CN1869697A - 评价乙肝患者机体免疫力水平的方法、应用于该方法的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
评价乙肝患者机体免疫力水平的方法、应用于该方法的检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1869697A CN1869697A CN 200610087496 CN200610087496A CN1869697A CN 1869697 A CN1869697 A CN 1869697A CN 200610087496 CN200610087496 CN 200610087496 CN 200610087496 A CN200610087496 A CN 200610087496A CN 1869697 A CN1869697 A CN 1869697A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hepatitis
- igg1
- igg3
- enzyme
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及了一种评价乙肝患者机体免疫力水平的方法、应用于该方法的一种检测核心抗体亚类IgG3和IgG1的酶联免疫试剂盒和一种检测核心抗体亚类IgG3和IgG1的化学发光检测试剂盒检测试剂盒及其制备方法。所述方法包括下列步骤：(1)检测核心抗体亚类IgG3和IgG1；(2)计算IgG3和IgG1的比值；(3)根据IgG3和IgG1的比值评估乙肝患者机体清除病原体的能力，预测乙肝治疗效果和预后。所述各试剂盒采用所述方法，对人血清中的乙肝核心抗原抗体中的亚类IgG3和IgG1进行检验。本发明可用于乙型肝炎病毒的发展水平、预后诊断，治疗效果评价等。
Description
技术领域
本发明涉及了一种评价乙肝病毒感染者机体免疫力水平的方法，还涉及应用于该方法的两种检测试剂盒及其制备，该方法通过检测乙肝核心抗原抗体亚类IgG3/IgG1比值评价乙肝病毒感染者的免疫力水平，其检测结果同乙肝五项指标、ALT的检测结果对照，对判断HBV病毒在体内的发展和治疗情况的预后有重要的指导意义。
背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的全球性传染病，据估计，全世界目前大约有3亿乙肝病毒携带者，且这一数字还在增加。其中，中国是乙型肝炎的高流行区，据我国70年代末和90年代初两次全国肝炎的流行病学调查的数据显示，我们国家感染过乙肝病毒的人有6.9亿，感染率是57.6％，长期携带乙肝病毒的人有1.2亿，乙肝病毒表面抗原的携带率9.75％，历年累积下来，现有慢性乙肝病人约两千多万。HBV属嗜肝病毒家族，可引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生有密切的关系。
CD4+细胞是调节免疫应答的一类重要调节性细胞，具有辅助体液免疫和细胞免疫的功能。1986年Mosmann据其产生的细胞因子的不同，将小鼠CD4+细胞分为Th1和Th2两个亚群，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α，主要参与诱导细胞免疫反应和产生IgG2a型抗体，Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-IO、IL-13等细胞因子，刺激B细胞增殖和分化，主要参与介导体液免疫和产生IgG1和IgE型抗体。Th1、Th2相互调节、相互制约，共同维持机体的免疫状态。随着对Th1和Th2的研究逐步深入，发现在人类也存在Th1和Th2细胞，现在已经明确Th1/Th2型细胞因子可以调节机体的免疫反应，影响免疫应答的格局。人TH2通过分泌IL-4和IL-5辅助IgG1和IgA合成，分泌IL-10，抑制TH1细胞合成细胞因子，而TH1对IgG1合成则有抑制作用，但辅助其他几种类型IG的合成，包括IgG3的合成。因此TH2功能与抗体亚类IgG1产量相关，TH1功能与抗体亚类IgG3产量相关。
免疫学研究表明TH1/TH2应答能反映机体对病源体清除的能力。TH1和TH2型细胞因子的平衡是机体处于正常状态的保证，二者失衡是感染、自身免疫病、变态反应、器官移植排斥反应、肿瘤发生与恶化的重要促进因素。在HBV感染中，机体能否建立有效清除HBV的保护性免疫有赖于免疫系统中的细胞免疫和体液免疫，而免疫应答过程需要多种免疫细胞的参与，其中Th细胞起重要作用。
研究已经证实乙型肝炎的发生和发展与机体的免疫功能密切相关。许多临床表明，慢乙肝的发展和后果主要取决于宿主的免疫应答。
一般认为Th1免疫应答能增强宿主对感染(尤其是胞内病原体)的免疫应答和防御功能，而Th2应答则与感染的进展、持续性和慢化性有关，Th1和Th2所介导的免疫反应通常是通过自己分泌的细胞因子互相抑制的，既总是一个较另外一个具有优势。以往的研究已经证实，在乙肝慢性者外周血中TH2占优势，TH1较弱。
在慢性肝炎TH1和TH2的对比中，TH1类细胞因子明显降低(P＜0.001)，TH2类细胞则升高(P＜0.001)，即在慢性肝炎中，细胞免疫下降，而体液免疫加强，TH1/TH2类细胞免疫应答出现了失衡，可见TH2类细胞因子水平上升与感染慢性化相关；目前的研究显示，TH2型细胞应答与病情慢性化有关，TH2型应答愈占优势，炎症反应愈趋向于慢性化。各型慢性肝炎中，TH1类细胞因子均降低，TH2类细胞因子则升高。自限性HBV急性感染期间以Th1应答为主，恢复期表现以Th0细胞应答占优(即同时分泌Th1类和Th2类细胞因子)，但分泌水平均下降。因此机体对HBV的免疫应答失衡是慢性乙型肝炎的重要发生机制之一，表现为Th1型免疫低下而Th2型免疫亢进。Th1型免疫低下致使免疫系统不能产生足量的Tc细胞及Th1型细胞因子以杀伤、破坏病毒感染的靶细胞和抑制病毒基因的复制及表达，机体不能及时清除病毒；Th2型细胞因子则进一步抑制Th1型免疫应答；病毒抗原的持续刺激又诱导特异性T细胞凋亡或无能，因此形成宿主对病毒抗原的免疫耐受；最终导致了HBV的慢性持续感染。
因此如何检测宿主(即患者)的免疫应答对于有效治疗和预后预示都是具有重大意义。
当前判断疾病免疫发病机制中Th1或Th2细胞效应为主导的方法，主要是依据炎症组织局部细胞因子的表达，也可根据外周血清中抗体反应，如IgG亚类的变化进行判断。细胞因子检测方法既检测TH1相关的IL-2、IFNγ和TH2相关的IL-4、IL-10。本方法检测指标较多，联合评价方法复杂。由于已经知道TH2与抗体亚类IgG1相关，TH1与抗体亚类IgG3相关，因此检测抗体的亚类是个可以选择的方向。
乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B virus core antigen，HBcAg)蛋白由183～185个氨基酸残基(各亚型之间稍有不同)组成，相对分子质量为21000，其C端富含精氨酸，有结合核酸RNA的能力，并与其组装成乙肝核心颗粒有关，同时也含有多种蛋白酶作用位点，N端的1～144位氨基酸残基是真正的颗粒装配区。HBcAg能够直接激活B细胞，是典型的T细胞非依赖性抗原。同时HBcAg也是强有效的T细胞免疫原，即也是T细胞依赖性抗原。
HBcAg为强免疫原，几乎在所有HBV感染中均可出现抗-HBc和T细胞应答。乙肝感染后，HBcAb在绝大部分患者体液内都可以获得，目前所检测方法均为测总抗体方法，没有对其抗体亚类进行检测。在多种病毒和寄生虫的免疫机制中发现，患者感染后血液中总的IgG也许是正常，但是IgG某些亚类是缺陷的，而不同亚类IgG与肌体免疫保护力相关，因此此时正常水平总的IgG可能是误导，不能起到诊断的作用。
目前临床上缺乏简便的手段来衡量乙肝患者自身对病源体清除的能力。申请人研究发现了检测乙肝核心抗体中的IgG3和IgG1亚类的比值可以反映乙肝患者体内TH1/TH2的平衡，并发现这对指标联合检测可以预示疾病恢复，肌体免疫力。对不同人群乙肝抗体亚类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4进行分析，发现乙肝核心抗体IgG3亚类与IgG1亚类的比率是预示肝炎疾病转归的指示性指标。由于IgG3/IgG1被认为可以反映TH1/TH2的相关情况，因此检测IgG3/IgG1可以用于评价乙肝病毒感染者免疫力水平。本方法较采用双抗体夹心ELISA法检测血清TH1型细胞因子(IL-2、IFNγ)和TH2型细胞因子(IL4、IL-I0)水平判断TH1/TH2更为简便。
发明内容
为克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种简便有效的评价乙肝患者机体免疫力水平的方法，还提供了应用于该方法的两种检测试剂盒及其制备方法。采用本发明的方法和产品，可以更好地评估乙型肝炎感染后机体的免疫情况，更好地评价治疗效果和预后情况，并配合现有的检测技术，为乙肝患者的治疗提供帮助。
本发明提供的评价乙肝患者机体免疫力水平的方法，包括下列步骤：(1)检测核心抗体亚类IgG3和IgG1；(2)计算IgG3和IgG1的比值；(3)根据IgG3和IgG1的比值评估乙肝患者机体清除病原体的能力，预测乙肝治疗效果和预后。
其中所述核心抗体亚类IgG3和IgG1的检测方法可以采用下列方法中的一种或几种：酶联免疫吸附实验方法、化学发光检测方法、时间分辨方法、流式细胞仪。
如IgG3/IgG1的比值小于1，说明机体免疫能力不完善，比值越小说明免疫能力越不完善；随着比值升高，显示机体免疫能力趋向完善，如果IgG3/IgG1的比值大于1，说明机体免疫能力较好，治疗有效。
本发明提供一种试剂盒为检测核心抗体亚类IgG3和IgG1的酶联免疫试剂盒，其包括包被了乙肝核心抗原的酶标板、酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液。
这种试剂盒的制作方法如下：
(1)获得乙肝核心抗原，包被到酶标板吸附过夜；
(2)用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干；
(3)获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgG1单克隆抗体；
(4)将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；
(5)将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液共同包装，得到试剂盒。
其中：所述包被板制作的过程为：包被乙肝核心抗原，该核心抗原可以是病毒中提取也可以是基因工程重组蛋白，具有生物高活性，经过电泳鉴定，蛋白纯度超过90％。将此抗原用碳酸缓冲液体(CB Buffer)稀释成低浓度进行包被，包被载体为聚苯乙烯塑料板。包被时每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得核心抗原包被酶标板，酶标板可选用国产板或进口板，规格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆条板；
所述酶工作液的制备过程为：将酶标记物HRP(辣根过氧化物酶)标记的鼠抗人IgG3单克隆抗体和HRP标记鼠抗人IgG1单克隆抗体，分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；
所述酶标单克隆抗体的制备可以采用下列步骤：
(a)NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml；
(b)单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜；
(c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标鼠抗人IgG1或IgG3单克隆抗体。
所述辅助试剂的配制过程为：
(a)底物溶液：磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；
(b)显色液：四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
(c)反应终止液：2mol/L硫酸；
(d)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)：PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
检测方法包括下述步骤：
(1)抗原-抗体反应：在包被板的2个微孔中分别加入50μl待测血清样品，进行温育：37℃水浴保温30分钟；
(2)加酶：2个微孔中分别加入酶工作液1和酶工作液2，进行温育：37℃水浴保温30分钟；
(3)显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应；
(4)测量：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD值并记录；
(5)结果判断：对比IgG3和IgG1的显色OD值，IgG3/IgG1比值越小，说明机体清除病原体能力越差，IgG3/IgG1比值越大，说明机体清除病原体能力越好，比值升高或者大于1说明即将恢复或已经恢复。
本发明提供的另一种试剂盒为检测核心抗体亚类IgG3和IgG1的化学发光检测试剂盒，其包括包被了乙肝核心抗原的酶标板；酶工作液；酶联反应底物溶液、显色液、清洗缓冲液、标准品。
这种试剂盒的制作方法包括以下步骤：
(1)获得乙肝核心抗原，包被到化学发光酶标板吸附过夜；
(2)用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干；
(3)获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgG1单克隆抗体；
(4)将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；
(5)将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、清洗缓冲液、标准品共同包装，得到试剂盒。其中，
所述包被板的制作过程为：包被乙肝核心抗原，该核心抗原可以是病毒中提取也可以是基因工程重组蛋白，具有生物高活性，经过电泳鉴定，蛋白纯度超过90％。将此抗原用柠檬酸缓冲液体稀释成低浓度进行包被，包被载体为化学发光塑料板，包被时每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得核心抗原包被酶标板，酶标板可选用国产或进口化学发光酶标板，规格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆条板；
所述酶工作液的制备过程为：将酶标记物HRP(辣根过氧化物酶)标记的鼠抗人IgG3单克隆抗体和HRP标记鼠抗人IgG1单克隆抗体，分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；
所述酶标单克隆抗体的制备可以采用下列步骤：
(a)NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml；
(b)单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对多克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜；
(c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化后的HRP酶标鼠抗人IgG1或IgG3单克隆抗体。
所述辅助试剂的配制，方法如下：
(a)底物溶液：1.0ml EDTA(1.0×10-2M)1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)、0.2ml Tween20(1％)；
(b)显色液：luminol 5.0×10-4Mol/L；
(c)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)：PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液；
(d)标准品：包括人核心抗体IgG3和人核心抗体IgG1标准品。
检测方法包括下述步骤：
(1)抗原-抗体反应：在化学发光包被板的微孔中分别加入50μl已稀释好的不同浓度的2个系列标准品，或2孔待测血清样品，进行温育：37℃水浴保温30分钟，重复洗板操作4次
(2)加酶：将配成酶工作液1、酶工作液2分别加入相应孔内；进行温育：37℃水浴保温30分钟，重复洗板操作4次
(3)显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各25μl，37℃水浴保温10分钟；
(4)测量：在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔；
(5)结果计算：
(a)制作标准曲线：以IgG3标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU值为纵坐标，作出标准曲线；以IgG1标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU值为纵坐标，作出标准曲线；
(b)计算待测血清样品浓度：根据待测样品的RLU值从标准曲线计算出待测血清样品的核心抗体IgG3和IgG1浓度
(c)结果判断：对比IgG3和IgG1的含量，IgG3/IgG3比值越小，说明机体清除病原体能力越差，IgG3/IgG3比值越大，说明机体清除病原体能力越好，比值升高或大于1说明即将恢复或已经恢复。
由于本发明通过检测乙肝核心抗体中的IgG3和IgG1亚类的比值，反映出乙肝患者体内TH1/TH2的平衡，从而对乙肝患者机体免疫力水平进行评价和判断，为评价治疗效果、预测预后情况提供了一个重要的依据，这些指标或判断同现有检测技术相配合，有助于做出更为准确的诊断，为乙肝患者的治疗提供帮助。本发明的两种试剂盒采用了本发明提出的方法，使用和操作方便，成本低，使本发明的方法得以实现。
附图说明
图1为大三阳标本的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的数据分布图；
图2为小三阳标本的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的数据分布图；
图3为感染后自动恢复的标本245或25的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的数据分布图。
具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：一种乙型肝炎病毒核心抗原抗体亚类IgG3/IgG1酶联免疫检测试剂盒(96人份)
其组成包括：
核心抗原包被板(96孔)1块；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG3酶标工作液体1瓶，6ml/瓶；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG1酶标工作液体1瓶，6ml/瓶；
底物溶液、显色液各1瓶，各5ml/瓶；
反应终止液1瓶，5ml/瓶；
清洗缓冲液(20X浓缩)1瓶，30ml/瓶。
具体制作如下：
1.制作核心抗原包被板：
包被：酶标板采用Costar公司生产的12×8可拆条板，核心抗原为市购。所获核心抗原用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用该封闭液缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得核心抗原包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭；
2.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人抗IgG3或IgG1抗体：
1)酶的氧化(全过程避光)：
a)称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；
b)称取NaIO4 5mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度；
c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌；
d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟；
e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌；
f)室温静置30分钟；
g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml；
2)单克隆抗体的准备及标记(避光)：
a)调整抗体浓度到5mg/ml左右(蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3与1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质(如Tris)，4℃下透析过夜，其中换液3次；
b)将单克隆抗体与HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5 CB中透析6小时以上，头两个小时换液一次；
c)用新鲜配置的1mg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适；
d)用pH7.2的10mM PBS(预配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜。换液一次即可；
3)纯化HRP酶标鼠抗人IgG3或IgG3单克隆抗体：
a)完成标记的单克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3；
b)4℃静置1小时；
c)8000rpm离心10分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积PBS重新悬浮；
d)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到40％，分别收集上清和沉淀；
e)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到50％，分别收集上清和沉淀；
f)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到60％，分别收集上清和沉淀；
g)收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度；
h)提纯的HRP-单克隆抗体对PBS透析过夜；
i)超滤管离心浓缩纯化的HRP-单克隆抗体，获得克分子比接近1∶8的酶标鼠抗人IgG3或IgG1单克隆抗体；
4)组装：用含10％胎牛血清的缓冲液稀释由步骤3)获得的酶标鼠抗人IgG3或IgG1单克隆抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃。
4.配制底物溶液：磷酸-柠檬酸缓冲液(PH5.0)配制的3％过氧化氢溶液，按5ml/瓶分装；
5.配制显色液：TMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分装；
6.配制反应终止液：2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分装；
7.配制清洗缓冲液(20倍浓缩液)：PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按15ml/瓶分装。
这种试剂盒的质量检测方式为：
1)准确性：15份大三阳慢性肝炎质控血清(包括特异性对照血清)参考品的检测结果，IgG1/IgG3大于1。15份小三阳慢性肝炎质量控制血清中，3份标本的IgG3/IgG1大于1，15份感染后恢复的标本(245阳性)，12份IgG3/IgG1大于1；
2)精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。分别计算核心抗体亚类IgG1/IgG3测定结果，分别求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV＜＜15％。
这种试剂盒的具体使用方式为：
1.清洗缓冲液配制：将试剂盒提供的浓缩清洗缓冲液加蒸馏水20倍稀释；
2.抗原-抗体反应：在试剂盒提供的核心抗原包被板的2个微孔中分别加入同一个待测血清样品；
3.温育：37℃水浴保温30分钟，重复洗板操作5次，每次3分钟；
4.加酶：分别加入鼠抗人IgG3酶工作液和鼠抗人IgG1酶工作液；
5.温育：37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作5次，每次3分钟；
6.显色反应：每孔依次加入底物溶液、TMB显色液各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50ul反应终止液结束反应；
7.比色：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD平均值；记录各孔吸光值；
6.结果判断：
对比IgG3和IgG1的OD值，IgG3/IgG1比值越小，说明机体清除病原体能力越差，IgG3/IgG1比值越大，说明机体清除病原体能力越好，比值升高或大于1说明即将恢复或已经恢复。
实施例2：一种乙肝核心抗体亚类IgG3/IgG1化学发光定量检测试剂(96人份)
其组成包括：
核心抗原IgG3标准品1瓶；
核心抗原IgG1标准品1瓶；
核心抗原包被板(96孔)1块；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG3单克隆抗体1瓶，6ml/瓶；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG3单克隆抗体1瓶，6ml/瓶；
底物溶液、显色液各1瓶，各5ml/瓶；
清洗缓冲液(20X浓缩)1瓶，30ml/瓶。
具体制作方法如下：
1.制作核心抗原包被板：
1)酶标板采用Costar公司生产的12×8可拆条板，核心抗原为基因工程重组或病毒提取，市购；
2)所获核心抗原用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用该封闭液缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得核心抗原包被酶标板，按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭；
2.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人抗IgG3或IgG1抗体：
1)酶的氧化(全过程避光)：
a)称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；
b)称取NaIO4 5mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度；
c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌；
d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟；
e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌；
f)室温静置30分钟；
g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml；
2)组装：
用含10％胎牛血清的缓冲液稀释由步骤3)获得的鼠抗人抗IgG3或IgG1抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃；
3)底物溶液：1.0ml EDTA(1.0×10-2M)1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4mlHCl(1.0×10-2M)、0.2ml Tween20(1％)，按5ml/瓶分装；
4)配制显色液：显色液：1uminol 5.0×10-4Mol/L，按5ml/瓶分装；
5)配制清洗缓冲液(20倍浓缩液)：PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按15ml/瓶分装。
这种试剂盒的质量检测方式为：
1)准确性：15份大三阳慢性肝炎质控血清(包括特异性对照血清)参考品的检测结果，IgG1含量/IgG3含量大于1。15份小三阳慢性肝炎质量控制血清中，3份标本的IgG3含量/IgG1含量大于1，15份感染后恢复的标本(245阳性)，12份IgG3/IgG1大于1；
2)精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。分别计算核心抗体亚类IgG1/IgG3测定结果，分别求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV＜＜15％；
3)线性范围：用核心抗体亚类IgG1或IgG3纯品稀释成一系列不同浓度的纯品溶液：300ng、100ng、25ng、10ng、5ng、1ng。按照说明书操作步骤进行测定。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线。线性范围内最高检测上限值为300ng/ml，最低检测下限值为1ng/ml。试剂盒的线性范围为1-300ng/ml；
4)检测灵敏度：根据上述线性范围测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为1ng/ml。
这种试剂盒的具体使用方式为：
1.清洗缓冲液配制：将试剂盒提供的浓缩清洗缓冲液加蒸馏水20倍稀释；
2.将试剂盒提供的IgG3和IgG1标准品作为标本平行检测，标准品各点浓度分别为300ng、100ng、25ng、10ng、5ng、1ng；
3.抗原-抗体反应：在试剂盒提供的核心包被板的微孔中分别加入50μl已稀释好的2个系列的不同浓度的标准品，或在平行的2孔中加入同一个待测血清样品，37℃水浴保温30分钟。然后用清洗缓冲液重复洗板4次，每次3分钟；
4.酶联反应：分别加入相应的鼠抗人IgG3或IgG1单克隆抗体酶工作液，溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次，每次3分钟；
5.显色反应：每孔依次加入底物溶液、显色液各25μl；
6.读值：在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔；
7.结果计算：
a)制作标准曲线：以IgG3标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU值为纵坐标，作出标准曲线；以IgG1标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU值为纵坐标，作出标准曲线；
b)计算待测血清样品浓度：根据待测样品的RLU值从标准曲线计算出待测血清样品的核心抗体IgG3和IgG1浓度；
c)结果判定：
对比IgG3和IgG1的含量，IgG3/IgG3比值越小，说明机体清除病原体能力越差，IgG3/IgG3比值越大，说明机体清除病原体能力越好，比值大于1说明即将恢复或已经恢复。
为对本发明进行检验，申请人采用本发明的两种试剂盒，对不同状况下的乙肝患者、过往感染者以及健康人群进行了IgG3/IgG1指标和其他现有检验指标的对比检验和分析，证明本发明的方法以及本发明的两种试剂盒的可靠性和有效性。采用本发明的方法和本发明的试剂盒，可以有效地检测出乙肝核心抗原抗体亚类IgG3/IgG1比值，用于评价乙肝病毒感染者的免疫力水平，其检测结果同乙肝五项指标、ALT的检测结果对照，对判断HBV病毒在体内的发展和治疗情况的预后有重要的指导意义。
实验1：采用实施例1的酶联免疫检测试剂盒对不同乙型肝炎患者和过往感染恢复样品的检测
为判断本发明乙肝核心抗体亚类IgG3/IgG1酶联免疫检测试剂盒的检测情况，本发明取地坛医院病毒研究室血清总共280份研究数据：100份已知HBV-大三阳慢性肝炎标本，100份经过抗病毒治疗后转阴性既小三阳标本，80份过往感染乙肝病毒已经恢复的血清标本(245阳性)。分别检测每个标本的IgG3/IgG1的OD值，结果见表1。
表1.不同肝炎人群的IgG3/IgG1比较
| 血清来源 | 例数 | 检测情况IgG3/IgG1 | |
| ≤1 | ＞1 | ||
| 大三阳慢性乙型肝炎患者小三阳慢性乙型肝炎患者245阳性 | 10010080 | 97％78％10％ | 3％22％90％ |
本实验结果表明，本发明对于与病程转归正性相关，小三阳中有22％免疫能力接近于达到清除病原体的能力。在恢复期标本中，体现了抗体亚类较为均衡，也体现了TH1/TH2的转化情况。
实验2：采用实施例2的化学发光定量检测试剂盒对不同乙型肝炎患者和过往感染恢复样品的检测
检测来源于浙江湖州医院的拉米夫定治疗系列血清5例，观察这些标本在经过治疗的过程中既从大三阳性到小三阳的转化过程中，核心抗体亚类IgG3/IgG1的情况。检测结果与乙肝五项指标、ALT的检测结果对照，对判断HBV病毒在体内的发展和治疗情况的预后有重要的指导意义。结果分别见表2(基于保护患者个人隐私的考虑，删除了表中的患者姓名)。
表2.乙肝患者IgG3/IgG1以及其他检测指标对照表
| 编号 | 姓名 | 用药时间 | 采血日期 | 检测时间点 | DNA定量 | HBV M | ALT(U/L) | 核心抗体IgG3/IgG1 |
| 2 | 基线 | 2001.1.11 | 0 | 7.66×108 | 135 | 83 | 0.1 | |
| 2 | 3个月 | 2001.4.23 | 1 | ＜103 | 135 | 217 | 0.1 | |
| 2 | 6个月 | 2001.7.27 | 2 | ＜103 | 15 | 65 | 0.5 | |
| 2 | 9个月 | 2001.11.1 | 3 | ＜103 | 15 | 99 | 0.7 | |
| 2 | 12个月 | 2002.1.15 | 4 | ＜103 | 15 | 167 | 0.6 | |
| 3 | 基线 | 2001.2.1 | 0 | 3.56×108 | 135 | 482 | 0.2 | |
| 3 | 3个月 | 2001.5.10 | 1 | ＜103 | 135 | 217 | 0.2 | |
| 3 | 6个月 | 2001.8.16 | 2 | ＜103 | 15 | 74 | 0.7 | |
| 3 | 9个月 | 2001.11.15 | 3 | 1.04×103 | 145 | 35 | 1.3 | |
| 3 | 12个月 | 2002.2.7 | 4 | ＜103 | 145 | 30 | 3.5 | |
| 5 | 基线 | 2001.2.1 | 0 | 4.71×106 | 135 | 120 | 0.1 | |
| 5 | 3个月 | 2001.5.21 | 1 | ＜103 | 15 | 147 | 0.2 | |
| 5 | 6个月 | 2001.8.23 | 2 | ＜103 | 15 | 87 | 0.8 | |
| 5 | 9个月 | 2001.11.26 | 3 | ＜103 | 15 | 109 | 1.7 | |
| 5 | 12个月 | 2002.2.26 | 4 | ＜103 | 15 | 82 | 1.6 | |
| 8 | 基线 | 2001.2.15 | 0 | 5.26×107 | 135 | 128 | 0.3 | |
| 8 | 3个月 | 2001.5.23 | 1 | 1.37×106 | 135 | 74 | 0.4 | |
| 8 | 6个月 | 2001.8.24 | 2 | ＜103 | 15 | 80 | 1.2 | |
| 8 | 9个月 | 2001.11.22 | 3 | ＜103 | 145 | 75 | 1.1 | |
| 8 | 12个月 | 2002.2.25 | 4 | ＜103 | 145 | 36 | 1.4 | |
| 9 | 基线 | 2001.2.6 | 0 | 3.11×107 | 135 | 161 | 0.3 | |
| 9 | 3个月 | 2001.5.10 | 1 | ＜103 | 15 | 49 | 0.9 | |
| 9 | 6个月 | 2001.8.10 | 2 | ＜103 | 145 | 42 | 1.5 | |
| 9 | 9个月 | 2001.11.12 | 3 | ＜103 | 145 | 23 | 4.7 | |
| 9 | 12个月 | 2002.2.11 | 4 | ＜103 | 145 | 19 | 5.6 | |
| 10 | 基线 | 2001.3.23 | 0 | 4.86×106 | 135 | 259 | 0.1 | |
| 10 | 3个月 | 2001.5.24 | 1 | ＜103 | 135 | 0.5 | ||
| 10 | 6个月 | 2001.8.23 | 2 | ＜103 | 135 | 136 | 0.1 | |
| 10 | 9个月 | 2001.11.23 | 3 | ＜103 | 145 | 116 | 1.1 | |
| 10 | 12个月 | 2002.2.21 | 4 | ＜103 | 145 | 73 | 4.6 | |
| 15 | 基线 | 2001.2.22 | 0 | 6.37×106 | 135 | 182 | 0.1 | |
| 15 | 3个月 | 2001.5.29 | 1 | ＜103 | 5 | 12 | 1.1 | |
| 15 | 6个月 | 2001.8.31 | 2 | ＜103 | 5 | 12 | 2.5 | |
| 15 | 9个月 | 2001.12.17 | 3 | ＜103 | 145 | 11 | 2.8 | |
| 15 | 12个月 | 2002.3.17 | 4 | ＜103 | 145 | 14 | 5.2 | |
| 19 | 基线 | 2001.2.9 | 0 | 4.41×107 | 135 | 99 | 0.3 |
| 19 | 3个月 | 2001.5.2 | 1 | ＜103 | 15 | 83 | 0.1 | |
| 19 | 6个月 | 2001.8.9 | 2 | ＜103 | 15 | 54 | 2.5 | |
| 19 | 9个月 | 2001.11.14 | 3 | ＜103 | 15 | 38 | 4.7 | |
| 19 | 12个月 | 2002.2.25 | 4 | ＜103 | 15 | 22 | 8.6 | |
| 23 | 基线 | 2001.2.28 | 0 | 9.83×108 | 135 | 124 | 0.2 | |
| 23 | 3个月 | 2001.6.6 | 1 | 9.81×104 | 15 | 11 | 1.1 | |
| 23 | 6个月 | 2001.9.7 | 2 | ＜103 | 15 | 24 | 2.5 | |
| 23 | 9个月 | 2001.12.11 | 3 | ＜103 | 15 | 15 | 4.1 | |
| 23 | 12个月 | 2002.3.15 | 4 | ＜103 | 15 | 10 | 7.1 | |
| 25 | 基线 | 2001.2.28 | 0 | 5.59×108 | 135 | 281 | 1.1 | |
| 25 | 3个月 | 2001.6.4 | 1 | ＜103 | 135 | 83 | 0.5 | |
| 25 | 6个月 | 2001.9.4 | 2 | ＜103 | 15 | 34 | 1.5 | |
| 25 | 9个月 | 2001.12.14 | 3 | ＜103 | 15 | 24 | 2.7 | |
| 25 | 12个月 | 2002.3.16 | 4 | ＜103 | 15 | 18 | 4.6 | |
| 26 | 基线 | 2000.12.26 | 0 | 6.72×108 | 135 | 880 | 0.2 | |
| 26 | 3个月 | 2001.3.27 | 1 | ＜103 | 15 | 20 | 0.8 | |
| 26 | 6个月 | 2001.6.29 | 2 | ＜103 | 15 | 28 | 1.5 | |
| 26 | 9个月 | 2001.10.3 | 3 | ＜103 | 15 | 24 | 4.2 | |
| 26 | 12个月 | 2002.1.3 | 4 | ＜103 | 15 | 12 | 7.6 | |
| 1 | 基线 | 2001.1.11 | 0 | 8.37×108 | 135 | 204 | 0 | |
| 1 | 3个月 | 2001.4.19 | 1 | 6.82×107 | 135 | 62 | 0.1 | |
| 1 | 6个月 | 2001.7.19 | 2 | 6.93×105 | 135 | 182 | 0.15 | |
| 1 | 9个月 | 2001.10.18 | 3 | 6.20×105 | 135 | 98 | 0.2 | |
| 1 | 12个月 | 2002.1.17 | 4 | 1.57×105 | 135 | 137 | 0.6 | |
| 4 | 基线 | 2001.1.31 | 0 | 8.76×107 | 135 | 61 | 0.1 | |
| 4 | 3个月 | 2001.5.17 | 1 | 1.55×107 | 135 | 46 | 0 | |
| 4 | 6个月 | 2001.8.16 | 2 | 1.08×106 | 135 | 68 | 0.1 | |
| 4 | 9个月 | 2001.11.14 | 3 | 1.18×105 | 135 | 54 | 0.12 | |
| 4 | 12个月 | 2002.2.12 | 4 | 4.20×105 | 135 | 44 | 0.2 | |
| 6 | 基线 | 2001.3.23 | 0 | 5.21×107 | 135 | 50 | 0.2 | |
| 6 | 3个月 | 2001.6.1 | 1 | 2.33×106 | 135 | 33 | 0 | |
| 6 | 6个月 | 2001.9.7 | 2 | 1.03×106 | 135 | 39 | 0.15 | |
| 6 | 9个月 | 2001.11.26 | 3 | 5.78×105 | 135 | 73 | 0.1 | |
| 6 | 12个月 | 2002.2.27 | 4 | 2.64×106 | 135 | 39 | 0.16 |
结果显示，本发明乙肝核心抗体亚类IgG3/IgG1试剂在对治疗有效预后的检测与病情预后相同，对治疗无效预后的检测也与病情预后相同。
实验3：本发明乙肝核心抗体亚类IgG3/IgG1酶免试剂在检测肝炎、正常人TH1和TH2相关指标关联分析
实验背景：对照组为中心血站献血人员20例，未携带病毒，并且单独表面抗体阳性。慢性肝炎65例，来源于地坛医院住院病人，ALT均高于正常值。乙肝感染后恢复血清，其标志是乙肝二对半中245阳性。TH1和TH2细胞因子检测采用商品化试剂盒。结果见表3。
表3.对比实验结果
| 对照正常人慢性肝炎组乙肝感染恢复后血清 | TH1类细胞因子 | TH2类细胞因子 | IgG3/IgG1ELISA OD值 | ||
| IL-2308.44±67.18122.55±35.01385.27±65.75 | IFN-γ1211.28±207.1842.15±144.222460.27±116.13 | IL-4189.1±38.34281.21±39.38211.487±36.27 | IL-10243.6±31.22336.01±31.28251.06±35.11 | 平均比值IgG3检测不出，比值相当于00.35±0.321.75±1.11 | |
分析：以上结果非常明显的看出，慢性肝炎患者体内TH1和TH2失衡，TH2占优势，这个时候IgG3/IgG1的比率远小于1，而在乙肝感染恢复后患者血清内的TH1增长，与TH2相比较，处于平衡或占有优势，体现在血清中IgG3/IgG1的比率大于1。
根据上述实验，得出本发明乙肝核心抗体亚类IgG1、IgG3、IgG2、IgG4、酶免试剂在检测乙型肝炎大三阳、小三阳、感染恢复后血清的对比图，即附图1-3。从这些图中，也可以得出这样的结论：HBcAb的IgG3与IgG1的比例均衡是对病毒治疗有效所具有的免疫力的一个重要特征。
可以理解的是，对于相同患者，采用不同的检测手段，得到的HBcAb的IgG3与IgG1数值可能是不同的，两者的比值也可能是不同。因此在不同的检测手段下，相同的IgG3/IgG1数值可以代表乙肝患者不同的机体免疫力水平状况，因此需要对不同检测手段下IgG3、IgG1和IgG3/IgG1数据同患者状况之间在统计学意义下的对应关系进行分析，或者对各种检测手段下这些数据的变化进行对比，以揭示不同检测手段下具体的IgG3/IgG1数据同患者免疫水平和预后状况的关系，确定在不同检测手段下判断预后良好和预后不良的IgG3/IgG1数据范围。同时，也应该理解到，任何一种检测指标都具有其局限性，应根据实际情况进行多指标的综合判断。
Claims (10)
1、一种评价乙肝患者机体免疫力水平的方法，包括下列步骤：(1)检测乙肝病毒核心抗体亚类IgG3和IgG1；(2)计算IgG3和IgG1的比值；(3)根据IgG3和IgG1的比值评估乙肝患者机体清除病原体的能力，预测乙肝治疗效果和预后。
2、如权利要求1所述的评价乙肝患者机体免疫力水平的方法，其特征在于核心抗体亚类IgG3和IgG1的检测方法为下列方法中的一种或几种：酶联免疫吸附实验方法、化学发光检测方法、时间分辨方法、流式细胞仪。
3、一种检测核心抗体亚类IgG3和IgG1的酶联免疫试剂盒，包括下列组件：
(1)包被了乙肝核心抗原的酶标板；
(2)酶工作液；
(3)酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液
4、如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；显色液为四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；反应终止液为2mol/L硫酸；清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)为PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
5、如权利要求3所述的试剂盒的制作方法，包括以下步骤：
(1)获得乙肝核心抗原，包被到酶标板吸附过夜；
(2)用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干；
(3)获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgG1单克隆抗体；
(4)将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；
(5)将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液共同包装，得到试剂盒。
6、如权利要求5所述的试剂盒的制作方法，其特征在于所述酶标单克隆抗体的制备采用下列步骤：
(a)NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml；
(b)单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜；
(c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标鼠抗人IgG1或IgG3单克隆抗体。
7、一种检测核心抗体亚类IgG3和IgG1的化学发光检测试剂盒，包括下列组件：
(1)包被了乙肝核心抗原的化学发光酶标板；
(2)酶工作液；
(3)酶联反应底物溶液、显色液、清洗缓冲液、标准品。
8、如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的底物溶液为1.0mlEDTA(1.0×10-2M)、1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)、0.2ml吐温20(1％)；显色液为1uminol(5.0×10-4Mol/L)；清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)为PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液；标准品包括人核心抗体IgG3和人核心抗体IgG1标准品。
9、如权利要求8所述的试剂盒的制作方法，包括以下步骤：
(1)获得乙肝核心抗原，包被到化学发光酶标板吸附过夜；
(2)用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干；
(3)获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgG1单克隆抗体；
(4)将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；
(5)将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、清洗缓冲液、标准品共同包装，得到试剂盒。
10、如权利要求9所述的试剂盒的制作方法，其特征在于所述酶标单克隆抗体的制备采用下列步骤：
(a)NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml；
(b)单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对多克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜；
(c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标鼠抗人IgG1或IgG3单克隆抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610087496A CN100580453C (zh) | 2006-06-12 | 2006-06-12 | 评价乙肝患者机体免疫力水平的检测试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610087496A CN100580453C (zh) | 2006-06-12 | 2006-06-12 | 评价乙肝患者机体免疫力水平的检测试剂盒及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1869697A true CN1869697A (zh) | 2006-11-29 |
| CN100580453C CN100580453C (zh) | 2010-01-13 |
Family
ID=37443415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200610087496A Active CN100580453C (zh) | 2006-06-12 | 2006-06-12 | 评价乙肝患者机体免疫力水平的检测试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100580453C (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114441610A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-06 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种检测胰岛素抗体各亚型的电化学发光法检测试剂盒 |
-
2006
- 2006-06-12 CN CN200610087496A patent/CN100580453C/zh active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114441610A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-06 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种检测胰岛素抗体各亚型的电化学发光法检测试剂盒 |
| CN114441610B (zh) * | 2021-12-31 | 2023-02-24 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种检测胰岛素抗体各亚型的电化学发光法检测试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN100580453C (zh) | 2010-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3482201B1 (en) | Early diagnosis of infections | |
| CN1811447A (zh) | 核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途 | |
| CN111704666B (zh) | 新型冠状病毒n蛋白的配对单克隆抗体及其应用 | |
| CN109374903A (zh) | 一种超灵敏il-6荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法 | |
| CN1227532C (zh) | 高灵敏度的免疫检测方法 | |
| CN1738908A (zh) | 使用生物标记谱诊断脓毒或者sirs | |
| CN104823052A (zh) | 用于诊断和/或监测结核病的生物标记 | |
| Lim et al. | Current laboratory diagnosis of coronavirus disease 2019 | |
| CN1547027A (zh) | 用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法 | |
| CN1871518A (zh) | 丙型肝炎病毒的检测方法 | |
| CN1532286A (zh) | 检测或确定hcv核心抗原的方法及其中应用的用于检测或确定的试剂 | |
| CN1732261A (zh) | 用于诊断肝脏疾病的标志蛋白质以及使用该蛋白质诊断肝脏疾病的方法 | |
| CN1810838A (zh) | 一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白及其制备方法 | |
| Speranza et al. | SARS-CoV-2 infection dynamics in lungs of African green monkeys | |
| CN1766618A (zh) | 检测青霉素g的酶联免疫试剂盒及其方法 | |
| CN1861633A (zh) | 一种基于重组抗原的弓形虫检测试剂盒 | |
| CN1880956A (zh) | 免疫结合直接法或免疫沉淀分离法测定脂蛋白残粒中胆固醇浓度 | |
| CN1773282A (zh) | 用于免役介导1型糖尿病诊断的自身抗体检测方法 | |
| CN1839319A (zh) | 用于诊断视网膜血管病的包含醛缩酶的组合物以及应用它诊断的方法 | |
| CN1869697A (zh) | 评价乙肝患者机体免疫力水平的方法、应用于该方法的检测试剂盒及其制备方法 | |
| KR20180104038A (ko) | 활동성 결핵의 진단을 위한 방법 및 키트 | |
| CN1313564C (zh) | 一种经过表面修饰活化的上转换发光材料 | |
| CN1928562A (zh) | 一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒 | |
| CN109085343A (zh) | 一种测定抗Jo-1抗体的试剂盒及检测方法 | |
| CN1700010A (zh) | 乙型肝炎病毒大蛋白前s区抗原检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 102600 Daxing District, Zhongguancun science and Technology Park Daxing biomedical industry base, Fu Street, No. 9, building 9, No. Patentee after: Beijing hot King biotechnology Limited by Share Ltd Address before: 100070 life science incubation center, room 8, Zhongguancun Fengtai Park, Beijing, Fengtai District Science City, 420 Patentee before: Beijing Hotgen Biotechnology Co., Ltd. |