CN1867577A

CN1867577A - 雌三烯衍生物

Info

Publication number: CN1867577A
Application number: CNA2004800201772A
Authority: CN
Inventors: 阿拉斯泰尔·乔治·斯图尔特; 戴维·詹姆斯·麦卡利斯特; 约翰·尼古拉斯·兰伯特
Original assignee: CRYPTOPHARMA Pty Ltd
Current assignee: CRYPTOPHARMA Pty Ltd
Priority date: 2003-05-13
Filing date: 2004-05-13
Publication date: 2006-11-22
Also published as: EP1625143A4; EP1625143A1; US20070275935A1; CA2525651A1; AU2004238395A1; JP2006528207A; WO2004101595A1

Abstract

本发明涉及用于调节间充质细胞功能例如平滑肌和成纤维细胞增殖或细胞因子表达和用于治疗与间充质细胞功能相关的病症例如与哮喘相关的气道高反应性的化合物和方法。该化合物还抑制炎症。该化合物是一类雌三烯衍生物，包括包含基团A的2－甲氧基雌二醇的多种衍生物，所述衍生物在2－、6－和17－位包含取代的芳族取代基。

Description

雌三烯衍生物

相关申请

本申请要求US 60/470,397的优先权，该申请的全部内容引入本文作为参考。

发明领域

本申请涉及用于调节间充质细胞功能例如平滑肌和成纤维细胞增殖或细胞因子表达和用于治疗与间充质细胞功能相关的病症例如与哮喘相关的气道高反应性的化合物和方法。本申请的化合物是一类雌三烯衍生物。

发明背景

哮喘是一种以不同程度的气道阻塞、慢性炎症、称为气道壁重塑(AWR)的气道壁结构改变和气道高反应性(AHR)为特征的疾病。AHR通常通过用乙酰甲基胆碱或组胺或其它刺激性刺激物如冷空气或缓激肽人工诱导气道阻塞来测定。AHR的特征是对气道刺激物诱导的阻塞的浓度-反应曲线的左移和对这些非特异性刺激物反应的平台期的消失。

气道阻塞，例如在哮喘或慢性阻塞性肺病中发生的气道阻塞可以本身自发地或者因活性剂治疗而消退。目前用于治疗哮喘的三大类活性剂是预防药(抗炎药)、缓解药和症状控制剂。所有这些药物的目标是减少气道阻塞和/或炎症。预防药通过抗炎作用使气道阻塞的可能性和/或强度减小。缓解药产生平滑肌缩短的快速逆转，从而缓解支气管痉挛性气道阻塞。症状控制剂产生持久的支气管扩张剂反应，其减少达到需要使用缓解药物治疗的水平的气道阻塞的可能性。

这些已知的疗法各自都具有显著的副作用。以上治疗剂的组合在很多，但不是所有的患者中成功地控制哮喘的症状。尽管患有严重哮喘的患者占总哮喘人群的不到10％，但认为他们占有大于70％的哮喘的健康预算成本，并且是最有住院治疗和哮喘致死风险的一组人。因此，明显需要新的治疗剂用于控制和预防这种疾病的症状。

现有的这三类活性剂并不特异性地针对气道壁重塑(AWR)的原因；不过，已确定AWR为一种可能的治疗哮喘的新目标。有大量的证据支持气道壁重塑是AHR形成的主要因素这一假说。认为被平滑肌、成纤维细胞和细胞外基质占据的气道体积的增加促进AWR中气道壁的增厚。该体积增加的至少一个原因是气道平滑肌细胞的过度增殖。这种增厚的后果是对于给定量的平滑肌收缩而言增加的气道变窄。此外，AWR降低气道平滑肌细胞的负荷，使得对于该收缩性器官的给定程度的激活而言有更大量的平滑肌细胞缩短。因此AWR中的结构变化能够解释AHR的非特异性。由此可见，能够防止或逆转该重塑的抗哮喘活性剂具有降低AHR，从而降低作为平滑肌收缩的结果发生的气道阻塞水平的潜能。

本申请的一个目的是提供能够调节平滑肌细胞或成纤维细胞的功能，从而提供用于治疗与平滑肌细胞或成纤维细胞功能相关的病症例如哮喘的潜在活性剂的活性剂和方法。

发明内容

本申请涉及新的雌三烯衍生物以及它们的合成方法和应用。该新的雌三烯衍生物可以用于调节平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能，例如细胞增殖、细胞外基质沉积、细胞因子表达和收缩性，并可以用于涉及平滑肌细胞和/或成纤维细胞的病症。这些化合物在调节平滑肌细胞和/或成纤维细胞的增殖和细胞因子表达方面表现出令人惊奇的选择性。

本发明的一个实施方案提供式I的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R¹和R⁴各自选自H、R^a、-R^cR^d、-CN、-NO₂、-卤素、OH、-OR^a、-OC(O)R^a；

R²选自-OR^b、-(R^c)_n-AR^b、-H、-R^e、-R^cR^e、-CH＝NOH、-CH＝NOR^b、-CH＝NNR^b ₂、-OH、-SR^b、-R^b、-CN、-R^cR^d和-卤素，其中n为0或1；

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

Z′为A或＞CH₂、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-OR^b、＞C(R^b)-OH、＞C(R^b)-CN；＞C(R^b)-NR^b ₂、＞CR^b ₂、＞C＝N-NH₂、＞C＝N-NR^b ₂、-O-、＞N-R^b、＞C(R^b)-R^c-OR^b、＞CR^bR^e、＞CR^b-NR^bR^e、＞C＝N-酯-R^a；

Z″为A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-OR^b、＞C(R^b)-OR^b、＞C(R^b)-R^c-OR^b、＞C(H)-NR^b ₂、＞C(H)-卤素、＞CR^b ₂、＞C＝N-酯-R^a；

A为＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-R^c-X、＞C＝N-NH-R^c-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；

X为被一个或多个取代基Y取代的芳族基，其中Y选自-H、-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d；

R^a为直链、支链或环状烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；

R^b为H或直链、支链或环状烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^d代表一个或多个选自以下的取代基：-OH、-NH₂、-卤素、-CF₃、-CN、-COOR^a、-SR^b；

R^e为酰基；

n为0或1；

条件是该化合物包含至少一个基团A，且当R¹和R⁴为H，R²为OR^a，R³为OH，R⁶为-H，而Z″为OH或NH₂时，则在Z′位的A不为＞C＝N-NH-SO₂-X。

根据一个实施方案，至少Z′和Z″之一为A。换句话说，根据此实施方案，A在6和17位之一或二者。

根据另一个实施方案，虽然“取代基”Y组中包括H，但当芳族基为苯基时，则可能的取代基Y组中适宜地不包括H。

在一个实施方案中，所公开的化合物具有调节成纤维细胞和/或平滑肌细胞功能的活性。该化合物可以通过抑制增殖来调节细胞功能。在其它实施方案中，该化合物可以通过影响细胞的细胞外基质沉积、细胞迁移、细胞因子表达或细胞收缩性中的一种或多种来调节细胞功能。

在一个实施方案中，该化合物能够抑制气道高反应性，例如在哮喘中表现出的气道高反应性。

在另一个实施方案中，该化合物抑制纤维变性，例如肺纤维变性或肺炎症。

根据一个实施方案，该化合物具有调节间充质细胞功能的特异性活性。

本说明书还提供一种合成如以上定义的式I的化合物的方法，所述方法包括使式II、III或IV的酮或醛前体与其中X如式I中所定义的式H₂N-O-X、H₂N-O-R^c-X、H₂N-NH-R^c-X、H₂N-NH-X或H₂N-酯-X的胺反应以形成式I的化合物的步骤：

其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R^b、R^c、n、Z′和Z″如式I中所定义。

本申请还提供一种包含以上定义的式I的化合物和药学可接受的载体的药物组合物。

本申请还提供以上定义的式I的化合物作为用于调节平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能的活性剂的应用。在一个实施方案中，该应用是作为抗增殖或抗炎活性剂。本申请还提供式I的化合物作为气道高反应性抑制剂或抗哮喘活性剂的应用。

在另一个实施方案中，该化合物用作抑制纤维变性，例如肺纤维变性的活性剂。在另一个实施方案中，式I的化合物用作抑制肺炎症的活性剂。

在一个实施方案中，该化合物用作具有调节间充质细胞功能的特异性活性的活性剂。本申请提供一种用于治疗与平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能相关的病症的方法，所述方法包括给予需要其的个体治疗有效量的式I的化合物。在某些特定的实施方案中，该症状与气道平滑肌细胞或肺成纤维细胞功能有关。该细胞功能可以选自细胞增殖、细胞的细胞因子表达、细胞的细胞外基质沉积、细胞迁移或细胞收缩性。

本申请还提供式I的化合物在治疗气道高反应性中的应用。在一个优选的实施方案中，该化合物用于治疗哮喘。

本申请还提供式I的化合物在抑制纤维变性如肺纤维变性中的应用。

本申请还提供式I的化合物在抑制肺炎症中的应用。

本申请提供式I的化合物在制备用于治疗与平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能相关的病症的药物中的应用。

本领域技术人员应理解，本申请中确定的活性剂的活性包括但不限于抑制平滑肌增殖、迁移和细胞因子合成以及抑制成纤维细胞增殖和抑制炎症。根据这些活性，预期这些活性剂在过敏性和炎性疾病例如类风湿性关节炎、过敏性皮炎、过敏性鼻炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、成人呼吸窘迫综合征、慢性感染和脓毒病的治疗中具有活性。成纤维细胞增殖的减少还表明预期该活性剂在纤维变性性疾病包括不同类型的肺纤维变性、瘢痕和内脏粘连/纤维化(fibroid)的治疗中具有活性。

优选的式I的化合物是应用以下之一或多项的化合物：

i.Y优选为选自如下的钝化基团：-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑和咪唑，更优选选自-NO₂、-CN、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑或咪唑；

ii.X优选为苯基、萘基或吡啶基，最优选为苯基；

iii.X优选包括1个或2个取代基Y，更优选1个，最优选为当X为苯基时，单一取代基Y在4-位；

iv.A中的基团R^c如果存在的话，优选为亚烷基，更优选为C₁-C₆亚烷基，最优选为-CH₂-或-CH₂CH₂-；

v.A优选为＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-R^c-X或＞C＝N-NH-R^c-X，更优选为＞C＝N-O-X或＞C＝N-O-R^c-X；

vi.当Z″为A时，Z′优选为＞CH₂、＞C＝O、＞C＝N-OH或＞C＝N-OR^b；

vii.当Z′为A时，Z″优选为＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH或＞C＝N-OR^b，更优选为＞C＝O、＞C(H)OH或＞C＝N-OH；

viii.R²优选为-OR^b、-AR^b、-R^e、-R^cR^e、-CH＝NOH、-CH＝NOR^b、-CH＝NNR^b ₂、-OH、-SR^b、-R^b或-CN，更优选为-OR^b，最优选为-OMe；

ix.R³优选为-OH、-OR^a或-R^cOR^b，最优选为-OH；

x.R¹和R⁴优选为H；和

xi.R⁶优选为H。

以上优选特征的组各自可以彼此组合。特别优选某些组合，例如组iv和组i和/或组iii。

本申请还包括以下化合物：

式(V)的化合物：

其中

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、Z″和X如关于式I所定义，且

R^f为直接键或亚烷基；

式(VI)的化合物：

其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、Z′和X如关于式I所定义，且R^e为直接键或亚烷基；

式(VII)的化合物：

其中

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和Z″如式I中所定义；

R^f为直接键或亚烷基，且

X¹选自被一个或多个取代基Y¹取代的芳基和被一个或多个取代基Y取代的杂芳基，其中Y¹u选自-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d，其中Y选自-H、-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d；

式(VIII)的化合物：

其中

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和Z′如式I中所定义；

R^f为直接键或亚烷基，且

X¹选自被一个或多个取代基Y¹取代的芳基和被一个或多个取代基Y取代的杂芳基，其中Y¹选自-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d，其中Y选自-H、-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d；

式(IX)的化合物：

其中

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶如式I中所定义，

R^f为直接键或亚烷基，

X¹选自被一个或多个取代基Y¹取代的芳基和被一个或多个取代基Y取代的杂芳基，其中Y¹选自-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d，其中Y 选自-H、-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素-、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^cCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d；且

Z为＞C＝O、＞C(H)OH或＞C＝N-OH；

式(X)的化合物：

其中

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶如式I中所定义，

R^f为直接键或亚烷基，

X¹选自被一个或多个取代基Y¹取代的芳基和被一个或多个取代基Y取代的杂芳基，其中Y¹选自-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d，其中Y选自-H、-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d；且

Z^IV为＞CH₂、＞C＝O或＞C＝N-OH；

式(XI)的化合物：

其中：

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、Z′、Z″、R^b和X如式I中所定义，且

R^f为直接键或亚烷基。

本申请的申请人发现以上定义的包含取代基A的雌三烯衍生物具有调节平滑肌和/或成纤维细胞功能，特别是细胞增殖、细胞的细胞外基质沉积、细胞迁移和细胞因子表达。因此，本申请广义地包括所有包含以上定义的取代基A的雌二醇衍生物，条件是该化合物不是2-乙氧基-6-甲苯磺酰腙-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇。

附图简述

图1比较2-甲氧基雌二醇(2MEO)和两种化合物4NO(CP-DM-2-11-7)和4NOM(CP-DM-3-91)抑制培养的人气道平滑肌细胞的凝血酶介导的细胞分裂的效力和效能。

图2比较2MEO、4NO(CP-DM-2-11-7)和4NOM(CP-DM-3-91)抑制II型气道上皮细胞系A549对5％胎牛血清反应的增殖的效力和效能。

图3比较2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制表达雌激素受体的乳房肿瘤细胞系MCF7对5％胎牛血清或300pM表皮生长因子反应的增殖的效力和效能。

图4比较2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制培养的牛主动脉内皮细胞对5％胎牛血清反应的增殖的效力和效能。

图5比较4NO(CP-DM-2-11-7)和地塞米松抑制组织培养塑料上培养的碱性成纤维细胞生长因子介导的人气道平滑肌细胞的增殖的效力和效能。

图6比较4NO(CP-DM-2-11-7)和地塞米松抑制涂布胶原的硅橡胶上培养的碱性成纤维细胞生长因子介导的人气道平滑肌细胞的增殖的效力和效能。

图7比较2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制来自培养的人气道平滑肌细胞的白细胞介素-1介导的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的释放的效力和效能。

图8比较腹膜内给予的2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制卵清蛋白致敏的小鼠对支气管收缩剂乙酰甲基胆碱的静脉内激发的气道高反应性的效力和效能。

图9比较口服2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制卵清蛋白致敏的小鼠对静脉内支气管收缩剂乙酰甲基胆碱激发的气道高反应性的效力和效能。

图10比较4NO(CP-DM-2-11-7)和4NOM(″4NO-menox″)(CP-DM-3-91)抑制肺成纤维细胞对碱性成纤维细胞生长因子刺激反应的增殖的效力和效能。

图11显示与4NOM(CP-DM-3-91)一起预培养对人气道平滑肌细胞的凝血酶介导的细胞周期蛋白D1蛋白表达的影响。

图12比较2MEO或4NO(CP-DM-2-11-7)抑制血小板衍生生长因子(BB)诱导的人气道平滑肌细胞迁移的效力。

具体实施方式

为说明本申请的目的，应清楚地理解词语“包含(comprising)”意指“包括但不限于”，而词语“包含(comprises)”具有相应的含义。

所公开的化合物是一组2-甲氧基雌二醇(2MEO)的衍生物。先前已研究过2MEO和此化合物的其它衍生物以及它们治疗癌症的活性。

单独或者在复合词如“芳烷基”中使用的术语“烷基”指具有1-10个碳原子，优选1-6个碳原子，更优选1-4个碳原子的直链、支链或环状烃基。这些烷基的例子为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

单独或者在复合词中使用的术语“烯基”指2-20个碳原子，优选2-14个碳原子，更优选2-6个碳原子的具有至少一个碳碳双键的直链、支链或者单环或多环基团。烯基的实例包括烯丙基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、异丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、环戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、环己烯基、1-壬烯基、1，3-丁二烯基等。术语“炔基”具有相应的含义。

单独或者在复合词中使用的“酰基”指具有1-20个碳原子，优选1-14个碳原子的氨基甲酰基、脂族酰基、称为芳族酰基的含芳环的酰基或者称为杂环酰基的含杂环的酰基。酰基的实例包括氨基甲酰基；直链或支链烷酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、2-甲基丙酰基、辛酰基；烷氧羰基，例如甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基；环烷基羰基，例如环己基羰基；烷基磺酰基，例如甲基磺酰基或乙基磺酰基；烷氧基磺酰基，例如甲氧基磺酰基或乙氧基磺酰基；芳酰基，例如苯甲酰基、甲苯酰基或萘酰基；芳烷酰基，例如苯烷酰基如苯乙酰基或苯丙酰基，或者萘烷酰基如萘丁酰基；芳烯酰基，例如苯烯酰基如苯丙烯酰基或苯甲基丙烯酰基或萘烯酰基如萘丙烯酰基；芳烷氧羰基，例如苯基烷氧羰基如苄氧羰基；芳氧羰基，例如苯氧羰基；芳氧基烷酰基，例如苯氧基丙酰基；芳基氨基甲酰基，例如苯基氨基甲酰基；芳硫基氨基甲酰基，例如苯硫基氨基甲酰基；芳基乙醛酰基，例如苯基乙醛酰基；芳基磺酰基，例如苯基磺酰基；杂环羰基；杂环烷酰基，例如噻吩乙酰基、噻二唑乙酰基或四唑乙酰基；杂环烯酰基，例如杂环丙烯酰基；或杂环乙醛酰基，例如噻唑乙醛酰基。

单独或者在复合词中使用的术语“杂环基”指含有至少一个选自氮、硫和氧的杂原子的单环或多环杂环基。例示此术语范围内的大量杂环的一些实例如下：吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、四唑基、吡咯烷基、吲哚基、苯并咪唑基、吡喃基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、吗啉基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、噻唑基、噻二唑基、噻唑烷基、苯并噻唑基和苯并噻二唑基。

优选杂环基作为5或6元芳族杂单环基。

单独或者在复合词如“芳烷基”或“芳基酰基”中使用的术语“芳基”指含有一、二或三个环的碳环芳族系统，其中这些环可以以悬挂(pendent)的方式连接在一起或者可以是稠合的。

术语“芳基”包括芳族基，例如苯基、萘基、四氢萘基、茚满和联苯。优选该芳基为苯基。

术语“芳族基”指芳基和芳族杂环基(即杂芳)基团，并包括以上例举的具体杂环。

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。

术语“烷氧基”指直链或支链含氧基团，优选各基团具有1至大约6个碳原子的烷基部分。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。

术语“任选取代的”指可以进一步被一个或多个选自以下的基团取代或可以不被取代的基团：烷基、烯基、炔基、芳基、醛、卤素、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、卤代芳基、羟基、烷氧基、烯氧基、芳氧基、苄氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、卤代芳氧基、硝基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基杂环基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、苄基氨基、二苄基氨基、酰基、烯基酰基、炔基酰基、芳基酰基、酰基氨基、二酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、芳基亚磺酰氧基、杂环基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、巯基、烷硫基、苄硫基、酰硫基、含磷基团等。

术语“酯”最广义地用于本文，指含有至少一个碳、硫或磷与氧成的双键和该碳、硫或磷原子与另一个氧或硫原子成的单键的二价基团。有机酯基团的实例包括磺酰酯(sulfonylate)、磺酸酯、膦酸酯、硫代膦酸酯、羧酸酯和硫醇酯(RCOS)。此外，该酯基团内可以含有其它官能团。这些官能团包括硫代、硫烷基、亚硫酰基、磺酰基、磺酸酯基、氧膦基、膦酰基、磷酰基、氨基或它们的混合物。含有这些官能团的酯的实例包括衍生自硫代膦酸、硫代磷酸、亚硫酰基磷酸、硫酸酯基氨基酸、磺酸酯基次膦酸和氨基磷酸的酯。

与气道平滑肌细胞增殖相关的病症包括哮喘及相关的病症如气道壁重塑和气道高反应性，还包括与哮喘无关但特征是平滑肌细胞增殖的症状，例如慢性阻塞性肺病或导致赘生物、肿瘤或癌症的平滑肌细胞的异常生长。

对气道平滑肌细胞增殖的抑制包括减缓或停止平滑肌细胞分裂周期。在一个实施方案中，对增殖的抑制优选不伴有平滑肌细胞死亡的增加或其它正常平滑肌细胞功能如收缩性的丧失。

术语“选择性”在本文中用于描述化合物影响组织的一种或多种细胞类型的程度大于与该组织有关的其它细胞类型的能力。

例如，对气道平滑肌细胞或成纤维细胞增殖的抑制的选择性意指这些细胞的细胞分裂速率与气道和其它组织有关的其它细胞例如内皮细胞、肺泡细胞、上皮细胞、肥大细胞和乳房肿瘤上皮细胞相比被更大比例地降低。

合成方法

本文公开的在选择的一个或多个位置含有基团A的化合物可以通过使适宜的具有代替A的羧基的雌三烯基前体与适宜的胺在缩合反应中反应来制备。下面我们建立了取代芳基胺(H₂N-O-X、H₂N-O-R^c-X、HN₂-NH-R^c-X、H₂N-NH-X或H₂N-酯-X)合成的标准方法，其后我们将描述使雌三烯前体多样化的多种方法。

取代芳基胺(H₂N-O-X、H₂N-O-R^c-X、H₂N-NH-R^c-X、H₂N-NH-X或H₂N-酯-X)

取代芳基羟胺(例如H₂N-O-X和H₂N-O-R^c-X)可以容易地通过一些方法合成。优选的合成方法为经过芳基取代羟胺的关键的苯二甲酰亚氨基中间体。在此情况下，N-羟基邻苯二甲酰亚胺通过对取代芳基和芳基烷基卤进行亲核攻击起作用。[1]可以使用许多其它离去基团替代该卤化物。然后用肼处理去除邻苯二甲酰亚胺基得到取代芳基羟胺，其经常以盐酸盐的形式被分离。

路线1

得到这些中间体的另一种途径是通过铜介导的取代苯基硼酸与N-羟基邻苯二甲酰亚胺进行偶联。[2]然后再用肼去除邻苯二甲酰亚胺基得到期望的芳氧基胺。

路线2

取代芳基羟胺的另一种合成方法是用去质子化的乙酸基异羟肟酸乙酯对取代氟苯进行亲核攻击，然后用高氯酸水解。[3]

路线3

这些实例用于苯环的情况，但也存在一些用于生产萘基和吡啶基取代羟胺的方法。[4-6]

一旦合成这些取代羟胺，可以将它们容易地用于与基本雌-1，3，5(10)-三烯甾族化合物结构内包含的酮和醛进行缩合反应以形成取代芳基肟。

许多取代芳基肼可商购获得(例如2，4-二硝基苯肼)。许多取代芳基磺酰基肼(H₂N-NH-SO₂-X)和取代芳基磺酰基羟胺也可商购获得。或者，一种产生取代芳基肼的简单方法包括使用已确立的如Malachowski等人[28]例示的还原氨基化化学。可以对取代芳基醛进行来自肼的亲核攻击，并将产物还原得到所需要的取代芳基肼。

然后使这些肼与适宜的前体化合物II、III或IV反应得到相应的酰肼、磺酸酰肼或磺酰基肟。这三种基团中的后二种是本申请的含酯化合物的实例。

使雌-1，3，5(10)-三烯多样化以形成前体化合物II、III和IV

现在我们使用多种可以用来获得含有代替A的羧基的前体雌三烯的方法，且表明这些取代基中的任一个可以在R¹、R²、R³、R⁴、R⁶、Z′和Z″位。

(A)R¹、R²、R³和R⁴的多样化

许多可商购获得的雌-1，3，5(10)-三烯化合物可以通过在该分子的芳族A环上进行多种取代而容易地得到。这些商购化合物中的许多还具有存在于Z″的酮官能团，可以与取代芳基胺缩合形成式I的化合物。或者，可以在与取代芳基胺缩合之前使用以下所示的技术对这些化合物进行进一步多样化。

作为实例，以下的化合物可以从Steraloids Inc.商购获得：

17-OH化合物

1-甲基雌二醇

2，4-二溴雌二醇

2，4-二硝基雌二醇

2-溴雌二醇

2-乙氧基雌二醇

2-氟雌二醇

2-羟基雌二醇

2-羟基雌二醇-3-甲基醚

2-碘雌二醇

2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚

2-硝基雌二醇

4-溴雌二醇

4-氟雌二醇

4-甲氧基雌二醇

4-甲基雌二醇

雌二醇-3-乙酸酯

雌二醇-3-苯甲酸酯

雌二醇-3-苄基醚

雌二醇-3-羧甲基醚

雌二醇-3-丙酸酯

雌二醇-3-硫酸酯

17-酮化合物

1-甲基雌酮

2-氟雌酮

2-羟基雌酮

2-羟基雌酮-3-甲基醚

2-甲氧基雌酮-3-甲基醚

3-脱氧雌酮

4-羟基雌酮

4-硝基雌酮

雌酮-3-乙酸酯

雌酮-3-苯甲酸酯

雌酮-3-苄基醚

雌酮-3-乙基醚

雌酮-3-甲基醚

雌酮-3-硫酸酯

16-变体

16-羟基雌二醇-3-甲基醚

16-溴雌酮

16-溴雌二醇-3-甲基醚

16-羟基雌二醇-3-乙酸酯

16-溴雌二醇

16-羟基雌二醇

2，16-二羟基雌二醇

16-羟基-2-甲氧基雌二醇

16-羟基-4-甲氧基雌二醇

16-羟基雌二醇-3-硫酸酯

以下化合物可从Research Plus商购获得：

17-OH化合物

16-溴雌二醇

雌二醇-3-甲基醚

雌二醇-3-磷酸酯

2，4-二甲氧基雌二醇

3，4-二溴-2-甲氧基雌二醇

17-酮化合物

2，4-二硝基雌酮

雌酮-3-磷酸酯

除了可商购获得的含有适宜的R¹、R²、R³和R⁴基团的化合物之外，其它化合物可以容易地通过现有方法，在基本雌-1，3，5(10)-三烯结构上进行多样化而合成。这些在1-位的不同取代基(R¹)的实例包括胺、羟基、醚和烷基链，它们可以通过参考文献7-10中所示的方法制备。这些在2-位的不同取代基(R²)的一些实例包括硝基、卤素、胺、羟基、硫醇、醚、烷基链和亚烷基，它们可以通过参考文献11-17所示的方法制备。

3-位的取代基(R³)的一些实例包括羟基、醚和酯，例如烷基磷酸酯和氨基磺酸酯，它们可以通过参考文献14和18-22所示的方法制备。

4-位取代基(R⁴)的进一步实例包括卤素、羟基、醚、烷基、烯、氰基和硝基，它们可以通过参考文献17和23-26所示的方法制备。

(B)Z′的多样化

6-位的苄基氧化可以使用多种铬基氧化剂，但最优选使用于酸性介质中的三氧化铬来进行。在2-位为吸电子取代基的情况下(例如R²＝氰基)，可能需要在2-取代基的引入之前进行这一种类的氧化。可能需要在Z′和可能的Z″处的酮的保护，优选为乙缩醛或乙缩醛衍生物，以使得在这种情况下能够进行R²处的取代。一旦该酮官能团适当地在Z′位，这些取代胺中的任一个可以与该基团缩合，或者用适宜的氢化物试剂还原将得到6-羟基衍生物。如果已引入肟，则它的还原将产生胺，其本身可以通过还原氨基化过程被进一步烷基化。所有这些反应在本领域已进行了充分地研究[34]。上述的各种反应在以下路线4中作了例示。

路线4

(C)Z″的多样化

许多在6-和/或17-位已存在酮官能团并且在芳族A环(R¹-R⁴)上具有变化的取代雌-1，3，5(10)-三烯甾族化合物可商购获得。它们通过与适宜的取代芳基羟胺缩合直接适用于形成芳基肟。许多可商购获得的雌-1，3，5(10)-三烯甾族化合物还具有存在的17-羟基官能团，并可以容易地转化成酮以用于进一步的根据要求的Z″的多样化。存在许多用于这一类型氧化的方法[14，27]。一个重要的因素是使用适宜的保护基(例如乙酰基、甲氧基、苄基)阻断其它潜在的可氧化基团的氧化，这些潜在的可氧化基团可以作为在该分子的芳环或其它部位上的取代基存在。

如果在Z″处需要羟基，则再用氢化物试剂将该酮简单还原得到此官能团。类似地，肟的还原氨基化或还原将允许在此点引入胺官能团。通过还原氨基化将可以将此胺再烷基化。

路线5

在Z′为酮、肟或芳基肟且Z″也为酮、肟或芳基肟的情况下，应该首先将Z″转化成适宜的肟或芳基肟，然后将苄基位Z′氧化。这种情况在2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟的合成中作了例示。

(D)2-位(R²)的多样化以引入A。

路线6

2-甲酰基雌二醇可以通过Pert和Ridley的方法制备[23]，然后分别与苄基羟胺和4-硝基苄基羟胺缩合得到2-苄氧基亚氨基甲基雌二醇和2-(4-硝基苄氧基)亚氨基甲基雌二醇。为得到产生其它化合物的变体，可以将醛转化成酮，或者可以进一步沿烃链(-R^c-)将醛定位在R²处。

取代芳基胺与式II、III和IV的化合物缩合

一旦合成或得到所需的取代芳基胺(其可以是肼)和式II、III或IV的前体，可以通过本领域已知的和在实施例中所示的技术对它们进行缩合，得到式I的目标化合物。

式II、III或IV的化合物与取代胺的缩合反应不限于与取代芳基胺衍生物的反应，而是可以形成以上定义的许多其它的“酯”。与取代芳基磺酰基肼(其中许多可以商购获得)反应将得到取代芳基磺酸酰肼，而同样地与取代芳基磺酰基羟胺反应将得到相应的取代芳基磺酰基肟。这些反应以如下关于芳基为苯基的情况所图示。可以用基团X即不同的取代芳基来替代以下所示的具有一个(或多个)取代基的苯基。

路线7

另外，与在17-位具有酮的前体化合物的缩合反应不限于与取代芳基羟胺衍生物的反应，而是可以形成以上定义的许多其它的“酯”。与取代芳基磺酰基肼(其中许多可商购获得)反应将得到取代芳基磺酸酰肼，而同样地与取代芳基磺酰基羟胺反应将得到相应的取代芳基磺酰基肟。

路线8

式I的化合物的盐优选是药学可接受的，但应理解非药学可接受的盐也在本申请的范围内，因为它们用作制备药学可接受的盐的中间体。药学可接受的盐的实例包括药学可接受的阳离子如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵的盐；药学可接受的无机酸如盐酸、正磷酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的酸加成盐；或者药学可接受的有机酸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、三卤代甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗坏血酸和戊酸的盐。

此外，本申请的某些化合物可以与水或常用的有机溶剂形成溶剂合物。这些溶剂合物包含在本申请的范围内。

“药学可接受的衍生物”意指任何药学可接受的盐、水合物或任何其它化合物，其在给予个体时能够(直接或间接地)得到式I的化合物或者其活性代谢产物或残基。

术语“前药”最广义地用于本文，包括在体内转化成式I的化合物的那些化合物，例如有机酸酯或醚。

术语“互变异构体”最广义地用于本文，包括能够以两种异构形式之间的平衡状态存在的式I的化合物。这些化合物在连接两个原子或基团的键和这些原子或基团在该化合物中的位置方面可以不同。

术语“异构体”最广义地用于本文，包括结构、几何和立体异构体。由于式I的化合物可以具有一个或多个手性中心，因此它能够以对映异构形式存在。式I所示的波状线表示该取代基可以在α或β位，或者可以是它们的异构体混合物。

本申请的组合物包含至少一种式I的化合物和一种或多种药学可接受的载体和任选的其它治疗活性剂。载体、稀释剂、助剂和/或赋形剂各自必须是药学“可接受的”，其含义是可以与该组合物的其它成分相容且对个体无害。组合物包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括口含、气道和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)给药的组合物。该组合物可以方便地以单元剂量的形式存在，并可以由药学领域中熟知的方法制备。这些方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般地，该组合物通过以下方法制备：使活性成分与液体载体、稀释剂、助剂和/或赋形剂或者微细固体载体或二者均匀而紧密地结合，然后如果需要的话制成产品。

本文所用的术语“个体”指患有需要用药学活性剂治疗的疾病或病症的任何动物。该个体可以是哺乳动物，优选人，或者可以是家养或伴侣动物。虽然特别考虑到本申请的化合物适用于人的医学治疗，但它还可以应用于兽医治疗，包括治疗伴侣动物如狗和猫和家养动物如马、小型马、驴、骡、美洲驼、羊驼、猪、牛和羊，或者动物园动物如灵长类、猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物。应理解，控制气道平滑肌细胞增殖的机制主要通过哺乳动物保存，因此认为本申请的化合物广泛应用于治疗与许多物种的气道平滑肌细胞增殖增加相关的病症。

本文所用的术语“治疗有效量”意指本申请的化合物有效地实现所期望的治疗反应，例如预防或治疗与气道平滑肌细胞过度增殖相关的病症如哮喘的量。

显然，特定的“治疗有效量”将随诸如以下的因素而变化：被治疗的具体病症、个体的身体状况、被治疗的个体的类型、治疗的持续时间、同时治疗(如果有的话)的性质以及所用的特定制剂和该化合物或其衍生物的结构。

可以将本申请的化合物另外地与其它药物组合得到一种可操作的组合。本申请意在包括药学活性剂的任何化学相容的组合，只要这种组合不消除式I或II的化合物的活性。应理解，本申请的化合物和其它药物可以单独、序惯或同时给药。

当病症为哮喘时，其它药物可以包括，例如抗炎药、预防剂、缓解剂和症状控制剂现有疗法中的一种或多种。

用于制备药物组合物的方法和药学载体在本领域中是熟知的，如诸如以下的教科书所述：Remington′s Pharmaceutical Sciences，20thEdition，Williams & Wilkins，Pennsylvania，USA。

本文所用的“药学载体”是用于将式I的化合物递送至个体的药学可接受的溶剂、助悬剂或赋形剂。该载体可以是液体或固体，并根据计划的给药方式来选择。各种载体必须是药学“可接受的”，其含义是与该组合物的其它成分相容，并对个体无害。

式I的化合物可以口服、局部或肠胃外以包含常规无毒的药学可接受的载体、助剂和赋形剂的剂量单元制剂给予。本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、用于肺或鼻腔给药的气雾剂形式、静脉内注射、肌内注射、鞘内注射、颅内注射或者输注技术。

本申请还提供用于本申请的新治疗方法的适宜的局部、口服和肠胃外药物制剂。本申请的化合物可以作为片剂、水或油混悬剂、糖锭、锭剂、散剂、颗粒剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂或酏剂经口服给药。口服使用的组合物可以包含一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂，以产生药学上精致美味的制剂。适宜的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天冬甜素或糖精。适宜的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原酸胶、膨润土、海藻酸或琼脂。适宜的调味剂包括薄荷油、冬绿油、樱桃、橙或覆盆子调味剂。适宜的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适宜的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。适宜的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。该片剂包含与适于制备片剂的无毒的药学可接受的赋形剂混合的活性成分。

这些赋形剂可以是例如(1)惰性稀释剂，例如碳酸钙、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；(2)成粒剂或崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；(3)粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和(4)润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。这些片剂可以是未包衣的，或者可以由已知的技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供在较长时间内的持续作用。例如，可以使用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。还可以使用美国专利4,256,108、4,160,452和4,265,874中所述的技术进行包衣，以形成用于控释的渗透性治疗片剂。

为进行体内施用，用于该方法的式I的化合物和药学活性剂可以单独或一起通过注射或者通过一段时间内缓慢输注而肠胃外给药。给药可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮给药或者通过例如渗透泵进行输注。为进行体外研究，可以将这些活性剂加入或溶解于适宜的生物学可接受的缓冲液中，并加入细胞或组织中。肠胃外给药制剂包括无菌含水或非水溶液、悬浮液和乳液。

一般地，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等在本文中意指影响个体、组织或细胞以获得期望的药理学和/或生理学效果。该效果在完全或部分预防疾病或者其征候或症状方面而言可以是预防性的和/或在部分或完全治愈疾病方面而言可以是治疗性的。本文所用的“治疗(treating)”涵盖脊椎动物、哺乳动物特别是人的疾病的任何治疗或预防，包括：(a)预防可能有患病倾向但尚未诊断为患病的个体发生疾病；(b)抑制疾病，即阻止它的发展；或者(c)缓解或改善该疾病的影响，即导致该疾病的影响消退。

该组合物包括用于改善疾病的多种药物组合物。根据本申请的一个实施方案，该药物组合物通过以下方法制备：使用载体、赋形剂和添加剂或助剂将式I的化合物、其类似物、衍生物或盐，或者式I的化合物和一种或多种药学活性剂的组合变成适于给予个体的形式。经常使用的载体或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露糖醇和其它糖、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素和其衍生物、动物和植物油、聚乙二醇和溶剂如无菌水、醇、甘油和多羟基醇。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其它药学可接受的载体包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等，如例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，20th ed.Williams and Wilkins(2000)和The British National Formulary 43rd ed.(British MedicalAssociation and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain，2002；http://bnf.rhn.net)中所述，这些文献的内容在此被引入作为参考。根据本领域技术常识调节该药物组合物的不同组分的pH和精确浓度。参见See Goodman and Gilman的The Pharmacological Basis forTherapeutics(7th ed.，1985)和Remington的Pharmaceutical Sciences，20th ed.Williams和Wilkins(2000)。

该药物组合物优选制备成剂量单元并以此给药。固体剂量单元可以是片剂、胶囊剂和栓剂。可以通过单次给予单个剂量单元或多个较小剂量单元的形式来进行日剂量的给予，还可以通过以特定的时间间隔多次给予细分的剂量来进行日剂量的给予。

该药物组合物可以以治疗有效剂量局部或全身给药。当然此应用的有效量取决于疾病的严重程度和个体的体重与一般状况。通常体外使用的剂量可以为用于药物组合物原位给予的量提供有用的指导，并可以用动物模型确定治疗细胞毒性副作用的有效剂量。各种考虑事项在例如Langer，Science，249：1527，(1990)中有描述。

式I的化合物的优选的剂量水平的数量级为大约0.1mg至大约150mg/千克体重，更优选数量级为50-100mg/千克体重，特别优选剂量为大约50mg/千克体重/日。可以与载体材料组合以产生单一剂量的活性成分的量将随被治疗的宿主和特定的给药方式而变化。例如，欲用于口服给予人的制剂可以包含大约5mg-1g活性化合物和适宜、方便量的载体材料，该载体材料可以占总成分的大约5-95％。剂量单元形式一般包含大约5mg-500mg的活性成分。

供口服使用的制剂可以是硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合。它们还可以是软明胶胶囊的形式，其中活性成分与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

含水悬浮液一般包含与适于制备含水悬浮液的赋形剂混合的活性材料。这些赋形剂可以是(1)助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；(2)分散剂或润湿剂，其可以是(a)天然存在的磷脂，例如卵磷脂；(b)环氧烷和脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；(c)环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如十七烷乙烯氧基十六醇；(d)环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或者(e)环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。

式I的化合物还可以以脂质体递送系统，例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡的形式给药。脂质体可以由多种磷脂，例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。

实施例

现在将通过仅参考以下非限制性实施例的方式详细描述本发明。

制备式I的侯选化合物

实施例1

合成2-甲氧基-6-(4′-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇(″4NO″)

实施例1a

通过用在吡啶中的乙酸酐处理将2-甲氧基雌二醇(1)二乙酰基化，收率为95％。用在乙酸/水混合物中的三氧化铬进行该双保护物质(species)的苄基氧化，收率为45％。通过用在甲醇水溶液中的碳酸钾处理新形成的酮化合物(3)除去二种乙酸酯，收率98％。然后用在甲醇中的O-(4-硝基苄基)羟胺进行该酮的缩合，得到2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇(5)，收率99％。

路线9

实施例1b

3，17-双-乙酰氧基-2-甲氧基雌-1，3，5(10)三烯(2)

在氮气氛下将2-甲氧基雌二醇(127.5mg，0.426mmol)溶于无水吡啶(6.0mL)中，并冷却至0℃。滴加乙酸酐(3.0mL)，并使反应物暖至室温。搅拌过夜后，将反应混合物冷却至0℃，此时加入50.0mL 1M盐酸水溶液，并使反应物暖至室温。用乙酸乙酯(3×50mL)进行萃取，并依次用3M盐酸水溶液(50mL)、水(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的有机萃取液。用硫酸钠干燥有机层，然后过滤，并将溶剂真空浓缩，得到白色固体(154mg)。当用TLC分析时产物是均匀的，因此认为没有必要纯化，但使用1∶5乙酸乙酯/石油溶剂油作为洗脱液在硅胶柱上纯化分析样品。

R_f 0.88[乙酸乙酯-石油溶剂油(1∶1)，硅胶]；¹H NMR(CDCl₃)：δ6.86(s，1H)，6.71(s，1H)，4.67(t，J＝8.3Hz，1H)，3.78(s，3H)，2.77-2.74(m，2H)，2.28(s，3H)，2.04(s，3H)，2.26-1.23(m，13H)，0.81(s，3H)。

实施例1c

3，17-双-乙酰氧基-2-甲氧基-6-氧代雌-1，3，5(10)三烯(3)

在90分钟的时间内通过搅拌将三氧化铬(79.8mg，0.798mmol)溶于2.0mL 90％(v/v)乙酸水溶液中。在10℃下将该氧化混合物滴加入3，17-双-乙酰氧基-2-甲氧基雌-1，3，5(10)三烯(2)(72.5mg，0.188mmol)的搅拌溶液中。将该混合物于10℃下搅拌30分钟，此时将反应物倾倒在冰/水混合物(30mL)上，用乙酸乙酯(3×15mL)进行萃取。用水(20mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)、水(20mL)和盐水(20mL)洗涤合并的萃取液，然后用硫酸钠干燥，并过滤。蒸发有机溶剂得到黄色固体残余物。通过闪蒸硅胶色谱法纯化此残余物，使用1∶3乙酸乙酯/石油溶剂油混合物作为洗脱液，得到白色固体(34mg，45％)。

R_f 0.36[乙酸乙酯-石油溶剂油(1∶3)，硅胶]；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.73(s，1H)，6.92(s，1H)，4.71(t，J＝8.5Hz，1H)，3.90(s，3H)，2.69(dd，J＝16.9，3.4Hz，1H)，2.53(dt，J＝16.9，3.4Hz，1H)，2.31(s，3H)，2.06(s，3H)，2.40-1.34(m，13H)，0.83(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ195.81，171.10，168.92，155.40，146.95，138.42，126.06，121.79，108.36，82.09，55.97，49.74，43.49，43.26，42.63，39.57，36.38，27.36，25.35，22.92，21.12，20.52，11.84。

实施例1d

2-甲氧基-6-氧代-雌二醇(4)

在氮气氛下将无水碳酸钾(20mg，0.145mmol)加入在8.0mL甲醇中的3，17-双-乙酰氧基-2-甲氧基-6-氧代雌-1，3，5(10)三烯(3)(7)(34mg，0.085mmol)的搅拌溶液中。加入水(3.0mL)，并将反应物在室温下搅拌16小时。通过滴加1M盐酸水溶液将反应物的pH调节至pH4。用乙酸乙酯(3×10mL)进行萃取，然后用水(10mL)和盐水溶液(10mL)洗涤合并的层，然后用硫酸钠干燥，并过滤。真空蒸发溶剂得到米色固体，通过闪蒸硅胶色谱法(3∶2乙酸乙酯∶石油溶剂油)纯化得到26.4mg(98％)目标化合物，为白色结晶固体。

熔点189-190℃(分解)；R_f 0.34[乙酸乙酯-石油溶剂油(3∶2)，硅胶]；¹H NMR(CD₃OD)：δ7.36(s，1H)，6.91(s，1H)，3.92(s，3H)，3.66(t，J＝8.5Hz，1H)，2.52(dd，J＝16.8，3.5Hz，1H)，2.43-1.26(m，12H)，0.76(s，3H)。

实施例1e

2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇(″4NO″)(5)

在氮气氛下向在甲醇(25.0mL)中的2-甲氧基-6-氧代-雌二醇(4)(176.0mg，0.556mmol)的搅拌溶液中加入4-硝基苄基羟胺盐酸盐(266mg，1.574mmol)。向此溶液中加入4-聚乙烯基吡啶(25％交联，1.033g)，并将反应混合物加热回流。17小时后，将反应物冷却至室温，并在真空下除去溶剂。将粗产物溶于无水四氢呋喃中，并用PS-异氰酸酯(装载1.25mmol/g，2.522g)树脂处理15.5小时。通过硅藻土滤垫(celite pad)过滤混合物，并再用四氢呋喃(4×50mL)洗脱得到浅黄色溶液，将其真空蒸发得到无定形固体(257mg，99％)。

R_f 0.60[乙酸乙酯-石油溶剂油(2∶1)，硅胶]；¹H NMR(CDCl₃)：δ8.21(d，8.8Hz，2H)，7.53(d，8.8Hz，2H)，7.46(s，1H)，6.78(s，1H)，5.49(s，1H)，5.27(s，2H)，3.90(s，3H)，3.75(t，J＝8.6Hz，1H)3.14(dd，J＝18.1，4.4Hz，1H)，2.19-1.22(m，12H)，0.77(s，3H)；ESIMS-[M+H]⁺m/z＝467；HRESI-MS：[M+H]⁺ 467.2185(467.2182计算值)。

实施例2

合成2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(″4NOM″)(10)

实施例2a

在回流下将2-甲氧基雌酮与过量的在甲醇中的羟胺缩合得到2-甲氧基雌酮-17-肟(6)，为一种单一几何异构体。此化合物没有进行纯化，而用在吡啶中的乙酸酐处理得到3，17-二乙酰基化肟衍生物(7)，两步收率为90％。用在乙酸/水混合物中的三氧化铬将乙酰基保护的物质苄基氧化，得到6-氧代衍生物，将其立即脱保护得到2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟(9)，该两步收率为71％。用在甲醇中的4-硝基苄基羟胺处理该酮得到2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(10)，收率为33％。

路线10

实施例2b

2-甲氧基雌酮-17-肟(6)

在氮气氛下向在无水甲醇(160.0mL)中的2-甲氧基雌酮(1.698g，5.651mmol)的悬浮液中加入羟胺盐酸盐(1.110g，15.97mmol)，通过缓慢加热该混合物至35℃达到完全溶解。加入4-聚乙烯基吡啶(8.00g，25％交联)，并使反应物回流。14.5小时后，将反应冷却至室温，并在真空下除去溶剂。将残余物悬浮在无水四氢呋喃(60.0mL)中，并通过烧结玻璃漏斗过滤。进一步用四氢呋喃(40.0mL，50.0mL)洗涤树脂，并将滤液真空蒸发得到粗产物，为白色泡沫状物(1.942g)。

R_f 0.28[乙酸乙酯-石油溶剂油(1∶2)，硅胶]；¹H NMR(CDCl₃)：δ6.79(s，1H)，6.65(s，1H)，5.50(s，1H)，3.86(s，3H)，2.90-2.70(m，2H)，2.60-1.32(m，13H)，0.96(s，3H)；ESIMS-[M+H]⁺m/z＝316。

实施例2c

3-乙酰氧基-2-甲氧基雌-1，3，5(10)三烯-17-酮乙酰肟(7)

在氮气氛下将粗2-甲氧基雌酮-17-肟(6)(1.937g)溶于吡啶(12.0mL，148.8mmol)中。搅拌下滴加乙酸酐(6.0mL，63.6mmol)。在室温下继续搅拌16小时，此时通过小心加入1M氯化铵水溶液(50.0mL，50.0mmol)来终止反应物反应。然后用乙酸乙酯(100mL，然后2×50mL)萃取反应混合物，并用1M氯化铵溶液(3×50mL)、1M盐酸水溶液(50mL)、水(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的有机层。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，并真空蒸发，然后高真空干燥得到灰白色固体(2.099g)，两步收率为90％。

R_f 0.38[乙酸乙酯-石油溶剂油(1∶2)，硅胶]；¹H NMR(CDCl₃)：δ6.89(s，1H)，6.75(s，1H)，3.81(s，3H)，2.84-2.72(m，2H)，2.60-1.32(m，13H)，2.31(s，3H)，2.16(s，3H)1.02(s，3H)。

实施例2d

3-乙酰氧基-2-甲氧基-6-氧代雌-1，3，5(10)三烯-17-酮乙酰肟(8)

在60分钟的时间内在振摇下将三氧化铬(2.26g，22.6mmol)溶于50.0mL 90％(v/v)乙酸水溶液中。5-8℃下将此氧化混合物滴加入3-乙酰氧基-2-甲氧基雌-1，3，5(10)三烯-17-酮乙酰肟(7)(2.099g，5.07mmol)的搅拌溶液中。将该混合物于5-8℃下搅拌42分钟，此时通过加入水(150mL)来终止反应物反应。然后用乙酸乙酯(2×150mL，然后100mL)萃取反应混合物，并用饱和碳酸氢钠水溶液(3×100mL)、水(100mL)和盐水(100mL)洗涤合并的萃取液。然后用硫酸钠干燥有机相，并通过硅藻土滤垫过滤，进一步用乙酸乙酯(2×20mL)洗涤。蒸发溶剂得到浅黄色固体。当用TLC分析时产物是均匀的，因此认为没有必要纯化，但是用1∶1乙酸乙酯/石油溶剂油作为洗脱液在硅胶柱上纯化分析样品。

R_f 0.28[乙酸乙酯-石油溶剂油(1∶1)，硅胶]；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.77(s，1H)，6.95(s，1H)，3.93(s，3H)，2.69(dd，J＝16.9，3.4Hz，1H)，2.53(dt，J＝16.9，3.4Hz，1H)，2.31(s，3H)，2.06(s，3H)，2.40-1.34(m，13H)，1.05(s，3H)；ESIMS-[M+H]⁺m/z＝414。

实施例2e

2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟(9)

在氮气氛下将无水碳酸钾(12.56g，90.87mmol)加入在甲醇(150mL)中的粗3-乙酰氧基-2-甲氧基-6-氧代雌-1，3，5(10)三烯-17-酮乙酰肟(8)的搅拌溶液中。13.5小时后，加入水并将反应物于40℃下搅拌12小时。然后用水(150mL)稀释反应混合物，并通过滴加1M盐酸水溶液将溶液的pH调节至pH7。用乙酸乙酯(3×150mL)进行萃取，然后用水(150mL)和盐水(150mL)洗涤合并的层，之后用硫酸钠干燥，并过滤。真空蒸发溶剂得到米色固体，通过闪蒸硅胶色谱法(2∶1乙酸乙酯∶石油溶剂油)纯化，得到1.233g(71％，两步)灰白色固体。

R_f 0.46[乙酸乙酯-石油溶剂油(2∶1)，硅胶]；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.61(s，1H)，6.85(s，1H)，5.57(s，1H)，3.97(s，3H)，2.77(dd，J＝16.6，3.4Hz，1H)，2.61-1.41(m，12H)，0.97(s，3H)；ESIMS-[M+H]⁺m/z＝330。

实施例2f

2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(″4NOM″)(10)

在氮气氛下向在无水甲醇(10.0mL)中的2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟(9)(22.8mg，0.069mmol)的搅拌溶液中加入4-硝基苄基羟胺盐酸盐(42.5mg，0.208mmol)和4-聚乙烯基吡啶(185.0mg，25％交联)。将反应物于室温下搅拌24小时，此时真空蒸发溶剂。在室温下，将该浅黄色残余物悬浮在无水四氢呋喃(15.0mL)和用PS-苯甲醛树脂(177.0mg)净化的过量的亲核试剂中24小时。在固相萃取柱(SupelcoLC-CN)上过滤该固体，并进一步用四氢呋喃(4×5.0mL)洗涤，然后在氮气流下除去溶剂得到浅黄色油状物，进一步通过闪蒸硅胶色谱法(2∶1乙酸乙酯∶石油溶剂油)进行纯化，得到11.2mg(33％)所需的产物，为浅黄色固体。

R_f 0.33[乙酸乙酯-石油溶剂油(3∶2)，硅胶]；ESIMS-[M+H]⁺m/z＝480

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.21(d，J＝8.7Hz，2H)，7.54(d，J＝8.7Hz，2H)，7.48(s，1H)，6.78(s，1H)，5.55(br s，1H)，5.27(s，2H)，3.91(s，3H)，3.22(dd，J＝18.1，4.4Hz，1H)，2.65-1.21(m，12H)，0.94(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ170.63，154.16，148.08，147.41，146.09，143.97，135.09，128.34，123.58，123.27，109.89，106.83，74.67，55.87，53.20，43.97，41.84，36.50，33.56，29.43，25.55，25.07，22.91，17.01；ESI-MS(20v)m/z 480(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺480.2125(480.2135计算值)。

实施例3

合成2-苄氧基亚氨基甲基雌二醇和2-(4-硝基苄氧基)亚氨基甲基雌二醇

路线11

通过Pert和Ridley的方法[23]制备2-甲酰基雌二醇，然后分别与苄基羟胺和4-硝基苄基羟胺缩合得到2-苄氧基亚氨基甲基雌二醇(Y＝H；12a)和2-(4-硝基苄氧基)亚氨基甲基雌二醇(Y＝NO₂；12b)。

将两份在5mL无水THF中的2-甲酰基雌二醇(7.2mg，0.190mmol)溶液在氮气氛下搅拌，并将如下所示的O-芳基羟胺(以它们的盐酸盐)加到每一份中。

表1

羟胺	量(mg)	摩尔量(mmol)
羟胺	量(mg)	摩尔量(mmol)	O-苄基羟胺盐酸盐	11.5	0.719
O-4-硝基苄基羟胺盐酸盐	14.7	0.719	O-苄基羟胺盐酸盐	11.5	0.719

在加入各羟胺时，将一定量的25％交联的聚(4-乙烯基吡啶)(200-220mg)加入每一个反应管中，将每管加热回流，并搅拌16小时。使反应物冷却至室温，并将PS-苯甲醛净化剂树脂(32-42mg，装载1.31mmol/g)加入每管中。将反应物搅拌2小时，此时通过聚乙烯玻璃料过滤除去所有的残余物。用THF(3×5mL)洗涤残余物，并在氮气流下除去剩余的溶剂。

通过薄层色谱法(SiO₂，1∶1；乙酸乙酯∶石油溶剂油)、高效液相色谱法；22分钟内梯度洗脱70％CH₃CN/H₂O-98％ CH₃CN/H₂O(Phenomenex C18 column spherex 5，(250×4.6mm))以及电雾化质谱法分析得到的产物。结果见下表。

表2

化合物	ESI-MS[M+H]⁺	HPLC保留时间(分钟)	220nm处HPLC纯度(％)	TLCR_f
化合物	ESI-MS[M+H]⁺	HPLC保留时间(分钟)	220nm处HPLC纯度(％)	TLCR_f	2-苄氧基亚氨基甲基雌二醇	406	19.2	93.0	0.70
2-(4-硝基苄氧基)亚氨基甲基雌二醇	451	19.4	94.3	0.57	2-苄氧基亚氨基甲基雌二醇	406	19.2	93.0	0.70

实施例4

制备6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基-2甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-36)

该化合物通过如下所述的两种中间体来制备。

实施例4a

制备N-(3，5-二氟苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

在氮气氛下向在25mL无水四氢呋喃中的N-羟基邻苯二甲酰亚胺(试剂A)(592.3mg，3.631mmol)溶液中加入3，5-二氟苄基溴(试剂B)(516.7μL，3.994mmol)。然后搅拌下滴加N，N-二异丙基乙胺(试剂C)(1.367mL，7.988mmol)立即引起颜色变化。将反应物加热回流并在此温度下保持20小时，之后冷却至室温，形成稠厚的白色沉淀。然后将反应混合物用25mL水稀释，之后用5×25mL乙酸乙酯萃取。用水(25mL)和盐水(25mL)洗涤合并的有机部分，之后用无水硫酸钠干燥。真空蒸发得到936.1mg产物(D)(89％)，为白色固体。

R_f 0.375[二氯甲烷，硅胶]；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.86-7.75(m，4H)，7.11-7.09(m，2H)，6.85-6.79(m，1H)，5.17(s，2H)。ESI-MS(40V)m/z 312(100)[M+Na]⁺，601(34)[2M+Na]⁺。

实施例4b

制备O-(3，5-二氟苄基)羟胺盐酸盐

在氮气氛和搅拌下将N-(3，5-二氟苄氧基)邻苯二甲酰亚胺(D)(143.0mg，0.494mmol)溶于5mL冰乙酸中，并滴加37％盐酸(1.00mL，31.8mmol)。将反应物加热回流并在此温度下保持3小时，之后冷却至室温。将反应混合物在氮气流下蒸发，之后悬浮于0.2M氢氧化钠水溶液中。通过滴加6M氢氧化钠水溶液将混合物的pH调节至pH8＜10。用3×15mL乙酸乙酯萃取，将合并的有机萃取液用无水硫酸钠干燥，并蒸发得到浅黄色油状物，将其溶于乙醇(1mL)中，之后滴加在乙醚(3mL)中的1M盐酸，立即产生白色沉淀。加入另外的乙醚(25mL)，离心，倾析，进一步用乙醚(25mL)洗涤，进一步离心和倾析，之后风干，得到白色固体(E)(78.6mg，82％)。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ10.92(br s，3H)，7.24(tt，J＝9.6，2.4Hz，1H)，7.17-7.09(m，2H)，4.96(s，2H)；ESI-MS(20V)m/z 160(100)[M+H]⁺，143(43)[M+H-NH₂]⁺。

实施例4c

制备6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-36)

在氮气氛下将2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟(F)(15.0mg，0.0455mol)、O-(3，5-二氟苄基)羟胺盐酸盐(E)(11.6mg，0.059mmol)和4-聚乙烯基吡啶(G)(25％交联，200mg)都加入反应器中，并在室温和搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。反应在室温下进行64小时，此时将反应混合物真空蒸发。将得到的残余物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，并用PS-苯甲醛树脂(H)(46mg，1.20mmolg^-1)处理。将悬浮液通过LC-C18固相萃取柱过滤，进一步用3×5mL THF处理。蒸发，之后通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(1∶1)]纯化，得到白色无定形固体。(20.2mg，94％)。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.50(s，1H)，6.89-6.82(m，2H)，6.78(s，1H)，6.76-6.64(m，1H)，5.15(s，2H)，3.91(s，3H)，3.22(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H，2.62-1.20(m，12H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z471(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 471.2086(471.2095计算值)。

实施例5

制备6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-35)

使用与以上实施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的变化。

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为15.1mg(0.048mmol)，作为试剂E，O-(3，5-二氟苄基)羟胺盐酸盐的使用量为12.1mg(0.062mmol)，树脂G的使用量为210mg，而树脂H的使用量为43.0mg。反应进行64小时。获得产物2-甲氧基-6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基雌二醇，收率为88％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.49(s，1H)，6.89-6.87(m，2H)，6.78(s，1H)，6.74-6.68(m，1H)，5.50(br s，1H)，5.15(s，2H)，3.90(s，3H)，3.75(t，J＝8.5Hz，1H)，3.14(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.62-1.22(m，12H)，0.94(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ164.04(dd，J＝248.0，13.0Hz)，155.41，149.02，144.93(t，J＝9.9Hz)，136.51，124.55，111.32(dd，J＝18.7，6.5Hz)，110.95，107.92，107.90，103.86(t，J＝25.2Hz)，82.69，75.71，56.90，51.53，44.09，42.88，38.30，37.26，31.63，30.61，26.76，24.14，12.00；ESI-MS(20v)m/z 458(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 458.2131(458.2143计算值)。

实施例6

制备6-(3-甲氧基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-66)

该化合物通过如下所述的两种中间体来制备。

实施例6a

制备N-(3-甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

使用与以上实施例4a中所描述的相同的方法，具有如下的变化。

作为试剂B，3-甲氧基苄基溴使用486.1μL(3.47mmol)，试剂A的使用量为514.8mg(3.16mmol)，而试剂C使用1.20mL(7.01mmol)。反应在回流下进行15小时。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷进行萃取。获得产物D，N-(3-甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率为95％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.84-7.70(m，4H)，7.26(m，1H)，7.10-7.06(m，2H)，6.89(dd，J＝8.3，2.8Hz，1H)，5.17(s，2H)，3.80(s，3H)。

实施例6b

制备O-(3-甲氧基苄基)羟胺盐酸盐

使用与以上实施例4b中所描述的相同的方法，具有如下的变化。

作为试剂D，N-(3-甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用211.5mg(0.791mmol)，冰乙酸的使用量为10mL，而37％盐酸的使用量为2.00mL(63.6mmol)。反应在回流下进行4.5小时。获得产物E，O-(3-甲氧基苄基)羟胺盐酸盐，收率为92％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ10.15(br s，3H)，7.32(t，J＝7.5Hz，1H)，6.97-6.92(m，3H)，4.88(s，2H)，3.76(s，3H)。

实施例6c

制备6-(3-甲氧基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-66)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为13.0mg(0.040mmol)，来自实施例6b的试剂E的使用量为9.7mg(0.051mmol)，树脂G的使用量为103.9mg，而树脂H的使用量为35.0mg。反应进行64小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(3-甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率45％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.55(s，1H)，7.26(m，1H)，7.15(br s，1H)，7.01-6.97(m，2H)，6.84(dd，J＝8.1，2.6Hz，1H)6.77(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.17(s，2H)，3.91(s，3H)，3.82(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.63-1.24(m，12H)，0.76(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 465(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 465.2385(465.2389计算值)。

实施例7

制备6-(3-甲氧基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-62)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为11.2mg(0.035mmol)，来自实施例6b的试剂E的使用量为8.7mg(0.046mmol)，树脂G的使用量为120.2mg，而树脂H的使用量为35mg。反应进行64小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(3-甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率70％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.54(s，1H)，7.26(m，1H)，6.97(m，2H)，6.84(dd，J＝8.4，2.6Hz，1H)6.77(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.11(s，2H)，3.90(s，3H)，3.81(s，3H)，3.73(t，J＝8.5Hz，1H)，3.13(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.33-1.15(m，12H)，0.76(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ159.59，153.86，147.88，143.88，139.94，135.37，129.32，123.76，120.41，113.60，113.22，109.99，106.84，81.64，76.06，55.82，55.21，50.50，43.02，41.83，37.27，36.22，30.57，29.58，25.71，23.08，10.94；ESI-MS(20v)m/z 452(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺452.2432(452.2437计算值)。

实施例8

制备6-(3-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-67)

该化合物通过两种中间体来制备，各阶段相应于实施例4中所述。

实施例8a

制备N-(3-三氟甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

作为试剂B，3-三氟甲氧基苄基溴使用546.0μL(3.37mmol)，试剂A的使用量为499.1mg(3.16mmol)，而试剂C使用1.20mL(7.01mmol)。反应在回流下进行15小时。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷进行萃取。获得产物D，N-(3-三氟甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率94％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.82-7.71(m，4H)，7.47(d，J＝7.7Hz，1H)，7.42-7.38(m，2H)，7.22-7.20(m，1H)，5.19(s，2H)。

实施例8b

制备O-(3-三氟甲氧基苄基)羟胺盐酸盐

作为试剂D，N-(3-三氟甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用202.8mg(0.631mmol)，冰乙酸的使用量为10mL，而37％盐酸的使用量为2.00mL(63.6mmol)。反应在回流下进行4.5小时。获得产物(E)O-(3-三氟甲氧基苄基)羟胺盐酸盐，收率90％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ9.79(br s，3H)，7.54(dd，J＝8.6，7.9Hz1H)，7.43-7.36(m，3H)，4.90(s，2H)。

实施例8c

作为试剂F，(2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟)的使用量为14.1mg(0.043mmol)，来自实施例8b的试剂E的使用量为13.6mg(0.056mmol)，树脂G的使用量为124mg，而树脂H的使用量为35.0mg。反应进行64小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率34％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.52(s，1H)，7.40-7.26(m，3H)，7.14(d，7.9Hz，1H)，6.78(s，1H)，5.50(br s，1H)，5.20(s，2H)，3.91(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.67-1.24(m，12H)，0.94(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ170.93，153.79，149.25，147.91，143.91，140.79，135.01，129.65，123.51，120.46(q，J＝257.1Hz)，120.34，119.97，109.88，106.74，75.14，55.83，53.17，43.94，41.83，36.48，33.57，29.42，25.58，25.02，22.85，17.00；ESI-MS(20v)m/z 519(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 519.2102(519.2107计算值)。

实施例9

制备6-(3-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-63)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为11.0mg(0.035mmol)，来自实施例8b的试剂E的使用量为11.0mg(0.045mmol)，树脂G的使用量为141.3mg，而树脂H的使用量为35mg。反应进行64小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率25％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.49(s，1H)，7.37-7.23(m，3H)，7.12-7.11(m，1H)，6.76(s，1H)，5.43(br s，1H)，5.17(s，2H)，3.89(s，3H)，3.72(t，J＝8.5Hz，1H)，3.12(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H，2.32-1.17(m，12H)，0.75(s，3H)；ESI-MS(60v)m/z 506(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 506.2155(506.2154计算值)。

实施例10

制备6-(4-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-68)

实施例10a

制备N-(4-三氟甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

作为试剂B，4-三氟甲氧基苄基溴使用490.9μL(3.07mmol)，试剂A的使用量为455.0mg(2.79mmol)，而试剂C使用1.20mL(7.01mmol)。反应在回流下进行15小时。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷进行萃取。获得产物D，N-(4-三氟甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率91％。

[δ¹H NMR(CDCl₃)：δ7.82-7.70(m，4H)，7.57(d，J＝8.6Hz，2H)，7.21(d，J＝8.2Hz，2H)，5.18(s，2H)。

实施例10b

制备O-(4-三氟甲氧基苄基)羟胺盐酸盐

作为试剂D，N-(4-三氟甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用223.3mg(0.695mmol)，冰乙酸的使用量为10mL，而37％盐酸的使用量为2.00mL(63.6mmol)，反应在回流下进行4.5小时。获得产物E，O-(4-三氟甲氧基苄基)羟胺盐酸盐，收率93％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ10.78(br s，3H)，7.55(d，J＝8.5Hz，2H)，7.42(d，J＝8.4Hz，2H)，5.01(s，2H)。

实施例10c

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为14.2mg(0.043mmol)，来自实施例10b的试剂E的使用量为13.7mg(0.056mmol)，树脂G的使用量为133.4mg，而树脂H的使用量为35.0mg。反应进行64小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率85％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.94(br s，1H)，7.53(s，1H)，7.43(d，J＝8.4Hz，2H)，7.20(d，J＝8.2Hz，2H)，6.77(s，1H)，5.57(br s，1H)，5.18(s，2H)，3.91(s，3H)，3.18(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.63-1.23(m，12H)，0.93(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ170.71，153.57，148.67，147.89，143.91，137.05，134.95，129.58 123.55，120.80，120.44(q，J＝257.2Hz)，109.87，106.75，75.17，55.83，53.17，43.95，41.79，36.45，33.53，29.40，25.52，25.05，22.89，16.98；ESI-MS(20v)m/z519(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 519.2101(519.2107计算值)。

实施例11

制备6-(4-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-64)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为11.4mg(0.036mmol)，来自实施例10b的试剂E的使用量为11.4mg(0.047mmol)，树脂G的使用量为133.1mg，而树脂H的使用量为35mg。反应进行64小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率29％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.52(s，1H)，7.43(d，J＝8.7Hz，2H)，7.19(d，J＝7.9Hz，2H)，6.78(s，1H)，5.47(br s，1H)，5.17(s，2H)，3.91(s，3H)，3.74(t，J＝8.5Hz，1H)，3.12(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.34-1.17(m，12H)，0.76(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 506(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 506.2149(506.2154计算值)。

实施例12

制备6-(4-三氟甲硫基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-69)

实施例12a

制备N-(4-三氟甲硫基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

作为试剂B，4-三氟甲硫基苄基溴使用747.8mg(2.77mmol)，试剂A的使用量为475.5mg(2.91mmol)，而试剂C使用1.20mL(7.01mmol)。反应在回流下进行15小时。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷进行萃取。获得产物D，N-(4-三氟甲硫基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率95％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.86-7.73(m，4H)，7.68(d，J＝8.2Hz，2H)，7.61(d，J＝8.2Hz，2H)，5.25(s，2H)。

实施例12b

制备O-(4-三氟甲硫基苄基)羟胺盐酸盐

作为试剂D，N-(4-三氟甲硫基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用203.1mg(0.602mmol)，冰乙酸的使用量为10mL，而37％盐酸的使用量为2.00mL (63.6mmol)。反应在回流下进行4.5小时。获得产物E，O-(4-三氟甲硫基苄基)羟胺盐酸盐，收率84％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ10.36(br s，3H)，7.76(d，J＝8.1Hz，2H)，7.54(d，J＝8.3Hz，2H)，4.99(s，2H)。

实施例12c

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为15.5mg(0.047mmol)，来自实施例12b的试剂E的使用量为15.9mg(0.061mmol)，树脂G的使用量为116.9mg，而树脂H的使用量为35.0mg。反应进行64小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率68％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.90(br s，1H)7.64(d，J＝8.1Hz，2H)7.52(s，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，2H)，6.78(s，1H)，5.55(br s，1H)，5.22(s，2H)，3.91(s，3H)，3.21(dd，J＝17.9，4.6Hz，1H)，2.64-1.39(m，12H)，0.94(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ170.70，153.76，147.94，143.93，141.63，136.30，135.00，129.57(q，J＝308Hz)，128.84，123.46，109.90，106.77，75.15，53.17，43.97，41.80，36.45，33.54，29.42，25.52，25.08，22.90，16.99；ESI-MS(20v)m/z 535(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 535.1873(535.1878计算值)。

实施例13

制备6-(4-三氟甲硫基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-65)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为11.2mg(0.035mmol)，来自实施例12b的试剂E的使用量为11.9mg(0.046mmol)，树脂G的使用量为133.8mg，而树脂H的使用量为35mg。反应进行64小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率87％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.63(d，J＝8.2Hz，2H)7.51(s，1H)，7.44(d，J＝8.3Hz，2H)，6.78(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.21(s，2H)，3.90(s，3H)，3.16(dd，J＝18.1，4.6Hz，1H)，2.34-1.18(m，12H)，0.77(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 522(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺522.1922(522.1926计算值)。

实施例14

制备6-(4-吡啶基甲氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-15)

实施例14a

制备N-(4-吡啶基甲氧基)邻苯二甲酰亚胺

作为试剂B，(4-溴甲基)吡啶氢溴酸盐使用2.048g(8.098mmol)，试剂A的使用量为1.201g(7.362mmol)，而试剂C使用3.665mL(22.08mmol)。反应在室温下于50.0mL四氢呋喃中进行136小时。用3×50mL乙酸乙酯萃取。将合并的萃取液用水(50mL)、50％饱和盐水(100mL)和盐水(50mL)洗涤。甲苯中重结晶，获得产物D，N-(4-吡啶基甲氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率34％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.66(d，J＝5.4Hz，2H)，7.85-7.74(m，4H)，7.48(d，J＝5.6Hz，2H)，5.24(s，2H)。

实施例14b

制备O-(4-吡啶基甲基)羟胺二盐酸盐

作为试剂D，N-(4-吡啶基甲氧基)邻苯二甲酰亚胺使用103.3mg(0.602mmol)，37％盐酸的使用量为2.00mL(63.6mmol)。反应在回流下进行2.5小时。获得产物O-(4-吡啶基甲基)羟胺二盐酸盐(E)，收率50％。

¹H NMR(CD₃OD)：δ8.90(d，J＝6.1Hz，2H)，8.03(d，J＝6.1Hz，2H)，5.26(s，2H)。

实施例14c

制备6-(4-吡啶基甲氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-15)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为16.5mg(0.050mmol)，来自实施例14b的试剂E的使用量为12.8mg(0.065mmol)，树脂G的使用量为172.4mg，而树脂H的使用量为37.1mg。反应进行90小时。通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(3∶1)]纯化。获得产物2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亚氨基雌酮-17肟，收率46％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ10.13(br s，1H)，8.54(d，J＝4.7Hz，2H)，7.35(d，J＝4.8Hz，2H)，7.22(s，1H)，6.81(s，1H)，5.19(s，2H)，3.77(s，3H)，3.14(dd，J＝17.6，4.5Hz，1H)，2.56-1.20(m，12H)，0.83(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃+DMSO-d6)δ154.85，149.67，149.29，149.12，144.98，134.98，122.38，110.53，110.49，108.64，80.29，73.56，55.78，50.17，43.02，41.75，37.51，36.45，30.26，29.52，25.68，23.08，11.48；ESI-MS(20v)m/z 436(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 436.2225(436.2236计算值)。

实施例15

制备6-(4-吡啶基甲氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-16)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为13.7mg(0.043mmol)，来自实施例14b的试剂E的使用量为11.1mg(0.056mmol)，树脂G的使用量为140.2mg，而树脂H的使用量为32.5mg。反应进行90小时。通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(3∶1)]纯化。获得产物2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亚氨基雌二醇，收率52％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.58(d，J＝4.9Hz，1H)，7.47(s，2H)，7.33(d，J＝4.9Hz，2H)，6.78(s，1H)，5.21(s，2H)，3.90(s，3H)，3.75(t，J＝8.4Hz)，3.16(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.37-1.20(m，12H)，0.78(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 423(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 423.2271(423.2283计算值)。

实施例16

制备6-(4-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-38)

实施例16a

制备N-(4-氰基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

作为试剂B，4-氰基苄基溴使用773.4mg(3.95mmol)，试剂A的使用量为585.0mg(3.59mmol)，而试剂C使用1.35mL(7.89mmol)。反应在回流下进行20小时。用3×50mL二氯甲烷进行萃取。将合并的萃取液用水(50mL)、50mL盐水洗涤。获得产物D，N-(4-氰基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率73％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ7.89(d，J＝8.2Hz，2H)，7.85(m，4H)，7.73(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27(s，2H)。

实施例16b

制备O-(4-氰基苄基)羟胺盐酸盐

作为试剂D，N-(4-氰基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用143.1mg(0.514mmol)。反应在回流下进行3小时。获得产物O-(4-氰基苄基)羟胺盐酸盐(E)，收率70％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ7.89(d，J＝8.1Hz，2H)，7.59(d，J＝7.9Hz，2H)，5.02(s，2H)。

实施例16c

制备6-(4-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-38)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为14.0mg(0.043mmol)，来自实施例16b的试剂E的使用量为10.2mg(0.055mmol)，树脂G的使用量为200mg，而树脂H的使用量为48.0mg。反应进行64小时。获得产物2-甲氧基-6-(4-氰基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率74％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.64(d，J＝8.2Hz，2H)，7.49(d，J＝8.4Hz，2H)，7.48(s，1H)，6.77(s，1H)，5.55(br s，1H)，5.22(s，2H)，3.91(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.60-1.25(m，12H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 460(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺460.2235(460.2236计算值)。

实施例17

制备6-(4-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-37)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为11.7mg(0.037mmol)，来自实施例16b的试剂E的使用量为8.9mg(0.046mmol)，树脂G的使用量为200mg，而树脂H的使用量为49mg。反应进行64小时，获得产物2-甲氧基-6-(4-氰基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率77％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.64(d，J＝8.0Hz，2H)，7.48(d，J＝8.6Hz，2H)，7.47(s，1H)，6.78(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.22(s，2H)，3.90(s，3H)，3.73(t，J＝9.0Hz，1H)，3.13(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.18-1.22(m，12H)，0.77(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ154.41，147.95，144.14，143.82，135.46，132.15，128.24，123.36，118.92，111.26，109.78，106.80，81.58，74.87，55.82，50.43，43.00，41.77，37.20，36.16，30.52，29.52，25.67，23.07，10.94；ESI-MS(60v)m/z 447(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 447.2275(447.2284计算值)。

实施例18

制备6-(3-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-51)

实施例18a

制备N-(3-氰基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

作为试剂B，3-氰基苄基溴使用773.4mg(3.95mmol)，试剂A的使用量为585.0mg(3.59mmol)，而试剂C使用1.35mL(7.89mmol)。反应在回流下进行20小时。用3×50mL二氯甲烷进行萃取。将合并的萃取液用水(50mL)、50mL盐水洗涤。获得产物D，N-(3-氰基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率73％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.85-7.75(m，6H)，7.68(d，J＝7.9Hz，1H)，7.53(dd，J＝8.1，7.8Hz，1H)，5.23(s，2H)。

实施例18b

制备O-(3-氰基苄基)羟胺盐酸盐

作为试剂D，N-(3-氰基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用143.1mg(0.514mmol)。反应在回流下进行3小时。获得产物O-(3-氰基苄基)羟胺盐酸盐(E)，收率70％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ10.75(br s，3H)，7.88-7.85(m，2H)，7.75(d，J＝7.9Hz，1H)，7.64(dd，J＝7.9，7.8Hz，1H)，5.05(s，2H)。

实施例18c(CP-DM-4-51)

制备6-(3-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为14.0mg(0.043mmol)，来自实施例18b的试剂E的使用量为10.2mg(0.055mmol)，树脂G的使用量为200mg，而树脂H的使用量为48.0mg。反应进行64小时。通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(2∶3)]纯化。获得产物2-甲氧基-6-(3-氰基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率74％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.78(br，s1H)，7.68(s，1H)，7.62(d，J＝7.8Hz，1H)，7.59(d，J＝7.7Hz，1H)，7.48-7.44(m，2H)，6.78(s，1H)，5.55(br s，1H)，5.20(s，2H)，3.91(s，3H)，3.22(dd，J＝17.9，4.4Hz，1H)，2.65-1.25(m，12H)，0.94(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ171.19，154.00，148.02，143.94，140.11，135.02，132.26，131.38，131.27，129.10，123.32，118.89，112.44，109.85，106.77，74.73，55.85，53.19，44.07，41.77，36.45，33.51，29.40，25.54，25.27，22.88，16.97；ESI-MS(20v)m/z 460(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺460.2231(460.2236计算值)。

实施例19

制备6-(3-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-52)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为11.7mg(0.037mmol)，来自实施例18b的试剂E的使用量为8.9mg(0.046mmol)，树脂G的使用量为200mg，而树脂H的使用量为49mg。反应进行64小时。获得产物2-甲氧基-6-(3-氰基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率77％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.67(s，1H)，7.61(d，J＝7.7Hz，1H)，7.57(d，J＝7.7Hz，1H)，7.53-7.43(m，2H)，6.78(s，1H)，5.54(brs，1H)，5.19(s，2H)，3.90(s，3H)，3.74(t，J＝8.5Hz，1H)3.12(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.34-1.22(m，12H)，0.77(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ154.43，147.95，143.82，140.23，135.48，132.20，131.31，131.22，129.07，123.39，118.89，112.41，109.80，106.83，81.59，74.64，55.82，50.43，43.00，41.76，37.20，36.17，30.53，29.53，25.67，23.07，10.93；ESI-MS(20v)m/z 447(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺447.2283(447.2284计算值)。

实施例20

制备6-(4-甲基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-76)

该化合物通过如下所述的两种中间体来制备。

实施例20a

制备N-(4-甲基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

使用与以上实施例4中所描述的相同的方法，具有如下的变化。

作为试剂B，4-甲基苄基溴使用590.3μL(2.90mmol)，试剂A的使用量为590.3mg(3.19mmol)，而试剂C使用1.20mL(7.01mmol)。反应在回流下进行15小时。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷进行萃取。获得产物D，N-(4-甲基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率90％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.82-7.72(m，4H)，7.42(d，J＝8.1Hz，1H)，7.18(d，J＝7.9Hz，2H)，5.17(s，2H)，2.35(s，3H)。

实施例20b

制备O-(4-甲基苄基)羟胺盐酸盐

作为试剂D，N-(4-甲基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用214.8mg(0.855mmol)，冰乙酸的使用量为10mL，而37％盐酸的使用量为2.00mL(63.6mmol)。反应在回流下进行4.5小时。获得产物O-(4-甲基苄基)羟胺盐酸盐(E)，收率21％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ9.77(br s，3H)，7.26(d，J＝8.0Hz，2H)，7.20(d，J＝7.9Hz，2H)，4.81(s，2H)，2.30(s，3H)。

实施例20c

制备6-(4-甲基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-76)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为8.8mg(0.027mmol)，来自实施例20b的试剂E的使用量为6.0mg(0.035mmol)，树脂G的使用量为107.1mg，而树脂H的使用量为40.3mg。反应进行90小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(4-甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率43％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.56(s，1H)，7.32(d，J＝7.8Hz，2H)，7.17(d，J＝7.9Hz，2H)，6.77(s，1H)，5.50(br s，1H)，5.15(s，2H)，3.91(s，3H)，3.22(dd，J＝18.1，4.4Hz，1H)，2.63-1.24(m，12H)，2.35(s，3H)，0.92(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 449(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 449.2435(449.2440计算值)。

实施例21

制备6-(4-甲基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-78)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为6.2mg(0.020mmol)，来自实施例20b的试剂E的使用量为4.4mg(0.025mmol)，树脂G的使用量为120.4mg，而树脂H的使用量为22.3mg。反应进行90小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(4-甲基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率25％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.54(s，1H)，7.31(d，J＝7.7Hz，2H)，7.16(d，J＝7.7Hz，2H)，6.76(s，1H)，5.45(br s，1H)，5.14(s，2H)，3.90(s，3H)，3.10(dd，J＝18.1，4.6Hz，1H)，2.34(s，3H)，2.33-1.17(m，12H)，0.75(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 436(100)[M+H]⁺。

实施例22

制备6-(4-异丙基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-77)

该化合物通过如下所述的两种中间体来制备。

实施例22a

制备N-(4-异丙基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

作为试剂B，4-异丙基苄基溴使用563.0μL(2.99mmol)，试剂A的使用量为488.5mg(3.29mmol)，而试剂C使用1.20mL(7.01mmol)。反应在回流下进行15小时。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷进行萃取。获得产物D，N-(4-异丙基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率98％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.86-7.71(m，4H)，7.47(d，J＝8.0Hz，2H)，7.24(d，J＝8.1Hz，2H)，5.18(s，2H)，2.91(七重峰，J＝6.9Hz，1H)，1.24(s，3H)，1.23(s，3H)。

实施例22b

制备O-(4-异丙基苄基)羟胺盐酸盐

作为试剂D，N-(4-异丙基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用208.6mg(0.747mmol)，冰乙酸的使用量为10mL，而37％盐酸的使用量为2.00mL(63.6mmol)。反应在回流下进行4.5小时。获得产物O-(4-异丙基苄基)羟胺盐酸盐(E)，收率24％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ7.33-7.20(m，4H)，4.80(s，2H)，2.89(七重峰，J＝7.0Hz，1H)，1.20(s，3H)，1.18(s，3H)。

实施例22c

制备6-(4-异丙基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-77)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为6.3mg(0.019mmol)，来自实施例22b的试剂E的使用量为4.1mg(0.025mmol)，树脂G的使用量为106.4mg，而树脂H的使用量为35.1mg。反应在回流下进行90小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(4-异丙基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率21％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.57(s，1H)，7.35(d，J＝8.1Hz，2H)，7.22(d，J＝8.1Hz，2H)，6.77(s，1H)，5.47(br s，1H)，5.16(s，2H)，3.91(s，3H)，3.19(dd，J＝17.9，4.6Hz，1H)，2.91(七重峰，J＝7.0Hz，1H)2.63-1.20(m，12H)，1.44(s，3H)，1.43(s，3H)，0.92(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 477(100)[M+H]⁺。

实施例23

制备6-(3-硝基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-3-105)

该化合物通过如下所述的两种中间体来制备。

实施例23a

制备N-(3-硝基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

在氮气氛下向在25mL无水四氢呋喃中的N-羟基邻苯二甲酰亚胺(试剂A)(1.059g，6.418mmol)中加入3-硝基苄基溴(试剂B)(1.543mL，7.141mmol)。然后搅拌下滴加N，N-二异丙基乙胺(试剂C)(2.155mL，12.98mmol)，立即产生颜色变化。反应物在室温下保持19小时。然后将反应混合物用25mL四氢呋喃和100mL水稀释，之后用3×100mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机部分用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，之后用无水硫酸钠干燥。通过闪蒸硅胶色谱法[二氯甲烷]纯化。真空蒸发得到877.6mg白色固体(D)(45％)。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.39(dd，J＝1.9，1.9Hz，1H)，8.25(dd，J＝8.2，2.3Hz，1H)，7.95(d，J＝7.7Hz，1H)，7.60(dd，J＝8.0，7.9Hz，1H)，7.84-7.75(m，4H)，5.30(s，2H)。

实施例23b

制备O-(3-硝基苄基)羟胺盐酸盐

将N-(3-硝基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺(D，来自实施例23b)(166.2mg，0.557mmol)加入15mL乙醇中，并加入一定量的二氯甲烷(7.5mL)。在氮气氛和搅拌下将肼水合物(试剂1)(29.8μL，0.613mmol)加入反应物中。将反应物加热回流，在此温度下保持18小时，之后冷却至室温。将反应物真空蒸发，并悬浮于5mL乙醇中，将悬浮液在室温下搅拌2小时，之后通过过滤除去固体。将残余物用另外的3mL乙醇洗涤。将滤液和洗液合并，蒸发，并通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(2∶3)]纯化。将得到的油状物溶解在乙醇(2mL)中，之后加入盐酸(1M，在乙醚中)和乙醚20mL，得到白色沉淀。过滤固体，进一步用乙醚洗涤，得到产物(E)，收率94％。

¹H NMR(CD₃OD)：δ8.39-8.20(m，2H)，7.84(d，J＝7.6Hz，1H)，7.70(dd，J＝8.1，7.9Hz，1H)，5.11(s，2H)。

实施例23c

制备2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基-雌酮-17-肟(CP-DM-3-105)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为14.7mg(0.045mmol)，来自实施例23b的试剂E的使用量为11.9mg(0.058mmol)，树脂G的使用量为72.1mg，而树脂H的使用量为33.5mg。反应物进行28小时。通过聚乙烯玻璃料滤过。获得产物2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率为68％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.26(s，1H)，8.16(d，J＝8.1Hz，1H)，7.73(d，J＝7.6Hz，1H)，7.51(dd，J＝8.0，7.9Hz，1H)，7.49(s，1H)，7.41(br s，1H)，6.78(s，1H)，5.52(br s，1H)，5.27(s，2H)，3.91(s，3H)，3.23(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.63-1.22(m，12H)，0.94(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ170.81，154.22，148.31，148.02，143.91，140.78，135.12，133.96，129.25，123.29，122.80，122.63，109.85，106.77，74.64，55.84，53.15，43.95，41.83，36.48，33.55，29.44，25.55，25.05，22.88，17.01；ESI-MS(20v)m/z 480(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 480.2135(480.2135计算值)。

实施例24

制备2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇(CP-DM-3-106)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为16.3mg(0.052mmol)，来自实施例23b的试剂E的使用量为26.3mg(0.129mmol)，树脂G的使用量为60mg，而树脂H的使用量为193mg。反应进行60小时。通过聚乙烯玻璃料过滤。获得产物2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率为92％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.25(d，J＝1.6Hz，1H)，8.15(dd，J＝8.1Hz，2.1Hz，1H)，7.72(d，J＝7.7Hz，1H)，7.52(dd，J＝8.1，7.9Hz，1H)，7.48(s，1H)，6.78(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.26(s，2H)，3.90(s，3H)，3.75(t，J＝8.6Hz，1H)，3.15(dd，J＝18.0，4.6Hz，1H)，2.36-1.20(m，12H)，0.77(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ154.60，148.30，147.96，143.80，140.80，135.52，133.90，129.23，123.36，122.74，122.57，109.80，106.82，81.60，74.55，55.81，50.41，43.00，41.77，37.21，36.15，30.53，29.56，25.67，23.05，10.93；ESI-MS(20v)m/z467(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 467.2179(467.2182计算值)。

实施例25

制备2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(CP-DM-3-117)

该化合物通过如下所述的两种中间体来制备。

实施例25a

制备N-(2-硝基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

使用与以上实施例23a中所描述的相同的方法，具有如下的变化。

作为试剂B，2-硝基苄基溴使用1.6306g(7.548mmol)，来自实施例23a的试剂A的使用量为1.1193g(6.861mmol)，而试剂C使用2.277mL(13.72mmol)。反应在室温下进行41小时。将另外量的试剂B[2-硝基苄基溴](313.5mg，1.45mmol)加入反应混合物中，反应在室温下持续另外48小时。将反应物用水(50mL)稀释。氯仿重结晶获得产物D，N-(2-硝基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率为51％。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.14(d，J＝8.3Hz，1H)，8.01(d，J＝7.8Hz)，7.90-7.68(m，5H)，7.54(dd，J＝8.3，7.8Hz，1H)，5.65(s，2H)。

实施例25b

制备O-(2-硝基苄基)羟胺盐酸盐

使用与以上实施例23b中所描述的相同的方法，具有如下的变化。

作为试剂D，N-(2-硝基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用188.4mg(0.632mmol)，试剂I的使用量为33.8μL(0.695mmol)。反应在15mL乙醇中回流下进行20小时。加入另外量的试剂I(5μL，0.103mmol)，反应在回流下持续另外24小时。获得产物O-(2-硝基苄基)羟胺盐酸盐(E)，收率为23％。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.17(d，J＝8.3Hz，1H)，7.51-7.83(m 3H)，5.44(s，2H)。

实施例25c

制备2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(CP-DM-3-117)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为13.5mg(0.041mmol)，来自实施例25b的试剂E的使用量为10.5mg(0.051mmol)，树脂G的使用量为80mg，而树脂H的使用量为35mg。反应进行66小时。获得产物2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率为88％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.05(d，J＝8.1Hz，1H)，7.61(m，2H)，7.46-7.40m，2H)，6.77(s，1H)，5.59(s，2H)，3.91(s，3H)，3.25(dd，J＝18.1，4.6Hz，1H)，2.71-1.24(m，12H)，1.00(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 480(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 480.2136(480.2135计算值)。

实施例26

制备2-甲氧基6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇(CP-DM-3-124)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为16.3mg(0.052mmol)，来自实施例25b的试剂E的使用量为15.8mg(0.077mmol)，树脂G的使用量为98.3mg，而树脂H的使用量为52mg。反应进行48小时。通过将产物溶于甲醇(8mL)中并用C18柱(装载300mg)过滤来纯化。获得产物2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率为99％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.06(d，J＝8.4Hz，1H)，7.63-7.57(m，2H)，7.46-7.38，m，2H)，7.49(s，1H)，6.78(s，1H)，5.59(s，2H)，3.90(s，3H)，3.76(t，J＝8.6Hz，1H)，3.19(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.34-1.20(m，12H)，0.77(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 467(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 467.2179(467.2182计算值)。

实施例27

制备2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(CP-DM-4-6)

该化合物通过如下所述的两种中间体来制备。

实施例27a

制备N-(4-甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

作为试剂B，4-甲氧基苄基溴使用0.9777g(7.204mmol)，来自实施例23a试剂A的使用量为1.0684g(6.549mmol)，而来自实施例23a的试剂C使用2.173mL(13.10mmol)。反应在室温下进行41小时。将另外量的试剂B[4-甲氧基苄基氯](250.0μL，1.835mmol)加入反应混合物中，反应在室温下持续另外40小时。用水(50mL)稀释反应物。获得产物D，N-(4-甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，粗收率为72％。

¹H NMR(CDCl₃)inter alia δ7.83-7.77(m，2H)，7.76-7.70(m，2H)，7.45(d，J＝8.4Hz，2H)，7.29(d，J＝8.4Hz，2H)，5.15(s，2H)，3.81(s，3H)。

实施例27b

制备O-(4-甲氧基苄基)羟胺盐酸盐

作为粗试剂D，N-(4-甲氧基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用291.9mg(1.030mmol)，而试剂I的使用量为101.3μL(2.084mmol)。反应在6mL乙醇和3mL二氯甲烷中回流下进行21小时。获得产物O-(4-甲氧基苄基)羟胺盐酸盐(E)，收率为23％。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.36(d，J＝8.7Hz，2H)，6.97(d，J＝8.7Hz，2H)，4.92(s，2H)，3.81(s，3H)。

实施例27c

制备2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(CP-DM-4-6)

作为试剂F，(2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟)的使用量为19.7mg(0.060mmol)，来自实施例27b的试剂E的使用量为11.5mg(0.075mmol)，树脂G的使用量为100.4mg，而树脂H的使用量为117.6mg。反应进行24小时。将来自实施例27b的另外量的试剂E加入反应混合物(4.9mg，0.032mmol)中，反应持续另外44小时。获得产物2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率为70％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.57(s，1H)，7.37(d，J＝8.5Hz，2H)，6.90(d，J＝8.5Hz，2H)，6.76(s，1H)，5.54(br s，1H)，5.12(s，2H)，3.91(s，3H)，3.81(s，3H)，3.16(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.62-1.39(m，12H)，0.92(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ170.82，159.26，153.05，147.74，143.89，134.82，130.31，130.05，123.88，113.69，109.91，106.72，75.94，55.84，55.24，53.19，43.96，41.80，36.46，33.55，29.41，25.55，25.05，22.90，16.98；ESI-MS(20v)m/z 465(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 465.2382(465.2390计算值)。

实施例28

制备2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇(CP-DM-4-5)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量为17.3mg(0.055mmol)，来自实施例27b的试剂E的使用量为10.5mg(0.068mmol)，树脂G的使用量为86.6mg，而树脂H的使用量为91.3mg。反应进行24小时。将另外量的试剂E加入反应混合物(3.5mg，0.022mmol)中，反应持续另外40小时。通过将产物溶于甲醇(8mL)中并用C18柱(装载300mg)过滤来纯化。获得产物2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇，收率为80％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.56(s，1H)，7.36(d，J＝8.5Hz，2H)，6.89(d，J＝8.7Hz，2H)，6.77(s，1H)，5.51(br s，1H)，5.11(s，2H)，3.90(s，3H)，3.81(s，3H)，3.72(t，J＝8.3Hz，1H)，3.16(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.35-1.14(m，12H)，0.75(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 452(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 452.2435(452.2437计算值)。

实施例29

制备2-甲氧基-6-(3-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(CP-DM-3-118)

该化合物通过如下所述的两种中间体来制备。

实施例29a

制备N-(3-三氟甲基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺

作为试剂B，3-三氟甲基苄基溴使用1.1019g(7.214mmol)，试剂A的使用量为1.070g(6.559mmol)，而试剂C使用2.246mL(13.18mmol)。反应在室温下进行41小时。将另外量的试剂B[3-三氟甲基苄基溴](250.0mg，1.63mmol)加入反应混合物中，反应在室温下持续另外48小时。将反应物用水(50mL)稀释。通过闪蒸硅胶色谱法[甲苯，然后二氯甲烷]纯化。获得产物D，N-(3-三氟甲基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺，收率为39％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.89-7.72(m，6H)，7.64(d，J＝7.8Hz，1H)，7.53(dd，J＝8.0，7.6Hz，1H)，5.26(s，2H)。

实施例29b

制备O-(3-三氟甲基苄基)羟胺盐酸盐

作为试剂D，N-(3-三氟甲基苄氧基)邻苯二甲酰亚胺使用588.0mg(1.737mmol)，而试剂I的使用量为101.3μL(2.084mmol)。反应在乙醇(6mL)和二氯甲烷(3mL)中回流下进行16小时。加入另外量的乙醇(5mL)和二氯甲烷(2.5mL)，反应在回流下持续另外5小时。获得产物O-(3-三氟甲基苄基)羟胺盐酸盐(E)，收率为13％。

¹H NMR(CD₃OD)：δ7.78-7.60(m，4H)，5.10(s，2H)。

实施例29c

制备2-甲氧基-6-(3-三氟甲基苄氧基)亚氨基-雌酮-17-肟(CP-DM-3-118)

作为试剂F，(2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟)的使用量为7.5mg(0.023mmol)，来自实施例29b的试剂E的使用量为6.5mg(0.029mmol)，树脂G的使用量为80mg，而树脂H的使用量为30mg。反应进行66小时。通过LC-CN固相萃取柱过滤。获得产物2-甲氧基-6-(3-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟，收率为95％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.66(br s，1H)，7.62-7.44(m，4H)，6.78(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.23(s，2H)，3.91(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.62-1.16(m，12H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 503(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 503.2155(503.2158计算值)。

实施例30

制备6-(2，4-二硝基苯基亚肼基)-2-甲氧基-雌酮-17-肟(CP-DM-3-119)

作为试剂F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量为11.6mg(0.035mmol)，试剂E(2，4-二硝基苯肼)的使用量为8.7mg(0.044mmol)，树脂G的使用量为80mg，而树脂H的使用量为35mg。将一定量的盐酸(37％，100.0μL)加入反应物中。反应在室温下进行16小时。通过将产物溶于甲醇(8mL)中并用C18柱(装载300mg)过滤来纯化。获得产物6-(2，4-二硝基苯基亚肼基)-2-甲氧基-雌酮-17-肟，收率为24％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ9.16(d，J＝2.1Hz，1H)，8.38(dd，J＝9.7，2.1Hz，1H)，8.15(d，J＝9.7Hz，1H)，7.79(s，1H)，6.84(s，1H)，3.97(s，3H)，2.99(dd，J＝16.7，4.9Hz)，2.66-1.11(m，12H)，0.98(s，1H)；ESI-MS(20v)m/z 508(100)[M-H]^-；HRESI-MS：[M-H]^-508.1825(508.1832计算值)。

实施例31

制备雌酮-17-(4-硝基苄基)肟(CP-DM-3-101)

在氮气氛下将雌酮(16.0mg，0.059mmol)、O-(4-硝基苄基)羟胺(30.3mg，0.148mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，81.3mg)都加入反应器中，并在搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。反应在室温下进行24小时，之后回流24小时。将反应物真空蒸发，并将PS-苯甲醛树脂(222mg，1.20mmolg^-1)加入反应器中。将反应混合物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，室温下搅拌60小时，之后通过聚乙烯玻璃料过滤，进一步用2×5mL四氢呋喃洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到浅黄色固体，将其悬浮于甲醇(5mL)中。将该悬浮液通过C18柱(装载300mg)，用另外量的甲醇(2mL)洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到产物雌酮-17-(4-硝基苄基)肟，收率86％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.20(d，J＝8.6Hz，2H)，7.49(d，J＝8.8Hz，2H)，7.14(d，J＝8.4Hz，1H)，6.62(dd，J＝8.4，2.7Hz，1H)，6.56(d，J＝2.6Hz，1H)，5.17(s，2H)，4.93(br s，1H)，2.92-1.22(m，15H)，0.94(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ171.89，153.45，147.26，146.32，138.01，132.24，127.99，126.45，123.48，115.24，112.74，73.89，52.92，44.51，43.91，38.11，34.09，29.47，27.17，26.15，22.97，17.30；ESI-MS(20v)m/z 421(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺421.2122(421.2127计算值)。

实施例32

制备2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基苄基)肟(CP-DM-3-103)

在氮气氛下将2-甲氧基雌酮(9.8mg，0.033mmol)、O-(4-硝基苄基)羟胺[可商购获得](16.7mg，0.082mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，72.9mg)都加入反应器中，并在搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。将反应在室温下进行24小时，之后回流16小时。将反应物真空蒸发，并将PS-苯甲醛树脂(122mg，1.20mmolg^-1)加入反应器中。将反应混合物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，室温下搅拌60小时，之后通过聚乙烯玻璃料过滤，进一步用2×5mL四氢呋喃洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到浅黄色固体，将其悬浮于甲醇(5mL)中。将该悬浮液通过C18柱(装载300mg)，用另外量的甲醇(2mL)洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到产物2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基苄基)肟，收率73％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.18(d，J＝8.7Hz，2H)，7.48(d，J＝8.6Hz，2H)，6.76(s，1H)，6.63(s，1H)，5.47(br s，1H)，5.16(s，1H)，3.84(s，3H)，2.88-1.22(m，15H)，0.93(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ171.79，147.23，146.35，144.60，131.31，129.26，127.96，123.47，114.58，107.94，73.88，56.03，52.91，44.46，44.20，38.09，34.12，28.84，27.29，26.44，26.14，22.94，17.31；ESI-MS(20v)m/z 451(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 451.2222(451.2233计算值)。

实施例33

制备雌酮-17-(3-硝基苄基)肟(CP-DM-3-102)

试剂O-(3-硝基苄基)羟胺通过上述实施例23a和23b的方法制备。

在氮气氛下将雌酮(14.9mg，0.055mmol)、O-(3-硝基苄基)羟胺[来自实施例23b](28.2mg，0.138mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，91.5mg)都加入反应器中，并在搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。反应在室温下进行24小时，之后回流24小时。将反应物真空蒸发，将PS-苯甲醛树脂(207mg，1.20mmolg^-1)加入反应器中。将反应混合物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，室温下搅拌60小时，之后通过聚乙烯玻璃料过滤，进一步用2×5mL四氢呋喃洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到浅黄色固体，将其悬浮于甲醇(5mL)中。将该悬浮液通过C18柱(装载300mg)，用另外量的甲醇(2mL)洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到产物雌酮-17-(3-硝基苄基)肟，收率77％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.23(br s，1H)，8.14(dd，J＝8.3，2.0Hz，1H)，7.66(d，J＝7.5Hz，1H)，7.51(dd，J＝7.9，7.8Hz，1H)，7.14(d，8.5Hz，1H)，6.63(dd，J＝8.4，2.8Hz，1H)，6.57(d，J＝2.7Hz，1H)，5.16(s，2H)，4.78(br s，1H)，2.92-1.22(m，15H)，0.94(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ172.18，153.61，148.46，141.10，138.27，133.86，132.53，129.34，126.71，122.84，122.66，115.44，112.94，74.07，53.11，44.74，44.13，38.32，34.32，29.71，27.39，26.40，23.20，17.51；ESI-MS(20v)m/z 421(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺421.2122(421.2127计算值)。

实施例34

制备2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基苄基)肟(CP-DM-3-104)

试剂O-(3-硝基苄基)羟胺通过上述实施例23a和23b的方法制备。

在氮气氛下将2-甲氧基雌酮(9.7mg，0.032mmol)、O-(3-硝基苄基)羟胺[来自实施例23b](16.5mg，0.081mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，63.3mg)都加入反应器中，并在搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。反应在室温下进行24小时，之后回流16小时。将反应物真空蒸发，并将PS-苯甲醛树脂(121mg，1.20mmolg^-1)加入反应器中。将反应混合物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，室温下搅拌60小时，之后通过聚乙烯玻璃料过滤，进一步用2×5mL四氢呋喃洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到浅黄色固体，将其悬浮于甲醇(5mL)中。将该悬浮液通过C18柱(装载300mg)，用另外量的甲醇(2mL)洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到产物2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基苄基)肟，收率76％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.24(s，1H)，8.15(dd，J＝8.8，2.1Hz，1H)，7.66(d，J＝7.6Hz，1H)，7.51(dd，J＝8.0，7.8Hz，1H)，7.14(d，8.5Hz，1H)，6.78(s，1H)，6.65(s，1H)，5.45(br s，1H)，5.16(s，2H)，3.86(s，3H)，2.94-1.24(m，15H)，0.95(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 451(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 451.2214(451.2233计算值)。

实施例35

制备雌酮-17-(4-甲氧基苄基)肟(CP-DM-4-33)

试剂O-(4-甲氧基苄基)羟胺通过上述实施例27a和27b的方法制备。

在氮气氛下将雌酮(4.2mg，0.016mmol)、O-(4-甲氧基苄基)羟胺[来自实施例27b](4.4mg，0.023mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，101.9mg)都加入反应器中，并在搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。反应在回流下进行48小时。将反应物真空蒸发，并将PS-苯甲醛树脂(44mg，1.20mmolg^-1)加入反应器中。将反应混合物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，室温下搅拌70小时，之后通过LC-C18固相萃取柱过滤，进一步用4×5mL四氢呋喃洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到雌酮-17-(4-甲氧基苄基)肟，收率为94％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ9.00(s，1H)，7.26(d，J＝8.5Hz，2H)，7.03(d，J＝8.6Hz，1H)，6.89(d，J＝8.6Hz，2H)，6.49(d，J＝8.4Hz，1H)，6.42(s，1H)，4.90(s，2H)，3.73(s，3H)，2.77-1.16(m，15H)，0.86(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 406(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 406.2377(406.2382计算值)。

实施例36

制备2-甲氧基雌酮-17-(4-甲氧基苄基)肟(CP-DM-4-34)

在氮气氛下将2-甲氧基雌酮(4.6mg，0.015mmol)、O-(4-甲氧基苄基)羟胺[来自实施例27b](4.4mg，0.023mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，98.6mg)都加入反应器中，并在搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。反应在回流下进行48小时。将反应物真空蒸发，将PS-苯甲醛树脂(50mg，1.20mmolg^-1)加入反应器中。将反应混合物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，室温下搅拌70小时，之后通过LC-C18固相萃取柱过滤，进一步用4×5mL四氢呋喃洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到2-甲氧基雌酮-17-(4-甲氧基苄基)肟，收率88％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ8.56(br s，1H)，7.26(d，J＝8.2Hz，2H)，6.89(d，J＝8.4Hz，2H)，6.76(s，1H)，6.44(s，1H)，4.91(s，2H)，3.74(s，3H)，3.71(s，3H)2.72-1.13(m，15H)，0.87(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 436(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 436.2491(436.2488计算值)。

实施例37

制备6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基雌三醇(CP-DM-4-88)

试剂O-(3，5-二氟苄基)羟胺通过上述实施例4a和4b的方法制备。

在氮气氛下将6-氧代-雌三醇(8.4mg，0.028mmol)、O-(3，5-二氟苄基)羟胺[来自实施例4b](10.9mg，0.056mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，150mg)都加入反应器中，并在搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。反应在回流下进行48小时。将反应物真空蒸发，并将PS-苯甲醛树脂(69.7mg，1.20mmolg^-1)加入反应器中。将反应混合物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，室温下搅拌2.5小时，之后通过LC-CN固相萃取柱过滤，进一步用3×5mL四氢呋喃洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到白色固体，通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(2∶1)]纯化，得到产物6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基雌三醇，收率86％。

¹H NMR(CD₃OD/CDCl₃)：δ7.31(d，J＝2.7Hz，1H)，7.13(d，J＝8.6Hz，1H)，6.92-6.86(m，2H)，6.77(dd，J＝8.4，2.7Hz，1H)，6.73(tt，J＝6.8，2.2Hz，1H)，5.14(s，2H)，4.08-4.02(m，1H)，3.46(d，J＝5.9Hz，1H)，3.08(dd，J＝18.2，4.3Hz，1H)，2.30-1.23(m，10H)，0.73(s，3H)；ESIMS(20v)m/z 444(100)[M+H]⁺。

实施例38

制备2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇-17-乙酸酯(CP-DM-4-91)

在氮气氛下将2-甲氧基雌二醇-17-乙酸酯(16.3mg，0.045mmol)、O-(4-硝基苄基)羟胺(18.6mg，0.091mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，150mg)都加入反应器中，并在搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。反应在回流下进行48小时。将反应物真空蒸发，并将PS-苯甲醛树脂(113.6mg，1.20mmolg^-1)加入反应器中。将反应混合物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，室温下搅拌2.5小时，之后通过LC-CN固相萃取柱过滤，进一步用3×5mL四氢呋喃洗涤。蒸发合并的滤液和洗液，得到产物2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇-17-乙酸酯，收率92％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.21(d，J＝8.4Hz，2H)，7.53(d，J＝8.6Hz，2H)，7.46(s，1H)，6.76(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.26(s，2H)，4.69(t，J＝8.5Hz，1H)，3.90(s，3H)，3.15(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.28-1.31(m，12H)，2.07(s，3H)，0.81(s，3H)；ESIMS(20v)m/z 509(100)[M+H]⁺。

实施例39

制备2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基-雌酮-17-甲基肟(CP-DM-4-75)

该化合物通过如下所述的四种中间体来制备。

实施例39a

制备2-甲氧基雌酮-17-甲基肟

在氮气氛和搅拌下将2-甲氧基雌酮(98.3mg，0.327mmol)溶于甲醇(12mL)中，并加入甲氧胺盐酸盐(82.0mg，0.981mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，207.0mg)。反应在回流下进行21小时，之后真空蒸发。将混合的固体悬浮于二氯甲烷(10mL)中，通过LC-CN固相萃取柱过滤，用另外的5mL二氯甲烷洗涤。真空蒸发得到无定形白色固体，收率为99％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ6.90(s，1H)，6.74(s，1H)，3.84(s，3H)，3.81(s，3H)，2.81-1.37(m，15H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 330(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 330.2082(330.2069计算值)。

实施例39b

制备2-甲氧基雌酮-17-甲基肟-3-乙酸酯

在室温和氮气氛下将2-甲氧基雌酮-17-甲基肟(106.5mg，0.323mmol)溶于吡啶(2.0mL，24.80mmol)中，搅拌下滴加乙酸酐(1.0mL，10.58mmol)。15.5小时后，将反应物用1M盐酸水溶液稀释，之后用3×10mL乙酸乙酯萃取。将合并的萃取液用水(10mL)和盐水(10mL)洗涤，之后用无水硫酸钠干燥。过滤并真空蒸发得到灰白色固体，收率90％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ6.89(s，1H)，6.74(s，1H)，3.85(s，3H)，3.81(s，3H)，2.81-1.33(m，15H)，2.29(s，3H)，0.93(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 372(100)[M+H]⁺。

实施例39c

制备2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟-3-乙酸酯

将三氧化铬(119.5mg，1.195mmol)溶于乙酸(1.80mL)和水(0.20mL)的混合物中。加入于乙酸(2.00mL)中的2-甲氧基雌酮-17-甲基肟-3-乙酸酯(104.5mg，0.281mmol)溶液，之后加入另外量的乙酸(1.80mL)和水(0.20mL)，并将反应物在5-8℃下保持50分钟。将反应物用水(25mL)稀释，之后用3×20mL乙酸乙酯萃取。将合并的萃取液用饱和碳酸氢钠溶液(2×20mL)、水(20mL)和盐水(20mL)洗涤，之后用无水硫酸钠干燥。过滤并真空蒸发得到白色固体，收率87％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.75(s，1H)，6.95(s，1H)，3.91(br s，3H)，3.85(s，3H)，2.77(dd，J＝16.8，3.4Hz，1H)，2.62-1.25(m，12H)，2.32(s，3H)，0.96(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 386(100)[M+H]⁺。

实施例39d

制备2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟

在氮气氛和搅拌下将2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟-3-乙酸酯(84.4mg，0.219mmol)溶于乙醇(10.0mL)中，并加入碳酸钾(934mg，6.758mmol)。室温下持续搅拌18小时，之后加入1M氯化铵溶液(25.0mL)。通过滴加6M盐酸溶液将反应物pH进一步调节至pH＝7。用二氯甲烷(3×20mL)萃取。将合并的萃取液用水(20mL)和盐水(20mL)洗涤，之后用无水硫酸钠干燥。过滤并真空蒸发，得到粗产物。通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(1∶2)]纯化。获得产物，为白色固体，收率78％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.59(s，1H)，6.83(s，1H)，5.52(br s，1H)，3.96(s，3H)，3.83(s，3H)，2.73(dd，J＝16.8，3.5Hz，1H)，2.56-1.37(m，12H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 344(100)[M+H]⁺，366(64)[M+Na]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺344.1851(344.1826计算值)。。

实施例39e

制备2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-甲基肟(CP-DM-4-75)

在氮气氛和搅拌下将2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟(16.4mg，0.048mmol)和O-(4-硝基苄基)羟胺盐酸盐(12.7mg，0.062mmol)溶于甲醇(10mL)中。加入一定量的4-聚乙烯基吡啶(25％交联，217.4mg)，反应在室温下进行66小时。将混合物真空蒸发，之后加入PS-苯甲醛树脂(39mg，1.20mmolg^-1)，并用四氢呋喃(10mL)溶剂化。将反应混合物搅拌另外的48小时，之后通过LC-CN固相萃取柱过滤，用另外的3×5mL四氢呋喃洗涤。将合并的萃取液和洗液蒸发得到黄色油状残余物，通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(3∶7)]纯化，得到产物，收率66％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.21(d，J＝8.7Hz，2H)，7.54(d，J＝8.6Hz，2H)，7.47(s，1H)，6.78(s，1H)，5.50(br s，1H)，5.27(s，2H)，3.91(s，3H)，3.84(s，3H)，3.22(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.58-1.25(m，12H)，0.93(s，3H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ169.65，154.22，148.03，147.36，146.11，143.89，135.20，128.34，127.83，123.58，123.22，109.79，106.77，74.65，55.85，53.19，43.85，41.82，36.49，33.68，29.46，25.60，22.97，17.10；ESI-MS(20v)m/z 494(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 494.2288(494.2291计算值)。

实施例40

制备2-甲氧基-6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基雌酮-17-甲基肟(CP-DM-4-74)

本实施例中使用的两种试剂，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟和O-(3，5-二氟苄基)羟胺盐酸盐分别由实施例39a-39d和4a-4b的方法制备。

在氮气氛和搅拌下将2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟[来自实施例39b](14.5mg，0.042mmol)和O-(3，5-二氟苄基)羟胺盐酸盐[来自实施例4b](10.7mg，0.055mmol)溶于甲醇(10mL)。加入一定量的4-聚乙烯基吡啶(25％交联，227.8mg)，反应在室温下进行66小时。将混合物真空蒸发，之后加入PS-苯甲醛树脂(39mg，1.20mmolg^-1)，并用四氢呋喃(10mL)溶剂化。将反应混合物搅拌另外48小时，之后通过LC-CN固相萃取柱过滤，用另外的3×5mL四氢呋喃洗涤。将合并的萃取液和洗液蒸发得到黄色油状残余物，通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(2∶7)]纯化得到产物，收率52％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ7.50(s，1H)，6.93-6.87(m，2H)，6.78(s，1H)，6.72(tt，J＝9.0，2.4Hz，1H)，5.48(br s，1H)，5.15(s，2H)，3.92(s，3H)，3.85(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.6Hz，1H)，2.60-1.25(m，12H)，0.93(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 485(100)[M+H]⁺；HRESI-MS：[M+H]⁺ 485.2246(485.2252计算值)。

实施例40A

制备6-(4-硝基苄氧基)亚氨基-17-乙炔基-雌二醇(CP-DM-4-89)

在氮气氛下将17-乙炔基-6-氧代-雌二醇(8.9mg，0.029mmol)、O-(3，5-4-硝基苄基)羟胺(11.7mg，0.057mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交联，150mg)都加入反应器中，并在搅拌下用甲醇(10mL)溶剂化。反应在回流下进行48小时。将反应物真空蒸发，将PS-苯甲醛树脂(71.7mg，1.20mmolg^-1)加入反应器中。将反应混合物悬浮于无水四氢呋喃(10mL)中，并在室温下搅拌2.5小时，之后通过LC-CN固相萃取柱过滤，进一步用3×5mL四氢呋喃洗涤。将合并的滤液和洗液蒸发得到白色固体，通过闪蒸硅胶色谱法[乙酸乙酯-石油溶剂油(40-60℃)(1∶2)]纯化，获得产物6-(4-硝基苄氧基)亚氨基-17-乙炔基-雌二醇，收率43％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.22(d，J＝8.6Hz，2H)，7.53(d，J＝8.6Hz，2H)，7.35(d，J＝2.9Hz，1H)，7.21(d J＝8.5Hz，1H)，6.84(dd J＝8.5，2.9Hz，1H)，5.29(s，2H)，4.84(br s，1H)，2.62(s，1H)，3.14(dd，J＝18.3，4.6Hz，1H)，2.40-1.24(m，12H)，0.86(s，3H)；ESIMS(20v)m/z 461(100)[M+H]⁺。

实施例4-40A的化合物

实施例4-40A的化合物如下所示。

其他化合物的合成

下述化合物已经由或可以由上述类似的方法合成：

2-甲氧基-6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(2-氰基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3-氰基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(4-氰基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(2-氰基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(3-氰基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(4-氰基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(2-硝基苯氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(3-硝基苯氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(2-硝基苯氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3-硝基苯氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(2-吡啶氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(3-吡啶氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(4-吡啶氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(2-吡啶氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3-吡啶氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(4-吡啶氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基苄基)肟

2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基苄基)肟

6-(4-氰基苄氧基)亚氨基雌二醇

6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(4-羧基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(4-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(2-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(4-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(3-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(2-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌二醇

实施例41

本发明化合物效力的研究

测试化合物对人气道平滑肌细胞增殖的作用

(a)人气道平滑肌的培养

根据以前详细发表的方法(Fernandes等，1999)，培养人气道平滑肌(HASM)细胞，其来自由Alfred Hospital(Melbourne)提供的肺切除或心-肺移植标本的肉眼检查正常的支气管(直径0.5-2cm)。

对于每次细胞培养，从支气管壁上剥离大约0.1g平滑肌。将切碎的组织浸于Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(FlowLaboratories，Scotland)中，补加100U/ml青霉素G(CSL，Australia)和100μg/ml链霉素(CSL，Australia)。在磷酸缓冲盐水(PBS；oxoid，英国)中漂洗组织，并将气道平滑肌切成2mm³的小块，于37℃和搅拌下在含弹性蛋白酶(0.5mg/mL：Worthington Biochemical，USA)的DMEM中消化2小时，之后在含胶原酶(1mg/ml)(WorthingtonBiochemical，USA)的DMEM中温育12小时。

将得到的细胞悬液离心，并在磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤三次。在最后的离心步骤之后，将细胞重悬于25mL补加有如下物质的DMEM中：L-谷氨酸(2mM：Sigma，USA)、青霉素G(100U/ml)、链霉素(100μg/mL)、两性霉素B(2μg/mL：Wellcome，UK)和热灭活的FCS(1％v/v：CLS，Australia)，并接种于25cm²培养瓶中。将原代分离群培养7-14天达到汇合。

每周通过与胰蛋白酶(0.5％：CLS，Australia)和EDTA(1mM，在PBS中：BDH，Australia)接触10分钟来收集细胞，以1∶3的比例传代接种于75cm²培养瓶中。

通过测定这些化合物对促分裂原诱导的细胞数目增加的作用确定了它们在细胞培养物中的活性。我们研究了2MEO及其类似物4NO和4NOM对HASM细胞对凝血酶或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)增殖刺激物反应的增殖的作用。将细胞接种于6-孔板中，密度为1.5×10⁴个细胞/cm²，通过去除含血清培养基24小时使细胞处于静止状态。然后用凝血酶(0.3U/mL)或bFGF(300pM)刺激48小时。将测试化合物与HASM细胞一起预培养30分钟，之后加入凝血酶。在培养48小时结束时，通过胰蛋白酶(0.5％w/v，在含1mM EDTA的PBS中)将细胞从培养板上分离下来，室温下在含0.5％(w/v)锥虫蓝的PBS中温育5分钟，洗涤两次(2％FCS，在PBS中)，离心分离(12000×g，5分钟)，并重悬于200μl 2％在PBS中的FCS中，在血细胞计数器小室中计数。

这些试验的结果提供在图1和表3中。数据以载体处理的孔中的细胞数的百分比表示，并以均值和平均标准误表示。

表3.2MEO类似物对用凝血酶或bFGF刺激的人气道平滑肌细胞增殖反应的作用

类似物(300pM)	细胞数(％对照)
	细胞数(％对照)		凝血酶(0.3U/mL)	bFGF
	-2MEO(10μM)4NO(1μM)4NOM(1μM)	133.5±4.1(24)100.9±8.1(13)111.1±6.9(13)117.5±8.5(8)	凝血酶(0.3U/mL)	bFGF	135.8±3.7(14)87.5±13.8(4)116.6±6.6(14)111.1±10.9(4)

2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇(4NO)类似物显示在宽的浓度范围(10nM至10μM)对HASM细胞增殖的抑制活性(图1)。令人惊奇地，2MEO的相关类似物2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(4NOM)比2MEO或4NO都更有效的多(图1)。4NO的抑制活性对于用凝血酶或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为促分裂原是相似的(表3)。对这两个不同的促分裂原缺乏选择性表明它和相关类似物不可能在对特定促分裂原的受体水平上起作用，而是影响有益于这些反应的细胞内信号途径。

还使用了该测定法测试了其他公开的化合物对凝血酶诱导的人气道平滑肌细胞增殖的抑制的作用，结果总结在表4的A栏至C栏中。

评价了这些化合物在上述培养物中保持的细胞中对调节凝血酶诱导的人气道平滑肌(HASM)增殖的效能。效能以pIC₅₀值表示(表4的A栏)，pIC₅₀指使增殖反应降低50％的浓度的负对数。此外，因为一些化合物的抑制作用是双相的，所以数据也用″二位″模型拟合，其中确定了化合物对于第一相相当于抑制达到50％和第二相抑制达到100％的效能，并以pIC₂₅和pIC₇₅值(分别为B栏和C栏)表示。当确定单相模型更合适时，则pIC₂₅和pIC₇₅的值不被计算或显示在表中。

数据显示与B环的C6连接的苄基羟亚氨基环上的取代产生这样的化合物，其通常显示出比2-甲氧基雌二醇具有更显著高的调节增殖的效能。一组在17位上具有相似的苄基羟亚氨基取代基的化合物显示出比相应的6-位类似物具有更低的效能。这类活性剂的调节平滑肌增殖的效能支持它们在治疗以平滑肌增殖为特征的疾病中的应用。

还进行了更有限的化合物组对牛主动脉血管平滑肌的实验。3μM的2-甲氧基雌二醇、CP-DM-2-11-7和CP-DM-3-91分别将bFGF(300pM)诱导的增殖减少了87±6％、75±14％和93±4％，这些观测表明所公开的化合物可能对于包括心血管系统的血管平滑肌功能失调的疾病具有治疗作用。

应理解这些测定法可以容易地用于测定所公开的化合物抑制凝血酶或bFGF诱导的人气道平滑肌细胞增殖的能力。这些测定法也可以用于测试这些化合物抑制凝血酶或bFGF诱导的来自其他组织的平滑肌细胞例如血管平滑肌细胞的增殖的能力。

化合物ID	AHASM-ThrpIC₅₀	BHASM-ThrpIC₂₅	CHASM-ThrpIC₇₅	DHASM-GM-CSF	EpFib-bFGF	FER-RLB pIC₅₀	GMCF7pIC₅₀	HA549pIC₅₀
化合物ID	AHASM-ThrpIC₅₀	BHASM-ThrpIC₂₅	CHASM-ThrpIC₇₅	DHASM-GM-CSF	EpFib-bFGF	FER-RLB pIC₅₀	GMCF7pIC₅₀	HA549pIC₅₀	2-甲氧基雌二醇CP-DM-2-11-7CP-DM-3-91CP-DM-3-106CP-DM-3-105CP-DM-3-124CP-DM-3-117CP-DM-3-119CP-DM-3-118CP-DM-4-15CP-DM-4-16CP-DM-4-36	5.496.907.597.607.007.355.195.485.535.475.846.89	5.948.8210.329.358.859.356.577.91	4.985.665.706.365.596.365.195.69	29±10^45±8^43±11^NDNDNDND0±0ND34±11^NDND	62±20^63±15^49±14^*NDNDNDND17±14NDNDNDND	7.325.824.266.754.606.054.004.004.684.904.004.70	5.404.004.004.004.00NDND4.00ND5.00ND4.00	6.004.894.995.125.29ND5.294.80NDNDND5.00

化合物ID	AHASM-ThrpIC₅₀	BHASM-ThrpIC₂₅	CHASM-ThrpIC₇₅	DHASM-GM-CSF	EpFib-bFGF	FER-RLB pIC₅₀	GMCF7pIC₅₀	HA549pIC₅₀
化合物ID	AHASM-ThrpIC₅₀	BHASM-ThrpIC₂₅	CHASM-ThrpIC₇₅	DHASM-GM-CSF	EpFib-bFGF	FER-RLB pIC₅₀	GMCF7pIC₅₀	HA549pIC₅₀	CP-DM-4-35CP-DM-4-37CP-DM-4-51CP-DM-4-52CP-DM-4-38CP-DM-3-101CP-DM-3-102CP-DM-3-103CP-DM-3-104CP-DM-4-5CP-DM-4-6CP-DM-4-33	6.854.895.366.024.005.727.055.506.266.876.935.87	7.805.464.006.278.037.1610.469.577.12	5.755.264.005.065.995.025.274.945.03	14±24NDNDNDNDND14±14NDNDND28±10^*ND	22±14NDNDND26±26ND96±4^*NDNDNDNDND	5.285.194.466.404.005.625.624.004.006.104.346.96	4.004.004.004.004.004.904.004.005.07ND5.645.50	5.50NDNDNDNDND4.904.39ND5.305.115.04

化合物ID	AHASM-ThrpIC₅₀	BHASM-ThrpIC₂₅	CHASM-ThrpIC₇₅	DHASM-GM-CSF	EpFib-bFGF	FER-RLB pIC₅₀	GMCF7pIC₅₀	HA549pIC₅₀
化合物ID	AHASM-ThrpIC₅₀	BHASM-ThrpIC₂₅	CHASM-ThrpIC₇₅	DHASM-GM-CSF	EpFib-bFGF	FER-RLB pIC₅₀	GMCF7pIC₅₀	HA549pIC₅₀	CP-DM-4-34CP-DM-4-65CP-DM-4-66CP-DM-4-68CP-DM-4-62CP-DM-4-63CP-DM-4-64CP-DM-4-67CP-DM-4-69CP-DM-4-74CP-DM-4-75CP-DM-4-76	4.006.655.005.745.666.465.615.004.005.945.595.37	4.007.915.697.706.564.006.59	4.005.005.635.624.814.005.34	29±1228±31ND8±13NDNDNDNDND11±8NDND	ND32±23NDNDNDNDNDND87±13^*5±9NDND	4.396.194.004.006.006.875.804.004.004.004.004.00	5.394.00NDND4.004.004.00NDND5.00NDND	5.675.50NDNDNDNDNDNDNDNDNDND

化合物ID	AHASM-ThrpIC₅₀	BHASM-ThrpIC₂₅	CHASM-ThrpIC₇₅	DHASM-GM-CSF	EpFib-bFGF	FER-RLB pIC₅₀	GMCF7pIC₅₀	HA549pIC₅₀
化合物ID	AHASM-ThrpIC₅₀	BHASM-ThrpIC₂₅	CHASM-ThrpIC₇₅	DHASM-GM-CSF	EpFib-bFGF	FER-RLB pIC₅₀	GMCF7pIC₅₀	HA549pIC₅₀	CP-DM-4-77CP-DM-4-78CP-DM-4-88CP-DM-4-91CP-DM-4-89	5.526.004.805.20ND	ND	ND	26±1335±9^*NDNDND	NDNDNDNDND	4.006.644.004.005.25	4.004.004.004.00ND	5.505.004.005.00ND

ND＝未测量

确定pIC₅₀为4.00的化合物没有活性

(b)流式细胞术分析细胞周期状态

将细胞接种于6-孔板中，密度为1.5×10⁴细胞/cm²，用前述方法使之处于静止状态，然后用凝血酶(0.3U/mL)刺激48小时。在加入促分裂原时将Monomed A加入所有细胞(包括对照细胞)中。

通过用胰蛋白酶(0.5％w/v)在37℃下温育30分钟来将细胞从培养板上分离下来。将得到的悬液用PBS洗涤两次，之后重悬于1mL70％乙醇中，-20℃下贮存达3周。在染色之前，将细胞洗涤两次(2％FCS，在PBS中)以除去乙醇。将固定的细胞用于含有RNA酶II(180mU/mL)的Triton X-100中的二碘化丙锭(50μg/mL)(0.1％v/v)染色。将细胞悬液通过18口径的针以促进细胞团的分开。将细胞贮存24小时，然后分析。

使用Becton-Dickinson FACScan仪器(Becton Dickinson，NJ，USA)分析细胞周期状态。对于每一样本计数1万个事件(event)，并用ModFitLT V2.0分析包(Verity Software House，ME，USA)进行分析。

没有证据表明浓度低于3μM具有细胞毒性，细胞毒性通过细胞不能从培养板上脱离和细胞不能被锥虫蓝染色(少于5％)来证明。FACs特征(profile)表明凋亡不是类似物的作用特点，因为没有亚G0/G1DNA含量的累积。因此，这些类似物看起来提供了特定的抗气道平滑肌细胞增殖的作用。不希望被任何特定的提议的作用方式所束缚，这些结果表明本申请的化合物通过调节细胞内信号途径起作用。

研究2MEO和4NOM在凝血酶(0.3U/mL)存在下对HASM形状的影响。将类似物和HASM一起预培养30分钟，之后加入凝血酶。培养持续48小时，之后捕获HASM的图像。

重要地，观察到在等效的增殖抑制浓度下没有检测到4NO(1μM)对HASM细胞的形状有影响，但是2MEO(10μM)导致大量细胞变圆。

可以使用相同的测定体系研究其他化合物对细胞周期和细胞死亡的作用。

实施例42

测试化合物对非平滑肌细胞增殖的作用

评价4NO对一些非平滑肌细胞类型包括II型气道上皮细胞系A549(ATCC保藏号ATCC CCL-185人肺癌)(图2)；人乳腺肿瘤细胞系MCF7(ATTC保藏号ATCC HTB-22人乳腺癌)，其表达雌激素受体体(图3)；以及牛主动脉内皮细胞(BAEC)(图4)。

检测了测试化合物对A549细胞对5％胎牛血清(FCS)反应的增殖的作用。

将类似物与A549细胞一起预培养30分钟，之后加入FCS。培养持续48小时，之后细胞计数。数据以载体处理孔中的细胞数的百分比表示，并且以均值和平均标准误表示。类似地检测了2MEO和4NO对MCF7对5％FCS或表皮生长因子(EGF，300pM)反应的增殖的作用，以及2MEO和4NO对BAEC对5％FCS反应的增殖的作用。培养参数同上述相同，结果以均值和平均标准误表示。

令人惊奇地，在低于3μM的浓度下，没有检测到4NO对这些细胞类型中的任一类型细胞的增殖具有作用，表明该化合物对平滑肌细胞和成纤维细胞的特异性，而且对气道中存在的各种其他细胞也没有检测到作用。相比之下，2MEO是每种细胞类型增殖的抑制剂。

该测定法也用于评价其他化合物抑制非平滑肌细胞MCF7和A549(如上所述)对5％FCS反应的增殖的抑制能力。测定结果显示在表4(分别为G栏和H栏)中。化合物抑制这些细胞系增殖的效能比对HASM低的多。这些观测支持这些化合物的作用具有细胞类型特异性靶向的观点。这些测定法也适合检测其他公开的化合物对这些细胞或对其他感兴趣的非平滑肌细胞的作用。

实施例43

比较测试化合物和地塞米松对HASM增殖的抑制

我们检测了4NO(1μM)和糖皮质激素地塞米松(Dex，100nM)对HASM细胞对bFGF(300pM)反应的增殖的作用。地塞米松为常用的抗炎糖皮质激素。在标准的塑料组织培养板上培养细胞。测试化合物和HASM一起预培养30分钟，之后加入bFGF。培养持续7天，之后细胞计数(图5)。数据以载体处理孔中的细胞数的百分比表示，并且以均值和平均标准误表示。

塑料培养板上的HASM细胞的增殖减弱，但并没有完全被地塞米松阻断。相比而言，有利的是4NO使HASM细胞数显著减少到低于地塞米松减少的水平。检测了细胞外胶原基质上生长的HASM细胞对糖皮质激素和测试化合物的反应。将细胞在胶原包被的硅橡胶基底上培养。将测试化合物和HASM细胞一起预培养30分钟，之后加入bFGF(300pM)。持续培养7天，之后细胞计数(图6)。数据以载体处理孔中的细胞数的百分比表示，并且以均值和平均标准误表示。

令人惊奇地，胶原ECM上的HASM细胞的增殖对地塞米松的调节具有抵抗性，表明在含胶原基质存在下该化合物的作用减弱。但是，4NO保持了它对在胶原ECM上的细胞的作为抗增殖活性剂的效能。这些观测显示，本发明公开的化合物与糖皮质激素相比更好地控制HASM细胞增殖。

实施例44

测试化合物对雌激素受体和微管蛋白的亲和力

雌激素受体结合测定

如Hughes等，2002中所详细描述，使用大鼠子宫细胞溶胶作为ER的来源(Markaverich等，1979)检测雌二醇(E2)、2MEO和类似物的雌激素受体(ER)亲和力。子宫(每批6-10个)分离自Brown Norway大鼠(250-350g)，用盐水洗除血液，并在10mM Tris缓冲液(pH7.4，1.5mMEDTA、10％w/v甘油、1mM苯基甲基磺酰氟)中使用Ultra Turrax匀浆器冰上间隔1分钟15秒脉冲匀浆3次。

通过4℃下750×g(Sorvall RT7)离心10分钟去除核物质和细胞碎片；在Beckman JM1离心中4℃下30000×g离心120分钟制备细胞溶胶成分。使用Bradford方法(Biorad)测定，将细胞溶胶稀释至大约1mg/mL蛋白质(大鼠子宫提取物)。

通过在300μL上述缓冲液中4℃下温育过夜来进行结合测定，所述缓冲液包含200μL细胞溶胶、50μL置换剂(displacer)(10μM雌二醇或缓冲液)和50μL 0.2nM[³H]-E2(150Ci/mmol)。加入500μL葡聚糖包被的活性炭(400mg临床等级C的葡聚糖和2g活性炭Norit A，在100mL Tris缓冲液中)并在Sorval RT7中4℃下2000×g离心10分钟来实现将结合的放射性配体与游离的分离。

在0.01-50nM[³H]-雌二醇范围内进行饱和分析，得到K_d为0.18nM，而Bmax为112fmol/mg蛋白(n＝3，使用Graph Pad Prism^TM进行分析)，显示0.2nM浓度适合于置换(displacement)研究。在0.1nM-10μM范围内以0.5至1.0对数级增加进行2MEO和类似物的分析，在确定适合的范围后，使用每十进制3-4个浓度来测定对雌二醇的置换。

数据用Cheng和Prussof方程拟合，使用K_d为0.18nM(如饱和分析所测定)，数据以pIC50(产生放射标记最大置换的50％的浓度的负对数)表示。

结果显示在表5中。

用于秋水仙碱结合测定的微管蛋白纯化

检测了2MEO及其类似物将³H-秋水仙碱从部分纯化的微管蛋白上的它的结合位点上替换的能力。对于该结合测定，部分纯化的微管蛋白由Williams和Lee的聚合-解聚方法(Williams等，1982)得到。宰杀后大约15分钟得到3个羊脑(大约共计150g)。将每批100g羊脑在50mL冷PM4M缓冲液(100mM哌嗪-N，N′-双[2-乙烷磺酸](PIPES)、1mMMgSO4、2mM乙二醇四乙酸酯(EGTA)、2mM DTT、4M甘油，pH 6.9)使用家用型(domestic)搅拌器(Power Blender，Ronson)以最高设定匀浆30秒。将粗匀浆物离心15分钟(9000rpm(6500×g)，4℃)并去除沉淀物(细胞碎片、细胞外基质和粗核部分)。然后将6500×g上清液离心75分钟(28000rpm(96000×g)，4℃)并去除沉淀物(主要由细胞膜组成)。

通过添加适宜量的新配制的于蒸馏水中的50mM GTP溶液将96000×g上清液的GTP(鸟苷三磷酸)浓度调至1mM。通过在37℃水浴中加热45分钟进行微管蛋白的聚合。然后将粗微管蛋白离心60分钟(28000rpm(96000×g)，27℃)来沉淀。然后使用手提式组织匀浆器将富含微管蛋白的沉淀物轻轻地重悬于15mL缓冲液(1M谷氨酸钠、1mM MgCl₂，pH6.6)中。然后将部分纯化的微管蛋白冰育30-60分钟，-80℃下冻存。

根据Williams和Lee(1982)，30-60分钟冰育可使微管蛋白解聚(Williams等，1982)。但是在该冰育后澄清60分钟(28000rpm，4℃，60分钟)的部分显示对秋水仙碱没有特异性结合，表明微管蛋白仍是聚合的并以悬浮形式存在。因此，30-60分钟冰育后得到的部分没有进一步纯化而使用。

秋水仙碱置换测定

通过置换³H秋水仙碱来进行微管蛋白对秋水仙碱-结合位点的亲和力的测定。反应成分由D′Amato及其同事(D′Amato等，1994)的方法得到，同时采用Penefsky的方法(Penefsky，1977)在1mL尺寸排阻柱上将结合的放射性配体与游离的分开。这些微型柱由Hamel及其同事(Hamel等，1996)成功地用于研究³H 2-甲氧基雌二醇与微管蛋白的结合特性。每个微型柱由1mL一次性注射器中装填大约0.95mLSephadex G-50(二级精度)的柱组成。双份的反应混合物(总量0.48mL)于缓冲液(1M谷氨酸钠、1mM MgCl₂、0.5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，pH6.6)中含有大约0.5mg/mL部分纯化的微管蛋白、1μM³H秋水仙碱和置换剂化合物。饱和研究显示此测定法中秋水仙碱的K_D为1.4μM，提示1μM是合适的放射性配体浓度。采用置换剂的半-十进制增加方式(范围从10^-7.5至10^-4M)。

将反应混合物在37℃下水浴中温育30分钟，之后在冰上冷固定1至1.5小时。对每一反应混合物，然后将三个0.14mL等分试样加入分开的、预冷的微型柱中。通过离心2分钟(1100rpm(100×g)，4℃)完成分离。将5mL“Emulsifier Safe”闪烁液(Packard)加入每一试管中，并将样本在Packard 1600TR液体闪烁分析器中计数。数据用Cheng和Prusoff方程拟合，并且计算Ki和pIC₅₀值(GraphPad Prism)。

表5 2MEO及类似物对微管蛋白上的雌激素受体和秋水仙碱结合位点的亲和力。

类似物	ER亲和力(pIC₅₀ ³H-E2置换)	微管蛋白亲和力(pIC₅₀ ³H-秋水仙碱置换)
类似物	ER亲和力(pIC₅₀ ³H-E2置换)	微管蛋白亲和力(pIC₅₀ ³H-秋水仙碱置换)	E22MEO4NO4NOM	9.5±0.16.8±0.1＜5.0＜5.0	＜4.04.8＜4.0NA

NA＝没有得到

2MEO的pIC₅₀值为6.8(表5)，然而在达到10μM的浓度下2MEO类似物4NO和4NOM几乎没有或没有检测到对3H-雌二醇的置换。4NO和4NOM在该浓度下都没置换E2结合的50％，因此它们的亲和常数不能被测定(表5)。

秋水仙碱置换试验的结果证明，在达到100μM的浓度下，2MEO对微管蛋白的pIC₅₀为4.8，然而测试化合物都没有显示出显著地秋水仙碱置换。鉴于测试化合物对微管蛋白相对弱的亲和力，这些测试化合物的抗增殖活性看起来不可能是通过一般的对微管动力学的破坏所介导。

之后，检测了一些公开的化合物置换来自如上所述的大鼠子宫细胞溶胶制备物的³H-雌二醇的能力。这些测定结果总结在表4的F栏中。无例外的，表4中例示的化合物对细胞溶胶雌激素受体具有比2-甲氧基雌二醇更低的亲和力。

鉴于这些测试化合物对于ER的低亲和力，看起来这些化合物的作用模式不是通过该受体。

实施例45

测试化合物对人气道平滑肌细胞的白细胞介素-1α-介导的GM-CSF产生的作用

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由多种不同细胞类型在多种前炎症刺激物如白细胞介素-1、脂多糖和柴油机废气(Ritz等，2002)的刺激下产生的细胞因子。GM-CSF涉及不同范围的炎性病症包括类风湿性关节炎、哮喘、脓毒症和过敏性鼻炎。很可能GM-CSF不同程度地参与所有组织炎症(Hamilton，2002)。

已经证实间充质细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞对于炎性疾病中细胞因子的过多具有重要贡献。特别地，大量的证据表明气道平滑肌细胞具有产生炎性细胞因子的能力(Panettieri，2002)。这些环节提示4NO对GM-CSF的抑制作用可能构成潜在的重要抗炎作用。为研究4NO的潜在抗炎活性，检测了其对白细胞介素-1α(1ng/mL)介导的HASM的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的产生的作用。

测量GM-CSF水平

使用ELISA定量测定GM-CSF水平。将ELISA板用大鼠抗人GM-CSF单克隆包被抗体(1μg/mL，Endogen，MA，USA；在0.1M碳酸钠缓冲液中，pH9.4-9.8)包被，然后室温下温育过夜。

用缓冲液(含0.1％Tween-20的PBS，PBS-T)漂洗板三次，然后用封闭缓冲液(含4％FCS的PBS)温育1小时。在PBS中稀释的生物素标记的鼠抗人GM-CSF抗体(0.25μg/mL，Endogen)与样本或人重组GM-CSF标准品(范围在0-1000pg/mL，Endogen)在室温下温育2小时，然后大量冲洗。根据厂商(Endogen)提供的方法，与聚合HRP-链霉抗生物素溶液(Endogen)和底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(BD PharMingen，San Diego，CA)一起温育，在30分钟内产生信号并在450nm处测定吸光度(Victor 1420Multilabel Counter，Wallac)。

试验结果显示在图7中。数据以测试化合物预处理的IL-lα-刺激细胞的培养物上清液中检测到的GM-CSF水平的百分数表示，并以均值和平均标准误表示。4NO比2MEO更大程度地减少GM-CSF的生成。

随后在上述测定系统中测试了其他公开的化合物抑制GM-CSF产生的能力。这些结果见总结在表4的D栏中。尽管测试的三种化合物CP-DM-3-119、CP-DM-3-103和CP-DM-4-35与2-甲氧基雌二醇相比对HASM细胞的GM-CSF产生都没有抑制或产生很小抑制，不过一种化合物CP-DM-3-102却具有更显著性的效果。对抑制活性变异的原因到目前还不清楚，且每一点上测试的样本数目相对较少；进一步增加测试样本数目的试验可能有助于确认这些结果。还应该使用该测定系统测试其他公开的化合物。

平滑肌中GM-CSF产生的减少可能对炎症反应的强度和持续时间都有重要的影响。此外，很可能4NO对GM-CSF产生的抑制将在许多其他产生GM-CSF的细胞类型中发生，因为其它活性剂例如糖皮质激素看来作用于所有产生GM-CSF的细胞类型以抑制其产生。

实施例46

测试化合物在气道高反应性动物模型中的作用。

小鼠已广泛用来阐述气道内过敏反应的病理学基础的特征，并用于研究现有和新的抗哮喘活性剂的作用。小鼠模型被许多研究者认为是获得新抗哮喘活性剂具有潜在功效的证据的关键性模型(Gleich &Kita，1997)，并因此在制药工业中广泛应用。证明最重要的一类预防药糖皮质激素(见例如，Walter等，2002)的功效的小鼠模型支持了这一应用。

致敏和抗原激发

6-8周龄的意识清醒的雌性小鼠(C57BL/6)通过在第0天和第12天腹膜内注射0.2mL 50μg卵清蛋白(在10mg/mL氢氧化铝中)致敏，之后在第20-28天用OVA(1％w/v)/FCS(5％v/v)气雾剂雾化30分钟来激发。通过将这些动物放置在全身体积描记器中，然后经位于室顶部的孔将药物喷洒入室中来实现气雾剂接触。通过偏流进入一个小收集器(particle trap)中将气雾剂排出该室。抗原激发没有导致可检测到的气道阻抗的增加，也没有不适的迹象。

给予药物治疗以评价药物对气道高反应性发生的作用。药物治疗在首次接触OVA(第20天)之前(第19天)的那天开始，并持续贯穿OVA激发小鼠的整个期间。药物治疗包括4NO或2MEO，各自以于体积为100μL的10％DMSO/90％花生油载体中的50mg/kg通过腹膜内或口服在OVA接触之前2小时每日一次给予。

26-28天致敏和激发步骤后，测量对支气管收缩剂乙酰甲基胆碱反应的气道阻塞情况。用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。行气管造口术，颈静脉内放置导管以由静脉内给予乙酰甲基胆碱。然后将小鼠置于全身体积描记器中，机械通气(150呼吸次/分钟，潮气量10ml/kg)。用一个孔连于体积描记器内部而另一个孔连于气管内套管的差压传感器测量跨肺压。用呼吸速率计测量气流速率。

使用Buxco肺机械分析器联机计算气道对静脉内乙酰甲基胆碱(1-1000μg/kg，给定间隔4分钟)反应的阻力的改变。

这些实验结果显示在图8和9中。

2MEO或4NO以50mg/kg/日腹膜内给药处理卵清蛋白-激发小鼠(veh-OVA)对气道对静脉内给予乙酰甲基胆碱的反应性的作用显示在图8中。用测试化合物50mg/kg/日口服给药处理的作用显示在图9中。数据以基线水平的呼吸阻力的改变表示，并且以均值和平均标准误表示。

与在非激发小鼠(veh-SAL)中检测到的相比，OVA激发(veh-OVA)增加了气道对乙酰甲基胆碱的反应性。

4NO和/或2MEO，当口服或静脉内给药时，能够降低攻击后表现的呼吸阻力的增加。

实施例47

测试化合物对人肺成纤维细胞增殖的作用

来自人肺移植物受者的实质样本从胸膜上切离，切成小于1mm²的碎片，使之附着于最小体积的含有血清(10％)和抗生素(同用于HASM培养所用)的DMEM的塑料培养皿上。组织碎片附着于培养皿的底部之后，加入另外的培养基。每周换液两次，直到外植体培养物形成，此时除去组织碎片，并通过每周接触胰蛋白酶以1∶3的分流比例传代，产生肺成纤维细胞培养物。

在有或无测试化合物存在下，将肺成纤维细胞在不含血清的DMEM中培养24小时，然后用300pM bFGF刺激48小时，之后收集细胞并计算有活力的细胞。这些实验结果显示在图11中。4NOM在1至1000nM的浓度范围内抑制肺成纤维细胞数目的增加。在相同浓度范围内4NO显著降低肺成纤维细胞对bFGF的增殖反应。

之后使用上述测定系统检测了一系列所公开的化合物，结果总结在表4的E栏中。数据以来自至少3个供者的细胞系的3个单独实验的最小的对bFGF(300pM)诱导的增殖的抑制的均值和平均标准误表示。在1μM时，4NOM和几个其他化合物显示具有显著性的抑制活性。实质成纤维细胞的增殖在肺纤维变性的形成中起重要作用。因此，这些现在的观测表明所公开的化合物在气道和肺的纤维变性病症的治疗中具有治疗潜能。

气道成纤维细胞还从来自气道活检的外植体培养物获得。更有限的实验组显示3μM的4NO和4NOM分别将bFGF(300pM)诱导的增殖降低55±20％和50±24％。因此，看起来这些化合物具有对抗不同组织来源的成纤维细胞的活性，表明其在成纤维细胞功能紊乱相关的病症中的治疗潜能。这进一步被4NO和4NOM对凝血酶诱导的成纤维细胞源的NIH3T3细胞的增殖的分别为26±12％和68±10％的抑制效果所支持，表明可以合理地预测这些化合物对机体的其它部位具有抗纤维变性活性。

这些测定法也可以用于测定其他所公开的化合物对这些或其他组织来源的成纤维细胞的抗增殖活性。

实施例48

测试化合物对细胞周期蛋白D1表达的作用

在增殖实验中如上所述培养人气道平滑肌细胞。将细胞去除血清24小时，并用凝血酶(0.3U/mL)刺激8小时，之后收集细胞用于细胞周期蛋白D1的蛋白质印迹。将4NO(0.01μM-1μM)和HASM一起预温育产生细胞周期蛋白D1浓度依赖性减少。这些结果如图10中所例示。细胞周期蛋白D1的减少表明细胞进入S-期延迟和/或减少，因此它可以部分地解释在增殖测定中48小时时间点观测到的细胞数目的减少。

实施例49

测试化合物对人气道平滑肌细胞迁移的作用

开始该测定(改良的Boyden小室法)之前，将直径6.5mm和孔径8mm的Costar transwell culture insert(Corning Inc，USA)在4℃下用0.1％明胶(牛皮；Sigma，USA)包被过夜。开始该测定之前，将HASM细胞去除血清24小时。将细胞加到用这些测试化合物之一预处理30分钟或没有处理的transwell insert的上面。将血小板衍生生长因子(BB)(1ng/mL)加到下室以刺激细胞迁移，将小室和细胞保持5小时。这一时间后，用PBS冲洗具有粘附细胞的膜，用DiffQuick(Lab Aids，Aus)固定剂固定2分钟，然后用DiffQuick染色。然后将膜用PBS冲洗两次，剥除insert并置于载玻片上。将膜用光镜观察。计数5个视野(×400)内的细胞数目，重复三次。该实验结果显示在图12中。

计数出现在多孔膜的下面的HASM的数，将反应以在没有预处理情况下对PDGF反应迁移的细胞数的百分比表示。显示用2MEO或4NO预处理的HASM具有显著性降低的对PDGF反应的迁移水平。

实施例50

体外评价平滑肌和成纤维细胞相关病理学

血管平滑肌

评价药物对血管平滑肌增殖的作用是对用于预防血管重塑的药物的活性的完善筛选。血管重塑在全身性和肺性高血压、动脉粥样硬化和动脉(冠状动脉等)血管成形术后再狭窄中发生。

血管平滑肌增殖

根据以前详细描述的方法(Campbell and Campbell 1993)培养血管平滑肌。血管平滑肌从大鼠主动脉、牛主动脉或从牛肺动脉获得。通过磨擦去除内皮，并将中层与外膜切离。然后将中层切碎成小的(2mm³)片段，并用胶原酶和弹性蛋白酶消化直到产生单个或少许细胞悬液。然后将细胞悬液在磷酸缓冲盐水(PBS)(含2％胎牛血清)(FCS)中洗两次，将细胞接种于一个75cm²的装有含抗微生物剂和10％胎牛血清的DMEM的培养瓶中。细胞每周用胰蛋白酶(0.5％w/v，在含有0.1％w/v EDTA的无Ca²⁺PBS中)(Tomlinson，Croft等，1994)接触来传代。

通过将细胞以亚汇合密度10⁴个细胞/cm²接种到6孔组织培养板中来评价VASM增殖。72小时后将培养基更换成缺乏胎牛血清的培养基。另外的24小时后，用一定浓度范围的特异性促分裂原和含有胰岛素、硒和运铁蛋白的无血清培养基补充物一起刺激细胞。当欲评价本申请的化合物时，将它们在加入浓度范围为1pM-10μM的促分裂原之前30分钟加入。细胞和促分裂原一起培养48小时之后，通过与胰蛋白酶接触来将细胞从组织培养板上去除。将细胞悬液用离心机1000g(室温)分离，将细胞重悬于含2％FCS的PBS中，之后用血细胞计数器计数。另外将等分试样细胞与二碘化丙锭在含RNA酶的渗透性固定剂缓冲液存在或不存在下培养，以使得能够计数无活力的细胞并为前面研究(Berk，Elder等，1990；Fernandes，Guida等，1999)中所描述的DNA含量的流式细胞计数评价准备细胞。

前述评价在体外在培养的细胞中调节平滑肌增殖的研究显示了用于治疗平滑肌相关病症例如动脉粥样硬化(Hupfeld and Weiss2001；Mattingly，Gibbs等，2002)的活性剂的抗增殖作用，因此这些测定法可以用于预测公开的化合物的功效。

平滑肌肥大

平滑肌的肥大反应在很多病症包括高血压、气管壁重塑和前列腺肥大中是重要的。培养的平滑肌的肥大反应可以通过测量未固定的细胞悬液中的前向光散射的量来评估(Uhal，Ramos等，1998))。将细胞接种在6孔组织培养板中，并在48-72小时后将培养基用缺乏胎牛血清的培养基替换24小时。将潜在的肥大因子和胰岛素、运铁蛋白和硒的混合物一起加入，持续最多7天的不同时间，此时通过短暂的胰蛋白酶接触来收集粘附细胞。将细胞在含2％胎牛血清和二碘化丙锭的PBS中培养，以使得能够将无活力的细胞从分析中排除。前向光散射的增加表明细胞大小的增加。此外，可以通过测定每个细胞的蛋白量(Isaeff，Goya等，1993；Blennerhassett，Bovell等，1999)或通过测定蛋白合成率，其以培养物的DNA含量来标准化(McKay，de Jongste等，1998)来间接地测量肥大。

平滑肌收缩功能

将血管、气道、子宫、膀胱和胃肠平滑肌制备物安装在保持37℃、含有标准生理盐溶液(例如Krebs溶液)的加套玻璃器官浴槽中。将组织制备成环状或条状，然后将其悬挂在金属钩之间，该金属钩一端固定到夹子上，另一端连于预先校准的力传感器。通过将它们以1pM至10μM的递增浓度直接添加到器官浴槽中来研究2MEO类似物的作用。通过检测类似物对制备物对该特定组织相关的刺激物的收缩或舒张反应的影响来评价间接作用。这些方法是常规的方法，在下面的引文(Armour，Lazar等，1984；Arthur，Yin等，1997；Andersen，Weis等，1999)中已举例说明。

平滑肌细胞因子产生

有证据表明，不同组织来源的平滑肌当受到适当的刺激时具有产生多种不同细胞因子的能力(John，Au等，1998)。细胞因子的产生通过收集保持在培养物中并与2MEO类似物和细胞因子产生的刺激物一起培养的细胞的上清液很容易测定，所述刺激物包括脂多糖、白细胞介素-1α、肿瘤坏死因子-α等。平滑肌产生的细胞因子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-8、嗜酸细胞活化趋化因子和RANTES。这些细胞因子通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定以测定分泌性蛋白水平。此外，各个细胞因子特定的信使RNA可用实时PCR或通过RNA印迹定量测定。

成纤维细胞功能

许多在培养的不同组织来源的成纤维细胞中可测量的成纤维细胞功能被认为是在病症中具有活性的预示，在该病症中成纤维细胞促进了发病。这些病症包括但并不限于肺纤维变性、气道纤维变性包括闭塞性细支气管炎、心肌纤维变性和其他组织发生的纤维变性。这些功能包括增殖、细胞因子产生、细胞外基质产生、细胞迁移和收缩，并容易地在来源于该病理相关的器官的成纤维细胞细胞培养物中测定(Bishop，Mitchell等，1993；Butt，Laurent等，1995；Dube，Chakir等，1998)。

成纤维细胞培养

成纤维细胞可以从多种组织活检物包括皮肤、肺实质、气道活检物、心脏组织和包皮来培养。来自气道活检物的成纤维细胞通过外植体培养生长，Dube，Chakir等，1998。此外，因为成纤维细胞的生长特征可因疾病过程而改变，所以成纤维细胞还从纤维变性器官如外周肺的活检组织获得(Ramos，Montano等，2001)。

实施例51

评价平滑肌和成纤维细胞相关病理的临床前动物模型

动脉粥样硬化/再狭窄

许多动脉粥样硬化/再狭窄动物模型通常用于评价药物对内膜损伤形成的影响(Karas 2002(Hodgin和Maeda 2002)。近期的出版物讨论了这些模型的价值(Van Put，Van Hove等，1995；Hickey，Makdissi等，1996)。显示不同程度的ApoE缺乏的鼠模型证明动脉粥样硬化损伤的形成能被饮食改变加速。另外，对兔采用非闭塞套囊包绕颈动脉的模型在7-10天内诱导新内膜损伤且具有最小的直接内皮损伤。这些动脉粥样硬化模型通常用于筛选新的抗动脉粥样硬化活性剂，并表明许多对人疾病有活性的化合物在模型中也有活性(Arthur，Yin等，1997；Karas 2002)。在该模型中，内皮功能障碍在内膜损伤发生前就可探测到。斑块破裂在各种动脉粥样硬化复合模型中均可以被诱导，也被报道见于ApoE缺乏的鼠模型(Rekhter 2002))中。再狭窄可以通过大鼠颈动脉内皮的气囊导管剥离来更特异地模拟(Nili，Zhang等，2002)。

前列腺增生

前列腺增生用拟交感神经药如苯肾上腺素皮下注射长期处理的大鼠或小鼠进行研究(Marinese等，2003)。

肺动脉高压

实验动物中肺动脉高压的形成可以通过长期低氧接触或通过注射野百合碱来诱导(Jeffery和Wanstall 2001；Wanstall，Gambino等，2002)。小鼠或大鼠的低氧导致右心室肥大和肺动脉增厚，这些可以通过将动物在含10％氧的环境中饲养4周之后用组织学方法来检测。

系统性高血压

有大量模型用于评价本发明所要求保护的化合物的抗高血压活性。参考电子数据库如PubMed应能够使本领域技术研究人员选择多种不同种类的模型。应理解，这些活性剂在具有遗传因素的模型(例如自发性高血压大鼠，SHR)中、在具有明显肾因素的模型中和在具有肥胖和/或糖尿病并发的模型(参见例如，(Haff，Page等，1977；Dominiczak，Devlin等，1997；Sechi 1999；Gerin，Pickering等，2000；Stoll and Jacob 2001；Sugiyama，Yagami等，2001)中被评价。而且，除了测量对系统血压的影响，还测定了相关病理如左心室肥大(以左心室：总重量的比例来确定)。

纤维变性疾病

尽管有许多纤维变性疾病的实验动物模型，但博来霉素诱导看起来是单独使用最常用的疾病诱导方法。例如，在14天的时间对小鼠局部皮下注射诱导皮肤硬化，具有容易测量的皮肤厚度和皮胶原含量的增加(Murota，Hamasaki等，2003)。与评价所公开的化合物特别相关的是由气管内注射博来霉素诱导的良好表征的肺纤维变性的模型(Chang，Nakao等，1980；Evans，McAnulty等，1990；Tani，Yasuoka等，1991)。

使用博来霉素肺纤维变性模型来研究CP-DM-2-11-7的活性(Underwood等，2000)。从博来霉素攻击的当天开始每天在小鼠接受博来霉素前2小时给予4NO。然后在14天的时间内给予4NO(50mg/kg/日，经腹膜内注射)。小鼠还每天接受溴脱氧尿苷(BrdU，经腹膜内注射)注射。另外两组小鼠对照组和博来霉素处理组每天接受腹膜内注射的含BrdU的载体。载体包含于花生油中的10％二甲基亚砜。

博来霉素在第一天以单次35pl滴鼻剂给予，该滴鼻剂含有溶于生理盐水中的125mU。先将小鼠用甲氧氟烷吸入浅麻醉。在将药滴施用到小鼠鼻孔中并向鼻内吹入后，将小鼠以45℃角保持以利于博来霉素在肺内的分布。

整个实验期间测量体重。在给予博来霉素后的12至14天实验结束时，用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠，准备用全身体积描记器(Buxco Inc.)记录呼吸阻力和顺应性。将小鼠进行机械通气，每分钟150次呼吸，潮气量为150pL。5分钟的稳定期后，记录阻力和顺应性的值，用致死量的戊巴比妥处死动物。

然后将每组的半数动物进行支气管肺泡灌洗(BAL)来产生BAL液(BALF)，用血细胞计数法计数其中的浸润细胞数。一组中半数动物的肺被快速冷冻。该组中另一半小鼠的肺用缓冲福尔马林盐水以25cmH₂O压力注入固定20分钟，之后转移到含有相同固定剂的烧杯中。然后将这些样本用石蜡处理用于之后的切片(5微米切片)以及形态分析，对于形态分析由工作者使用标准方法用苏木精和伊红染色来进行，工作者对处理组得到的样本保持盲态。另外，切片还用Masson三色染色法进行胶原染色。另外的切片用于进行BrdU阳性核检测的制备。这一染色的存在表明在给予BrDU期间，细胞经历过DNA合成，因此它可以作为细胞增殖的指标。

表6中报告的组织面积通过在100倍放大率下捕获肺切片的图像并将这些图像输入powerpoint文件中来测定。用覆盖整个捕获图像的具有至少10个交叉点的覆盖网格来确定面积，然后在600×放大率下观察并通过Image pro软件进行捕获。

然后将36点的覆盖用于捕获的图像，确定10个选择的区域中每个中与组织交叉的网格点的数。表6中的数据代表落在组织上的网格点的百分比。

纤维变性评分通过追踪在低倍(10×放大率)图像上以形态学确定的纤维变性的面积来确定并将其以切面总面积的百分比来表示，该切面包括整个肺的横切面。在纤维变性区中使用6点标度进行纤维变性损伤的严重程度的评估，在6点标度中0表示正常肺组织结构，而6代表由成纤维细胞和炎性浸润导致空间的完全实变。表6的数据代表受影响的面积百分比乘以它的严重程度的均值。

在两肺叶的每一个的主实质气管内测定细胞增殖，通过测量主气管中BrdU阳性核的数来进行，以核总数的百分比表示。气道壁的细胞根据形态和部位确定为上皮细胞或间充质细胞(平滑肌或成纤维细胞)。数据显示4NO处理选择性减弱了间充质细胞的增殖。

表6 4NO(50mg/kg/日，i.p.)处理对C57BL6雌鼠博来霉素诱导的纤维变性的作用。

	对照	博来霉素	博来霉素/4NO
	对照	博来霉素	博来霉素/4NO	初始体重(g，n＝11-12)	20.5±0.3	20.7±0.3	20.6±0.3
体重百分比改变(g，n＝11-12)	6.4±0.8^*	-6.7±2.6^*	-1.7±1.6	初始体重(g，n＝11-12)	20.5±0.3	20.7±0.3	20.6±0.3
体重百分比改变(g，n＝11-12)	6.4±0.8^*	-6.7±2.6^*	-1.7±1.6	阻力(cm H₂O/ml/s)(n＝11-12)	0.42±0.01	0.50±0.03^*	0.45±0.01
顺应性(ml/cm H₂O)(n＝11-12)	0.104±0.004	0.071±0.008^*	0.080±0.003^*	阻力(cm H₂O/ml/s)(n＝11-12)	0.42±0.01	0.50±0.03^*	0.45±0.01
顺应性(ml/cm H₂O)(n＝11-12)	0.104±0.004	0.071±0.008^*	0.080±0.003^*	BALF细胞#(n＝5-6)	3926±881	11463±2130^*	8356±1434
纤维变性评分(n＝6)	0.00±0.00	0.80±0.17^*	0.10±0.06	BALF细胞#(n＝5-6)	3926±881	11463±2130^*	8356±1434
纤维变性评分(n＝6)	0.00±0.00	0.80±0.17^*	0.10±0.06	组织面积(％)(n＝6)	31.1±1.0	44.4±2.3^*	35.0±1.7
增殖				组织面积(％)(n＝6)	31.1±1.0	44.4±2.3^*	35.0±1.7
增殖				上皮细胞	0.6117±0.1752	4.646±0.8564^*	3.802±0.9053
间充质细胞(n＝6)	1.036±0.3941	10.16±1.969^*	6.065±1.223	上皮细胞	0.6117±0.1752	4.646±0.8564^*	3.802±0.9053
间充质细胞(n＝6)	1.036±0.3941	10.16±1.969^*	6.065±1.223	实质细胞增殖§	109±31	1340±287^*	738±185

^*P＜0.05，与对照相比

＝P＜0.05，与没有改变(即0)相比。

数据区表示为均值±平均标准误，

§数据表示在600倍放大率下每10⁶象素的阳性细胞数。

三组间小鼠的初始体重无差异。12-14天的处理期后，对照组小鼠体重增加，博来霉素/载体组小鼠体重减轻，而用博来霉素/4NO处理组没有显著性改变。载体/博来霉素处理组小鼠的气道阻力显著增加，而博来霉素/4NO处理组无显著性改变。不考虑4NO处理，博来霉素处理的小鼠顺应性显著降低。载体/博来霉素处理组小鼠的BALF中的炎性淋巴细胞/白细胞数显著增加，而博来霉素/4NO处理组无显著改变。博来霉素/载体组小鼠的纤维变性评分和组织面积均增加，而博来霉素/4NO处理组无这些改变。

可以获得其它的纤维变性动物模型，例如给予羰基铁和四氯化碳来诱导小鼠肝脏纤维变性(Arezzini，Lunghi等，2003)。小鼠气道纤维变性可以通过重复给予先前经腹膜内注射卵清蛋白致敏的小鼠卵清蛋白来诱导(Blyth，Wharton等，2000；Kuhn，Homer等，2000；Wills-Karp2001)。

肺炎症

给予脂多糖(LPS)得到的肺炎症模型(Bozinvski等，Innate immuneresponses to LPS in mouse lung are suppressed and reversed byneutralization of GM-CSF via repression of TLR-4.Am J Physiol LCMP(2004)286：L877-L885)用于研究某些公开的化合物抑制肺炎症的能力。

为确定对肺炎症的作用，将载体(如上在博来霉素实验中所述)、CP-DM-4-35或4NO各自以150mg/kg腹膜内注射，2小时后如前述鼻内给予35μL LPS(LPS总量为1μg)对雌性balb/c小鼠进行预处理。给予LPS后24小时，用过量戊巴比妥钠处死小鼠，气管插管使得能够获得BAL用于炎性淋巴细胞和白细胞计数并使用BioRad蛋白测定试剂盒测定蛋白水平。另外，BALF中的活性MMP-9的量通过采用完善的方法学(参见例如Johnson S，Knox A.Autocrine production of matrixmetalloproteinase-2 is required for human airway smooth muscleproliferation Am J Physiol.1999 Dec；277(6 Pt 1)：L1109-17)经酶谱法测定。

LPS(1μg)明显增加每组中的BALF细胞数，不过4NO和CP-DM-4-35具有使细胞数降低的趋势(表7)。LPS/载体小鼠的BALF中的蛋白水平增高，但在用LPS激发前用4NO或CP-DM-4-35预处理的小鼠无此改变。LPS/载体处理的动物的活性MMP-9水平显著增加，但在用LPS激发前用4NO或CP-DM-4-35预处理的动物无此改变。

根据已知的糖皮质激素化合物在肺炎症中的抗炎活性以及这些化合物也抑制其它组织中的炎症，因此合理地预测本申请公开的化合物在机体的其它部位也具有抗炎活性。

表7.4NO(150mg/kg，i.p.)或CP-DM-4-35(150mg/kg，i.p.)处理对LPS诱导的雌性Balb/c小鼠炎症的作用。

	对照	LPS(1μg)	LPS/4NO	LPS/CP-DM-4-35
	对照	LPS(1μg)	LPS/4NO	LPS/CP-DM-4-35	BALF细胞#(n＝14)	12578±2630	54058±7872^*	38565±5809^*	38316±5906^*
BALF蛋白(mg)(n＝14)	0.16±0.02	0.26±0.03^*	0.16±0.02	0.20±0.01	BALF细胞#(n＝14)	12578±2630	54058±7872^*	38565±5809^*	38316±5906^*
BALF蛋白(mg)(n＝14)	0.16±0.02	0.26±0.03^*	0.16±0.02	0.20±0.01	活性MMP-9任意单位(n＝6)	0.07±0.02	0.46±0.10^*	0.32±0.08	0.32±0.08

^*P＜0.05，与对照相比

数据区为表示为均值±平均标准误

实施例52

平滑肌和成纤维细胞相关病理的临床评价

哮喘的临床评价在近期文献中有很好的描述。评价新的抗哮喘活性剂，与对所考虑的特别严重的哮喘目前最好的实际治疗进行对比。对于中度哮喘，许多临床终点(endpoint)可用于评价新的治疗剂，包括抢救(短效β-激动剂)治疗剂的使用率；哮喘恶化的次数，该恶化定义为需要短期口服糖皮质激素或收住院；FEV1；基于日志卡的症状评分；生活质量；不损失哮喘控制的情况下糖皮质激素节制的水平(Lemanske，Sorkness等，2001；Lemanske，Nayak等，2002)。许多研究特别检测了试验治疗开始和结束时所取气道活检物的哮喘病理的重塑成分(Sont，Willems等，1999)。在这些活检物中，测定平滑肌和结缔组织的量、显示细胞增值标记的细胞部分和上皮损伤程度是可行的(Druilhe，Wallaert等，1998；Benayoun，Druilhe等，2003)。

再狭窄

再狭窄可以通过许多终点在临床试验中评价。间接的结果包括心肌梗死的发生和心绞痛的发生。另外，可以通过使用基于射线照相或超声的方法的血管造影直接测定新内膜(Topol，Califf等，1994；Brack，Ray等，1995；Leon，Baim等，1998；Serruys，Foley等，2001)。

肺纤维变性

临床研究中肺纤维变性情况通过临床检测如杵状指(clubbing)、射线照相异常和肺功能检测(talmadge king)来确定。这些疾病特征与疾病进展的相关性和它们在评价新治疗剂中的重要性基于现有文献的系统综述被一致认可地确立(Lipinski，Black等，1975；King 2000；King，Tooze等，2001；Selman，King等，2001))。

涉及平滑肌和成纤维细胞的其它病症

可获得多种完善的临床方案用于新的活性剂在成纤维细胞和平滑肌功能改变的其它病症中的评价。本领域技术研究人员通过检索公用数据库如PubMed将能够得到和应用这些方案。

本发明所属领域的技术人员应理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下可以对发明进行多种修改。

为方便参考，下表列出了本申请中所使用的化合物ID号以及它们相关的化学名称。

表8

化合物ID 化学名称

2-甲氧基雌二醇(2MEO)

CP-DM-2-11-7 2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇(4NO)

CP-DM-3-91 2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟(4NOM)

CP-DM-3-106 2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇

CP-DM-3-105 2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-3-124 2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇

CP-DM-3-117 2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-3-119 2-甲氧基-6-(2，4-二硝基苯基亚肼基)雌酮-17-肟

CP-DM-3-118 2-甲氧基-6-(3-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-15 2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基))亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-16 2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亚氨基雌二醇

CP-DM-4-36 6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟

CP-DM-4-35 6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇

CP-DM-4-37 6-(4-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇

CP-DM-4-51 2-甲氧基-6-(3-氰基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-52 2-甲氧基-6-(3-氰基苄氧基)亚氨基雌二醇

CP-DM-4-38 6-(4-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟

CP-DM-3-101 雌酮-17-(4-硝基苄基)肟

CP-DM-3-102 雌酮-17-(3-硝基苄基)肟

CP-DM-3-103 2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基苄基)肟

CP-DM-3-104 2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基苄基)肟

CP-DM-4-5 2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)-亚胺基雌二醇

CP-DM-4-6 2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)-亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-33 雌酮-17-(4-甲氧基苄基)肟

CP-DM-4-34 2-甲氧基雌酮-17-(4-甲氧基苄基)肟

CP-DM-4-65 2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基苄氧基)亚氨基雌二醇

CP-DM-4-66 2-甲氧基-6-(3-甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-68 2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-62 2-甲氧基-6-(3-甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇

CP-DM-4-63 2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇

CP-DM-4-64 2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇

CP-DM-4-67 2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-69 2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-74 6-(3，5二氟苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-甲基肟

CP-DM-4-75 6-(4-硝基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-甲基肟

CP-DM-4-76 2-甲氧基-6-(4-甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-77 2-甲氧基-6-(4-异丙基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

CP-DM-4-78 2-甲氧基-6-(4-甲基苄氧基)亚氨基雌二醇

CP-DM-4-88 6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基雌三醇

CP-DM-4-91 2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇-17-乙酸酯

CP-DM-4-89 6-(4-硝基苄氧基)亚氨基-17-乙炔基-雌二醇

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Claims

1.式I的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；且

n为0或1；

条件是所述化合物包含至少一个基团A。

2.权利要求1的化合物，其中Z′和Z″中至少一个为A。

3.权利要求1的化合物，其中X选自被一个或多个取代基Y¹取代的芳基和被一个或多个取代基Y取代的杂芳基，其中Y¹选自-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d，其中Y选自-H、-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d。

4.权利要求1的化合物，所述化合物具有调节平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能的活性。

5.根据权利要求4的化合物，所述化合物具有调节平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能的特异性活性。

6.根据权利要求4或权利要求5的化合物，其中所述调节细胞功能为抑制细胞增殖。

7.根据权利要求4或权利要求5的化合物，其中所述调节细胞功能为调节细胞的细胞外基质沉积。

8.根据权利要求4或权利要求5的化合物，其中所述调节细胞功能为调节细胞的细胞因子表达。

9.权利要求8的化合物，其中所述调节细胞的细胞因子表达为抑制GM-CSF表达。

10.根据权利要求4或权利要求5的化合物，其中所述调节细胞功能为调节细胞收缩性。

11.根据权利要求4或权利要求5的化合物，其中所述调节细胞功能为调节细胞迁移。

12.根据权利要求4或权利要求5的化合物，其中所述平滑肌细胞为气道平滑肌细胞。

13.根据权利要求4或权利要求5的化合物，其中所述成纤维细胞为气道成纤维细胞。

14.根据权利要求1的化合物，所述化合物具有抑制气道高反应性的活性。

15.根据权利要求14的化合物，其中所述气道高反应性与哮喘有关。

16.根据权利要求1的化合物，所述化合物具有抑制纤维变性的活性。

17.根据权利要求1的化合物，所述化合物具有抑制肺纤维变性的活性。

18.根据权利要求1的化合物，所述化合物具有抑制炎症的活性。

19.权利要求1的化合物，其中Y优选为选自基团-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑和咪唑的钝化基团。

20.权利要求19的化合物，其中Y选自基团-NO₂、-CN、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑和咪唑。

21.权利要求1的化合物，其中X选自基团苯基、萘基或吡啶基。

22.权利要求1的化合物，其中A中的基团R^c为亚烷基。

23.权利要求1的化合物，其中A为＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-R^c-X或＞C＝N-NH-R^c-X。

24.权利要求1的化合物，其中Z″为A，而Z′选自基团＞CH₂、＞C＝O、＞C＝N-OH和＞C＝N-OR^b。

25.权利要求1的化合物，其中Z′为A，而Z″选自基团＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH和＞C＝N-OR^b。

26.权利要求1的化合物，其中R²选自基团-OR^b、-AR^b、-R^e、-R^cR^e、-CH＝NOH、-CH＝NOR^b、-CH＝NNR^b ₂、-OH、-SR^b、-R^b和-CN。

27.权利要求25的化合物，其中R²为-OMe。

28.权利要求1的化合物，其中R³选自基团-OH、-OR^a和-R^cOR^b。

29.权利要求1的化合物，其中R¹和R⁴各自为H。

30.权利要求1的化合物，其中R⁶为H。

31.式(V)的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；且

R^f为直接键或亚烷基。

32.式(VI)的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；且

R^f为直接键或亚烷基。

33.式(VII)的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

R^e为直接键或亚烷基；且

X¹选自被一个或多个取代基Y¹取代的芳基和被一个或多个取代基Y取代的杂芳基，其中Y¹选自-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d。

34.式(VIII)的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

R^f为直接键或亚烷基，且

35.式(IX)的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

Z为＞C＝O、＞C(H)OH或＞C＝N-OH；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；且

R^f为直接键或亚烷基。

36.式(X)的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

Z^IV为＞CH₂、＞C＝O或＞C＝N-OH；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；且

R^f为直接键或亚烷基。

37.式(XI)的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

Z′为A或＞CH₂、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-OR^b、＞C(R^b)-OH、＞C(R^b)-CN；＞C(R^b)-NR^b ₂、＞CR^b ₂、＞C＝N-NH₂、＞C＝N-NR₂、-O-、＞N-R^b、＞C(R^b)-R^c-OR^b、＞CR^bR^e、＞CR^b-NR^bR^e、＞C＝N-酯-R^a；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；且

R^f为直接键或亚烷基。

38.根据权利要求1的化合物，所述化合物选自：

2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(3-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(2-硝基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(2，4-二硝基苯基亚肼基)雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3-三氟甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亚氨基雌二醇

6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟

6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇

6-(4-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌二醇

2-甲氧基-6-(3-氰基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3-氰基苄氧基)亚氨基雌二醇

6-(4-氰基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟

雌酮-17-(4-硝基苄基)肟

雌酮-17-(3-硝基苄基)肟

2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基苄基)肟

2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基苄基)肟

2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)-亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)-亚氨基雌酮-17-肟

雌酮-17-(4-甲氧基苄基)肟

2-甲氧基雌酮-17-(4-甲氧基苄基)肟

2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(3-甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(3-甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌二醇

2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-甲基肟

6-(4-硝基苄氧基)亚氨基-2-甲氧基雌酮-17-甲基肟

2-甲氧基-6-(4-甲基苄氧基)亚氨基雌酮-17-甲基肟

2-甲氧基-6-(4-异丙基苄氧基)亚氨基雌酮-17-肟

2-甲氧基-6-(4-甲基苄氧基)亚氨基雌二醇

6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基雌三醇

2-甲氧基-6-(4-硝基苄氧基)亚氨基雌二醇-17-乙酸酯

6-(3，5-二氟苄氧基)亚氨基-17-乙炔基-雌二醇。

39.一种合成以上定义的式I的化合物的方法，所述方法包括使式II、III或IV的酮或醛前体或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物与式H₂N-O-X、H₂N-O-R^c-X、H₂N-NH-R^c-X、H₂N-NH-X或H₂N-酯-X的胺反应以形成式I的化合物的步骤：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

在式H₂N-O-X、H₂N-O-R^c-X、H₂N-NH-R^c-X、H₂N-NH-X或H₂N-酯-X中X为被一个或多个取代基Y取代的芳族基，其中Y选自-H、-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d。

40.包含式I的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物和药学可接受的载体的药物组合物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

条件是所述化合物包含至少一个基团A。

41.一种治疗与平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能相关的病症的方法，所述方法包括给予需要其的个体治疗有效量的式I的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

X为被一个或多个取代基Y取代的芳族基，其中Y选自-H、-NO₂、-CN、、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-R^c-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^cNR^b ₂、-R^cR^d；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

条件是所述化合物包含至少一个基团A。

42.根据权利要求41的方法，其中所述平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能为细胞增殖。

43.根据权利要求41的方法，其中所述平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能为细胞的细胞因子表达。

44.根据权利要求43的方法，其中所述细胞的细胞因子表达为GM-CSF表达。

45.根据权利要求41的方法，其中所述平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能为细胞的细胞外基质沉积。

46.根据权利要求41的方法，其中所述平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能为细胞收缩性。

47.根据权利要求41的方法，其中所述平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能为细胞迁移。

48.根据权利要求41的方法，其中所述平滑肌细胞为气道平滑肌细胞。

49.根据权利要求41的方法，其中所述成纤维细胞为气道成纤维细胞。

50.根据权利要求41的方法，其中所述病症为气道高反应性。

51.根据权利要求50的方法，其中所述气道高反应性与哮喘有关。

52.根据权利要求41的方法，其中所述病症为纤维变性。

53.根据权利要求41的方法，其中所述病症为肺纤维变性。

54.一种治疗炎症的方法，所述方法包括给予需要其的个体治疗有效量的式I的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

条件是所述化合物包含至少一个基团A。

55.式I的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物在制备用于治疗与平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能相关的病症的药物中的应用：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

X为被一个或多个取代基Y取代的芳族基，其中Y选自-H、-NO₂、-CN、-SO₃H、-SO₃R^a、-CO-R^b、-⁺NR^b ₃、-CO₂R^b、-卤素、-CF₃、-CCl₃、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-R^a、-NH₂、-NR^a ₂、-OH、-OR^a、-Rc-CN、-R^c-卤素、-NR^bCOR^b、-R^c-NR^b ₂、-R^cR^d；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

条件是所述化合物包含至少一个基团A。

56.式I的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物在制备用于治疗炎症的药物中的应用：

其中：

R²选自-OR^b、-(R^c)_n-AR^b、-H、-R^e、-R^cR^e、-CH＝NOH、-CH＝NOR^b、-CH＝NNR^b ₂、-OH、-SR^b、-R^b、-CN、-R^cR^d和卤素，其中n为0或1；

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

条件是所述化合物包含至少一个基团A。

57.式I的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物作为用于调节平滑肌细胞和/或成纤维细胞功能的活性剂的应用：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

条件是所述化合物包含至少一个基团A。

58.式I的化合物或其盐、水合物、前药、异构体、互变异构体和/或衍生物作为用于治疗炎症的活性剂的应用：

其中：

R³选自-OH、-OR^a、-R^cOR^b、-H、-酯-R^b；

R⁵为甲基；

R⁶为-H、-OH、-OR^b或-卤素；

R^c为直链或支链C₁-C₁₀亚烷基、亚烯基或亚炔基；

R^e为酰基；

条件是所述化合物包含至少一个基团A。