CN1867329A - 作为雌激素药剂的(4－羟基苯基)－1h－吲哚－3－甲醛肟衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有下述结构的式(I)的雌激素受体调节剂、或其可药用盐：(见图)其中R₁、R₂、R₃、和R₄如说明书中定义。

Description

作为雌激素药剂的(4-羟基苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟衍生物

发明领域

本发明涉及(羟苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟衍生物、其作为雌激素药剂的用途、以及其制备方法。

发明背景

已经有很多文献记载过雌激素在哺乳动物组织中具有多种功效，目前已知雌激素可以影响很多器官系统[Mendelsohn和Karas，NewEngland Journal of Medicine 340：1801-1811(1999)，Epperson等人，Psychosomatic Medicine 61：676-697(1999)，Crandall，Journalof Womens Health & Gender Based Medicine 8：1155-1166(1999)，Monk和Brodaty，Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 11：1-10(2000)，Hurn和Macrae，Journal of Cerebral Blood Flow &Metabolism 20：631-652(2000)，Calvin，Maturitas 34：195-210(2000)，Finking等人，Zeitschrift fur Kardiologie 89：442-453(2000)，Brincat，Maturitas 35：107-117(2000)，Al-Azzawi，Postgraduate MedicalJournal 77：292-304(2001)]。雌激素可以通过多种方式对组织产生作用。或许最具特征性的作用机理是它们与雌激素受体相互作用，导致基因转录发生改变。雌激素受体是由配体活化的转录因子，属于细胞核激素受体超家族。该家族的其它成员包括孕酮、雄激素、糖皮质激素和盐皮质激素受体。一旦结合配体之后，这些受体发生二聚，然后既可以通过直接结合DNA上的特定序列(称作响应元件)，也可以通过与反过来直接结合特定DNA序列的其它转录因子(例如AP1)相互作用来活化基因转录[Moggs和Orphanides，EMBO Reports 2：775-781(2001)，Hall等人，Journal of Biological Chemistry 276：36869-36872(2001)，McDonnell，Principles Of Molecular Regulation.p351-361(2000)]。有一类“辅调节(coregulatory)”蛋白还可以与配体结合的受体发生相互作用，从而进一步调节其转录活性[McKenna等人，Endocrine Reviews 20：321-344(1999)]。另外还表明，雌激素受体可以同时通过依赖于配体的方式和不依赖于配体的方式抑制NFKB-介导的转录[Quaedackers等人，Endocrinology 142：1156-1166(2001)，Bhat等人，Journal of Steroid Biochemistry & MolecularBiology 67：233-240(1998)，Pelzer等人，Biochemical & BiophysicalResearch Communications 286：1153-7(2001)]。

雌激素受体还可以通过磷酸化作用活化。这种磷酸化作用通过生长因子例如EGF介导，在配体不存在下引起基因转录变化[Moggs和Orphanides，EMBO Reports 2：775-781(2001)，Hall等人，Journalof Biological Chemistry 276：36869-36872(2001)]。

雌激素影响细胞的另一略具特征性的方式是通过所谓的膜受体。是否存在这类受体是有所争议的，但是已有很多文献记载雌激素可以由细胞引发出非常迅速的非基因组响应。负责转导上述效应的这种分子实体未被最后分离，但是有证据表明它至少与雌激素受体的核心形式有关[Levin，Journal of Applied Physiology 91：1860-1867(2001)，Levin，Trends in Endocrinology & Metabolism 10：374-377(1999)]。

至今已经发现两种雌激素受体。第一种雌激素受体在大约15年前被克隆，现在被称作ERαGreen等人，Nature 320：134-9(1986)]。第二种相对而言是较近发现的，被称作ERβ[Kuiper等人，Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America93：5925-5930(1996)]。对ERβ的早期研究集中于分析其对各种配体的亲和力，并且实际上已经发现与ERα存一些差异。已经很详细地绘制了ERβ在齿动物中的组织分布，其与ERα并不一致。例如小鼠和大鼠子宫的组织主要表达ERα，而小和大鼠肺主要表达ERβ[Couse等人，Endocrinology 138：4613-4621(1997)，Kuiper等人，Endocrinology 138：863-870(1997)]。即使在同一器官内部，ERα和ERβ的分布也可能是不同的。例如，在小鼠卵巢中，ERβ高度表达于粒层细胞中，而ERα主要集中在鞘和基质细胞中[Sar和Welsch，Endocrinology 140：963-971(1999)，Fitzpatrick等人，Endocrinology140：2581-2591(1999)]。然而，有实例表明这些受体可以共表达，而且也有体外证据证实ERα和ERβ以形成杂二聚体[Cowley等人，Journal of Biological Chemistry 272：19858-19862(1997)]。

最有效的内源性雌激素是17β-雌二醇。已经公开了很多可以模拟或阻断17β-雌二醇活性的化合物。具有大致与17β-雌二醇相同生物活性的化合物被称作“雌激素受体激动剂”。那些当与17β-雌二醇联合给药时阻断其活性的化合物被称作“雌激素受体拮抗剂”。实际上，雌激素受体激动剂和雌激素受体拮抗剂活性之间存在一定关系，某些化合物在某些组织中作为雌激素受体激动剂，而在其它组织中却是雌激素受体拮抗剂。这些具有混合活性的化合物被称作选择性的雌激素受体调节剂(SERM)，在治疗上是有用的药物(例如EVISTA)[McDonnell，Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7：S10-S15(2000)，Goldstein等人，Human Reproduction Update 6：212-224(2000)]。为什么同一化合物可以具有细胞特异性的准确原因目前尚未阐明，但是已经发现受体构象和/或辅调节蛋白的周围环境存在差异。

已知在某些情况下雌激素受体在结合配体时可以接受不同的构象。然而，仅仅是最近才发现这些变化所带来的结果和精妙之处。已经通过与不同的配体共结晶发现了ERα和ERβ的三维结构，其清楚显示出螺旋12在雌激素受体拮抗剂的存在下换位，这样在空间上阻碍了受体-辅调节蛋白之间发生相互作用所需要的蛋白序列[Pike等人，Embo 18：4608-4618(1999)，Shiau等人，Cell 95：927-937(1998)]。另外，还可以使用噬菌体展示技术来识别在不同配体存在下与雌激素受体发生相互作用的肽[Paige等人，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 96：3999-4004(1999)]。例如，识别出能辨别受全雌激素受体激动剂17β-雌二醇和己烯雌酚束缚的ERα的肽。已表明，另一肽能辨别受ERα和ERβ束缚的氯米芬。这些资料表明，各配体潜在地使受体置于可能具有不同生物活性且既独特又不可预期的构象中。

如上所述，雌激素可以影响各种生物过程。另外，在讨论有关性别差异时(例如发病频率、应急反应等)，相关的解释还可能涉及雄性和雌性之间所存在的雌激素水平差异。

发明概述

本发明涉及(羟苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟衍生物。在某些方面，本发明涉及式1化合物或其可药用盐或前药：

其中：

R₁是氢、任选被取代的烷基、卤素、CN、或任选被取代的烷氧基；

R₂是氢、任选被取代的烷基、或任选被取代的苯基；

或者R₁和R₂一起可以形成5-7元环；以及

R₃和R₄各自独立地是H、OH、卤素、CN、任选被取代的苯基、任选被取代的烷基或任选被取代的烷氧基。

在某些实施方案中，本发明涉及含有化合物1和可药用载体的药物组合物。

在其它实施方案中，本发明涉及这类化合物在治疗或预防例如炎性肠病的疾病中的用途。

发明详述

本发明提供了可用于治疗和/或预防例如炎性肠病的疾病(包括克罗恩氏病和结肠炎)的式1的雌激素化合物或其可药用盐或前药：

其中R₁是氢、任选被取代的烷基、卤素、CN、或任选被取代的烷氧基；R₂是氢、任选被取代的烷基、或任选被取代的苯基；或者R₁和R₂一起可以形成5-7元环；以及R₃、和R₄各自独立地是H、OH、卤素、CN、任选被取代的苯基、任选被取代的烷基或任选被取代的烷氧基。

在化合物1的某些实施方案中，R₁是烷基，优选低级烷基，例如甲基。在其它实施方案中，R₂是氢、或烷基，优选低级烷基，例如甲基。其它实施方案包括其中R₁和R₂一起形成6元环的组合。在部分实施方案中，R₃是H、卤素或CN。R₄在部分实施方案中是氢。在部分其它实施方案中，R₄是氟。在部分实施方案中，R₄是邻位氟。

当本发明化合物含有碱性基团时，可药用盐可以由有机和无机酸形成，例如乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、苹果酸、邻苯二甲酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、樟脑磺酸、以及类似已知的可接受的酸形成。当本发明化合物含有酸性基团时，上述盐还可以由有机和无机碱形成，例如碱金属盐(如钠、锂、或钾盐)、碱土金属盐、铵盐、含有1-6个碳原子的烷基铵盐或在各烷基中含有1-6个碳原子的二烷基铵盐、以及在各烷基中含有1-6个碳原子的三烷基铵盐。

除非另有明确定义，本文中使用的单独或作为另一基团一部分的术语“烷基”是指被取代或未被取代的脂肪族烃链，包括但并不限于含有1-12个碳原子、优选1-6个碳原子的直链和支链。例如术语“烷基”包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。具体包括在“烷基”定义范围内的有任选被取代的脂肪族烃链。术语“低级烷基”是指含有1-6个碳原子的烷基，在某些实施方案中含有1-3个碳原子。本文中所使用的术语“烷氧基”是指基团R-O-，其中R是烷基，优选含有1-6个碳原子。

本文定义中使用的碳数目是指碳骨架和碳支链，并不包括取代基例如烷氧基取代基等中的碳原子。

本文中使用的单独或作为另一基团一部分的术语“苯基”是指被取代或未被取代的苯基。

任选被取代的烷基、链烯基、和苯基可以被一个或多个取代基取代。适宜的任选的取代基可以独立地选自硝基、氰基、-N(R₁₁)(R₁₂)、卤素、羟基、羧基、烷基、链烯基、链炔基、环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷基烷氧基、烷氧羰基、烷氧烷氧基、全氟烷基、全氟烷氧基、芳烷基、烷芳基、羟烷基、烷氧烷基、烷硫基、-S(O)₂-N(R₁₁)(R₁₂)、-C(＝O)-N(R₁₁)(R₁₂)、(R₁₁)(R₁₂)N-烷基、(R₁₁)(R₁₂)N-烷氧烷基、(R₁₁)(R₁₂)N-烷基芳氧基烷基、-S(O)_s-芳基(其中s＝0-2)、或者-S(O)_s-杂芳基(其中s＝0-2)。在本发明某些实施方案中，烷基、链烯基、链炔基、环烷基或苯基的优选取代基包括硝基、氰基、-N(R₁₁)(R₁₂)、卤素、羟基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷氧烷基、和烷氧羰基。在本发明某些实施方案中，芳基和杂芳基的优选取代基包括-N(R₁₁)(R₁₂)、烷基、卤素、全氟烷基、全氟烷氧基、芳烷基和烷芳基。R₁₁和R₁₂各自独立地选自氢和烷基。

本文中使用的单独或作为另一基团一部分的术语“链烯基”是指含有至少一个双键的被取代或未被取代的脂肪族烃链，包括但并不限于含有2-8个碳原子的直链和支链。优选该链烯基含有1或2个双键。这类链烯基可能存在E或Z构型，因此本发明包括这两种构型。具体包括在“链烯基”定义内的有任选被取代的脂肪族烃链。与链烯基相连的杂原子例如O、S或N-R不能与结合双键的碳原子相连。

本文中使用的术语链炔基是指可以含有1-3个三键、具有2-7个碳原子的脂肪族、直链或支链烃链。本文中使用的术语环烷基是指具有3-8个碳原子的单碳环，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。本文中使用的单独或作为另一基团一部分的术语芳基是指含有芳族5-13元单或双碳环，例如苯基或萘基。优选含有芳基部分的基团是环中含有5-7个碳原子的单环。本文中使用的单独或作为另一基团一部分的术语杂芳基是指含有1-5个独立地可为氮、氧或硫的杂原子的芳族5-13元含碳单环或双环。优选含有杂芳基部分的基团是环中含有5-7元的单环，其中一个或多个环原子独立地选自氮、氧、或硫。适宜的芳基包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吲哚基和喹啉基。

被卤素取代的烷基和链烯基实例包括1-溴乙烯基、1-氟乙烯基、1，2-氟基、2，2-二氟乙烯基、1，2，2-三氟乙烯基、1，2-二溴乙烷、1，2-二氟乙烷、1-氟-2-溴乙烷、CF₂CF₃、CF₂CF₂CF₃等。

术语卤素包括溴、氯、氟、和碘，优选为溴、氯或氟。

至于提供本发明所包括的化合物或物质而言，根据本发明所使用的术语“提供”是指要么直接施用这类化合物或物质，要么施用在体内可形成有效量的所述化合物或物质的前药、衍生物、或类似物。

在制备本发明化合物中用到的试剂既可以商购得到，也可以按照现有文献中描述过的常规方法制备得到。

下面的流程图1-3描述了本发明几个代表性实施例的制备。

流程图1

流程图2

流程图3

本发明化合物是雌激素受体调节剂，可用于治疗或抑制至少部分由雌激素缺乏或过量介导、或者可以通过使用雌激素药剂而得到治疗或抑制的病症、障碍或病理状态。本发明化合物尤其可用于治疗其中内生性雌激素严重减少的近绝经、绝经、或绝经后患者。绝经期通常被定义为最后的自然月经期，其特征在于卵巢功能停止，导致血流中的循环雌激素严重减少。本文中使用的绝经期还包括雌激素生成减少的情形，这种情形可能是由手术、或化学上引起的，也可能是由导致卵巢功能过早退化或停止的病理状态引起的。

因此，本发明的化合物可用于治疗或抑制骨质疏松症以及抑制骨脱矿质化(bone demineralization)，骨脱矿质化可能是由于个体中新骨组织的形成与老组织的再吸收之间失去平衡而引起的，最终导致骨净损失。在很多个体中均会出现这类骨缺失，特别是绝经后的妇女、接受过双侧卵巢切除术的人群、正在接受或已经接受过长期皮质类甾醇治疗的人群、遭受性腺发育不全的人群、以及患有柯兴氏综合症的人群。在患有骨折、具有缺陷性骨结构的个体、以及正在接受骨相关手术和/或假肢植入的人群中，使用这些化合物还可以解决他们对于包括牙骨和口腔骨在内的骨的具体需要。除了上述这些问题之外，这些化合物还可用于治疗或抑制骨关节炎、低钙血症、高钙血症、佩吉特氏病(Paget′s disease)、骨软化症、骨钙质缺乏、多发性骨髓瘤以及对骨组织具有有害作用的其它形式的癌症。

本发明的化合物还可用于治疗或抑制良性或恶性的异常组织生长，包括前列腺肥大、子宫平滑肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合症、子宫内膜息肉、良性乳房疾病、子宫腺肌病、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、CNS癌(例如神经胶质瘤或astioblastomia)。

本发明的化合物具有心脏保护特性，因而可用于降低胆固醇、甘油三酯、Lp(a)、和LDL水平；抑制或治疗高胆固醇血症；高脂血症；心血管疾病；动脉粥样硬化症；外周血管疾病；再狭窄、和血管痉挛；以及抑制因导致免疫介导的血管损伤的细胞活动而引起的血管壁损伤。为了抑制骨质疏松，在使用雌激素治疗绝经期后患者和使用雌激素治疗男性患者时，上述心脏保护特性特别重要。

本发明的化合物还是抗氧化剂，因而可用于治疗或抑制游离基诱导的病理状态。需要抗氧化剂治疗的具体情形有癌症、中枢神经系统疾病、阿耳茨海默氏病、骨病、老化、炎性疾病、外周血管疾病、类风湿性关节炎、自体免疫疾病、呼吸窘迫、气肿、再灌注损伤的预防、病毒性肝炎、慢性活动性肝炎、肺结核、银屑病、系统性红斑狼疮、成人呼吸窘迫综合症、中枢神经系统创伤和中风。

本发明的化合物还可用于提高认知力，治疗或抑制老年性痴呆、阿耳茨海默氏病、认知减退、神经变性疾病，提高神经保护作用或认知力提高作用。

本发明的化合物还可用于治疗或抑制炎性肠病、溃疡性直肠炎、克罗恩氏病、和结肠炎；与绝经相关的病症，例如血管舒缩症状包括潮热、阴道或外阴萎缩、萎缩性阴道炎、阴道干燥、搔痒症、性交困难、排尿困难、尿频、尿失禁、尿道感染、血管舒缩症状包括潮热、肌痛、关节痛、失眠、过敏等；男性型秃发；皮肤萎缩；痤疮；II型糖尿病；功能障碍性子宫出血；和不育症。

本发明的化合物可用于其中闭经是有益的病理状态中，所述病理状态例如白血病、子宫内膜脱除、慢性肾病或肝病或者凝固疾病或障碍。

本发明的化合物可用作避孕药，尤其是当其与孕激素联用时。

应该理解的是，在给药用于治疗或抑制特定病理状态或障碍时，其有效剂量可能取决于所使用的特定化合物、给药方式、待治疗病症的症状、及其严重程度、以及待治疗个体相关的身体因素。本发明化合物的有效给药可以按照大约0.1mg/天至大约1,000mg/天的口服剂量服用。优选按照大约10mg/天至大约600mg/天、更优选大约50mg/天至大约600mg/天，分成单一剂量或者两次或更多次的分剂量给药。预期的日剂量可望随给药途径的不同而不同。

上述剂量可以按照任意一种用于将本发明的活性化合物引导至接受者血流中的方式给药，包括口服、经植入物、非肠道(包括静脉内、腹膜内和皮下注射)、直肠、鼻内、阴道内、和经皮给药。

含有本发明活性化合物的口服制剂可以含有任意一种常用的口服剂型，包括片剂、胶囊剂、含剂形式、药片、锭剂以及口服液体制剂、混悬剂或溶液剂。胶囊剂可以含有(一种或多种)活性化合物与惰性填充剂和/或稀释剂例如可药用淀粉(如玉米、马铃薯或木薯淀粉)、糖、人造甜味剂、粉状纤维素例如结晶和微晶纤维素、面粉、明胶、树胶等的混合物。有用的片剂可以按照常规的挤压法、湿法制粒法或干法制粒法制备得到，同时使用可药用的稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、表面改性剂(包括表面活性剂)、助悬剂或稳定剂，包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、十二烷基硫酸钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、藻酸、阿拉伯胶、黄原胶、柠檬酸钠、复合硅酸盐、碳酸钙、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨糖醇、磷酸氢二钙、硫酸钙、乳糖、高岭土、甘露醇、氯化钠、滑石、干燥淀粉和糖粉。优选的表面改性剂包括非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、十八醇十六醇混合物、聚乙二醇单鲸蜡基醚(cetomacrogol)乳化蜡、山梨坦酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸镁铝、和三乙醇胺。本发明的口服制剂可以采用常规的延迟释出或限时释出制剂以改变活性化合物的吸收情况。该口服制剂还可以将活性成分包含在水或果汁中给药，如果需要的话，可以含有适宜的增溶剂或乳化剂。

在某些情形中，可能需要将化合物以气雾剂的形式直接施用至气道。

本发明的化合物还可以通过非肠道或腹膜内给药。该活性化合物的游离碱或其可药用盐的溶液剂或混悬剂可以在适当混合有例如羟丙基纤维素的表面活性剂的水中制备得到。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备得到分散剂。在储存和使用的常规条件下，这些制剂中可以含有防腐剂以抑制微生物的生长。

适合注射给药的药物剂型包括无菌水溶液剂或分散剂以及用于临时配制无菌注射溶液剂或分散剂的无菌粉剂。在任何情形中，这种剂型必须无菌且具有易于注射的流动性。它在制造和储存条件下必须保持稳定，同时还必须能够抵抗微生物例如细菌和真菌的污染。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)的溶剂或者分散介质、及其适宜的混合物，以及植物油。

对于本发明而言，经皮给药被理解为包括所有透过体表和体内通道(包括上皮和粘膜组织)内层的给药方式。使用本发明化合物、或其可药用盐的洗剂、霜剂、泡沫、贴剂、混悬剂、溶液剂、和栓剂(直肠和阴道给药)形式可以实现上述给药。

通过使用含有活性化合物以及对该活性化合物呈惰性且对皮肤无毒的载体的经皮贴剂可以实现经皮给药，从而释放出药剂以通过皮肤系统性吸收入血液中。载体可以为任意形式，例如乳膏和软膏、糊、凝胶、和闭合装置。乳膏和软膏可以是水包油或油包水型的粘性液体或半固体乳状液。由分散于含有活性成分的石油或亲水性石油中的吸附性粉末组成的糊也是适宜的。各种闭合装置可以用于将活性成分释放入血液中，例如将半透膜覆盖在含有活性成分和载体(可有可无)的储藏库、或者含有活性成分的基质上。其它闭合装置在文献中是已知的。

栓剂可以由传统材料制成，传统材料包括可可脂(可以加入也可以不加入蜡以调节栓剂的熔点)、和甘油。还可以使用水溶性栓剂基质，例如具有不同分子量的聚乙二醇。

实施例1a

1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚

向2-甲基吲哚(3.28g，25mmol)、4-苄氧基碘苯(7.76g，25mmol)、碳酸钾(2.65g，25mmol)、和N-甲基吡咯烷酮(250mL)的混合物中加入溴化亚铜(I)(0.5g，3.5mmol)。搅拌后的溶液加热至180℃，保持18小时。反应混合物冷却后，倾入冰上，用乙酸乙酯萃取。有机层用水和盐水洗涤后，用无水MgSO₄干燥，除去溶剂得到暗色液体。通过硅胶色谱法(2％乙酸乙酯-己烷)纯化得到为白色固体的标题化合物(30％)：mp 95-96℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.24(3H，s)，5.19(2H，s)，6.38(1H，s)，6.93-7.04(3H，m)，7.20(2H，d，J＝1.9Hz)，7.23(2H，d，J＝3.1Hz)，7.32-7.53(8H，m)；MS m/z(M+H)⁺314：

对C₂₂H₁₉NO0.1H₂O的分析：

计算值：C，83.83；H，6.14；N，4.44。

实测值：C，83.84；H，6.18；N，4.29。

实施例1b

5-氟-1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚

将5-氟-2-甲基吲哚(5.0g，33.5mmol)与4-苄氧基碘苯(10.40g，33.5mmol)按照前面实施例1a中采用的步骤反应得到白色固体(23％)：mp 94-95℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.23(3H，s)，5.19(2H，s)，6.39(1H，s)，6.84-6.94(2H，m)，7.19-7.29(3H，m)，7.34-7.44(5H，m)，7.51(2H，d，J＝7.1Hz)；MS m/z(M+H)⁺332。

对C₂₂H₁₈NOF的分析：

计算值：C，79.74；H，5.47；N，4.23。

实测值：C，79.54；H，5.54；N，4.21。

实施例1c

5-氯-1-(4-甲氧甲基氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚

将5-氯-2-甲基吲哚(4.14g，25mmol)与4-甲氧基甲基氧基碘苯(6.20g，25mmol)按照前面实施例1a中采用的步骤反应得到无色液体(19％)：¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.25(3H，s)，3.44(2H，s)，5.28(2H，s)，6.40(1H，s)，6.96(1H，d，J＝8.8Hz)，7.02(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.8Hz)，7.22(2H，d，J＝8.8Hz)，7.36(2H，d，J＝8.8Hz)，7.55(1H，d，J＝2.0Hz)；MS m/z(M+H)⁺302/304(1Cl)。

对C₁₇H₁₆ClNO₂的分析：

计算值：C，67.66；H，5.34；N，4.64。

实测值：C，67.49；H，5.17；N，4.51。

实施例1d

5-溴-1-(4-甲氧甲基氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚

将5-溴-2-甲基吲哚(5.59g，23.8mmol)与4-甲氧甲基氧基碘苯(7.47g，23.8mmol)按照前面实施例1a中采用的步骤反应得到无色液体(8.4％)：¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.23(3H，s)，3.43(2H，s)，5.26(2H，s)，6.39(1H，s)，6.94(1H，d，J＝8.7Hz)，7.01(1H，dd，J＝2.2Hz，J＝8.6Hz)，7.20(2H，d，J＝8.6Hz)，7.34(2H，d，J＝8.6Hz)，7.53(1H，d，J＝2.2Hz)；MS m/z(M+H)⁺346/348(1Br)。

对C₁₇H₁₆BrNO₂的分析：

计算值：C，58.98；H，4.66；N，4.05。

实测值：C，58.72；H，4.53；N，4.17。

实施例1e

(4E)-9-(4-苄氧基苯基)-1，2，3，9-四氢-4H-咔唑

将咔唑(8.70g，39.7mmol)与4-苄氧基碘苯(12.33g，39.7mmol)按照前面实施例1a中采用的步骤反应得到棕褐色固体(20％)：mp128-129℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.86(4H，br s)，2.55(2H，br s)，2.72(2H，br s)，5.16(2H，s)，7.00-7.03(2H，m)，7.05-7.08(1H，m)，7.13-7.16(2H，m)，7.27-7.30(2H，m)，7.33-7.36(1H，m)，7.40-7.43(2H，m)，7.49(2H，d，J＝7.2Hz)；MS m/z(M+H)⁺354。

对C₂₅H₂₃NO的分析：

计算值：C，84.95；H，6.56；N，3.96。

实测值：C，84.74；H，6.76；N，3.91。

实施例1f

1-(4-苄氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚

向2-甲基吲哚(6.23g，47.5mmol)、4-苄氧基-3-氟溴苯(14.066g，50mmol)、碳酸钾(5.83g，55mmol)、和N-甲基吡咯烷酮(500mL)的混合物中加入溴化亚铜(I)(1.0g，7mmol)。搅拌后的溶液加热至180℃，保持18小时。反应混合物冷却后，倾入冰上，用乙酸乙酯萃取。有机层用水和盐水洗涤后，用无水MgSO₄干燥，除去溶剂得到暗色液体，将其通过硅胶色谱法(2％乙酸乙酯-己烷)纯化得到为白色固体的标题化合物(3.45gr.22％收率)：mp 70-71℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.26(3H，s)，5.28(2H，s)，6.39(1H，s)，6.99-7.05(3H，m)，7.21-7.24(2H，m)，7.36-7.54(7H，m))；MS m/z(M+H)⁺332：

对C₂₂H₁₈NOF0.1H₂O的分析：

计算值：C，79.31；H，5.51；N，4.20。

实测值：C，79.29；H，5.39；N，4.16。

实施例2a

1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛

将三氯氧化磷(3mL)加入至无水二甲基甲酰胺(6mL)中，混合物在室温下搅拌15分钟。加入1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚(0.94g，3mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的混合物，混合物加热至80℃，持续18小时。反应混合物倾入冰上，通过加入2NNaOH调节pH至7。混合物用乙酸乙酯萃取(2×100mL)。有机层用水和盐水萃取，MgSO₄干燥。蒸发得到为暗色固体的产物。将其通过硅胶色谱法(10％ EtOAC-己烷)纯化得到白色固体(63％)：mp150-152℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.54(3H，s)，5.22(2H，s)，6.99(1H，d，J＝7.9Hz)，7.17-7.42(4H，m)，7.45-7.54(7H，m)，8.17(1H，d，J＝7.5Hz)，10.19(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺342。

对C₂₃H₁₉NO₂的分析：

计算值：C，80.92；H，5.61；N，4.10。

实测值：C，80.76；H，5.70；N，3.93。

实施例2b

5-氟-1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛

将三氯氧化磷(5mL)加入至无水二甲基甲酰胺(10mL)中，混合物在室温下搅拌15分钟，向其中加入5-氟-1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚(1.63g，4.9mmol)的二甲基甲酰胺(10mL)溶液，按照实施例2a中采用的步骤反应得到棕褐色固体(85％)：mp 219-220℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.53(3H，s)，5.22(2H，s)，6.99-7.06(2H，m)，7.27(2H，d，J＝8.9Hz)，7.37-7.53(7H，m)，7.86(1H，dd，J＝2.5Hz，J＝9.5Hz)；MS m/z(M+H)⁺360。

对C₂₃H₁₈FNO₂·0.5H₂O的分析：

计算值：C，74.99；H，5.20；N，3.80。

实测值：C，74.91；H，4.96；N，3.59。

实施例2c

5-氯-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛

将三氯氧化磷(5mL)加入至无水二甲基甲酰胺(10mL)中，在室温下搅拌15分钟，向其中加入5-氯-1-(4-甲氧甲基氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚(1.22g，3.5mmol)的二甲基甲酰胺(10mL)溶液。溶液按照实施例2a中采用的步骤反应得到棕褐色固体(85％)：mp＞240℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.52(3H，s)，6.97-7.02(3H，m)，7.22(1H，dd，J＝2.3Hz，J＝8.7Hz)，7.30(2H，d，J＝8.6Hz)，8.40(1H，d，J＝2.1Hz)，10.02(1H，s)，10.16(1H，s)；MS m/Z(M+H)⁺286/288(1Cl)。

对C₁₆H₁₂ClNO₂·0.3H₂O的分析：

计算值：C，66.01；H，4.36；N，4.81。

实测值：C，65.85；H，4.10；N，4.74。

实施例2d

5-溴-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛

将三氯氧化磷(2.5mL)加入至无水二甲基甲酰胺(5mL)中，在室温下搅拌15分钟，向其中加入5-溴-1-(4-甲氧甲基氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚(0.65g，1.9mmol)的二甲基甲酰胺(10mL)溶液。溶液按照实施例2a中采用的步骤反应得到棕褐色固体(51％)：mp＞250℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.50(3H，s)，6.95-7.02(3H，m)，7.21(1H，dd，J＝2.4Hz，J＝8.8Hz)，7.28(2H，d，J＝8.7Hz)，8.38(1H，d，J＝2.2Hz)，9.98(1H，s)，10.14(1H，s)；MS m/Z(M+H)⁺318/320(1Br)。

对C₁₆H₁₂BrNO₂·0.2H₂O的分析：

计算值：C，55.99；H，3.88；N，4.35。

实测值：C，55.69；H，3.95；N，4.15。

实施例2e

(4E)-9-(4-苄氧基苯基)-1，2，3，9-四氢-4H-咔唑-4-酮

向搅拌后的(4E)-9-(4-苄氧基苯基)-1，2，3，9-四氢-4H-咔唑(1.55g，4.4mmol)、四氢呋喃(30mL)、和水(20mL)的溶液中加入DDQ(1g，4.4mmol)。继续搅拌30分钟，粗产物过滤后用水洗涤。产物通过硅胶色谱法纯化(25％EtOAc-己烷)得到白色固体(57％)：mp219-220℃；¹H NMR(CDCl₃)：δ2.18-2.25(2H，m)，2.62(2H，t，J＝5.9Hz)，2.79(2H，t，J＝6.1Hz)，5.16(2H，s)，7.11-7.51(12H，m)，8.30(1H，d，J＝7.9Hz)；MS m/z(M+H)⁺368。

对C₂₅H₂₁NO₂·0.5H₂O的分析：

计算值：C，79.76；H，5.86；N，3.72。

实测值：C，79.86；H，5.75；N，3.53。

实施例2f

1-(4-苄氧基苯基)-H-吲哚-3-甲醛

将1H-吲哚-3-甲醛(3.63g，25mmol)与4-苄氧基碘苯(7.76g，25mmol)按照前面实施例1a中采用的步骤反应得到黄色固体(12％)：mp 62-64℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ5.22(2H，s)，7.26(2H，d，J＝8.8Hz)，7.32-7.52(7H，m)，7.61(2H，d，J＝8.8Hz)，8.19-8.22(1H，m)，8.54(1H，s)，10.02(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺328。

对C₂₂H₁₇NO₂·0.1H₂O的分析：

计算值：C，80.27；H，5.27；N，4.25。

实测值：C，80.15；H，5.05；N，3.97。

实施例2g

1-(4-苄氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛

将三氯氧化磷(3mL)加入至无水二甲基甲酰胺(6mL)中，混合物在室温下搅拌15分钟。加入1-(4-苄氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚(1.03g，3.1mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的混合物，然后混合物加热至80℃，保持18小时。反应混合物倾入冰上，通过加入2N NaOH调节pH为7。混合物用乙酸乙酯萃取(2×100mL)，有机层用水和盐水洗涤，MgSO₄干燥，蒸发得到为暗色固体的产物。通过硅胶色谱法纯化(25％EtOAC-己烷)得到白色固体(0.84gr，76％)：mp 166-168-152℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.55(3H，s)，5.30(2H，s)，7.04(1H，d，J＝6.9Hz)，7.19-7.28(2H，m)，7.23-7.52(7H，m)，7.44(2H，dd，J＝6.0Hz，J＝1.4Hz)，7.59(1H，dd，J＝11.7Hz，J＝2.5)，8.17(1H，dd，J＝7.0Hz，J＝1.0)，10.20(1H，s)Hz；MS m/z(M+H)⁺360。

对C₂₃H₁₈FNO₂₍0.1H₂O)的分析：

计算值：C，76.48；H，5.08；N，3.88。

实测值：C，76.39；H，4.81；N，3.69。

实施例3a

1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟

将1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.64g，1.9mmol)、盐酸羟胺(0.25g，3，6mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的溶液加热回流30分钟。混合物冷却后，蒸发除去甲醇。产物用乙酸乙酯萃取(2×50mL)，有机层用水和盐水洗涤，MgSO₄干燥。蒸发除去溶剂，产物通过硅胶色谱法纯化(25％乙酸乙酯-己烷)得到白色固体(53％)：mp 171-173℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.31(3H，s)，5.20(2H，s)，6.94-7.J01(1H，m)，7.10-7.14(2H，m)，7.23(2H，d，J＝8.9Hz)，7.37-7.47(5H，m)，7.52(2H，d，J＝7.4Hz)，8.01-8.03(1H，m)，8.41(1H，s)，10.66(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺357。

对C₂₃H₂₀N₂O₂·0.5H₂O的分析：

计算值：C，75.60；H，5.79；N，7.67。

实测值：C，75.12；H，5.53；N，7.34。

实施例3b

5-氟-1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟

将5-氟-1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.97g，2.7mmol)、盐酸羟胺(0.25g，3，6mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的溶液按照实施例3a中的步骤反应得到白色固体(88％)：mp 183-185℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.30(3H，s)，5.20(2H，s)d，6.94-6.97(2H，m)，7.23(2H，d，J＝8.9Hz)，7.37-7.46(5H，m)，7.52(2H，d，J＝6.8Hz)，7.71(1H，d，J＝10.1Hz)，8.41(1H，s)，10.72(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺375。

对C₂₃H₁₉FN₂O₂的分析：

计算值：C，73.78；H，5.11N，7.48。

实测值：C，73.55；H，5.03；N，7.35。

实施例3e

(4E)-9-(4-苄氧基苯基)-1，2，3，9-四氢-4H-咔唑-4-酮肟

将(4E)-9-(4-苄氧基苯基)-1，2，3，9-四氢-4H-咔唑-4-酮(1.00g，2.7mmol)、盐酸羟胺(0.56g，8.1mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的混合物按照实施例3a中的反应得到白色固体(51％)：mp241-243℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.83-1.92(2H，m)，2.65(2H，t，J＝5.9Hz)，2.72(2H，t，J＝6.0Hz)，5.20(2H，s)，7.09-7.14(3H，m)，7.22(2H，d，J＝8.8Hz)，7.36-7.46(5H，m)，7.51(2H，d，J＝6.9Hz)，8.00-8.02(1H，m)，10.46(1H，s)；MS m/z(M-H)^-379。

对C₂₅H₂₄N₂O₂的分析：

计算值：C，78.51；H，5.80；N，7.32。

实测值：C，78.24；H，5.52；N，7.26。

实施例3f

1-(4-苄氧基苯基)-H-吲哚-3-甲醛肟

将1-(4-苄氧基苯基)-H-吲哚-3-甲醛(0.50g，1.5mmol)、盐酸羟胺(0.25g，3，6mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的混合物按照实施例3a中的步骤反应得到黄色固体(61％)：mp 152-154℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ5.20(2H，s)，7.19-7.53(12H，m)，7.86(1H，s)，8.10(1H，d，J＝7.5Hz)，10.75(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺383。

对C₂₂H₁₈N₂O₂的分析：

计算值：C，77.17；H，5.30；N，8.18。

实测值：C，77.49；H，5.44；N，7.85。

实施例3g

1-(4-苄氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟

向搅拌后的1-(4-苄氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.81g，2.3mmol)、盐酸羟胺(0.25g，3.6mmol)和甲醇(25mL)的溶液中加入吡啶(1mL)。反应混合物加热回流，保持30分钟。混合物冷却后，蒸发除去甲醇，残余物投入乙酸乙酯/水中。产物用乙酸乙酯萃取(2×50mL)，乙酸乙酯层用水和盐水洗涤，MgSO₄干燥。蒸发除去溶剂，粗产物通过硅胶色谱法纯化(25％乙酸乙酯-己烷)得到白色固体(0.7gr，83％)：mp 167-168℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.32(3H，s)，5.29(2H，s)，6.99-7.01(1H，m)，7.10-7.17(2H，m)，7.25-7.28(1H，m)，7.37-7.42(1H，m)，7.43-7.49(3H，m)，7.49-7.54(2H，m)，8.01-8.04(1H，m)，8.41(1H，s)，10.67(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺375。

对C₂₃H₁₉FN₂O₂的分析：

计算值：C，73.78；H，5.11；N，7.48。

实测值：C，73.53；H，5.06；N，7.32。

实施例4

1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟

向搅拌后的二氯甲烷(20mL)、Pd(OAc)₂(50mg，0.2mmol)、和三乙基硅烷(2mL)的溶液中加入三乙胺(1mL)，混合物在室温下搅拌15分钟。向混合物中加入1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟(0.36g，1mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，搅拌90分钟。加入乙酸乙酯(25mL)和氯化铵(25mL的10％溶液)，产物用乙酸乙酯萃取(2×25mL)。合并的有机层用水(3×25mL)和盐水(25mL)洗涤，MgSO₄干燥。除去溶剂后，得到液体，将其溶解于无水四氢呋喃(10mL)中。向该混合物中加入氟化四丁基铵(3mL)。搅拌30分钟后，混合物用乙酸乙酯和水萃取。有机层用水和盐水洗涤，MgSO₄干燥。蒸发除去溶剂后得到固体粗产物，其通过硅胶色谱法纯化(25％乙酸乙酯-己烷)得到浅黄色固体(83％)：mp171-173℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.29(3H，s)，6.95(4H，d，J＝7.7Hz)，7.09-7.13(2H，m)，7.22(2H，d，J＝8.7Hz)，7.98-8.01(1H，m)，8.40(1H，s)，9.89(1H，s)，10.63(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺267。

对C₁₆H₁₄N₂O₂的分析：

计算值：C，72.17；H，5.30；N，10.52。

实测值：C，71.78；H，5.23；N，10.37。

实施例5

5-氟-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟

将5-氟-1-(4-苄氧基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟(0.49g，1.3mmol)按照实施例4中使用的步骤反应得到白色固体(67％)：mp162-163℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.29(3H，s)，6.94-6.97(4H，m)d，7.23(2H，d，J＝8.6Hz)，7.70(2H，d，J＝10.1Hz)，8.39(1H，s)，9.92(1H，s)，10.70(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺285。

对C₁₆H₁₃FN₂O₂的分析：

计算值：C，67.60；H，4.61；N，9.85。

实测值：C，67.44；H，4.67；N，9.79。

实施例6

5-氯-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟

将5-氯-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.63g，2.2mmol)、盐酸羟胺(0.30g，4.3mmol)、甲醇(25mL)和吡啶(1mL)的混合物按照实施例4中使用的步骤反应得到白色固体(68％)：mp212-213℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.29(3H，s)，6.96(3H，d，J＝8.7Hz)，7.12(1H，dd，J＝2.2Hz，J＝8.7Hz)，7.24(2H，d，J＝8.7Hz)，8.03(1H，d，J＝2.1Hz)，8.40(1H，s)，9.93(1H，s)，10.75(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺301/303(1Cl)。

对C₁₆H₁₃ClN₂O₂的分析：

计算值：C，63.90；H，4.36；N，9.31。

实测值：C，63.63；H，4.12；N，9.17。

实施例7

5-溴-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟

将5-溴-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛(0.16g，0.5mmol)、盐酸羟胺(0.10g，1.4mmol)、甲醇(10mL)和吡啶(0.2mL)的混合物按照实施例4中使用的步骤反应得到白色固体(66％)：mp209-211℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.29(3H，s)，6.92-6.97(3H，m)，7.20-7.25(3H，m)，8.19(1H，d，J＝1.9Hz)，8.39(1H，s)，9.94(1H，br s)，10.76(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺345/347(1Br)。

对C₁₆H₁₃BrN₂O₂·0.5H₂O的分析：

计算值：C，54.26；H，3.98；N，7.91。

实测值：C，54.26；H，3.68；N，7.65。

实施例8

(4E)-9-(4-羟基苯基)-1，2，3，9-四氢-4H-咔唑-4-酮肟

将(4E)-9-(4-苄氧基苯基)-1，2，3，9-四氢-4H-咔唑-4-酮肟(0.23g，0.6mmol)按照实施例4中使用的步骤反应得到棕褐色固体(40％)：mp 227-229℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.87-1.91(2H，m)，2.63(2H，t，J＝5.9Hz)，2.71(2H，t，J＝6.1Hz)，6.95(2H，d，J＝8.6Hz)，7.09-7.13(3H，m)，7.26(2H，d，J＝8.5Hz)，7.98-8.00(1H，m)，9.85(1H，s)，10.43(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺293。

对C₁₈H₁₆N₂O₂的分析：

计算值：C，73.95；H，5.52；N，9.58。

实测值：C，73.61；H，5.39；N，9.42。

实施例9

1-(4-羟基苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟

将1-(4-苄氧基苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟(0.31g，0.9mmol)按照实施例4中使用的步骤反应得到黄色固体(18％)：mp 95-97℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ6.94-6.98(2H，m)，7.19-7.29(2H，m)，7.36-7.45(4H，m)，8.31(1H，s)，9.80-9.83(1H，m)，10.72(1H，s)，11.44(1H，s)：MS m/z(M+H)⁺253。

对C₁₅H₁₂N₂O₂的分析：

计算值：C，71.42；H，4.79；N，11.10。

实测值：C，71.85；H，5.36；N，9.70。

实施例10

1-(3-氟-4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟

向搅拌后的二氯甲烷(10mL)、Pd(OAc)₂(50mg，0.2mmol)、和三乙基硅烷(3mL)的溶液中加入三乙胺(1.5mL)，混合物在环境温度下搅拌15分钟。向混合物中加入1-(4-苄氧基-3-氟苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟(0.52g，1.4mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液，继续搅拌4小时。加入乙酸乙酯(25mL)和氯化铵(25mL的10％溶液)，产物用乙酸乙酯萃取(2×25mL)。合并的有机层用水(3×25mL)和盐水(25mL)萃取，MgSO₄干燥。除去溶剂后得到液体，将其溶解于无水四氢呋喃(10mL)中。向该搅拌中的溶液中加入氟化四丁基铵(3mL)。搅拌30分钟后，混合物投入乙酸乙酯/水中，振摇，分离两层。有机部分用水和盐水洗涤，MgSO₄干燥。蒸发除去溶剂后，粗产物固体通过硅胶色谱法纯化(25％乙酸乙酯-己烷)得到浅黄色固体(0.22g，56％)：mp 182-184℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.31(3H，s)，6.98-7.01(1H，m)，7.07-7.17(4H，m)，7.35(1H，dd，J＝11.7Hz，J＝2.4Hz)，7.99-8.03(1H，m)，8.40(1H，s)，10.35(1H，br s)，10.64(1H，s)；MS m/z(M+H)⁺285。

对C₁₆H₁₃FN₂O₂₍0.3H₂O)的分析：

计算值：C，66.34；H，4.57；N，9.30。

实测值：C，66.38；H，4.61；N，9.85。

实施例11

对ERα或ERβ受体的选择性

评价了本发明代表性实施例与17β-雌二醇竞争ERα和ERβ的能力。该测试提供了一种测定某具体化合物是否结合雌激素受体(并因而被称作″具有雌激素活性″)以及其是否对ERαERβ具有选择性的方法。结果如下表所示，表达为IC₅₀。将17β-雌二醇引入作为用于对比的标准对照。下面简要描述了所采用的步骤。制备得到表达人类ERα或Rβ的雌激素受体配体结合结构域(D、E、和F)的大肠杆菌粗溶解产物。将受体和化合物稀释在补充有1mM EDTA的1XDulbecco’s PBS(DPBS)中。使用高结合力掩蔽微量滴定板，将100uL受体(1uG/孔)与2nM[³H]-17β-雌二醇和各种浓度的化合物结合。在室温下保持5-15小时后，滴定板用DPBS/1mM EDTA洗涤，通过液体闪烁计数法测量结合放射性。将IC₅₀定义为使总的17β-雌二醇结合力降低50％的化合物的浓度。所得到的结果如下表所示。

       表1.1-(4’-羟基-苯基)-1H-吲哚-3-甲醛肟衍生物

实施例	R1	R2	R3	R4	ERβ(nM)	ERα(nM)
							4	Me	H	H	H	12	270
5	Me	H	F	H	6.2	91
							6	Me	H	Cl	H	29	145
7	Me	H	Br	H	93.5	235
							8	-CH2CH2CH2-		H	H	10	153
9	H	H	H	H	202	1905
							10	Me	H	H	F	8	298

在上述标准药理测试步骤中得到的结果表明本发明的化合物是雌激素化合物，某些化合物对于ERβ受体具有强烈的优先亲和力。本发明化合物从对ERβ具有比ERα高的优先亲和力到对两种受体同时具有几乎相当的亲和力变动。因此，本发明化合物具有各种至少部分基于其受体亲和力选择性特征的活性。另外，由于各种新受体配体络合物不同，因此它与各种辅调节蛋白之间的相互作用也是不相同的，本发明化合物根据所处细胞环境将显示出不同的调节活性。例如，在某些细胞类型中，某化合物可作为雌激素激动剂，而在其它组织中，该化合物却是拮抗剂。具有上述活性的化合物通常被称作SERM(选择性雌激素受体调节剂)。然而，与大多数雌激素不同的是，很多SERM并不引起子宫湿重的增加。这些化合物在子宫中具有抗雌激素活性，因而在子宫组织中可以完全拮抗雌激素激动剂的营养(trophic)活性。然而，这些化合物在骨、心血管和中枢神经系统中作为雌激素激动剂。由于这些化合物具有上述的组织选择性，因而它们可用于治疗或预防哺乳动物的由雌激素缺乏(在某些组织例如骨和心血管中)或雌激素过量(在子宫或乳腺中)引起的或者与此相关的病理状态或综合症。

甚至超出上述细胞特异性调节作用之上，本发明化合物还潜在地对某种受体类型是激动剂，而对另一种受体却是拮抗剂。例如，已经发现某化合物对ERβ是拮抗剂，而对ERα却是激动剂(Meyers，MarvinJ.；Sun，Jun；Carlson，Kathryn E.；Katzenellenbogen，Benita S.；Katzenellenbogen，John A..J.Med.Chem.(1999)，42(13)，2456-2468)。这种ERSAA(雌激素受体选择性激动剂拮抗剂)活性为这一系列化合物提供了药理学上显著不同的雌激素活性。

可以方便地利用标准药理学测试步骤测得所给测试化合物的活性特征。下面简要概述了几种代表性测试步骤。用于SERM的标准药理学测试步骤还可以参见美国专利4,418,068和5,998,402。

实施例12

大鼠子宫营养/抗子宫营养测试步骤

可以在幼年大鼠子宫营养测试(4天)中测得化合物的雌激素和抗雌激素特性(如L.J.Black和R.L.Goode，Life Sciences，26，1453(1980)在先所述)。将未发育成熟的斯普拉-道来氏大鼠(Sprague-Dawley大鼠)(雌性，18天大)分成六组测试。这些动物通过每天ip注射10uG化合物、100uG化合物、(100uG化合物+1uG 17β-雌二醇)以检查抗雌激素类、和1uG 17β-雌二醇处理，使用50％DMSO/50％盐水作为注射媒介物。这些动物在第四天通过CO₂窒息处死，取出子宫，剥去过量的油脂，除去所有液体，测得湿重。取出一个角的一部分进行组织学分析，其余的用来分离出完整的RNA以评价补体成分3基因表达。

实施例13

6-周切除卵巢的大鼠测试步骤-骨和心脏保护作用

在自Taconic Farm手术一天后，得到切除卵巢或假切除卵巢的雌性斯普拉-道来氏CD大鼠(重240-275g)。将其3或4只大鼠/笼、按照12/12(光亮/黑暗)的时间表豢养在室内，同时提供食物(Purina5K96C鼠食)和充足的水。动物在到达1天后开始进行各项研究治疗，按指示每周给药7天，持续6周。对各项研究，将一组未接受任何治疗的彼此年龄相当的进行过假手术后的大鼠作为未被处理的、雌激素充足的对照组。

全部治疗以指定浓度在1％吐温80的生理盐水溶液中进行，使得治疗量达到0.1mL/100g体重。将17β雌二醇溶解于玉米油(20μg/mL)中，按照0.1mL/大鼠进行皮下给药。根据组平均体重测量结果，每隔三周调节一次剂量。

在开始治疗五周后以及结束研究一周前，评价每只大鼠的骨矿物质密度(BMD)。使用XCT-960M(pQCT；Stratec Medizintechnik，Pforzheim，Germany)评价麻醉后的大鼠中胫骨近端的总密度和小梁密度。测量如下进行：在扫描前的十五分钟，将每只大鼠通过腹膜内注射45mg/kg氯胺酮、8.5mg/kg赛拉嗪、和1.5mg/kg乙酰丙嗪麻醉。

将右后肢拉过直径为25mm的聚碳酸酯试管，绑在丙烯酸支架上使得踝关节位于90°角、膝关节位于180°。聚碳酸酯试管被固定在滑动平台上使得其与pQCT的孔径相垂直。调节平台使得股骨的远端和胫骨的近端位于扫描区域内。将平面扫描图像设定成长度为10mm，线性分辨率为0.2mm。当扫描图像显示在监测器上后，定位胫骨的近端。从距离该点3.4mm处开始pQCT扫描。pQCT扫描厚度为1mm，体素(三维象素)大小为0.140mm，且由145次薄片投影组成。

pQCT扫描完成后，图像显示在监测器上。描画出包括胫骨但是无腓骨的感兴趣区域的轮廓。使用迭代算法自动除去软组织。剩余骨的密度(总密度)以mg/cm³表示。将骨外侧的55％在同心螺旋机中剥离。剩余骨的密度(小梁密度)以mg/cm³表示。BMD评价一周后，大鼠通过二氧化碳窒息实施安乐死，收集血液进行胆固醇测量。取出子宫，称重。使用利用胆固醇/HP试剂盒的Boehringer-MannheimHitachi 911临床分析器测量总胆固醇。使用Dunnet’s检验的单向方差分析进行统计学比较。

实施例14

MCF-7/ERE抗增殖测试步骤

在DMSO中制备得到测试化合物的储备溶液(通常为0.1M)，然后用DMSO进行10-100倍稀释使得操作溶液达到1或10mM。DMSO储备液储存于4℃(0.1M)或-20℃(＜0.1M)下。使MCF-7细胞以每周两次通过生长培养基[D-MEM/F-12培养基，含有10％(v/v)热灭活胎牛血清、1％(v/v)青霉素-链霉素、和2mM glutaMax-1]传代。细胞保持在置于5％ CO₂/95％湿空气培养器中的37℃通气烧瓶中。在治疗前一天，将细胞用生长培养基以25,000/铺96孔滴定板中，在37°下培养过夜。

细胞在37℃下用50μl/孔的1∶10稀释的腺病毒5-ERE-tk-荧光素酶在试验培养基[无酚磺酞的D-MEM/F-12培养基，含有10％(v/v)热灭活且炭剥离(charcoal-stripped)的胎牛血清、1％(v/v)青霉素-链霉素、2mM glutaMax-1、1mM丙酮酸钠]中感染2小时。然后将孔用150μλ试验培养基洗涤一次。最后，细胞分成多份复制品在37℃下处理24小时，8孔/使用150μλ/孔媒介物(≤0.1％ v/v DMSO)或者用试验培养基稀释≥1000倍的化合物治疗。

在1μM的单剂量下进行测试化合物的初期筛选，其中所测试化合物是单独的(激动剂模式)或者与0.1nM 17β-雌二醇联合(EC₈₀；拮抗剂模式)。每个96孔滴定板还包括媒介物对照组(0.1％ v/vDMSO)和激动剂对照组(0.1或1nM 17β-雌二醇)。在激动剂和/或拮抗剂模式中，对由10^-14至10^-5M对数增加的活性化合物进行剂量响应试验。根据这些剂量响应曲线，分别得到EC₅₀和IC₅₀值。各治疗组最后的滴定孔中含有5μl 3×10^-5M ICI-182,780(10^-6M最终浓度)作为ER拮抗剂对照。

治疗后，将细胞在振荡器上用25μl/孔的1X细胞培养溶解试剂(Promega Corporation)溶解15分钟。细胞溶解产物(20μl)转移至96光度计盘中，使用100μl/孔的荧光素酶(PromegaCorporation)在MicroLumat LB 96 P光度计(EG & G Berthold)中测量荧光素酶活性。在注入底物之前，对每个孔进行1秒钟背景测量。在注入底物之后，测得延迟1秒钟后10秒内的荧光素酶活性。将这些来自光度计的数据转换至Macintosh个人电脑并用JMP软件(SAS Institute)分析；该程序减去来自每个孔荧光素酶活性的背景读数，然后计算每组治疗的平均和标准偏差。

上述荧光素酶数据通过对数转换，利用Huber M-估计器降低远离中心的经转换结果的权重。利用JMP软件来分析转换和加权后的数据进行单向ANOVA(Dunnett′s检验)。将化合物治疗组与激动剂模式中的媒介物对照组结果、或者拮抗剂模式中的阳性激动剂对照组结果(0.1nM 17β-雌二醇)进行对比。对于最初的单剂量试验而言，如果化合物治疗组结果显著不同于相应的对照组的话(p＜0.05)，就将结果表达为相对于17β-雌二醇对照组的百分比[也就是((化合物-媒介物对照组)/(17β-雌二醇对照组-媒介物对照组))×100]。另外，利用JMP软件由非线形剂量-响应曲线确定EC₅₀和/或IC₅₀值。

实施例15

对LDL氧化作用的抑制-抗氧化剂活性

由屠宰场获得猪主动脉，清洗后转入冷却后的PBS中，收集主动脉上皮细胞。为了收集上述细胞，将主动脉的肋间血管打结，主动脉的一端用钳子夹住。将新鲜、灭菌过滤后的0.2％胶原酶(Sigma TypeI)置于血管中，血管另一端用钳子夹住以形成闭合体系。主动脉在37℃下培养15-20分钟，然后收集胶原酶溶液，在2000xg下离心分离5分钟。将团粒悬浮于7mL上皮细胞培养基中，该培养基由无酚磺酞且补充有炭剥离的FBS(5％)的DMEM/Ham’s F12培养基、NuSerum(5％)、L-谷氨酰胺(4mM)、青霉素-链霉素(1000U/ml，100μg/ml)和庆大霉素(gentimicin)(75μg/ml)组成，然后播种于100mm培养皿中，在37℃、5％CO₂中培养。20分钟后，细胞用PBS冲洗，加入新鲜培养基，在24小时重复上述操作。大约一周后上述细胞汇合。这些上皮细胞通常一周饲养两次，在汇合时用胰蛋白酶作用后以1∶7的比例播种。在待评价化合物(5μM)存在下、于37℃允许进行12.5μg/mL LDL的细胞介导氧化作用，持续4小时。结果以抑制氧化过程的百分数表示，通过TBARS(硫代巴比妥酸反应活性物质)方法对游离醛进行分析而测得(Yagi K.，Biochem Med 15：212-216(1976))。

实施例16

D12下丘脑细胞测试步骤

由RCF17亲代细胞系亚克隆得到D12大鼠下丘脑细胞，冷冻储藏。常规地将其置于DMEM∶F12(1∶1)、glutaMAX-1(2mM)、青霉素(100U/ml)-链霉素(100mg/ml)、加10％胎牛血清(FBS)中生长。细胞置于无酚磺酞的培养基(DMEM∶F12、glutaMAX、青霉素-链霉素)中，所述培养基含有低于汇合密度(1-4×10⁶细胞/150mm皿)的2-10％炭剥离FBS。细胞稍后再次用含有2％经剥离血清(stripped serum)的培养基饲养24小时。为了测试激动活性，将细胞用10nM 17β-雌二醇或者各种剂量的测试化合物(1mM或者从1pM至1mM)处理。为了测试拮抗活性，将细胞用0.1nM 17β-雌二醇在存在或不存在各种剂量(100pM至1mM)的测试化合物的情形下处理。对照皿也用DMSO处理，作为阴性对照组。加入激素48小时后，将细胞溶解然后进行结合测试步骤。

对于每次细胞结合测试步骤，将100-150mg蛋白质用150ml体积的10nM ³H-R5020+100-倍过量的R5020培养。在96孔板中进行平行三份反应(三组有R5020，三组无R5020)。加入蛋白质提取物后，接着首先加入³H-R5020或³H-R5020+100x未标记的R5020。反应在室温下进行1-2小时。通过加入100ml冷的TE(pH为7.4)中5％炭(Norit SX-4)、0.5％右旋糖苷69K(Pharmacia)终止反应。在室温下保持5分钟后，将结合配体和非结合的配体通过离心分离(5分钟，1000RCF，4℃)。除去上清液(～150ml)并转移至闪烁瓶中。加入闪烁液(Beckman Ready Protein+)后，样本在闪烁计数器中计数1分钟。

实施例17

CNS视前区中的孕酮受体

将六十(60)天大的雌性斯普拉-道来氏大鼠切除掉卵巢。动物豢养在光周期为12小时光亮、12小时黑暗的动物看护装置中，给其自由供应自来水和啮齿动物食物。

将切除卵巢的动物随机分成几组，向其注射媒介物(50％ DMSO、40％ PBS、10％乙醇媒介物)、17β-雌二醇(200ng/kg)或者测试化合物。其它的动物在注射17β-雌二醇之前1小时注射测试化合物，以评价该化合物的拮抗特性。皮下注射六小时后，动物用致死剂量的CO₂实施安乐死，收集它们的大脑并冷冻。

将收集到的动物组织在-16℃的低温保持器上进行切割，随后收集在硅烷涂覆的载玻片上。所述安有切片的载玻片接着在42℃的载玻片加温器上干燥，储存在干燥的-80℃载玻片盒中。在处理之前，将这些干燥后的载玻片盒缓慢温热至室温(在-20℃下持续12-16小时；在4℃下持续2小时；室温下持续1小时)以消除载玻片上的凝聚的发生，从而降低组织和RNA降解。将干燥载玻片装填在金属支架上，随后固定在4％多聚甲醛(pH9.0)中保持5分钟，然后按照前述方法处理。

将含有大鼠PR cDNA 9(配体结合结构域)中815bp片段的质粒线性化，用来生成与大鼠PR mRNA部分互补的S 35-UTP标记探针。将处理后的安有切片的载玻片与20ml含有核糖核酸探针(4-6×10 6DPM/载玻片)和50％甲酰胺的杂交混合物杂交，在55℃的湿化室中培养过夜。上午将载玻片置于浸泡在2×SSC(0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠；pH7.0)/10mM DTT中的金属支架上。支架整体转移至大容器中，在室温、于2×SSC/10mM DTT中洗涤15分钟，同时温和搅拌。然后将载玻片在37℃的RNase缓冲液中洗涤30分钟，用37℃的RNase A(2mg/ml)洗涤30分钟，在室温下的1×SSC中洗涤15分钟。载玻片随后在65℃的0.1×SSC中洗涤(2×30分钟)除去非特异性标记，在室温下的0.1×SSC中冲洗15分钟，用一系列等级的醇：醋酸铵(70％、95％、和100％)脱水。风干后的载玻片与x-射线胶片对置3天，然后照相处理。将所有动物的载玻片一起杂交、洗涤、曝光和照相处理，以消除由于条件批间分析差异而产生的差异。

实施例18

大鼠潮热-CNS影响

手术后得到切除卵巢的雌性、60天大的斯普拉-道来氏大鼠。在第一次治疗之前至少8天进行手术。动物单独豢养在12小时光亮/黑暗周期下，使之随意摄取标准鼠食和水。

每组研究中包括两组对照组。剂量按照在10％ DMSO的芝麻油(sc研究)或者1.0％吐温80的盐水(po研究)中的mg/kg平均组体重给药。向动物施用剂量为0.01-10mg/kg平均组体重的测试化合物。各组测试中包括媒介物和乙炔雌二醇(EE)对照(0.1mg/kg，sc或0.3mg/kg，po)组。当测试化合物的拮抗剂活性时，联合施用0.1或0.3mg/kg的EE分别进行sc或po研究。一直施用测试化合物，直到尾部皮肤温度被测出的那天。

四天的驯化周期之后，动物使用感兴趣的化合物每天治疗一次。有10只动物/治疗组。化合物的给药要么通过向颈背sc注射0.1ml，要么po 0.5ml体积。在治疗后的第三天，皮下植入吗啡药丸(75mg硫酸吗啡)。在治疗后的第五天，再植入一个或两个吗啡药丸。在第八天，给大约一半的动物注射氯胺酮(80mg/kg，肌内)，同时在离尾根大约一英寸的尾上捆扎上一与MacLab数据获得系统(APIInstruments，Milford，MA)相连的热电偶。该系统可以连续测出尾部皮肤温度。测量15分钟内的基线温度，然后皮下给药(0.2ml)纳洛酮(1.0mg/kg)以阻断吗啡的影响，然后测量1小时内的尾部皮肤温度。在第九天，取出其余动物进行类似的分析。

实施例19

在分离的大鼠主动脉环中的血管舒缩功能

将斯普拉-道来氏大鼠(240-260克)分成四组：

1.正常的未切除卵巢(保持完整)

2.切除卵巢(ovex)且用媒介物治疗

3.切除卵巢且用17β-雌二醇治疗(1mg/kg/天)

4.切除卵巢且用测试化合物治疗(即1mg/kg/天)

动物在治疗前的三周左右切除卵巢。通过胃管饲法给每只动物服用1mg/kg/天悬浮于含有1％吐温-80的蒸馏去离子水中的17β-硫酸雌二醇或测试化合物。媒介物治疗组的动物服用适当体积的药物治疗组中使用的媒介物。

动物通过吸入CO₂实施安乐死并放血。迅速取出其胸主动脉，置于37℃具有下述组成(mM)的生理溶液中：NaCl(54.7)、KCl(5.0)、NaHCO₃(25.0)、MgCl₂2H₂O(2.5)、D-葡萄糖(11.8)和CaCl₂(0.2)，其用CO₂-O₂ 95％/5％充气直到最后的pH达到7.4。除去外表面的血管外膜，将血管切成2-3mm宽的环。这些环悬浮于10mL组织浴中，一端与组织浴的底部相连，另一端与力传感器相连。给环施加1克的静止张力。这些环平衡1小时后，获得信号并加以分析。

平衡后，将环曝露于浓度增加的苯福林(10^-8-10^-4M)中，记录张力。随后组织浴用新鲜的缓冲液清洗3次。洗净后，向组织浴中加入200mM L-NAME，平衡30分钟。然后重复上述苯福林浓度响应曲线。

实施例20

八臂旋臂迷宫-提高认知力

使用送到时重200-250g的雄性斯普拉-道来氏CD大鼠(CharlesRiver，Kingston，NY)。这些大鼠用可随意摄取标准实验室食物和水豢养一周，每六只一笼。在维持在22℃下、且具有12小时光亮/黑暗循环的群体室中进行豢养，其中在上午6:00给光。驯化熟悉后，动物单独豢养，同时保持在自由饲养重量的85％水平，一旦达到稳定的重量，让大鼠开始适应8-臂旋臂迷宫。

迷宫结构由Peele和Baron迷宫(Pharmacology，Biochemistry，and Behavior，29：143-150，1988)变型而来。将迷宫提高至高度为75.5cm，且由一环形区域组成，所述环形区域被八只由中心辐射出来的手臂包围，所述手臂彼此等距。每只旋臂58cm长×13cm高。在开始每次活动之前，将有机玻璃圆筒放下来以在迷宫中心部分围住动物。迷宫各旋臂装备有3组与数据采集单元连接的光电元件，所述数据采集单元反过来再与计算机相连。该光电元件用于跟踪大鼠在迷宫中的活动情况。药丸饲养器位于每只旋臂末端的食物杯上方，当旋臂的外侧光电元件在指定活动中被第一次活化时，投入两枚45mg的巧克力药丸。迷宫位于测试室中，测试室的每面墙壁上贴有黑色和白色的具有几何图形的海报作为视觉信号。在训练和测试过程中，听得见白噪音(～70db)。

训练过程由五期组成，每段期间中的日活动量持续5或10分钟。在将大鼠置于迷宫中心部分的时间与升高圆筒开始活动的时间之间加上10秒钟的延迟时间。在I期中，将限食的数对大鼠放置在迷宫中10分钟，同时沿着迷宫的八只旋臂分散放置45mg巧克力药丸。在II期中，将各只大鼠单独置于迷宫中持续10分钟，同时沿着中央光电元件至各旋臂食物杯分散放置药丸。在III期中，将各只大鼠置于迷宫中持续10分钟，仅仅在各旋臂的食物杯里面及其周围放置一些食物药丸。在IV期中，给大鼠10分钟的时间来收集位于各旋臂中的两枚药丸。重新返回旋臂中则被认为出现失误。大鼠按照上述方式每天进行训练，直到其在连续三天的训练时间内所取得的标准成绩低于或等于2次总失误。总的驯化和训练时间大约为三周。

在磷酸盐缓冲的盐水中制备测试化合物，然后以1ml/kg的体积给药。使用东莨菪碱HBr(0.3mg/kg s.c.)作为损伤剂，其使得失误率增加(丧失记忆)。在任意的既定测试日中第一次接触迷宫之前的30分钟，同时向腹膜内施用测试化合物与东茛菪碱。

为了评价测试化合物，设计一8×8平衡拉丁方用于重复测量以利用最少量的动物获得高的试验效率。进行了八个试验期间，每周两次，在各期间中随机应用八种治疗(媒介物、东茛菪碱、三个剂量的测试化合物与东茛菪碱)。每次治疗紧跟在相同次数的其它治疗之后。因此，可以评估出每次治疗残留下来的影响，同时除去其直接治疗影响。在ANOVA之后，使用针对调正平均数的Dunnett′s双向检验进行多重比对。

如果动物在第一次曝露期间五分钟内没有作出四次正确选择，或者在第二次曝露结束前没有作出总共八次选择，则被认为对该次活动“休眠”。所有在施用超过一个剂量的测试化合物之后就表现为“休眠”的动物被排除在分析之外。

实施例21

神经保护作用

对初级皮质神经元培养物中细胞的时间依赖性死亡的抑制

利用Monyer等人.1989，Brain Research 483：347-354描述的方法的变型形式由0-1天大的大鼠脑获得初级皮质神经元。将分散的脑组织置于DMEM/10％ PDHS(妊娠供体马血清)中生长三天，然后用阿糖胞苷(ARC)处理两天除去污染的神经胶质细胞。在第五天，除去ARC培养基，用DMEM/10％ PDHS替代。神经元细胞在使用之前继续培养4-7天。

对照初级神经元培养物在培养的第12-18天间显示出进行性细胞死亡。测试化合物在第9天加入至保持于DMEM和10％ PDHS中的六个培养物，同时保留残余的培养物作为对照品，在第12和16天评价12个培养物中乳酸脱氢酶(LD)的浓度。使用由Wroblewski等人.1955，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.90：210-213描述的方法的变型形式测定LD。LD是一种在临床和基础研究中通常用于测定组织存活力的细胞溶质酶。培养基LD的增加直接与细胞死亡有关。

针对由低血糖引起的细胞毒性的神经保护作用

在FALCON 25 cm²组织培养瓶中，将由ATCC获得的C6神经胶质瘤细胞按照在含有FBS的RPMI培养基中1×10⁶细胞/ml的浓度铺板。在出现低血糖前的4小时弃去维持培养基，细胞单层在适当的培养基中洗涤两次，然后在37℃以无血清方式或无血清加测试化合物方式培养4小时。在加入适当的葡萄糖处理之前，使用Kreb′s Ringer磷酸盐缓冲液将单层洗涤两次。RPMI培养基含有2mg葡萄糖/ml；烧瓶被分成六组，分别接收100％葡萄糖(2mg/ml)、80％葡萄糖(1.6mg/ml)、60％葡萄糖(1.2mg/ml)或0％葡萄糖(缓冲液)或者用测试化合物补充。全部烧瓶培养20小时后，利用锥虫蓝评价全部细胞、活细胞、以及死亡细胞的数量。

针对兴奋性中毒氨基酸的神经保护作用

将五只含有SK-N-SH成神经细胞瘤细胞的培养皿用测试化合物处理，五只培养皿用RPMI培养基处理。4小时后，所有细胞用NMDA(500μM)处理5分钟。然后测量总的活细胞和死亡细胞。

针对氧-葡萄糖剥夺的神经保护作用

分析固缩核以测量凋亡：由E18胎鼠制得皮质神经元，然后以密度为100,000细胞/孔铺板在预涂聚-D-赖氨酸(10ng/ml)和血清的8-孔腔载玻片上。将细胞在含有10％ FCS的高糖DMEM中铺板，置于37℃、充满10％ CO₂/90％空气的培养器中。第二天，通过用含有B27补充物的高糖DMEM替代培养基以除去血清，随后将细胞保存在培养基不再有任何变化的培养器中，直到试验当天。在第6天，将载玻片分成两组；对照组和OGD组。对照组中的细胞施用含有葡萄糖和普通B27(无抗氧化剂)的DMEM。OGD组中的细胞施用已在真空下脱气15分钟的含有普通B27的无糖DMEM。细胞在密闭室中用90％N₂/10％ CO₂冲洗10分钟，在37℃下培养6小时。6小时后，对照组和OGD组中的细胞均进行下述培养基替代，所述培养基含有媒介物(DMSO)或测试化合物于含有普通B27的含糖DMEM中。细胞再次返回至含氧量正常的37℃培养器中。24小时后，将细胞在4℃的4％PFA中固定持续10分钟，用Topro(荧光核结合染料)染色。利用激光扫描细胞计数器通过测量固缩核评价凋亡。

测量作为细胞死亡标志的LDH释放量：由E18胎鼠制得皮质神经元，然后以密度为150,000细胞/孔铺在预涂有聚-D-赖氨酸(10ng/ml)和血清的48-孔培养板上。将细胞在含有10％ FCS的高糖DMEM中铺板，置于37℃、充满10％ CO₂/90％空气的培养器中。第二天，通过用含有B27补充物的高糖DMEM替代培养基以除去血清。在第6天，将细胞分成两组；对照组和OGD组。对照组中的细胞施用含有葡萄糖和普通B27(无抗氧化剂)的DMEM。OGD组中的细胞施用含有普通B27的无糖DMEM，在真空下脱气15分钟。细胞在密闭室中用90％ N₂/10％ CO₂冲洗10分钟，在37℃下培养6小时。6小时后，对照组和OGD组中的细胞均用下述培养基替代，所述培养基含有媒介物(DMSO)或测试化合物于含有普通B27的含糖DMEM中。细胞再次返回至含氧量正常的37℃培养器中。24小时后，通过测量LDH(乳酸脱氢酶)向培养基中的释放量评价细胞死亡情况。对于LDH测定，将整份50μl培养基转移至96孔板中。加入140μl 0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)和100μl 0.2mg/ml NADH后，滴定板置于室温下的暗处20分钟。反应通过加入10μl丙酮酸钠引发。立即使用Thermomax板读数器(Molecular Devices)在340nM处读取上述滴定板。每隔6秒钟记录一次作为NADH浓度指数的吸光度，持续5分钟，然后使用代表NADH消失比例的斜率来计算LDH活性。

LDH活性(U/ml)＝(ΔA/分钟)(TCF)(20)(0.0833)/(.78)

其中：0.0833＝正比常数

0.78＝仪表光程长(cm)

实施例22

HLA大鼠测试步骤-克罗恩氏病和炎性肠病

由Taconic获得雄性HLA-B27大鼠，同时向其无限制地提供食物(PMI实验室食物5001)和水。在研究开始时，这些大鼠为22-26周大。

向大鼠皮下施用下述制剂之一，每天一次。每组五只大鼠，在实施安乐死前的两小时内给予最后的剂量。

·媒介物(50％ DMSO/50％ Dulbecco’s PBS)

·17α-乙炔基-17β-雌二醇(10μg/kg)

·测试化合物

每天观察其大便质量，按照下述标准分级：腹泻＝3；大便柔软＝2；大便正常＝1。在测试步骤结束时，收集血清储存在-70℃下。制备结肠切片进行组织学分析，同时分析其它片段的髓过氧化酶活性。

采用下述方法测量髓过氧化酶活性。收集结肠组织，然后快速冷冻在液氮中。使用完整结肠的一代表性样本来确保各样本之间具有一致性。组织储存在-80℃至使用。接下来，组织称重(大约500mg)后在1∶15 w/v 5mM H₂KPO₄(pH6)洗涤缓冲液中匀化。所述组织在2-8℃、于20,000xg下在Sorvall RC 5B离心机中旋转45分钟。随后弃去上清液。组织在含有10mM EDTA和0.5％ Hex AmmoniumBromide的2.5ml(1∶5 w/v)50mM H₂KPO₄中重悬并匀化，以有助溶解细胞内的MPO。组织在液氮中冷冻后，在37℃-水浴中解冻，超声波处理15秒钟以保证细胞膜裂解。重复上述步骤三次。然后将样本置于冰决上持续20分钟，在2-8℃、12,000xg下离心15分钟。上清液在这些步骤后进行分析。

通过向反应试管中加入含有0.167 O-邻联二茴香胺/ml和0.0005％H₂O₂的2.9ml 50mM H₂KPO₄制备得到测试混合物。当过氧化氢降解时，O-邻联二茴香胺被氧化，同时以取决于浓度的方式在460nm处发生吸收。混合物加热至25℃。将一百(100)μL组织上清液加入至反应试管中，在25℃下培养1分钟，然后转移1ml至一次性塑料试管中。每隔2分钟的反应时间在460nm处测量比照含有2.9ml反应混合物和100μl 0.5％溴化铵溶液的空白的OD。

通过将吸光度@460与由纯化人类MPO 31.1单元/小瓶制得的标准曲线对照，对酶活性单元进行量化。MPO复水后，用含有10mMEDTA和0.5％Hex Ammonium Bromide的50mM H₂KPO₄连续稀释至四种已知浓度。将样本吸光度与上述曲线对照测得活性。

按照下述方法进行组织学分析。将结肠组织浸泡于10％中性缓冲福尔马林中。结肠的每段标本分成四个样本进行评价。上述利用福尔马林固定的组织在真空渗入处理机中处理进行石蜡包埋。样本以5μm切片，然后用苏木精和曙红(H&E)染色，采用Boughton-Smith后调整的比例进行盲组织评价。评分结束后，样本脱盲(unblind)，将数据列表后利用具有多重平均对照的ANOVA线形模型进行分析。

将本文中所引入的所有专利、出版物、以及其它文献的全部内容在此引入作为参考。

Claims (20)

1.下式的化合物或其可药用盐或前药：

其中：

R₁是氢、任选被取代的烷基、卤素、CN、或任选被取代的烷氧基；

R₂是氢、任选被取代的烷基、或任选被取代的苯基；或

R₁和R₂一起可以形成5-7元环；以及

R₃和R₄各自独立地是H、OH、卤素、CN、任选被取代的苯基、任选被取代的烷基或任选被取代的烷氧基。

2.权利要求1的化合物，其中R₁是任选被取代的烷基。

3.权利要求1或权利要求2的化合物，其中R₂是氢或任选被取代的烷基。

4.权利要求1的化合物，其中R₁和R₂一起形成6-元环。

5.权利要求1-4中任意一项的化合物，其中R₃是H、卤素或CN。

6.权利要求1-5中任意一项的化合物，其中R₄是氢。

7.权利要求6的化合物，其中R₄是F。

8.权利要求1的化合物，选自：

(a)1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟；

(b)5-氟-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟；

(c)5-氯-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟；

(d)5-溴-1-(4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟；

(e)(4E)-9-(4-羟基苯基)-1，2，3，9-四氢-4H-咔唑-4-酮肟；或者

(f)1-(4-羟基苯基)-H-吲哚-3-甲醛肟或

(g)1-(3-氟-4-羟基苯基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醛肟。

9.一种药物组合物，所述药物组合物含有

a)权利要求1-8中任意一项的化合物和

b)可药用载体。

10.一种抑制有该需要的哺乳动物中的骨质疏松症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物提供有效量的权利要求1-8中任意一项的化合物。

11.一种抑制有该需要的哺乳动物中的骨关节炎、低钙血症、高钙血症、佩吉特氏病、骨软化症、骨钙质缺乏、多发性骨髓瘤或者对骨组织具有有害作用的其它形式的癌症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物提供有效量的权利要求1-8中任意一项的化合物。

12.一种抑制有该需要的哺乳动物中的良性或恶性的异常组织生长的方法，所述方法包括向所述哺乳动物提供有效量的权利要求1-8中任意一项的化合物。

13.权利要求12的方法，其中所述异常组织生长是前列腺肥大、子宫平滑肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合症、子宫内膜息肉、良性乳房疾病、子宫腺肌病、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、或CNS癌。

14.一种在有该需要的哺乳动物中降低胆固醇、甘油三酯、Lp(a)、或LDL水平的方法；或者抑制高胆固醇血症、高脂血症、心血管疾病、动脉粥样硬化症、外周血管疾病、再狭窄、或血管痉挛的方法；或者因导致免疫介导的血管损伤的细胞活动而引起的血管壁损伤的方法，所述方法包括向所述哺乳动物提供有效量的权利要求1-8中任意一项的化合物。

15.一种抑制有该需要的哺乳动物中的由游离基诱导的病理状态的方法，所述方法包括向所述哺乳动物提供有效量的权利要求1-8中任意一项的化合物。

16.一种在有该需要的哺乳动物中提供认知力提高或神经保护作用的方法；或者治疗或抑制老年性痴呆、阿耳茨海默氏病、认知减退、神经变性疾病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物提供有效量的权利要求1-8中任意一项的化合物。

17.一种抑制有该需要的哺乳动物中的炎性肠病、溃疡性直肠炎、克罗恩氏病、结肠炎、潮热、阴道或外阴萎缩、萎缩性阴道炎、阴道干燥、搔痒症、性交困难、排尿困难、尿频、尿失禁、尿道感染、血管舒缩症状、男性型秃发、皮肤萎缩、痤疮、II型糖尿病、功能障碍性子宫出血、或者不育症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物提供有效量的权利要求1-8中任意一项的化合物。

18.一种抑制有该需要的哺乳动物中的白血病、子宫内膜脱除、慢性肾病或肝病或者凝固疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述哺乳动物提供有效量的权利要求1-8中任意一项的化合物。

19.权利要求1-8中任意一项的化合物，用作药物。

20.权利要求1-8中任意一项的化合物在制备用于下述情形的药物中的用途：

抑制有该需要的哺乳动物中的骨质疏松症，

抑制有该需要的哺乳动物中的骨关节炎、低钙血症、高钙血症、佩吉特氏病、骨软化症、骨钙质缺乏、多发性骨髓瘤或者对骨组织具有有害作用的其它形式的癌症，

抑制有该需要的哺乳动物中的良性或恶性的异常组织生长，

在有该需要的哺乳动物中降低胆固醇、甘油三酯、Lp(a)、或LDL水平；或者抑制高胆固醇血症；高脂血症；心血管疾病；动脉粥样硬化症；外周血管疾病；再狭窄、或血管痉挛；或者抑制因导致免疫介导的血管损伤的细胞活动而引起的血管壁损伤，

抑制有该需要的哺乳动物中的由游离基诱导的病理状态，

在有该需要的哺乳动物中提供认知力提高或神经保护作用；或者治疗或抑制老年性痴呆、阿耳茨海默氏病、认知减退、或神经变性疾病，

抑制有该需要的哺乳动物中的炎性肠病、溃疡性直肠炎、克罗恩氏病、结肠炎、潮热、阴道或外阴萎缩、萎缩性阴道炎、阴道干燥、搔痒症、性交困难、排尿困难、尿频、尿失禁、尿道感染、血管舒缩症状；男性型秃发；皮肤萎缩；痤疮；II型糖尿病；功能障碍性子宫出血；或者不育症，

者抑制有该需要的哺乳动物中的白血病、子宫内膜脱除、慢性肾病或肝病或者凝固疾病或障碍。