CN1861657A - 聚乙二醇改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了聚乙二醇改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂及其制备方法和应用。甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂指以甲基丙烯酸缩水甘油酯为主要单体的共聚物和用甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的高分子材料。聚乙二醇通过化学键偶联到甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂上，实现甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂的改性。聚乙二醇改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂可以用于蛋白质分离纯化、固相偶联、层析复性的研究和生产中。
Description
一、技术领域
本发明属于功能性高分子材料，特别涉及聚乙二醇改性甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂及制备方法和应用。
二、技术背景
甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂(Poly glycidyl methacrylate，PGMA)是指以甲基丙烯酸缩水甘油酯(Glycidyl methacrylate，GMA)为主要单体，通过聚合反应(包括本体聚合、悬浮聚合、乳液聚合等)制备高分子材料，或者将甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝到其它高分子材料上制备的树脂。这种高分子材料表面带有大量的环氧基，为进一步改性提供了可能。
聚乙二醇(Poly ethylene glycol，PEG)属于聚醚类大分子，根据其末端基团可以分为双末端羟基聚乙二醇和单甲氧基聚乙二醇(methoxy Poly ethyleneglycol，mPEG)，因为聚合度不同而有多种分子量的产品。聚乙二醇与蛋白质等生物大分子有弱的疏水相互作用，同时聚乙二醇的亲水性长链具有柔韧性，对蛋白质的活性具有保护作用。在生化研究领域里，常用聚乙二醇沉淀法分离蛋白质。利用聚乙二醇对蛋白质的保护作用，也可以用作蛋白质纯化伴侣。另外偶合聚乙二醇的色谱介质也可以应用于蛋白质交联修饰和蛋白质折叠复性等技术中。
三、发明内容
本发明的目的在于将聚乙二醇通过化学反应偶联到甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂上，充分发挥聚乙二醇在生化技术中的优良特性，提供一种生物友好性的高分子材料。
本发明中采用的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂PGMA包括甲基丙烯酸缩水甘油酯与二乙烯基苯(Divinylbenzene)交联的聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯与亚乙基二甲基丙烯酸酯(Ethylene dimethacralate)交联的聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯与二甲基丙烯酸乙二醇酯(Ethylene glycol dimethacrylate)交联的聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(N，N’-methylene bisacrylamide)交联的聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯与衣康酸烯丙酯(Diallyl itaconate)交联的聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯与三甲基丙烯酸甘油酯(Trimethylolpropane trimethacrylate)交联的聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯与三聚异氰酸烯丙酯(Triallyl isocyanate)交联的聚合物，以及用GMA接枝在其它类型高分子材料上的树脂。PGMA的形态包括球形和不定形，包括平均孔径为10～300nm的多孔材料和无孔材料。甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂的粒径范围为5μm～2000μm。
本发明利用聚乙二醇末端的羟基与甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂表面上的环氧基反应，实现在树脂表面偶联到聚乙二醇的目的。制备方法如下：
用溶剂溶胀PGMA颗粒，溶胀剂可以是四氯甲烷、三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、二氧六环、二甲基亚砜或二甲基亚砜与水体积比1～10的混合溶剂，溶胀时间为3～16h。加入聚乙二醇和催化剂。聚乙二醇包括双末端羟基聚乙二醇和单甲氧基聚乙二醇，分子量范围为100～50000。催化剂包括钠、乙醇钠、三氟化硼、氢氧化钠、氢氧化钾、硼氢化钠、浓硫酸。温度30～100℃，反应时间3～36h。过滤，用无水乙醇淋洗两次，再用蒸馏水淋洗三次，20～70℃真空干燥6～36h，常温下干燥处保存。
解离改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂的方法如下：将偶联聚乙二醇的PGMA加入到氢氧化钠溶液中，氢氧化钠溶液浓度为5％～60％，加热至40～100℃，持续时间5h～36h。过滤，清液中的聚乙二醇通过滴定法定量(G.E.C.Sims &T.J.Snape，A Method for the Estimation of Polyethylene Glycol in PlasmaProtein Fractions，Analytical Biochemistry，107，1980，60～63)，从而确定单位质量树脂中聚乙二醇的偶联量。
附图说明
图1为PGMA与PEG(图A)及mPEG(图B)反应的示意图
图2为PGMA改性前后的红外光谱
具体实施实例
实施实例1：PGMA-PEG100吸附牛血清白蛋白
用1000.0mL二甲基亚砜与蒸馏水(1∶1，V/V)混合溶液或丙酮溶胀10.0g多孔甲基丙烯酸缩水甘油酯与二乙烯基苯交联的PGMA不定型颗粒或多孔甲基丙烯酸缩水甘油酯与二甲基丙烯酸乙二醇酯交联的PGMA不定型颗粒(平均粒径200μm，平均孔径10nm)1h，加入60.0g的PEG100和15.0g NaOH或12.0gKOH，在100℃搅拌混合36h。过滤，用无水乙醇淋洗，再用蒸馏水淋洗，70℃真空干燥6h，即得改性树脂PGMA-PEG100。取0.05g PGMA-PEG100加入到5％NaOH溶液中，在100℃恒温5h，过滤，清液中的PEG100用滴定法确定。经测定PGMA-PEG100中PEG100偶联量为0.4g/g干胶。
将PGMA-PEG100颗粒用硫酸铵溶液溶胀过夜，滤去水分，加入到4mg/mL的牛血清白蛋白溶液中，室温下振荡混合24h。其中，硫酸铵溶液浓度为0.1～2mol/mL，优选浓度为0.85mol/mL。牛血清白蛋白浓度为1～8mg/mL，优选浓度为4mg/mL。检测表明PGMA-PEG100对牛血清白蛋白的吸附力为90mg/g湿胶。
实施实例2：PGMA-mPEG100作为层析介质纯化猪胰激肽释放酶
用2000.0mL二氧六环或二甲基亚砜溶胀20.0g多孔甲基丙烯酸缩水甘油酯与亚乙基二甲基丙烯酸酯交联的PGMA微球或甲基丙烯酸缩水甘油酯与衣康酸烯丙酯交联的PGMA微球(平均粒径为5μm，平均孔径300nm)16h，加入100.0g的mPEG100，4.0g BF3，80℃搅拌混合24h。过滤，用无水乙醇淋洗，再用蒸馏水淋洗，40℃真空干燥10h，即得改性树脂PGMA-mPEG100。取0.05g PGMA-mPEG100加入到15％NaOH溶液中，在40℃恒温36h，过滤，清液中的mPEG100用滴定法确定。经测定PGMA-mPEG100中mPEG100偶联量为0.6g/g干胶。
将PGMA-mPEG100填充到100mm×400mm层析柱。新鲜的胰脏搅碎磨浆，投入500立升反应锅内，加2倍量水，2倍量丙酮，反应28h，反应温度16℃结束。进行过滤，要清液，此液体每毫升中含胰激肽原酶效价13～15单位。清液倒入带搅拌的反应锅中，加无水氯化钙调pH为6.2，到入沉淀锅内沉淀12h，虹吸出上清液。底部沉淀物用25％饱和度的(NH4)2SO4溶液溶解，过滤。将滤液注入PGMA-mPEG100层析柱。用5％饱和度的(NH4)2SO4溶液洗脱，收集第二个洗脱峰。这种方法制备猪胰激肽释放酶的平均得量1.92g/kg胰脏，比活150.34μg/mg，回收率为72.4％。
实施实例3：PGMA-PEG50000作为层析介质复性金黄色葡萄球菌翻译延长因子G(EF-G)
用2000.0mL三氯甲烷溶胀20.0g多孔甲基丙烯酸缩水甘油酯与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺交联的PGMA微球或甲基丙烯酸缩水甘油酯与三甲基丙烯酸甘油酯交联的PGMA微球(平均粒径为30μm，平均孔径100nm)，100.0g PEG50000，4.0g金属钠，在80℃搅拌混合3h。过滤，用无水乙醇淋洗，再用蒸馏水淋洗，30℃真空干燥36h，即得改性树脂PGMA-PEG50000。取0.05g PGMA-PEG50000加入到60％NaOH溶液中，在40℃恒温5h，过滤，清液中的PEG50000用滴定法确定。经测定PGMA-PEG50000中PEG50000偶联量为0.04g/g干胶。
将插入金黄色葡萄球菌fusA基因的pET30质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，在含50μg卡拉霉素/ml的LB培养基中于30℃培养至OD595于0.4～0.5，然后加入IPTG(isopropyl-β-D thiogalactopyranoside)至1mM终浓度进行诱导，继续培养4hrs，过量表达EF-G绝大多数以包涵体形式存在(80％)，其余以可溶性形式存在(20％)。发酵液于4000rpm离心35min，收集菌体沉淀。将菌体用缓冲液(100mM Tris，1mM EDTA，1μg/ml Dnase，1mM苯甲磺酰氟(PMSF)pH8.0)悬浮，在冰浴中用French press破碎3次，破碎液于17000rpm离心30min，收集包涵体沉淀。将所得包涵体用洗涤液(1％Triton X-100，50mM Tris，1mM EDTA，pH8.5)悬浮，搅拌至沉淀散开，再于17000rpm离心30min，重复洗涤两次。洗涤后包涵体用变性剂(6M盐酸胍(Gdn-HCl)，50mM Tris，1mM EDTA，150mM DTT，pH8.7)溶解，室温搅拌3h后，于17000rpm离心30min，然后收集上清，即为变性EF-G，分装后于-70℃保存。
将PGMA-PEG50000蒸馏水溶胀后装填色谱柱(100×10mm i.d.，8ml)。用缓冲液A(20mM Tris，3M(NH4)2SO4，pH8.2)平衡，然后上24mg/ml变性EF-G100μl。用缓冲液A冲洗一个柱体积，用缓冲液B冲洗(20mM Tris，5mMβ-ME，pH8.6)2个柱体积。再加入2ml缓冲液C(8M urea，50mM Tris，pH8.5)，然后再用缓冲液B持续洗脱至出峰完全。所有色谱过程在FPLC洗脱上进行，流速0.5ml/mi。洗脱峰收集液室温放置过夜后经分析，复性EF-G蛋白含量达到了580μg/ml，显著高于稀释复性。
实施实例4：PGMA-mPEG10000用作固相吸附制备牛血清白蛋白-牛血红蛋白偶联物
用100.0mL二甲基亚砜溶胀25.0g平均粒径为50μm GMA接枝在聚苯乙烯上的无孔PGMA微球或GMA接枝在聚丙烯酰上的无孔PGMA微球，加入14.0gmPEG10000，1.5g NaBH4，在30℃搅拌混合10h。过滤，用无水乙醇淋洗，再用蒸馏水淋洗，60℃真空干燥6h，常温下干燥处保存。即得改性树脂PGMA-mPEG10000。取0.05g PGMA-mPEG10000加入到30％NaOH溶液中，在80℃恒温16h，过滤，清液中的mPEG10000用滴定法确定。经测定PGMA-mPEG10000中mPEG10000偶联量为0.07g/g干胶。
用50mM HEPES缓冲液(pH7.0)平衡0.5g PGMA-mPEG10000，与200ml的2mg/ml牛血清白蛋白溶液混合，使蛋白吸附在介质上。随后再与5ml用50mM HEPES缓冲液(pH7.0)平衡好的4.5g PGMA-mPEG10000混匀。将PGMA-mPEG10000装入一个6.5×2cm的柱中，加入10ml的0.5％(v/v)戊二醛，混匀后在4℃下静置，并将柱封住。2小时后用1000ml 50mM HEPES缓冲液(pH7.0)洗柱，随后改用含有0.6M NaCl的500mM HEPES缓冲液(pH7.0)洗脱，收集蛋白峰。收集物随后上用50mM HEPES缓冲液(pH7.0)平衡的Sephadex G-25凝胶过滤柱，脱去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脱液，浓缩后上Superdex 200凝胶过滤柱(31×1cm)。该柱固定在WatersTM 650E高级蛋白纯化系统上，已用100ml含0.15M NaCl的50mM HEPES缓冲液(pH7.0)平衡。用该平衡液继续洗脱蛋白，流速为0.4ml/min。洗脱后出现两个洗脱峰，收集含有单体牛血清白蛋白的洗脱峰。血红蛋白溶于50mM HEPES缓冲液(pH7.0)，浓度为2mg/ml。在4℃下向血红蛋白溶液通入湿润的高纯氮气50分钟，彻底脱氧，以制备脱氧血红蛋白。10ml的2mg/ml脱氧血红蛋白与含有10mg的单体牛血清白蛋白的洗脱峰混合，调pH值至9.5，反应8小时。反应过程中均有氮气不断通入。随后加入1ml 0.5M赖氨酸溶液以终止偶联反应。
实施实例5：PGMA-mPEG50000用作膨胀床填料纯化蛋白质
用5000.0mL四氯甲烷溶胀200.0g粒径100～2000μm，平均孔径70nm的多孔甲基丙烯酸缩水甘油酯与三聚异氰酸烯丙酯交联的PGMA颗粒，加入600.0g mPEG50000，2.0mL浓硫酸，在80℃搅拌混合24h。过滤，用无水乙醇淋洗，再用蒸馏水淋洗，60℃真空干燥6h，即得改性树脂PGMA-mPEG50000。取0.05g PGMA-mPEG50000加入到5％NaOH溶液中，在100℃恒温36h，过滤，清液中的mPEG50000用滴定法确定。经测定PGMA-mPEG50000中mPEG50000偶联量为0.09g/g干胶。
用PGMA-mPEG50000填充16mm×400mm层析柱，用离子强度为10mmol/L、pH值为6.6的K2HPO4/NaH2PO4(PBS)缓冲体系平衡。
取50mL牛血红细胞，按红细胞∶蒸馏水＝1∶29(体积比)的比例混合，在4℃缓慢搅拌30min，使细胞膨胀破裂，胞内牛血红蛋白释放到溶液中。将溶液以线流速3.3cm/min注入PGMA-mPEG50000柱。改变缓冲液的pH值为7.2的条件下进行洗脱，整个操作在4℃下进行。PGMA-mPEG50000对牛血红蛋白的动态吸附量为70～75mg/mL，经过纯化的产品纯度达到电泳纯，高铁血红蛋白含量仅为3.4％。
Claims (10)
1、聚乙二醇改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂，其特征在于聚乙二醇偶联到甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂上。
2、根据权利要求1所述的聚乙二醇改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂，其特征在于甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂可以是甲基丙烯酸缩水甘油酯与二乙烯基苯、亚乙基二甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺或三甲基丙烯酸甘油酯交联的树脂，或用甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的高分子材料。
3、根据权利要求1所述的聚乙二醇改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂，其特征在于甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂的形态可以是球形或不定形、平均孔径为10～300nm的多孔或无孔，粒径范围为5μm～2000μm。
4、根据权利要求1所述的聚乙二醇改性甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂，其特征在于聚乙二醇可以是双末端羟基聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇，聚乙二醇的分子量范围可以是100～50000。
5、聚乙二醇改性甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂制备方法，其特征在于制备过程包括甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂的溶胀、甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂与聚乙二醇的偶联，产物洗涤与干燥。
6、根据权利要求5所述的聚乙二醇改性甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂制备方法，其特征在于甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂的溶胀时间为1～16h，采用的溶剂可以是四氯甲烷、三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、二氧六环、二甲基亚砜或二甲基亚砜与水体积比1∶1～10∶1的混合溶剂。
7、根据权利要求5所述的聚乙二醇改性甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂制备方法，其特征在于甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂与聚乙二醇偶联反应的条件为：温度30～100℃，反应时间3～36h，反应催化剂包括钠、乙醇钠、三氟化硼、氢氧化钠、氢氧化钾、硼氢化钠、浓硫酸、浓盐酸。
8、根据权利要求5所述的聚乙二醇改性甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂制备方法，其特征在于改性产物的洗涤包括用无水乙醇淋洗，再用蒸馏水淋洗，在20～70℃真空干燥6～36h。
9、根据权利要求1所述的聚乙二醇改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂，其特征在于偶联上的聚乙二醇含量可以解离后测定，解离方法是将改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂加入到5％～60％氢氧化钠溶液中，加热至40～100℃，持续时间5h～36h。
10、聚乙二醇改性甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂可以作为层析介质用于蛋白质分离纯化、蛋白质折叠复性、蛋白质固相偶联，或者可以作为膨胀床填料在蛋白质分离纯化中应用。
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Granted publication date: 20090513 Termination date: 20180509 |