮下、静脉内、肌内或脑池内注射或输注技术(如作为无菌可注射用含水或非水溶液剂或混悬剂)；经鼻，如吸入喷雾剂；局部，如乳膏或软膏形式；或者经直肠，如栓剂形式；含有无毒、药学可接受的载体或稀释剂的剂量单元制剂。例如所述化合物可以以适于速释或延时释放的形式给予。速释或延时释放可以通过使用含有本发明的化合物的合适的药物组合物来获得，或者特别是在延时释放的情况下，通过使用例如皮下植入物或渗透泵的装置获得。该化合物还可以以脂质体形式给予。
除了灵长类如人以外，各种其它的哺乳动物也可以根据本发明的方法进行治疗。例如，可以治疗的哺乳动物包括但不限于牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、达鼠或其它的牛类、羊类、马类、狗类、猫类、啮齿类或鼠类物种。然而，所述方法还可以对其它物种例如鸟类(如鸡)实施。
与炎症和感染相关的疾病和病况能够使用本发明的方法进行治疗。在优选的实施方案中，所述疾病或病况是其中为调节炎性反应嗜酸性粒细胞和/或淋巴细胞的作用将被抑制或促进的疾病或病况。
上述方法中希望JAK被抑制的治疗对象是哺乳动物，包括但不限于牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其它的牛类、羊类、马类、狗类、猫类、啮齿类或鼠类物种，且优选人，男性或女性。
术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生所探究的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的所述主题组合物的量。
如本文所用，术语“组合物”意指包括含有特定量的特定成分的产品，以及直接或间接由特定量的特定成分组合导致的任意产品。“药学可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容且不对其接受者具有毒性。
术语“给药”或“给予”化合物应理解为指将本发明的化合物提供给需要治疗的个体。
用于给予本发明的化合物的药物组合物可方便地以单位剂量形式存在，并可通过药学领域任何公知的方法制备。所有的方法包括将活性成分和包含一种或多种辅助成分的载体混合的步骤。通常，该药物组合物如下制备：将活性成分和液体载体或微细固体载体或两者均匀、充分地混合，然后，如果必要的话，将产品制成所需的制剂。在药物组合物中，包含足以对疾病的过程或状况产生所期望的效果的量的活性目标化合物。如本文所用，术语“组合物”意指包括含有特定量的特定成分的产品，以及直接或间接由特定量的特定成分组合导致的任意产品。
本发明的含有活性成分的药物组合物可以是适于口服使用的形式，例如以片剂、锭剂、糖锭、水或油混悬剂、可分散性散剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂、糖浆剂或酏剂使用.用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的生产药物组合物的任何方法制备，并且为提供精美可口的制剂，这些组合物可以含有一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂.片剂含有活性成分和无毒的适于生产片剂的药学可接受的赋形剂.这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂或崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石.片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知的技术包衣以延缓在胃肠道内的崩解和吸收并从而提供长时间内的持续作用.例如可以使用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯.它们也可以被包衣形成渗透性控释治疗片剂.
用于口服使用的制剂还可以以其中活性成分与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬凝胶胶囊剂，或者以其中活性成分与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软凝胶胶囊剂提供。
水混悬剂含有活性物质和适于生产水混悬剂的赋形剂。这些赋形剂为助悬剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，如卵磷脂，或者环氧烷与脂肪酸的缩合物，如聚氧乙烯硬脂酸酯；或者环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合物，如十七烷乙烯氧基十六醇，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合物，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酐单油酸酯。水混悬剂还可含有一种或多种防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
油混悬剂可通过将活性成分悬浮在植物油，如花生油、橄榄油、芝麻油、椰子油或矿物油如液体石蜡中制成。该油混悬剂可含有增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂，如上所述的那些以及调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过加入抗氧化剂，如抗坏血酸保存。
适于通过添加水而制备水混悬剂的可分散性散剂和颗粒剂提供活性成分和分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂。合适的分散剂或润湿剂和助悬剂由上述已提到的那些例示。还可以有其它赋形剂，如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可为水包油型乳剂的形式。油相可以为植物油，如橄榄油或花生油，或矿物油，如液体石蜡，或它们的混合物。合适的乳化剂可以为天然存在的树胶例如阿拉伯树胶和黄蓍树胶、天然存在的磷脂如大豆、卵磷脂、衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯如脱水山梨糖醇单油酸酯和所述偏酯与环氧乙烷的缩合物如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳剂还可含有甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可用甜味剂，如甘油、丙二醇或蔗糖配制。这些制剂还可含有缓和剂(demulcent)、防腐剂、调味剂和着色剂。
药物组合物可以是无菌的可注射用水或油混悬剂的形式.该混悬剂可根据已知技术使用上述已提到的那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂配制.无菌的可注射用制剂还可为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射用溶液或悬浮液，如作为在1，3-丁二醇中的溶液.在可接受的载体和溶剂中，可使用水、林格氏液和等渗氯化钠溶液.另外，无菌的固定油通常作为溶剂或悬浮介质使用.为此目的，可使用包括合成的单酸甘油酯和甘油二酯在内的任何温和的固定油.另外，脂肪酸如油酸用于制备注射剂.
本发明的化合物也可以以直肠给药的栓剂形式给予。这些组合物可通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂常温下为固体但在直肠温度下为液体，因此将在直肠内熔化释放出药物。这样的材料是可可油和聚乙二醇。
对于局部应用，可以使用含有本发明的化合物的乳膏、软膏、凝胶、溶液剂或混悬剂等。(为本申请的目的，局部施用将包括漱口剂和含漱剂)。
本发明的化合物还可以以脂质体的形式给予。如本领域已知的，脂质体通常衍生自磷脂或其它脂类物质。脂质体通过分散在水介质中的单层或多层水合液晶形成。可使用任何无毒生理学可接受的且可代谢的能够形成脂质体的脂类。脂质体形式的本发明的组合物，除了本发明的化合物以外，还可包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类是磷脂和磷脂酰胆碱，天然和合成的。形成脂质体的方法是本领域中已知的。
本发明的药物组合物和方法可进一步含有本文提到的通常用于治疗上述提到的病理状况的其它药学活性化合物。对用于联合治疗的合适的活性剂的选择可由本领域技术人员根据常规的药学原理进行。治疗活性剂的联合可协同作用以影响治疗或预防上述的各种疾病。使用这一方法，用每种活性剂的较低剂量可能能够达到治疗效果，因而降低了潜在的不利的副作用。
其它治疗活性剂的实例包括如下：
环孢菌素(如环孢菌素A)，CTLA4-Ig，抗体如ICAM-3、抗IL-2受体(Anti-Tac)、抗CD45RB、抗CD2、抗CD3(OKT-3)、抗CD4、抗CD80、抗CD86，阻断CD40和gp30间相互作用的活性剂如CD40和/或gp39(即CD154)特异性抗体、由CD40和gp39(CD401g和CD8gp39)构建的融合蛋白，抑制剂如核转位抑制剂，NF-κB功能抑制剂，如脱氧精胍菌素(DSG)、胆固醇生物合成抑制剂如HMG CoA还原酶抑制剂(洛伐他汀和斯伐他汀)，非甾族抗炎药(NSAID)如布洛芬、阿斯匹林、扑热息痛和环氧酶抑制剂如罗非考昔，甾族化合物如氢化可的松或地塞米松，金化合物，抗增殖剂如氨甲蝶呤、FK506(他克莫司、Prograf)、麦考酚酸吗乙酯，细胞毒药如硫唑嘌呤、VP-16、足叶乙甙、氟达拉滨、顺铂和环磷酰胺，TNF-11抑制剂如替尼达普，抗TNF抗体或可溶性TNF受体，以及雷帕霉素(西罗莫司或Rapamune)或其衍生物。
当其它治疗活性剂与本发明的化合物联合使用时，它们可以例如以在Physician Desk Reference(PDR)中所述的量或者以本领域普通技术人员确定的量使用。
对于治疗或预防需要抑制蛋白酪氨酸激酶的病况，合适的剂量水平通常为约0.01～500mg/kg患者体重/日，其可以单剂量或多剂量给药。优选，剂量水平为约0.1～约250mg/kg/日；更优选约0.5～约100mg/kg/日。合适的剂量水平可为约0.01～250mg/kg/日，约0.05～100mg/kg/日，或约0.1～50mg/kg/日。在此范围内，剂量可为0.05～0.5、0.5～5或5～50mg/kg/日。对于口服给药，该组合物优选以含有1.0～1000毫克活性成分的片剂形式提供，特别是根据要治疗的患者的症状调整剂量为1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成分。该化合物可以以每日1～4次，优选每日一或两次的方案给药。
然而，应理解，对于任何特定的患者，特定的剂量水平和给药频率可以不同，这取决于包括使用的特定化合物的活性、代谢稳定性和该化合物的作用时间、年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、给药方式和给药时间、排泄速率、联合药物、特定疾病的严重性和接受治疗的对象在内的各种因素.
本申请的全文中，词语“含有”或变体如“包含”或“包括”应理解为意味着包括述及的元素、实体或步骤或者元素、实体或步骤组，但是不排除任何其它的元素、实体或步骤或者元素、实体或步骤组。
该说明书中提到的所有出版物引入本文作为参考。
对本申请中包括的文献、文件、材料、装置、器件等的任何讨论仅是为本发明提供背景的目的。不应因为在本申请的每项权利要求的优先权日之前其在澳大利亚存在而承认这些材料中的任何一个或所有这些材料成为现有技术基础中的一部分或是本发明相关领域中的公知常识。
为更清楚地理解本发明的本质，现参考下述非限制性实施例描述本发明的优选形式。
实施例
材料和方法
化合物的合成
化合物通常以2步法从2，6-二氯吡嗪起始制备。
第一步是亲核芳香取代产生单氨基-单卤代中间体。(路线1)
路线1
亲核芳香取代通常通过在溶剂如乙醇、异丙醇、叔丁醇、二噁烷、THF、DMF、甲苯或二甲苯中伯胺加成到二卤代杂环上进行。反应通常在升高的温度下在过量胺或非亲核碱如三乙胺或二异丙基乙胺或无机碱如碳酸钾或碳酸钠存在下进行。
或者，氨基取代基可通过过渡金属催化氨化反应引入。用于这些转化的典型催化剂体系包括Pd(OAc)2/P(t-Bu)3、Pd2(dba)3/BINAP和Pd(OAc)2/BINAP。
合成这些化合物的第一步中使用的胺商业上获得或使用本领域技术人员已知的方法制备。特别感兴趣的是商业上获得或使用肟还原(路线2)制备的α-甲基苄胺。典型的还原剂包括氢化锂铝、在催化量的炭载钯存在下的氢气、盐酸存在下的Zn、路易斯酸如TiCl3、ZrCl4、NiCl2和MoO3存在下的硼氢化钠，或与Amberlyst H15离子交换树脂和LiCl组合的硼氢化钠。肟经一步从相应的酮通过与羟胺缩合得到。这一反应通常在0℃～回流的温度下在质子溶剂如水或乙醇中进行。羟胺通常以其盐酸盐的形式使用，因此该反应在碱如氢氧化钠存在下进行。作为原料使用的酮通常商业上获得或者经由本领域技术人员已知的方法获得。
路线2
高旋光纯度的α-甲基苄胺可使用本领域技术人员已知的方法从手性α-甲基苄醇制备。这些方法包括将羟基衍生作甲磺酸酯和甲苯磺酸酯并用氮亲核试剂如邻苯二甲酰亚胺和叠氮化物替代，然后可使用常规的合成方法将其转化为伯胺；或者，在Mitsunobu条件下用合适的氮亲核试剂替代羟基。这些手性α-甲基苄醇可通过相应的酮的手性还原获得。手性还原方法在有机化学中是熟知的，包括酶促过程、不对称氢化步骤和手性噁唑硼烷。
合成的第二步包括单氯单氨基吡嗪与苯并咪唑或吲唑的亲核芳香取代反应。该反应通常使用苯并咪唑或吲唑的盐在溶剂如四氢呋喃、二甲基甲酰胺、甲苯或二甲苯中在室温至回流温度下进行。苯并咪唑或吲唑盐通过与金属氢化物如氢化钠或氢化钾反应或通过与碳酸铯反应制备。或者，可以使用金属催化的偶联反应引入苯并咪唑或吲唑环。该反应通常使用碱如碳酸铯、碳酸铷、碳酸钾、叔丁醇钠或磷酸钾在溶剂如甲苯、苯或DMF中在室温至回流温度下进行。助剂如相转移剂(如十六烷三甲基溴化铵)或铜络合剂(如菲咯啉)也可在该反应中应用。
在该反应中使用的苯并咪唑或吲唑组分通常商业上获得或经由本领域技术人员已知的技术从商业上获得的苯并咪唑或吲唑制备。
或者，苯并咪唑或吲唑衍生物可与单氨基单氯吡嗪反应，随后的产物进一步使用本领域技术人员已知的方法衍生化。
下面给出代表性的合成。
实施例1
6-氯-N-[(1S)-1-(4-氟苯基)乙基]吡嗪-2-胺
将S-(-)-1-(4-氟苯基)-乙胺(5.0g，35.9mmol)、2，6-二氯吡嗪(5.90g，39.6mmol)、二异丙基乙胺(12.5ml，71.8mmol)在乙氧基乙醇(25ml)中的溶液在135℃和氮气下加热过夜。真空下除去溶剂、用H2O(2×30mL)洗涤残余物并干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂，将残余物用己烷(2×10mL)研磨，得到浅棕色固体。合并洗液、浓缩、所得的残余物用乙酸乙酯-己烷(1∶4-1∶2)进行色谱分离得到固体产物，将其与最初的固体合并，得到总产物(7.07g，78％)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.56(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，4.81-4.94(m，1H，CH)，5.05(m，1H，NH)，6.98-7.07(m，2H，ArH)，7.29-7.36(m，2H，ArH)，7.60(s，1H，吡嗪-H)，7.80(s，1H，吡嗪-H)。
实施例2
6-(1H-苯并咪唑-1-基)-N-苄基吡嗪-2-胺
在0℃和氮气下，向搅拌的苯并咪唑(130mg，1.1mmol)在无水DMF中的溶液中在两分钟内分批加入氢化钠(56mg，60％，分散在油中，1.45mmol)。将混合物在0℃下搅拌15分钟，在室温下搅拌60分钟。向其中加入(6-氯吡嗪-2-基)-(1-苄基)-胺(220mg)在DMF(5mL)中的溶液，然后将所得的混合物在回流下加热18小时。减压下除去DMF，将残余物用氯仿稀释。有机层用水洗涤、干燥(Na2SO4)、减压下除去溶剂得到粗产物。用二氯甲烷-甲醇(20∶1→10∶1)作为洗脱液进行柱色谱分离产物(100mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ4.66(d，2H，J＝5.7Hz，CH2)，5.56(m，1H，NH)，7.29-7.39(m，7H，ArH)，7.78-7.89(m，2H，ArH)，7.92(s，1H，吡嗪-H)，8.16(s，1H，吡嗪-H)，8.48(s，1H，ArH2)。
实施例3
1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺和
1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺
将2，6-二氯吡嗪(2.0g，13.4mmol)、1H-苯并咪唑-5-甲酰胺(2.0g，12.3mmol)和碳酸铯(5.6g，17.2mmol)在DMF(10mL)中的混合物在90。℃下加热3小时。将溶液冷却至室温，用乙酸乙酯(20mL)稀释并过滤。将固体物质用氯仿-甲醇(20mL，4∶1)洗涤，将合并的滤液真空浓缩。如此获得的残余物(3.02g)被使用而没有进一步纯化。
m/z(EI)273/275(M+1)
实施例4
1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-腈和
1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-腈
将在苯(3mL)中的约1∶1的1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺和1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺的混合物(0.3g，1.09mmol)和亚硫酰氯(0.3mL，3.3mmol)在回流下加热过夜。冷却至室温时，将溶液倾倒入冰上，所得的混合物用固体Na2CO3碱化至pH～11。然后将混合物用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。真空下除去溶剂，用二氯甲烷-甲醇(100∶0-96∶4)作为洗脱液进行柱色谱纯化残余物，得到的所需产物，为异构体混合物(135mg)。
m/z(EI)255/257(M+1)
实施例5
6-(1H-苯并咪唑-1-基)-N-[(1R)-1-苯基乙基]吡嗪-2-胺
类似于实施例2的方法，6-氯-N-[(1R)-1-苯基乙基]吡嗪-2-胺(240mg，1.03mmol)和苯并咪唑(130mg，1.10mmol)反应，得到产物(187mg，59％)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.63(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，4.98-5.20(m，1H，CH)，5.58(d，1H，J＝6.0Hz，NH)，7.25-7.42(m，6H，Ph-H，ArH)，7.70(dd，1H，J＝7.2，1.0Hz，ArH)，7.82(dd，1H，J＝8.0，1.2Hz，ArH)，7.87(s，1H，吡嗪-H)，8.11(s，1H，吡嗪-H)，8.38(s，1H，ArH)。
实施例6
6-(1H-苯并咪唑-1-基)-N-[(1S)-1-苯基乙基]吡嗪-2-胺
类似于实施例2的方法，6-氯-N-[(1S)-1-苯基乙基]吡嗪-2-胺(140mg，0.60mmol)和苯并咪唑(78mg，0.66mmol)反应，得到产物(71mg，38％)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.57(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)，4.95(m，1H，CH)，5.29(m，1H，J＝6.0Hz，NH)，7.19-7.35(m，7H，Ph-H，ArH)，7.63-7.66(m，1H，ArH)，7.74-7.77(m，1H，ArH)，7.78(s，1H，吡嗪-H)，8.06(s，1H，吡嗪-H)，8.31(s，1H，ArH).
m/z(ES)316(M++H)，212，105
实施例7
6-氯-N-甲基-N-[(1S)-1-苯基乙基]吡嗪-2-胺
类似于实施例1的方法，将N-甲基-N-[(1S)-1-苯基乙基]胺(0.27g，2.0mmol)与2，6-二氯吡嗪(0.36g，2.4mmol)缩合，得到所需的产物，为浅棕色固体(192mg，39％)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.56(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，4.81-4.94(m，1H，CH)，5.05(m，1H，NH)，6.98-7.07(m，2H，ArH)，7.29-7.36(m，2H，ArH)，7.60(s，1H，吡嗪-H)，7.80(s，1H，吡嗪-H)。
实施例8
1-(6-{[1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺和
1-(6-{[1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺
类似于实施例3的方法，6-氯-N-[1-(3-氟苯基)乙基]吡嗪-2-胺(0.25g，1mmol)与1H-苯并咪唑-5-甲酰胺(0.2g，1.2mmol)反应，得到产物，为异构体混合物。用二氯甲烷-甲醇(98∶2-92∶8)作为洗脱液进行色谱分离，从较低极性部分中得到1-(6-{[1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺(80mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.64(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，4.97-5.10(m，1H，CH)，5.47(d，1H，J＝6.2Hz，NH)，6.90-6.99(m，1H，ArH)，7.09-7.38(m，3H，ArH)，7.72(dd，1H，J＝8.4，1.6Hz，ArH)，7.86(s，1H，吡嗪-H)，7.87(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，8.22(s，1H，吡嗪-H)，8.47(s，1H，ArH)，8.60(s，1H，J＝1.6Hz，ArH)。
从较高极性部分中分离得到1-(6-{[1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺(63mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.63(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，4.94-5.07(m，1H，CH)，5.44(d，1H，J＝6.6Hz，NH)，6.90-7.38(m，4H，ArH)，7.65(d，1H，J＝9.0Hz，ArH)，7.82(dd，1H，J＝8.8，1.6Hz，ArH)，7.93(s，1H，吡嗪-H)，8.13(s，1H，吡嗪-H)，8.25(d，1H，J＝1.4Hz，ArH)，8.41(s，1H，ArH).
实施例9
1-(6-{[1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-腈
类似于实施例4给出的方法，1-(6-{[1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺(80mg，0.21mmol)与磷酰氯反应得到浅黄色固体产物(60mg，80％)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.65(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，4.94-5.09(m，1H，CH)，5.57(d，1H，J＝6.2Hz，NH)，6.97-7.12(m，2H，ArH)，7.20-7.25(m，1H，ArH)，7.35-7.46(m，1H，ArH)，7.59(dd，1H，J＝8.4，1.4Hz，ArH)，7.88(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.94(s，1H，吡嗪-H)，8.12(s，1H，吡嗪-H)，8.25(d，1H，J＝1.4Hz，ArH)，8.51(s，1H，ArH)。
实施例10
1-[6-(3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)吡嗪-2-基]-1H-苯并咪唑-5-腈和
1-[6-(3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)吡嗪-2-基]-1H-苯并咪唑-6-腈
类似于实施例1的方法，将约1∶1的1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-腈和1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-腈的混合物(102mg，0.4mmol)与1，2，3，4-四氢异喹啉(64mg，0.48mmol)缩合。粗产物用冷乙酸乙酯研磨，分离得到1-[6-(3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)吡嗪-2-基]-1H-苯并咪唑-5-腈，为灰白色固体(65mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ3.05-3.11(m，2H，CH2)，3.95-4.02(m，2H，CH2)，4.85(m，2H，CH2)，7.25-7.29(m，3H，ArH)，7.61-7.68(m，1H，ArH)，7.95(d，1H，J＝8.2Hz，ArH)，8.11-8.21(m，1H，ArH)，8.16(s，1H，吡嗪-H)，8.23(s，1H，吡嗪-H)，8.38(s，1H，ArH)，8.65(s，1H，ArH)。
合并乙酸乙酯洗液，并真空浓缩，得到1-[6-(3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)吡嗪-2-基]-1H-苯并咪唑-6-腈(41mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ3.07(t，2H，J＝5.9Hz，CH2)，3.97(t，2H，J＝6.1Hz，CH2)，4.84(3，2H，CH2)，7.24-7.32(m，4H，ArH)，7.67(dd，1H，J＝8.8，1.4Hz，ArH)，8.11-8.21(m，1H，ArH)，8.16(s，1H，吡嗪-H)，8.22(s，1H，吡嗪-H)，8.65(s，1H，ArH).
实施例11
1-{6-[(1S)-1，2，3，4-四氢萘-1-基氨基]吡嗪-2-基}-1H-苯并咪唑-5-腈和
1-{6-[(1S)-1，2，3，4-四氢萘-1-基氨基]吡嗪-2-基}-1H-苯并咪唑-6-腈
类似于实施例1的方法，将约1∶1的1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-腈和1-(6-氯吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-腈的混合物(100mg，0.39mmo1)与(1S)-1，2，3，4-四氢萘-1-胺(69mg，0.47mmol)缩合。产物以区域异构体混合物形式获得，将其通过用二氯甲烷-甲醇(95∶5)作为洗脱液进行柱色谱分离。从较低极性部分中获得1-{6-[(1S)-1，2，3，4-四氢萘-1-基氨基]吡嗪-2-基}-1H-苯并咪唑-6-腈，为黄色半固体(26mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.87-1.98(m，2H，CH2)，2.04-2.18(m，2H，CH2)，2.82-2.90(m，2H，CH2)，5.18-5.30(m，2H，NH+CH)，7.14-7.23(m，3H，ArH)，7.32-7.38(m，1H，ArH)，7.61(dd，1H，J＝8.2，1.4Hz，ArH)，7.94(s，1H，吡嗪-H)，8.11(ds，1H，J＝8.2Hz，ArH)，8.14(s，1H，吡嗪-H)，8.18(d，1H，J＝1.4Hz，ArH)，8.61(s，1H，ArH)。
从较高极性部分中分离出1-{6-[(1S)-1，2，3，4-四氢萘-1-基氨基]吡嗪-2-基}-1H-苯并咪唑-5-腈(19mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.89-2.02(m，2H，CH2)，2.10-2.20(m，2H，CH2)，2.83-2.91(m，2H，CH2)，5.25(m，2H，NH+CH)，7.15-7.35(m，4H，ArH)，7.62(dd，1H，J＝8.4，1.4Hz，ArH)，7.91-7.95(m，2H，ArH+吡嗪-H)，8.15(s，1H，吡嗪-H)，8.52(br s，1H，ArH)，8.66(s，1H，ArH)。
实施例12
1H-苯并咪唑-5-甲酰胺
在室温下，向搅拌的苯并咪唑-5-羧酸(5.0g，30.8mmol)在苯(25mL)中的悬浮液中滴加亚硫酰氯(25mL).向该混合物中加入DMF(0.1mL)，然后回流下加热6小时.减压下蒸发除去苯和亚硫酰氯，向残余物中加入甲苯(20mL).将它在减压下除去，将由此得到的酰氯悬浮在四氢呋喃(20mL)中.在0℃下向其中滴加28％的氨水(20mL)，然后将所得的混合物在室温下搅拌过夜.将沉淀过滤并用冷H2O洗涤，得到伯酰胺，为棕色固体(3.55g)。
1H-n.m.r.(d6-DMSO)δ7.25(br s，1H，NH)，7.60(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.78(dd，1H，J＝8.4和1.6Hz，ArH)，7.97(br s，1H，CONH)，8.18(br s，1H，ArH)，8.32(br s，1H，ArH)。
实施例13
1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基]吡嗪-2-基}-1H-苯并咪唑-5-胺和
1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-胺
在氮气下，向搅拌的5-氨基-苯并咪唑(290mg，2.2mmol)在无水DMF(10mL)中的溶液中加入碳酸铯(980mg)。所得的混合物在70℃下搅拌60分钟。向其中加入6-氯-N-[(1S)-1-苯基乙基]吡嗪-2-胺(470mg)在DMF(5mL)中的溶液，然后将所得的混合物回流下加热48小时。减压下除去DMF，将残余物用氯仿稀释。有机层用Na2CO3水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，并减压下除去溶剂，得到粗产物。使用二氯甲烷-甲醇(95∶5-92∶8)作为洗脱液进行柱色谱从未反应的原料中分离出两部分。较高Rf分数为该6-异构体(276mg，42％)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.64(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)，2.90(br s，2H，NH2)，5.05(m，1H，CH)，5.21(d，1H，NH)，6.70(dd，1H，J＝8.7，2.1Hz，ArH)，6.97(d，1H，J＝1.8Hz，ArH)，7.28-7.43(m，5H，Ph-H)，7.58(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.84(s，1H，吡嗪-H)，8.08(s，1H，吡嗪-H)，8.21(s，1H，ArH)。m/z(ES)331(M++H)。
较低Rf分数为该5-异构体(170mg，26％)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.64(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)，2.85(br s，2H，NH2)，5.01(m，1H，CH)，5.19(d，1H，NH)，6.70(dd，1H，J＝8.7，2.1Hz，ArH)，7.11(d，1H，J＝1.8Hz，ArH)，7.29-7.40(m，5H，Ph-H)7.51(d，1H，J＝8.7Hz，ArH)，7.81(s，1H，吡嗪-H)，8.10(s，1H，吡嗪-H)，8.32(s，1H，ArH)。
m/z(ES)331(M++H)。
实施例14
N-[1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基]吡嗪-2-基}-1H-苯并咪唑-6-基)-2，2-二甲基丙酰胺
在氮气下，向搅拌的2-(苄基氨基)-6-(5-氨基-苯并咪唑-1-基)-吡嗪(33mg，0.1mmol)在无水THF(2mL)中的溶液中加入三乙胺(38mg，0.3mmol)。将溶液在0℃下冷却，向其中加入新戊酸(12mg，0.11mmol)和EDC(23mg，0.12mmol)，然后将得到的混合物在室温下搅拌。64小时后，将溶液用H2O稀释，将混合物用CHCl3(2×15mL)萃取。将合并的有机层用10％Na2CO3水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，并真空除去溶剂。用二氯甲烷-甲醇(100∶6)作为洗脱液进行柱色谱纯化残余物，分离得到纯产物(15mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.35(s，9H，3CH3)，1.65(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，5.14(m，1H，CH)，5.24(d，1H，J＝5.7Hz，NH)，7.13(d，1H，J＝8.7Hz，ArH)，7.29-7.47(m，5H，ArH)，7.75(d，1H，J＝8.7Hz，ArH)，7.81(s，1H，吡嗪-H)，8.17(s，1H，吡嗪-H)，8.35(s，1H，ArH)，8.69(s，1H，CONH)。
实施例15
N-[1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-基]-乙酰胺
在氮气下，向搅拌的2-(S-α-甲基苄基氨基)-6-(5-氨基-苯并咪唑-1-基)-吡嗪(66mg，0.2mmol)在无水THF(2mL)中的溶液中加入三乙胺(41mg，0.4mmol)。将溶液在0℃下冷却，向其中加入乙酰氯(17mg，0.22mmol)，然后将得到的混合物在室温下搅拌。18小时后，将溶液倾倒入水(30mL)中，将产物用氯仿(2×20mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，减压下除去溶剂，得到粗产物，为浅黄色固体。用二氯甲烷-甲醇(200∶15)作为洗脱液进行柱色谱分离得到产物，为浅黄色固体(38mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.63(d，3H，J＝6.6Hz，CH3)，2.21(s，3H，CH3)，5.00(m，1H，CH)，5.43(d，1H，J＝5.7Hz，NH)，7.27-7.38(m，5H，ArH)，7.49(d，1H，J＝9.0Hz，ArH)，7.61(d，1H，J＝9.0Hz，ArH)，7.74(br s，1H，CONH)，7.84(s，1H，吡嗪-H)，7.90(s，1H，ArH)，8.11(s，1H，吡嗪-H)，8.36(s，1H，ArH)。
实施例16
N-[1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-基]-甲磺酰胺
在氮气下，向搅拌的2-(S-α-甲基苄基氨基)-6-(5-氨基-苯并咪唑-1-基)-吡嗪(33mg，0.1mmol)在无水THF(2mL)中的溶液中加入三乙胺(40mg，0.4mmol)。将溶液在0℃下冷却，向其中加入甲磺酰氯(25mg，0.2mmol)，然后将得到的混合物在室温下搅拌。16小时后，将溶液倾倒入水(30mL)中，将产物萃取入氯仿(2×15mL)中。将合并的有机层用10％Na2CO3水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，减压下除去溶剂，得到粗产物，为浅黄色固体。用二氯甲烷-甲醇(100∶6)作为洗脱液进行柱色谱从极性最大的部分中分离得到产物，为浅黄色固体(16mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.65(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)，3.00(s，3H，CH3)，5.02(m，1H，CH)，5.27(d，1H，J＝6.0Hz，NH)，7.21-7.40(m，6H，ArH)，7.64(d，1H，J＝8.7Hz，ArH)，7.69(d，1H，J＝1.9Hz，ArH)，7.88(s，1H，吡嗪-H)，8.10(s，1H，吡嗪-H)，8.41(s，1H，ArH)。
实施例17
2-(S-α-甲基苄基氨基)-6-(5-(N-甲基哌嗪-4-基-甲基)-苯并咪唑-1-基)-吡嗪
将3-[6-(S-α-甲基苄基氨基)-吡嗪-2-基]-3H-苯并咪唑-5-羧酸N-甲基哌嗪基酰胺(22mg，0.05mmol)在无水THF(1mL)中的溶液加入LiAlH4(4mg，0.1mmol)在THF(1mL)中的悬浮液中，将混合物在回流下加热4小时。当冷却至室温时，将溶液用H2O(1mL)、NaOH水溶液(1mL，2M)和H2O(5mL)顺序处理。将所得的混合物用CHCl3(2×10mL)萃取，并将合并的有机层干燥(Na2SO4)。减压下除去溶剂，产物用CH2Cl2-MeOH(10∶1→1∶1)作为洗脱液通过闪蒸色谱纯化，得到产物，为黄色固体(11mg，52％)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.65(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)，2.58(s，3H，NCH3)，2.81(br s，4H，CH2)，2.90(br s，4H，CH2)，3.74(s，2H，NCH2)，5.03(m，1H，CH)，5.33(d，1H，J＝6.0Hz，NH)，7.25-7.42(m，6H，ArH)，7.67(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.77(s，1H，ArH)，7.87(s，1H，吡嗪-H)，8.12(s，1H，吡嗪-H)，8.39(s，1H，ArH)。
实施例18
[1-(6-{[1-(4-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-基]甲醇，和
[1-(6-{[1-(4-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-基]甲醇
类似于实施例3的方法，6-氯-N-[1-(4-氟苯基)乙基]吡嗪-2-胺(1.80g，7.15mmol)和5-羟基甲基苯并咪唑(1.26mg，8.5mmol)反应得到两种产物，将该两种产物使用二氯甲烷-甲醇(98∶2-92∶8)作为洗脱液通过柱色谱分离。从较低极性部分中得到[1-(6-{[1-(4-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-基]甲醇，为浅黄色固体(210mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.60(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，4.93-5.05(m，1H，CH)，5.48(d，1H，J＝6.2Hz，NH)，6.97-7.07(m，2H，ArH)，7.29-7.39(m，3H，ArH)，7.76(d，1H，J＝9.4Hz，ArH)，7.79(s，1H，吡嗪-H)，7.89(s，1H，ArH)，8.09(s，1H，吡嗪-H)，8.34(s，1H，ArH)。
从较高极性部分中得到[1-(6-{[1-(4-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-基]甲醇，为黄色固体(265mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.62(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，4.82(s，2H，CH2OH)，4.94-5.06(m，1H，CH)，5.29(d，1H，J＝6.0Hz，NH)，7.02-7.10(m，2H，ArH)，7.29-7.40(m，3H，ArH)，7.68(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.80(d，1H，J＝1.2Hz，ArH)，7.84(s，1H，吡嗪-H)，8.12(s，1H，吡嗪-H)，8.39(s，1H，ArH)。
实施例19
N-[1-(4-氟苯基)乙基]-6-{6-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-苯并咪唑-1-基}吡嗪-2-胺
将乙醇(0.18mg，0.5mmo1)在二氯甲烷(5mL)中的溶液冷却至0℃，向其中加入二异丙基乙胺(0.13mL，0.75mmol)和甲磺酰氯(46μL，0.59mmol)。在室温下搅拌2小时后，加入另一等分部分的二异丙基乙胺(30μL)和甲磺酰氯(20μL)。1小时后，加入H2O(10mL)，收集有机层。水相用二氯甲烷(3×5mL)萃取，合并有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩.将由此获得的等分部分的粗甲磺酸酯(100mg)溶解在DMF(2mL)中，向其中加入二异丙基乙胺(52μL，0.3mmol)和1-甲基哌嗪(25μL，0.45mmol).将溶液在60℃下加热过夜.然后将溶液真空浓缩，将残余物溶解在二氯甲烷(20mL)中并用H2O洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，浓缩，将产物用二氯甲烷-甲醇-氨水(95∶5∶0-95∶5∶1)通过色谱纯化，得到产物，为浅黄色半固体(34mg)。
1H-n.m.r.(CDCl3)δ1.63(d，3H，J＝7.2Hz，CH3)，2.26(s，3H，NCH3)，2.45(br s，8H，4×CH2)，3.62(s，2H，CH2)，4.99-5.11(m，1H，CH)，5.41(d，1H，J＝6.4Hz，NH)，6.99-7.07(m，2H，ArH)，7.30-7.41(m，3H，ArH)，7.76(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.82(s，1H，吡嗪-H)，7.89(s，1H，ArH)，8.17(s，1H，吡嗪-H)，8.39(s，1H，ArH)。
实施例20
1-噻吩-2-基乙胺
氮气下，向1-噻吩-2-基乙酮(505mg，4mmol)和甲酸铵(1.26g，20mmol)在甲醇(4mL)中的溶液中加入二氯(五甲基环戊二烯基)铑(III)二聚物(14mg，0.023mmol)。将溶液在回流下加热7小时。之后，将溶液冷却至室温，用2M的HCl酸化至pH～2。将混合物用二氯甲烷(3×15mL)洗涤，然后加入5M的NaOH将水相碱化至pH～12。将水相用二氯甲烷(3×15mL)萃取，将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩，得到纯产物(280mg，55％)。
m/z(ES)127(M+)，112(M-15)+。
实施例21
(1R)-1-(3，4-二氟苯基)乙醇
在配有滴液漏斗和氮气进口的干燥的两颈圆底烧瓶中，将(S，R)-顺式-1-氨基-2-茚满醇(284.3mg，1.91mmol，0.1eq)溶解在四氢呋喃(25mL)中。溶液冷至约0℃，滴加N，N-二乙基苯胺-硼烷复合物(3.50mL，19.2mmol，1eq)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，此时，经滴液漏斗在大约90分钟内将3，4-二氟苯乙酮(2.40mL)在四氢呋喃(40mL)中的溶液加入。将溶液缓慢暖至室温并继续搅拌过夜。将丙酮(16mL)加入到反应混合物中，将溶液继续搅拌另一个小时，然后真空浓缩。残余物用甲苯(100mL)处理，用1M硫酸(4×50mL)、水(2×50mL)和盐水(50mL)洗涤。然后干燥(Na2SO4)有机相并真空浓缩，得到粗醇。梯度闪蒸毛细管色谱法(Gradient flashmaster chromatography)(20g硅胶柱；100％石油溶剂油-100％乙酸乙酯)得到所需的醇，为澄清油状物(2.242g，74％)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.47(3H，d，J＝6.4Hz)，1.80(1H，d，J＝3.6Hz)，4.87(1H，dq，J＝3.6，6.4Hz)，7.04-7.14(2H，m)，7.16-7.24(1H，m)。
实施例22
6-氯-N-[(1S)-1-(3，4-二氟苯基)乙基]吡嗪-2-胺
将(1S)-1-(3，4-二氟苯基)乙胺(977mg，6.2mmol)和2，6-二氯吡嗪(1.236g，8.3mmol，1.3eq)溶解在二噁烷(5mL)中，并将碳酸钾(1.73g，2.0eq)加入到溶液中。然后将混合物在氮气氛和回流(110℃)下加热65小时。然后将粗反应混合物倾倒入冷水(30mL)中，用二乙醚(3×30mL)萃取。浓缩合并的有机萃取液，进行闪蒸毛细管色谱法(20g硅胶柱(8∶2石油溶剂油∶乙酸乙酯，然后用乙酸乙酯淋洗)，得到所需的吡嗪加合物，为灰白色固体(587mg，35％)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.56(3H，d，J＝6.9Hz)，4.88(1H，dq，J＝6.5，6.9Hz)，4.97(1H，brd，J＝6.5Hz)，7.06-7.20(3H，m)，7.63(1H，s)，7.82(1H，s)。
MS(e.i.)m/z 269[M+(35Cl)，29％]，m/z 271[M+(37Cl)，10％]。
实施例23
1-(6-{[(1S)-1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺
向搅拌的6-氯-N-[(1S)-1-(3-氟苯基)乙基]吡嗪-2-胺(242mg，0.96mmol)和5-苯并咪唑甲酰胺(318mg，1.97mmol，2.1eq)在N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中的混合物中加入碳酸铯(460mg，1.41mmol，1.5eq)。然后将该溶液在氮气氛和120℃下加热48小时，此时加入另一份碳酸铯(180mg，0.6eq)。将混合物在120℃下再加热62小时，之后冷却至室温，用氯仿(15mL)稀释并过滤。将滤液真空浓缩，利用硅胶柱色谱法(逐步梯度从二氯甲烷至9∶1二氯甲烷∶甲醇)，得到5-甲酰胺产物(100.7mg，28％)以及所需的6-甲酰胺产物(63.7mg，18％)。
1H NMR(d6-丙酮，300MHz)δ1.64(3H，d，J＝6.9Hz)，2.76-2.88(2H，brm)，5.35(1H，m)，6.93(1H，m)，7.29-7.36(3H，m)，7.42(1H，dm J＝7.7Hz)，7.77(1H，ddJ＝8.5，0.5Hz)，7.93(1H，dd，J＝1.7，8.5Hz)，8.05(1H，s)，8.31(1H，s)，8.73(1H，s)，8.40(1H，dd J＝0.5，1.6Hz)。
MS(e.i.)m/z 376[M+，89％]。
通过与上述给出的类似方法制备的其它化合物包括：
筛选
JAK酪氨酸激酶结构域的生产
以下述方式制备JAK激酶结构域：
JAK1
人JAK1激酶结构域用下述引物经聚合酶链反应从U937mRNA扩增：
XHOI-J1 5′-CCG CTC GAG ACT GAA GTG GAC CCC ACACAT-3′
J1-KPNI 5′-CGG GGT ACC TTA TTT TAA AAG TGC TTCAAA-3′
JAK1PCR产物经由Xho I和Kpn I位点克隆入pFastBac HTb表达载体(Gibco)中。然后用JAK1质粒转化DH10Bac感受态细胞(Gibco)，产生的重组杆状病毒制备用于转染Sf9昆虫细胞。
JAK2
人JAK2激酶结构域用下述引物经聚合酶链反应从U937mRNA扩增：
SALI-jk2 5′-ACG CGT CGA CGG TGC CTT TGA AGA CCGGGA T-3′
Jk2-NOTI 5′-ATA GTT TAG CGG CCG CTC AGA ATG AAGGTC ATT T-3′
JAK2PCR产物经由SalI和Not I位点克隆入pFastBac HTc表达载体(Gibco)中。然后用JAK2质粒转化DH10Bac感受态细胞(Gibco)，产生的重组杆状病毒制备用于转染Sf9昆虫细胞。
JAK3
人JAK3激酶结构域用下述引物经聚合酶链反应从U937mRNA扩增：
XHOI-J3 5′-CCG CTC GAG TAT GCC TGC CAA GAC CCCACG-3′
J3-KPNI 5′-CGG GGT ACC CTA TGA AAA GGA CAG GGAGTG-3′
JAK3PCR产物经由Xho I和Kpn I位点克隆入pFastBac HTb表达载体(Gibco)中。然后用JAK3质粒转化DH10Bac感受态细胞(Gibco)，产生的重组杆状病毒制备用于转染Sf9昆虫细胞。
TYK2
人TYK2激酶结构域用下述引物经聚合酶链反应从A549mRNA扩增：
HT2EK 5′-GGA GCA CTC GAG ATG GTA GCA CAC AAC CAGGTG-3′
HY2.2R 5′-GGA GCA GGA ATT CCG GCG CTG CCG GTC AAATCT GG-3′
TYK2PCR产物经由EcoRI位点克隆入pBlueBacHis2A(Invitrogen)中。产生的重组TYK2杆状病毒制备用于转染Sf9昆虫细胞。
大规模生产激酶结构域
用从这些JAK家族成员中的每个得到的杆状病毒制备物感染5升于High Five血清游离培养基(Invitrogen)中生长的High Five细胞(Invitrogen)，得到细胞密度大约为1-2×106细胞/ml。用病毒以MOI为0.8-3.0感染细胞。收获细胞并裂解。通过在Probond(Invitrogen)镍络合物亲合柱进行亲合层析来纯化JAK激酶结构域。
测定方案
使用Alphascreen Protein Tyrosine Kinase试剂盒在96孔捕获基ELISA测定板中或者在384孔Optiplate(Packard)板中进行激酶测定。在任一种情况下，使用在pH 7.5的50mM HEPES、10mM MgCl2、150mM MaCl和10μM-1mM ATP存在下大约1.5μg亲合纯化的PTK 结构域。使用生物素化底物生物素-EGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(终浓度5μM)作为底物.在ELISA测定中，在使用过氧化物酶连接的抗磷酸化-酪氨酸抗体PY20转移到抗生物素蛋白包被的ELISA板上后定量测定酪氨酸磷酸化.在Alphascreen测定中，在柔和的光下加入Alphascreen磷酸化酪氨酸受体珠，然后加入链霉抗生物素蛋白供体珠.在BMG Fluorostar上读取ELISA板，在Packard Fusion Alpha上读取Alphascreen板。在加入ATP之前15分钟将抑制剂加入到测定样中。抑制剂以在DMSO水溶液中的形式加入，DMSO的浓度不超过1％。
结果
一系列化合物的活性在表3中示出。在20μM的浓度下表现抑制50％或更高酶活性的能力(在标准条件下测定，参见方法)的化合物表示为“+”；没有测试的化合物表示为“NT”；而在20μM下抑制酶活性不到50％的化合物表示为“-”。
表3
本领域技术人员会理解，在没有背离广义上描述的本发明的精神或范围的前提下可以对具体实施方案中示出的本发明作出各种改变和/或修改。因此，应将本发明的实施方案看作是对本发明各方面的例示而非限制。
参考文献
1、Kozma SC，Redmond SM，Fu XC，Saurer SM，Groner B，andHynes NE.(1998)Activation of the receptor kinase domain of the trkoncogene by recombination with two different cellular sequences.EMBOJ.7，147-54
2、Spiotto MT，and Chung TD.(2000)STAT3 mediatesIL-6-induced growth ingibition in the human prostate cancer cell lineLNCaP.Prostate 42，88-98
3、Wilks AF，Harpur AG，Kurban RP，Ralph SJ，Zurcher G，Ziermiecki A.(1991)Two novel protein-tyrosine kinase，each with asecond phosphotransferase-related catalytic domain，define a new class ofprotein kinase.Mol Cell Biol.11，2057-65
4、Wilks AF，and Kurban RR(1988)Isolation and structuralanalysis ofmurine c-fes cDNA clones.Oncogene 3，289-94
5、Sadowski I，Stone JC，Pawson T.(1986)A noncatalyticdomain conserved among cytoplasmic protein-tyrosine kinases modifiesthe kinase function and transforming activity of Fujinami sarcoma virusF130gag-fps.Mol Cell.Biol.6，4396-408.
Claims (13)
1.一种通式(I)的化合物或其药学可接受的盐，
其中：
D为选自如下的杂环：
R2选自CN和四唑；
R1为H、C1-4烷基，或者形成5-8元环连在环A的邻位上；
Q不存在，或者为CH；
A为各自任选被0-3个取代基取代的苯基、萘基或者含有一个或多个N原子的五或六元杂芳基，所述取代基独立地选自卤素、C1-4烷基、CF3、OCF3、杂芳基；
W选自H、C1-4烷基，或者形成5-8元环连在环A的邻位上；
Y为选自H、C1-4烷基的取代基。
2.一种化合物，其选自：
3.根据权利要求1的式(I)的化合物或其药学可接受的盐，其中所述化合物选自通式(II)的化合物，
其中：
D是选自如下的杂环：
R2选自CN和四唑；
R1为H、C1-4烷基，或者形成5-8元环连在环A的邻位上；
A为各自任选被0-3个取代基取代的苯基、萘基或者含有一个或多个N原子的五或六元杂芳基，所述取代基独立地选自卤素、C1-4烷基、CF3、OCF3、杂芳基；
W选自H、C1-4烷基，或者形成5-8元环连在环A的邻位上；
Y为选自H、C1-4烷基的取代基。
4.根据权利要求1的化合物，所述化合物选自：
5.根据权利要求1的化合物，所述化合物选自：
6-(1H-苯并咪唑-1-基)-N-苄基吡嗪-2-胺，
6-(1H-苯并咪唑-1-基)-N-[(1R)-1-苯基乙基]吡嗪-2-胺，
6-(1H-苯并咪唑-1-基)-N-[(1S)-1-苯基乙基]吡嗪-2-胺，
1-(6-{[1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺，
1-(6-{[1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺，
1-(6-{[1-(3-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-腈，
1-[6-(3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)吡嗪-2-基]-1H-苯并咪唑-5-腈，
1-[6-(3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)吡嗪-2-基]-1H-苯并咪唑-6-腈，
1-{6-[(1S)-1，2，3，4-四氢萘-1-基氨基]吡嗪-2-基}-1H-苯并咪唑-5-腈，
1-{6-[(1S)-1，2，3，4-四氢萘-1-基氨基]吡嗪-2-基}-1H-苯并咪唑-6-腈，
1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-胺，
1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-胺，
N-[1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-基]-2，2-二甲基丙酰胺，
N-[1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-基]乙酰胺，
N-[1-(6-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-基]甲磺酰胺，
2-(S-α-甲基苄基氨基)-6-(5-(N-甲基哌嗪-4-基-甲基)-苯并咪唑-1-基)-吡嗪，
[1-(6-{[1-(4-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-5-基]甲醇，
[1-(6-{[1-(4-氟苯基)乙基]氨基}吡嗪-2-基)-1H-苯并咪唑-6-基]甲醇，和
N-[1-(4-氟苯基)乙基]-6-{6-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-苯并咪唑-1-基}吡嗪-2-胺。
6.如下的化合物或其药学可接受的盐：
7.如下的化合物或其药学可接受的盐：
8.一种组合物，所述组合物包含载体和至少一种根据权利要求1-7任一项的化合物。
9.根据权利要求1-7任一项的化合物或根据权利要求8的组合物在制备用于治疗个体中酪氨酸激酶相关疾病状态的药物中的应用。
10.根据权利要求9的应用，其中所述疾病状态涉及JAK1、JAK2、JAK3或TYK2。
11.根据权利要求9或10的应用，其中所述疾病状态选自特应性反应、细胞介导的过敏反应、风湿性疾病、其它自身免疫性疾病、病毒性疾病、癌症、神经变性性疾病和心血管疾病.
12.根据权利要求9的应用，其中所述酪氨酸激酶相关疾病状态是JAK相关疾病状态。
13.根据权利要求9的应用，其中所述酪氨酸激酶相关疾病状态是与炎症和感染相关的疾病或病况。
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