CN102675288B - 2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺及制备、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及荧光探针领域,具体地,本发明涉及2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺及其制备、应用。本发明的2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺,具有式I所述结构。本发明还提供了该化合物的制备方法以及作为锌离子荧光探针的应用。本发明中所设计的锌离子荧光探针,合成路线简单,后处理方便,且具有一定的药理学应用价值,该探针的荧光强度与锌离子浓度之间具有非常好的线性关系,利用此探针,能够完成对锌离子的定量分析;对锌离子的识别操作也极其简单,并且识别结果便于监测,具有其特定的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针领域,具体地,本发明涉及2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺及其制备、应用。
背景技术
金属离子荧光探针是一种具有广泛应用价值的敏感检测手段,其设计、合成、应用和识别过程都受到了不同领域研究者的广泛关注。
荧光探针基于荧光分析技术发展而起来,通常在测量方法上、灵敏度、选择性、响应时间、现场测定(例如荧光成像技术)以及利用光纤进行远距离检测方面有突出优势。一般来说,荧光探针根据其激发-淬灭机制的不同,大致可分为四类:光诱导电子转移(PET)、单体-激基缔合物(monomer-excimer)、激发态分子内质子转移(EXIPT)和光致电荷转移(ICT)等。
荧光分子探针法是新型的针对金属离子进行定量的分析方法。该类探针分子应该具有以下条件:稳定性好,高选择性,感光快速,响应效果明显,具有实际操作性能。
锌是人体中第二丰富的过渡金属元素,在生物学上有着重要的作用。它影响DNA的合成,基因表达,细胞凋亡,神经传递,信号传导。同时,它还能够调节多种离子通道。此外,锌离子还是体内许多酶和转录因子(例如碳酸酐酶、锌指蛋白酶等)的核心组成成分。而这些酶和转录因子在人体中的组织结构和反应催化的方面,起着重要的作用。无法维持锌动态平衡的细胞,组织或个体,将患上各种发展缺陷病,并可能引起胰胆管汇合异常。因而发展一种对细胞或人体内锌离子的检测方法,有重大的意义。
基于以上原因,多种离子荧光探针已经被设计并合成出。但由于目前存的锌离子探针均采用以现有荧光染料(例如罗丹明B)为母核,而多数的荧光染料对生物体系均有一定的毒性,制备这些染料的过程通常比较繁杂,且部分探针的荧光发光强度不高以及对金属离子的选择性较差,因而限制了这些探针的应用。近年来,许多新型的2-氨基苯甲酰胺类衍生物被设计和合成,并发展成为热休克蛋白90(Hsp90)抑制剂。其中,化合物SNX-2112已经被应用于临床I期的研究,进一步发展以SNX-2112母体结构为荧光锌探针的苯甲酰胺衍生物,将会有更好的离子检测应用和更深入的药理学应用。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺化合物。
本发明的再一目的在于上述化合物的制备以及应用。
根据本发明的2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺化合物,该化合物结具有以下式I所述结构:
本发明还提供了该化合物的制备方法,所述方法包括以下步骤:
1)将4-氟-2-溴苯甲腈,3,6,6-三甲基-1,5,6,7-四氢-吲唑-4-酮和碳酸钾按摩尔比1∶1.20∶1.72进行混合并溶解,加热,进行反应,纯化结晶,得到式II化合物
2)将式II化合物在无水无氧的条件下和N,N’-双(2-吡啶甲基)乙二胺、叔丁醇钠、氯化钯和1,1′-双二苯基膦二茂铁混合,并以甲苯为溶剂,其中式II化合物与N,N’-(双(2-吡啶甲基)乙二胺、叔丁醇钠、氯化钯和1,1′-双二苯基膦二茂铁的摩尔比分别为1∶1.5、1∶2.6、1∶0.4和1∶0.34,在惰性气氛中进行反应,反应后过滤,浓缩,得到式III化合物
3)将式III化合物中的氰基进行酰胺化,得到2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺。
本发明的制备2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺化合物的合成路线为:
根据本发明的实施例1,制备该化合物的方法具体的包括以下步骤:
1)将4-氟-2-溴苯甲腈,3,6,6-三甲基-1,5,6,7-四氢吲唑-4-酮以及碳酸钾按摩尔比1∶1.20∶1.72混合于茄形瓶中,加入DMF使其溶解,室温搅拌半小时后再将茄形瓶置于40℃的恒温油浴中,搅拌至完全反应,旋转蒸发除去溶剂,并用150mL二氯甲烷稀释;用饱和氯化钠溶液洗涤(3×30mL)并用无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩;快速柱层析得到初品,并用二氯甲烷-石油醚重结晶得到式II化合物,用于下一步反应。
2)取式II化合物,100mg,置于已经无水无氧处理的25mL茄形瓶中,加入1.5倍摩尔当量的EDPA,2.60倍摩尔当量的叔丁醇钠,催化量的氯化钯和DPPF,并加入11mL甲苯,氩气保护;将茄形瓶置于100℃油浴中反应,直至反应完全;待混合物恢复至室温,以100mL二氯甲烷稀释,过滤,浓缩,进一步柱层析得到式III化合物。
3)将式III化合物溶解于乙醇和DMSO的混合溶剂(乙醇∶DMSO=4∶1)中,加入5.65倍摩尔当量的KOH,混合物置于50℃油浴中,并缓慢滴入30%的H2O2,直至反应完成,旋蒸除去乙醇,用150mL二氯甲烷稀释,并用饱和氯化钠溶液洗涤(3×30mL),无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩,柱层析得到产物。
本发明所制备得到的2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺化合物在作为锌离子荧光探针时对锌离子具有高度的选择性,在多种金属离子(Ba2+、Ca2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+和Zn2+)中,只有锌离子(Zn2+)对锌离子荧光探针表现出较好的选择性,并且荧光发射强度和Zn2+离子浓度之间具有良好的线性关系,因此可以用来锌离子的定量检测。因此,本发明的新型锌离子荧光探针可应用于离子检测领域。
本发明中所设计的锌离子荧光探针,以SNX-2112母体结构为荧光锌探针的苯甲酰胺衍生物,且该探针的荧光信号显示较好,选择性优异,后处理方便,且具有一定的药理学应用价值,最重要的是,该探针的荧光强度与锌离子浓度之间具有非常好的线性关系,利用此探针,能够完成对锌离子的定量分析。对锌离子的识别操作也极其简单,并且识别结果便于监测。本发明可作为具有药用价值的锌离子监测探针,具有其特定的应用前景。
附图说明
图1为本发明中2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺晶体结构图;
图2本发明中该化合物在HEPES缓冲溶液中逐步加入锌离子的紫外吸收光谱;
图3本发明中该化合物在HEPES缓冲溶液中逐步加入锌离子的荧光发射光谱;
图4本发明中该化合物的离子选择性图;
图5本发明中该化合物的荧光强度对锌离子的浓度的线性关系图。
具体实施方式
下面通过实例对本发明做进一步的说明:
实施例1
1、2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺的合成:
1)式II化合物的合成
将4-氟-2-溴苯甲腈(100mg,0.5mmol),3,6,6-三甲基-1,5,6,7-四氢-吲唑-4-酮(107mg,0.60mmol)以及碳酸钾(118mg,0.86mmol)(其中,4-氟-2-溴苯甲腈,3,6,6-三甲基-1,5,6,7-四氢-吲唑-4-酮和碳酸钾的摩尔比为1∶1.20∶1.72)混合于茄形瓶中,加入DMF使其溶解,室温搅拌半小时后再将茄形瓶置于40℃的恒温油浴中,搅拌至完全反应。旋转蒸发除去溶剂,并用150mL二氯甲烷稀释。用饱和氯化钠溶液洗涤(3×30mL)并用无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩。快速柱层析得到初品,并用二氯甲烷-石油醚重结晶得到式II化合物(145mg,产率82%),用于下一步反应。
2)式III化合物的合成
取式II化合物(100mg,0.28mmol)置于已经无水无氧处理的25mL茄形瓶中,加入N,N’-双(2-吡啶甲基)乙二胺(100mg,0.41mmol),叔丁醇钠(70mg,0.73mmol),催化量的氯化钯(20mg,0.11mmol)和DPPF(40mg,0.072mmol),并加入11mL甲苯,氩气保护,其中式II化合物与N,N’-(双(2-吡啶甲基)乙二胺、叔丁醇钠、氯化钯和1,1′-双二苯基膦二茂铁的摩尔比分别为1∶1.5、1∶2.6、1∶0.4和1∶0.26。将茄形瓶置于100℃油浴中反应,直至反应完全。待混合物恢复至室温,以100mL二氯甲烷稀释,过滤,浓缩。进一步柱层析得到式III化合物(74mg,50%)。
3)式I化合物的合成
将式III化合物(36mg,0.069mmol)溶解于乙醇和DMSO的混合溶剂(乙醇∶DMSO=4∶1)中,加入KOH(22mg,0.39mmol)(其中KOH的物质的量是式III化合物的5.65倍)的混合物置于50℃油浴中,并缓慢滴入30%的H2O2(0.11mL),直至反应完成。旋蒸除去乙醇,用150mL二氯甲烷稀释,并用饱和氯化钠溶液洗涤(3×30mL),无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩。柱层析得到锌探针纯品式I化合物-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺(32mg,87%)。
熔点:104.6-107.0℃;
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ=1.09(s,6H),2.39(s,2H),2.54(s,3H),2.77(s,2H),2.91(t,J=6.04Hz,2H),3.32(t,J=6.08Hz,2H),3.90(s,4H),6.63(dd,J=8.40,1.84Hz,1H),6.71(d,J=1.72Hz,1H,),7.12(t,J=6.06Hz,1H),7.49(d,J=8.40Hz,1H),7.65(t,J=7.62Hz,2H),7.73(d,J=7.80,2H),8.48(d,J=4.12Hz,2H)ppm.
13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ=13.39,28.38(2C),35.77,37.50,40.42,52.36,52.53,53.38,60.35,106.38,109.07,112.95,117.14,122.04(2C),123.24(2C),129.48,136.59(2C),142.57,148.81(2C),149.03,149.88,150.64,159.14,171.17,193.39ppm.
HRMS(ESI)计算值(M+H)+C31H36N7O2,538.2930;实际值538.2924。
2、该化合物在pH=7.4的HEPES缓冲液中加入金属离子的荧光光谱变化
将化合物溶于乙醇中制的0.001M的探针母液,取30μL加入3mL pH=7.4的HEPES缓冲液中,同取30μL浓度为0.001M的Ba2+、Ca2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+和Zn2+的水溶液,加入缓冲液中,监测溶液的荧光发射光谱变化,得到结果如图4。加入其它离子(除Cd2+外),探针均为对这些离子产生明显响应。而加入Zn2+离子后,探针的荧光发射增强为原先的16.4倍(加入Cd2+离子后,只增强为原来的8倍),体现了较好的对Zn2+离子的选择性。Cd2+离子是Zn2+离子检测中公认的干扰离子,其在生物体中含量甚微。因而,可以说,该化合物探针是一种灵敏并且具有较好选择性的Zn2+离子检测荧光探针。
3、该化合物紫外吸收与Zn2+离子浓度在pH=7.4的HEPES缓冲液中的关系
分别配制该化合物浓度为10-5mol/L的pH=7.4的HEPES缓冲液(10mL)11份,分别加入浓度为0.001M的Zn2+离子水溶液5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL(锌离子当量为0.05eq、0.1eq、0.2eq、0.3eq、0.4eq、0.5eq、0.6eq、0.7eq、0.8eq、0.9eq、1.0eq),测试该化合物紫外吸收图谱,得到结果如图2。通过紫外吸收结果显示,逐量加入Zn2+离子,该化合物的两个紫外吸收带强度明显下降,并发生了明显的Stokes红移,根据结果可知,该化合物与Zn2+离子发生了结合作用。
4、该化合物荧光发射强度与Zn2+离子浓度在pH=7.4的HEPES缓冲液中线性关系
分别配制该化合物浓度为10-5mol/L的pH=7.4的HEPES缓冲液(10mL)13份,分别加入浓度为0.001M的Zn2+离子水溶液5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、120μL和150μL(锌离子当量为0.05eq、0.1eq、0.2eq、0.3eq、0.4eq、0.5eq、0.6eq、0.7eq、0.8eq、0.9eq、1.0eq、1.2eq和1.5eq),测试该化合物荧光发射图谱,得到结果如图3。并根据荧光发射强度和Zn2+离子浓度关系绘制线性关系曲线,得到结果如图5,线性关系R2=0.999。根据结果可知,该化合物是一种灵敏并能够定量监测Zn2+离子浓度的荧光探针。
实施例2 2-((2-(双(2-吡啶甲基)氨基)乙基)氨基)-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲唑基)苯甲酰胺做为荧光探针在废水中检测锌离子的应用。
量取过滤后并处理好的含有锌离子的废水样本100μL,加入4mL石英比色皿,并加入HEPES缓冲液(25mM,0.1 M NaClO4,pH=7.4,I=0.1)3mL,加入荧光探针30μL(测定浓度为10-5mol/L),同时以260nm为激发波长,进行荧光扫描,在446nm处检测其荧光强度F,按同样方法作空白实验(荧光强度记作F0),计算出二者的荧光强度F/F0,并参照锌离子浓度与荧光强度线性关系图,测得废水中锌离子含量为130μg/L。
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