CN1871516A - 利用标记的桥合二哌啶的结合测试方法 - Google Patents

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CN1871516A CNA2004800307531A CN200480030753A CN1871516A CN 1871516 A CN1871516 A CN 1871516A CN A2004800307531 A CNA2004800307531 A CN A2004800307531A CN 200480030753 A CN200480030753 A CN 200480030753A CN 1871516 A CN1871516 A CN 1871516A
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Abstract

本发明涉及一种被标记的配体化合物，该化合物有用于鉴别、测试和/或筛选调节离子通道、尤其是诸如那些由ERG(包括hERG)编码的心肌Ikr通道的化合物的方法。因此，所述配体化合物有用于评价临床前化合物对ERG钾通道的亲和力。所述配体化合物是具有式I并包含至少一个放射性标记的化合物或其盐、水合物或溶剂化物。

Description

利用标记的桥合二哌啶的结合测试方法
技术领域
本发明涉及一种被标记的配体化合物，该化合物有用于鉴别、测试和/或筛选调节离子通道、尤其是诸如那些由ERG(包括hERG)编码的心肌Ikr通道的化合物的方法。因此，所述配体化合物有用于评价临床前化合物对ERG钾通道的亲和力。
发明背景
现在已认识到一些药物诱导的突发死亡仅次于被称为扭转型室性心动过速(Torsades de Pointes，TdP)的心律失常的发展(Vandenberg JI，Walker BD，Campbell TJ.HERG K+channels：friend and foe.Trends Pharmacol Sci 2001；22(5)：240-6)。
随着近来对这一现象理解的增进，显示出这些药物的主要作用是对延迟整流钾电流(Ikr)的快速组分的抑制。这些化合物与运载该电流-亚单位的通道蛋白质的成孔的α-亚单位结合，所述电流-亚单位由人类eag相关基因(human ether-a-go-go-related gene，hERG)编码。由于IKr在心脏动作电位的再极化中起着关键作用，所以其抑制作用减缓了再极化并随着QT间隔的延长而表现出来。可是就其本身而言，QT间隔延长是不安全的，它带有高风险的心血管副作用，并且在少量百分比的人群中，它能导致TdP并恶化为心室颤动。
许多化合物因为对hERG编码的心肌Ikr通道的抑制作用而不能成为可出售的药物。患有LQT2综合征的患者(其中hERG基因已经突变)还表现出扭转型室性心动过速。hERG通道含有对下述药物的结合位点，例如III类抗心律失常的甲磺苯胺类药物(多非利特，E-4031和MK-449)和许多在临床上共享该位点的导致QT延长的药物。因此，它们要么带有警告标记(如匹莫齐特)，要么已经撤出市场(例如特非那定)。在hERG通道和所需靶点的活性之间的合适治疗界限的缺乏将阻止潜在药物的进一步开发。因此，尽可能早地评价hERG活性，从而减少新化合物类型的该种活性。
为了评价新化合物的ERG，尤其是hERG，对新化合物的活性和结合性需要进行合适的测试方法。已经研发出临床前的测试方法，该方法使用与hERG结合的放射性标记的化合物并允许置换研究以确定新化合物类型的亲和力。但是，需要有做这种测试用的可供选择的配体。
发明内容
WO02/04446公开了桥合二哌啶(bispidine)化合物及其在心律失常治疗中的用途。
因此，一方面，本发明涉及如WO02/04446中所述桥合二哌啶化合物的放射性标记的衍生物或其盐、水合物或溶剂化物。适当地说，该化合物包含放射性标记的取代基，尤其是氚取代基。在一个优选实施方案中，该化合物包含至少1、2或3个氚取代基。
在一个优选实施方案中，本发明涉及具有式I并包含至少一个放射性标记的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
Figure A20048003075300051
                             式I
适当地说，该化合物包含至少1、2或3个氚取代基，该取代基优选在硝基的邻位。
这种放射性配体或放射性标记的化合物有用于评价化合物对由ERG、尤其是hERG编码的Ikr通道的亲和力。
在本发明的一个优选实施方案中，提供了式II的化合物或其盐：
Figure A20048003075300061
                         式II
合适的盐包括其酸加成盐或碱盐。一些合适的盐的综述记载于：Berge等人，J Pharm Sci，66，1-19(1977)。盐可由以下酸形成，例如强无机酸如矿酸，如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机酸，如未被取代或取代的(如被卤素取代)具有1-4个碳原子的烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未被取代或取代的(如被卤素取代)(C1-C4)-烷基或芳基-磺酸，例如甲磺酸或对甲苯磺酸。
本发明还包括式I或II放射性标记的化合物的所有对映异构体或互变异构体。本领域熟练技术人员将识别出具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变特性的化合物。相应的对映异构体和/或互变异构体可以按照本领域已知的方法分离/制备。
此外，本发明包括式I或II放射性标记的化合物的任何立体异构体和/或几何异构体。例如，可以存在一个或多个不对称和/或几何中心，由此所述化合物可以以两种或多种立体异构体和/或几何异构体形成存在。本发明涵盖这些物质的所有单个立体异构体和几何异构体、及其混合物的用途。权利要求中所用的术语包含这些形式，只要所述形式保留合适的功能活性(虽然不必达到同样的程度)。
本发明还包括所述化合物或其盐的其它同位素变体。本发明试剂或其可药用盐的同位素变体被定义为其中至少一个原子被具有相同原子数但与自然界最常见原子量不同的原子量的原子所替代的物质。可合并入所述化合物中的其它同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如分别为2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。如式II中所示，特别优选氚化物，即3H。可以使用C-14(即14C)同位素并由于它们容易制备和检测而被优选。同位素变体一般可按照常规的方法使用合适试剂的适宜同位素变体制备。
本发明还包括所述化合物的溶剂化物形态的用途。权利要求中所用术语包括这些形态。
放射性配体化合物在结合测试中的成功使用依赖于许多参数，包括所述放射性配体对所关心通道的亲和力，以及一旦结合该化合物的离解速率(off rate)。理论上，合适的放射性配体将具有允许与可结合同一位点的候选化合物竞争的亲和力，以及允许所述放射性配体保持接触足够长时间以使能检测出其结合的离解速率。化合物的这些性质是不可预料的。因此，本发明涉及这样的发现，即：1、2或3个氚取代的式I化合物或式II化合物是可以合成的，并且适合用于竞争性结合测试。
本发明第二方面，提供了使用本发明的化合物鉴定作为IKr通道阻滞剂的化合物的活性的方法。
适当地说，所述方法是包括下述步骤的测试方法：
a)在存在或不存在测试化合物或测试化合物的混合物的情况下，在式II的放射性配体化合物存在下，培养含有IKr通道的细胞膜；
b)在存在或不存在测试化合物的情况下，定量特异性结合标记的化合物；
c)计算测试化合物或测试化合物的混合物对标记化合物结合的抑制作用。
这种测试方法可用于辨别和鉴定具有潜在心脏毒性副作用的化合物。该测试方法测量所述测试化合物从IKr通道、优选ERG通道替换式II的放射性配体化合物的能力。适当地说，该测试方法可以在高通量测试系统上实施。该测试方法能够选择出合适的化合物(即那些对IKr通道没有、低度或减小的亲和力的化合物)用于进一步的研发。
另外，这种测试方法可用于鉴定能够结合IKr通道从而可能有用于治疗患有心律失常的患者的化合物。
在一个优选的实施方案中，所述测试方法包括步骤：
a)制备一或多个浓度的测试化合物溶液；
b)将式II的放射性配体化合物与含有IKr通道的细胞膜混合；
c)用式II的放射性配体化合物与含有IKr通道的细胞膜的混合物与测试化合物溶液孵育；
d)从溶液中分离出膜并测定该膜的放射性；
e)计算存在测试化合物的样品相比于不存在测试化合物的对照物的放射性。
适当地说，计算对放射性配体化合物与细胞膜的结合产生50％抑制率的所述测试化合物的浓度(IC50)。这些数值可用于预测易于对人类产生不需要副作用的化合物浓度。
在一个实施方案中，所述测试方法是点试验。在另一实施方案中，所述测试方法测试浓度范围，优选5或更多个浓度。
分离细胞膜并测定放射性的合适的方法包括诸如本文所述测试方法的滤膜结合试验。或者，可以使用以小珠为基底的测试方法例如闪烁近似测定法(SPA，Amersham Biosciences)测定放射性。
优选IKr通道是人ERG(hERG/HERG)。
在一个实施方案中，包含IKr通道的细胞膜来自ERG基因转染的细胞系。适当地说，ERG基因是人(hERG)、灵长类或犬科的。
在人胚肾(HEK)细胞中已经将HERG表达为稳定或短暂表达的功能性通道(例如，参见Circulation 2001年，11月27日；104(22)：2645-8Phospholipidmetabolite 1-palmitoyl-lysophosphatidylcholine enhances humanether-a-go-go-related gene(HERG)K(+)channel function。Wang J，Wang H，Han H，Zhang Y，Yang B，Nattel S，Wang Z；J Biol Chem 1998年8月14日；273(33)：21061-6HERG channel dysfunction in human long QT syndrome。Intracellular transport and functional defects.Zhou Z，Gong Q，Epstein ML，January CT)。
因此，合适的细胞系包括HEK(人胚肾)细胞，如HEK 293细胞。其它合适的细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、CHL(中国仓鼠肺)细胞或COS(猴)细胞。此外，所述通道可以在细菌、酵母或昆虫细胞如SF9中表达。
本发明的另一方面，提供了本发明化合物在鉴定一种或多种测试化合物的IKr通道阻滞剂活性的测试方法中的用途。
另一方面，提供了式II化合物在鉴别能与IKr通道结合的一种或多种候选化合物的测试方法中的用途。
适当地说，该测试方法是竞争性结合测试方法。
本发明的另一方面，提供了如本文所定义的式II化合物的制备方法，所述方法包括在(1，5-环辛二烯)二(甲基二苯基-膦)铱(I)六氟磷酸盐存在下，氚化3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷。
适当地说，3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷和(1，5-环辛二烯)二(甲基二苯基-膦)铱(I)六氟磷酸盐溶解于二氯甲烷中。
在一个实施方案中，使用氚化反应槽(manifold)进行氚化。
在一个特别优选的实施方案中，式II化合物的制备方法基本上如本文中所述。
下述非限制性显示了所述合成方法的应用和式II化合物的应用。
实施例
实施例1-放射性配体的合成
放射性标记之前3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷的合成描述于WO02/04446中。
放射性标记得到式II化合物：
Figure A20048003075300091
3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷(式II)按照如下进行：
将3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷(1.62mg，3.82μmol)和(1，5-环辛二烯)二(甲基二苯基-膦)铱(I)六氟磷酸盐(8.6mg，10.3μmol)溶解于二氯甲烷中，并转移至2ml厚玻璃壁圆底烧瓶中。将该烧瓶与RC Tritec氚化反应槽相连，进行如下循环：冷冻、抽真空至＜0.01mbar并解冻使样品脱气。该二氯甲烷溶液最终在液氮和氚气(大约130GBq，61μmol)中冷冻，氚气是由反应槽上初级铀床产生的，被引入溶液上方的空隙中。使反应物升温至室温并由磁力搅拌棒搅拌20小时。
所述溶液在液氮和再吸收在反应槽的第二铀储存床中的残留氚气中再次冷冻。将烧瓶从反应槽中撤去，使用乙醇(2×5ml)对所述溶液进行两次冻干循环，以除去不稳定的氚。将所得残留物溶解于乙醇(10ml)中，得到3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷的储备液(19.33GBq，放射化学纯度34％)。
取储备液等分试样(2ml，3.87GBq)并在氮气流下吹干，残留物再次溶解于乙腈/0.5％v/v三氟乙酸水溶液(体积比1∶1，400μl)中。使用下述HPLC条件，分大约5份等量注射液对该样品进行纯化：Xterra MS C-8 150×8mm，35％乙腈/0.5％v/v三氟乙酸水溶液，流速3ml/min，240nm检测。每次均收集3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷的馏分(保留时间10.77分钟)并合并(放射化学纯度＞97％)。向合并的馏分中加入硫代硫酸钠溶液(50％w/v，50μl)以稳定样品，之后减压除去有机溶剂。冷冻干燥所得水溶液，余下白色残留物，将其重新溶解于乙醇/水(体积比2∶1，15ml)中，得到纯化的3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷的储备液(881.7MBq；放射化学纯度97.5％)。由质谱测定摩尔比放射性，为2941.5GBq/mmol。
实施例2-hERG结合测试方法规程
测试板
96-孔聚丙烯板(Costar C3600)
Whatman GF/B滤板(Packard(6005177N))
测试和洗涤缓冲液
10mM HEPES
130mM NaCl
5mM KCl
1mM EGTA
0.8mM MgCl2
pH 7.4的NaOH
GF/B板涂敷溶液
0.3％(v/v)聚氮丙啶(polyethylenimine)
0.2％(w/v)BSA
在采集之前，GF/B滤板在涂敷溶液中预先浸泡最少20分钟。
膜
用于测试的膜按照如下制备：
使用标准的方法培养HEK(人胚肾)细胞以提供所需的数量，然后收集并沉淀。在无血清培养基中制备最终的沉淀并测量压紧细胞体积(pcv)。
将该沉淀物再次悬浮于4倍pcv体积的低渗缓冲液(3份水∶1份无血清介质或缓冲液)中，其中加入了1片/50ml Boehringer蛋白酶抑制剂(目录号1697498)。
让细胞在冰上膨胀两三分钟，然后使用Polytron组织匀浆器(设置在22,000rpm)使细胞裂解。所述细胞悬浮液保持在冰中，使Polytron匀浆器加速、然后关闭并在重复之前使其冷却30秒。通常3次猝发足以完全地裂解细胞。显微镜检查样品以确保完全裂解，如果需要重复该程序。
将10ml冷的41％蔗糖的缓冲溶液加入38ml Beckman超离心管(目录号344058)中。将已裂解的膜溶液小心地覆盖到所述41％缓冲液上。用缓冲液将可能粘贴在侧壁上的任何碎片从Polytron管中冲洗下来。向超离心管中加入冷缓冲液以完全装满该管(这是防止在离心期间离心管破裂)。使用具有在800rpm制动的SW-28甩平式转子，在@4℃、28,000rpm下离心1小时。
观察到膜是处于在蔗糖/缓冲液界面上的白色带状物。弃去缓冲液的上层，然后采集带有尽可能少量蔗糖的所有膜带并将其加入新的离心管中。用至少3倍体积的含有蛋白酶抑制剂的冰冷的缓冲液对其进行充分地稀释和混合。在4℃、23,000rpm下离心20分钟并在0转下停止。
弃去上清液，在冰上以1×108细胞当量/ml将粒状沉淀物再次悬浮于测试缓冲液+蛋白酶抑制剂中。然后等分该制备物并冷冻至-80℃或更低。
测试时，将所述膜溶液稀释65倍，例如0.5mL膜稀释至32.5mL测试缓冲液/测试板。3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷的总结合率不超过总加入量的10％。
放射性标记
根据上述规程制得3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷并加入67％(v/v)乙醇、33％(v/v)的含3.3mg/mL硫代硫酸钠的水中。这些研究中所用的放射性标记的比放射性为2941.5GBq/mmol(79.5Ci/mmol)并且其浓度为20μM。将该储备放射性标记稀释2000倍至10nM并每孔加入20μL至最终测试体积为200μL，得到最终放射性配体浓度为1nM。
总结合
在没有竞争配体的情况下，在载体对照物存在下定义总结合。在该种情况下，其是1％(v/v)DMSO(20μL/孔，来自10％(v/v)DMSO测试缓冲液的储备液)。
NSB
通过在10μM阿司咪唑(20μL/孔，来自10％(v/v)DMSO测试缓冲液中的100μM储备液)存在下，测量3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷的结合量来确定非特异结合。
测试化合物
将测试化合物溶解于DMSO中制成浓度为10mM的储备液。通常每板测试至多7个化合物并带有内标。使用8道移液器在96孔板中将它们同时稀释。将化合物连续在DMSO中稀释至待使用的最终测试浓度的100倍，所述最终测试浓度通常为3mM-30μM的半对数单位。这可以通过将30μL的每个连续稀释液加入96孔板中的65μL DMSO中而实现。进一步的稀释按照如下在测试缓冲液中进行：用测试缓冲液将化合物稀释10倍，得到化合物在10％DMSO中的5个浓度。然后将20μL的每种稀释液加入测试板中。当加入其它添加物时，使得总体积为200μL并且最终DMSO浓度为1％(v/v)。
测试标准
匹莫齐特(一种hERG-活性化合物)被用作测试标准。其pIC50为7.7±0.1(平均值±标准差，n＝7，范围7.5-8.0)。该化合物制成10mM的DMSO中的储备液并在-20℃等分冷冻以用于每次试验。在每个测试板中测试一个标准化合物。
测试方法
在Costar聚丙烯圆底96孔板中进行测试。每个测试板含有用于总结合和非特异结合的对照。通常，以5个对数级稀释液，一式两份地测试化合物。这使得每个测试板可测试八个化合物。一般在30μM-0.3μM的范围内测试化合物。
在表1中汇总了向每个测试板中加入的物质：
表1测试板孔中所含物质
  总结合   结合+化合物   非特异结合
  化合物载体式II化合物10μM阿司咪唑膜   --20μL20μL--160μL   20μL--20μL--160μL   ----20μL20μL160μL
在加入所有的添加物之后，将该板放在板振荡器上1分钟进行混合。然后在室温(18-20℃)培养该板3小时。在此期间，将用于每个测试板的一个GF/B板浸渍在涂敷溶液中。培养之后，使用Tomtec采集器采集测试孔中的内容物并洗涤7次，每次循环使用大约250μL洗涤缓冲液(总共1750μL)。所述板的布局(layout)转换至采集器中，由此测试板中的孔A1被采集到了GF/B板的孔A12。
将20μL的10nM 3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷加入干燥滤板中以测定加入测试孔中的总放射性。该板要么在58℃的烘箱中干燥2小时，要么室温放置过夜干燥。在每个板下部粘上底部密封，并向每个滤板中加入50μL/孔Microscint 0。向每个板加上顶部密封，使用Packard TopCount沿着倒转的板方向，在[3H]测定条件下测定放射活性，其中沿着倒转的板方向能够校正过滤期间产生的转换的布局。
数据分析
计算总的结合、非特异结合和加入的总[3H]的平均CPM值。还计算每个浓度的测试化合物的平均CPM值并且减去平均NSB。以平均CPM对应测试化合物的浓度绘制浓度-效应曲线。然后测定pIC50值。
结果
3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷以高亲和力与来自hERG-转染的HEK细胞的膜可逆性结合(Kd 0.91±0.01nM；Bmax23.1±0.4pmol/mg蛋白质；平均值±标准差，n＝3)。
对于竞争性置换测试，使用1nM的放射性配体浓度，它提供了相对于非特异结合10倍的结合范围，并证实具有可逆的、单位点结合特性。
与已公开的[3H]-多非利特数据比较
3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷被以前描述的作为hERG通道阻滞剂的一类化合物从hERG-转染的HEK膜上完全置换掉。
表2使用3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷和[3H]-多非利特(Finlayson等人)在hERG-转染的HEK膜上进行竞争性结合测试而得到的已知hERG通道阻滞剂的pIC50值的比较(平均值±标准差，n≥4)。
  配体   3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷pIC50   [3H]-多非利特pIC50
  3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷   8.5   -
  阿司咪唑   7.9   -
  多非利特   7.4   7.2
  西沙必利   6.5   -
  特非那定   6.4   6.4
  匹莫齐特   7.7   7.2
  E-4031   6.9   6.6
  氯非铵   8.7   8.1
  d-索他洛尔   4.6   3.9
  氟哌啶醇   6.1   6.3
这些化合物的pIC50值与使用辉瑞的多非利特作为放射性配体所观测到的已公开数据非常一致(表2；数据来自Finlayson等人)。这一相关性与下述观点相一致：即3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷占据与许多已知与hERG通道相互作用的药物所占据的结合位点类似的结合位点。
已知的hERG阻滞剂的电生理学数据的比较
3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷结合pIC50值与那些hERG通道阻滞剂的电生理学pIC50值之间的比较显示出，该结合测试方法可预测将会与所述通道发生功能性相互作用的那些化合物(表3)。
表3.使用3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷进行竞争性结合测试和电生理学而得到的已知hERG通道阻滞剂的pIC50值的比较。
  配体   3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷pIC50   电生理学pIC50   数据来源除非特别指明，均指人类
  多非利特   7.4   6.8   本机构得到的数据
  西沙必利   6.5   7.1   本机构得到的数据
  特非那定   6.4   7.3   本机构得到的数据
  匹莫齐特   7.7   7.7   Kang 2000
  E4031   6.9   7.1   本机构得到的数据
  d-索他洛尔   4.6   4.1   Chadwick 1993；G.Pig
  氟哌啶醇   6.1   6.0   Suessbrich 1997
候选化合物的电生理学数据比较
在3，7-二[2-(4-硝基[3，5-3H]苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷结合测试中对代表不同结构类型的化合物进行筛选。这些数据与来自电生理学研究的功能性pIC50数据进行比较，显示出大多数化合物在结合测试中比电生理学测试中活性低3至10倍。但是，在结合测试中检测到所有化合物的功能性活性均大于10微摩。
标准化合物的数据表明该结合测试方法适合用于考查通道阻滞剂的SAR。与标准物相反，当处理的对象化合物是通常是效力低很多的化合物时，在该测试方法的灵敏度之内不能得到清楚的SAR。
该测试方法清楚地提供了一种快速、早期检测对象化合物与hERG通道相互作用能力的便利方法。
结论
本发明已经提供了一种简单、有力的放射性配体-结合测试方法，该方法可鉴别不同结构类型的hERG结合活性。
对于大多数化合物而言，结合测试中的活性低于电生理学确定的活性，但这两种筛选方法间的总正相关性确保了在功能性筛选中具有显著活性的化合物类型将能在结合测试中检测出。该结合测试方法可用于检测能导致QT延长的化合物类型。
该结合测试方法适合用作初级hERG筛选，使需要电生理学测试的化合物的数量降低到最低。
参考文献
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4)Suessbrich H.，等，The inhibitory effect of the antipsychotic drughaliperidol on hERG potassium channels expressed in Xenopus oocytes.BritishJournal of Pharmacol.(1997)120：968-974.
上述说明书中提及的所有出版物和所述出版物中引用的参考文献在本说明书中作为参考文献引入。在不脱离本发明范围和精神的前提下，本领域熟练技术人员对本发明所述方法和体系作出各种改进和变化将是显而易见的。虽然本发明已经结合具体优选的实施方案进行描述，但应理解的是如权利要求所要求的本发明不应过分局限于这些具体实施方案。实际上，为实施本发明而描述的实施方式的各种改进也包括在下述权利要求的范围内，所述改进对于化学或相关领域的熟练技术人员而言是显而易见的。

Claims (14)

1.具有式I并包含至少一个放射性标记的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
               式I。
2.权利要求1的化合物，其中所述化合物在间位包含至少1、2或3个氚取代基。
3.式II化合物：
Figure A2004800307530002C2
              式II
或其盐。
4.一种鉴定作为IKr通道阻滞剂的化合物的活性的测试方法，其包括下述步骤：
a)在存在或不存在测试化合物的情况下，在式II化合物存在下，培养含有IKr通道的细胞膜；
b)在存在或不存在测试化合物的情况下，测定特异性结合的标记化合物；
c)计算测试化合物对标记化合物结合的抑制作用。
5.权利要求4的测试方法，其包括步骤：
a)制备一或多个浓度的测试化合物溶液；
b)将式II化合物与含有IKr通道的细胞膜混合；
c)用式II化合物与含有IKr通道的细胞膜的混合物与测试化合物溶液孵育；
d)从溶液中分离出膜并测定该膜的放射性；
e)计算在测试化合物存在的样品相比于不存在测试化合物的对照物的放射性。
6.权利要求4或5的测试方法，其中IKr通道是人ERG。
7.权利要求6的测试方法，其中所述细胞膜是来自人ERG基因转染的细胞系。
8.权利要求7的测试方法，其中所述细胞系是HEK。
9.式II化合物在鉴定一种或多种候选化合物的IKr通道阻滞剂活性的测试方法中的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述测试方法是竞争性结合测试方法。
11.一种制备权利要求3所定义的式II化合物的方法，所述方法包括在(1，5-环辛二烯)二(甲基二苯基-膦)铱(I)六氟磷酸盐存在下，氚化3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷。
12.权利要求11要求保护的方法，其中3，7-二[2-(4-硝基苯基)乙基]-3，7-二氮杂二环[3.3.1]壬烷和(1，5-环辛二烯)二(甲基二苯基-膦)铱(I)六氟磷酸盐溶解于二氯甲烷中。
13.权利要求11或12所述的方法，其中使用氚化反应槽进行氚化。
14.基本上如本说明书中所述的式II化合物的制备方法。
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