CN1854311A - 荧光偏极化侦测法的方法 - Google Patents

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Abstract

一种荧光偏极化侦测法的方法，改良的多重链聚合酶连锁反应包括一个同步链聚合酶连锁反应以及一个特异性链聚合酶连锁反应，而且这两个扩增步骤皆可以触减策略来进行，其中宽松的触减策略是以低于最佳粘合温度的温度来使用，而严谨的触减策略是以高于最佳粘合温度的温度来使用。通过整合一个两阶段的扩增反应以及采用条件化触减策略的多重链聚合酶连锁反应，达成同时以高可信度和高可用率扩增多个DNA序列，且具有高产出率以及低成本效益的方法。

Description

荧光偏极化侦测法的方法
本申请是申请号为200310100408.8，中请日为2003年10月15日，发明名称为“条件化触减多重链聚合酶连锁反应”的分案申请。
技术领域
本发明是有关一种能够同时以高可信度(fidelity)和高可用率(workablerate)扩增多个DNA序列，具有高产出率以及低成本效益的方法，特别是关于一种结合条件化触减策略(conditional touchdown strategies)的多重链聚合酶连锁反应(Multiplex Polymerase Chain Reaction；MPCR)的荧光偏极化侦测法的方法。
背景技术
为了清楚说明，兹将尔后所用的关于生物分子的各种字词给予进一步定义。
1、定义：
“多型性”(Polymorphism)一般指的是一种物种或基因以两种或更多的型式呈现的现象。特别对于本发明来说，“多型性”指的是同一个基因呈现两种以上的型式。
“单一核甘酸多型性”(Single Nucleotide Polymorphism或SNP)指的是由于单一个核甘酸所产生的多型性现象。
“多重链聚合酶连锁反应”(Multiplex Polymerase Chain Reaction或MPCR)指的是在单一个链聚合酶连锁反应中同时扩增多个DNA目标片段的数量。
“高产出率”(High-throughput)指的是快速而且具有低成本效益的大规模制造方法。在本发明中，能够在严苛要求的时间和预算下同时筛选在单一个DNA样本中大量、多种的基因座(genetic loci)。
2、相关技术：
“链聚合酶连锁反应(PCR)”：链聚合酶连锁反应是科学上的一项伟大发明，它扩大了从少量DNA料来源制造出大量DNA分子副本的应用性，并使得应用更多元化，也使得分子生物学的世界产生了革命性的变化。
这个方法包括使用能够和与它们互补的DNA序列粘合(anneal)，且已预先决定序列的数组成对寡核甘酸分子，或称为起始引子分子(primer)，并且通过热稳定的DNA链聚合酶限定特定的DNA片段扩增其数量。这些DNA分子产物是通过一个重复的一系列循环操作过程被合成出来，每一个循环都包括了模版分子变性分离(template denaturation)，引子粘合反应(primer annealing)，以及通过链聚合酶所进行的粘合引子的延伸反应(extension)。这些过程可以造成特定的DNA片段数量以指数函数的速度累积，这些DNA分子的末端特征是由引子的5’端来决定，可参考Saiki等人发表的“引子引导热稳定的DNA链聚合酶酵素扩增DNA数量”，Science(1988)239：487-91。
“单一核甘酸多型性基因型定型(genotyping)”：有许多种为了不同领域的特殊目的的PCR变化方法已经被发展出来。PCR使用在基因型定型技术上，已经为揭开基因组结构的神秘面纱打开了一扇宽广之窗，例如基因鉴定和辨认在实际上已经变得可行。目前科学界对于SNP的浓厚兴趣使得对于基因型定型技术的要求已进一步到以费用、正确性、产出率和检测的简单程度作为判断检测是否可行的重要因子。如果有1000个人，每个人50万个SNP要在一年内完成分析，那么每天就要完成一百五十万个SNP基因型定型，而且总花费将达到五千万美金。甚至，每个人需要数毫克的基因组DNA，例如收集十管以上的血液，也将增加样本收集的费用，使得这项工作变得不可行。即使是通过保守的估计，这个吓人的花费也将使得最大型的基因型定型中心望而却步。因此，对于高产出率、具有低成本效益的方法的需求促成了许多创新的技术出现，包括PCR的衍生技术、以对偶基因座特异探针发展出来的杂交方法(例如TaqMan(商品名)PCR)、寡核甘酸嵌合反应(例如寡核甘酸嵌合检测(OLA))、单一核甘酸引子延伸反应(例如基质辅助雷射脱附游离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMassSpectrometry)以及模版引导的终止染料分子并入的荧光偏极化侦测(FP-TDI，template directed dye terminator incorporation with detection byfluorescence polarisation))、以及酵素切割方法(例如Invader(商品名))都已经被设计来增强自动化平台或使基因型定型的生化反应更多样化，参考Syvnen的“获取基因变异资料：基因型定型单一核甘酸多型性”(Accessinggenetic variation：genotyping single nucleotide polymorphisms)，Nat RevGenet(2001)2：930-42。
然而，这些技术没有一个真正代表了基因型定型技术上的突破。昂贵的仪器和试剂伴随着珍贵而稀少的基因组DNA样本阻碍了市场的接受度，并且使得检测的设计更加复杂。此外，大部分被发展出来的技术需要消耗大量的样本DNA，也抑制了大规模SNP基因型定型的实行。
“多重PCR”：多重PCR，在单一个PCR反应中同时扩增两个以上的基因座，参考Chamberlain，“杜馨氏肌肉营养不良症基因座通过多重DNA扩增的缺失筛检”(Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus viamultiplex DNA amplification)，Nucleic Acids Res(1988)16：11141-56，此法是一个能大量减少时间、费用及所需基因组DNA样本的强大基因分析技术。这个方法已经被成功的运用在许多的DNA检测领域上，包括基因多型性的判断。然而多重的PCR引子同时置于一个反应中可能会造成许多问题，包括假性PCR产物形成增加、引子形成双聚体、以及较短的DNA片段数量会有扩增的倾向。所有这些可能的问题如果加诸于SNP基因型定型会导致不正确的结果。一个关于各种情况以及所会遇到的困难的详细叙述已经在Henegariu等人所著的“多重PCR：关键参数和详尽的操作流程”(Multiplex PCR：critical parameters andstep-by-step protocol)，BioTechniques(1997)23：504-511，被讨论过了。
“传统技术的问题”：如同前述所讨论到的技术，总括的说，至少有如下三项缺点没有被克服：
1、最近的SNP基因型定型技术需要昂贵的设备和试剂，加上珍贵而稀少的基因组DNA样本，阻碍了市场的接受度，并且使得检测的设计更加复杂；
2、多重PCR将多对PCR引子置于同一个反应中可能会造成许多问题，包括假性PCR产物形成增加、引子形成双聚体和倾向于偏极性扩增较短的DNA片段，因此降低了它的可用率；
3、由于上述所提到的可能产生的问题，从文献中记载多重PCR的成功比率几乎很难超过50％。
当然，有许多技术已经被提出来要解决该领域的各种问题。例如，美国专利第5,736,365号，由Walker等人在单一个扩增反应中使用多重分子链取代扩增技术(SDA)。这项技术能够同时鉴定出结核杆菌(M.tuberculosis)，并提供大量筛检所有临床相关的分支杆菌属的物种。
颁给Shuber的第5,882,856号和第6,207,372号美国专利则提供了通用的多重PCR扩增的引子序列，让多重PCR反应能够在不需要繁杂的最佳化步骤下被设计并且进行，不必管不同的引子可能造成的不一样的性质，而且每一个被扩增的产物能同时被制造出相等数量。
Diamandis等人设计出一套能够快速诊断和专一筛检p53基因的突变的方法、试剂和套装试剂，这项美国第6,071,726号专利可以快速而且经济的诊断出病人样本中p53基因的突变。不过这些方法都无法解决上面所提到的问题。
在美国专利公开第20020058281号中，Matsuzaki等人提出了一套多重核酸分子数量扩增的方法以及组成成分，这个方法能够以相同的效率扩增不同序列的DNA分子数量，因此能够得到相同摩尔数的分子产物。这个方法需要高浓度的引子并且使用相同的粘合温度，而且它的产物是非特异性的，可用率也很低。
为了解决使用少量的基因组DNA做为模版，以及在多重PCR中置入大量的引子对所遭遇到的困难，Nakamura等人在美国专利公开第20020182622号中揭露一个SNP定型的方法，此法借着在多重扩增反应中使用热起始的Taq(商品名)链聚合酶，可以用很少量的基因组DNA为成千上万的SNP位置进行基因型定型。然而，这个方法仍然使用了高浓度的引子和单一粘合温度，而且借着这个方法所得到的PCR产物仍有非特异性的问题，并且可用率仍然偏低(不超过50％)。因此，如何提供一种高产出率，并具有经济效益，能以高可信度和高可用率同时扩增多个目标DNA数量的方法，成为人们所期盼。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种条件化触减多重链聚合酶连锁反应，通过快速而且负担得起的方法，借着多重PCR伴随着条件化触减策略，能够用来进行多重目标DNA序列分子的同时扩增，应用在SNP基因型定型，达到进行SNP基因型定型所需的DNA模版的数量相较于传统的方法大幅度地减少的目的。
本发明的目的是这样实现的：一种条件化触减多重链聚合酶连锁反应，其特征是：它包括下列步骤：
(1)首先，在第一粘合温度的同步链聚合酶连锁反应，以增加许多引子粘合到模版上；
(2)然后，在第二粘合温度的特异性链聚合酶连锁反应，以丰富许多指定的序列；
其中，该第二粘合温度高于该第一粘合温度。
该第一粘合温度实质上等于一最佳化的粘合温度，该第二粘合温度高于该最佳化的粘合温度，该最佳化的粘合温度是通过两个基因组DNA样本和混和的多个引子对被置入以各种触减热循环条件，执行的扩增反应步骤中，调整出最佳化的粘合温度。
该第一粘合温度低于一最佳化的粘合温度，该第二粘合温度实质上等于该最佳化的粘合温度。该第一粘合温度低于一最佳化的粘合温度，该第二粘合温度高于该最佳化的粘合温度。
在该同步链聚合酶连锁反应的步骤之前，它更包括一最佳化引子混合物和相关链聚合酶连锁反应条件的步骤；该最佳化步骤是通过使用同一个基因组DNA样本和每一个引子对进行PCR来完成触减PCR的循环模式，包括如下步骤：
(1)第一种模版分子变性分离；
(2)引子粘合温度的下降梯度的许多第一循环，该第一循环包括第二种模版分子变性分离的第一时间区段，跟随着第二时间区段在一指定的梯度温度的第一种引子粘合反应，然后第三时间区段的第一种引子延伸反应；
(3)许多的第二循环，该第二循环包括第三种模版分子变性分离的第四时间区段，跟随着第五时间区段在最终触减点的第二种引子粘合反应，然后第六时间区段的第二种引子延伸反应；
(4)第三种引子延伸反应。
本发明又提供一种基因型定型方法，其特征是：它包括下列步骤：
(1)通过采用第一触减程序的多重链聚合酶连锁反应在一带有许多引子对及基因组DNA的混合液中同步扩增多种核甘酸序列分子；
(2)采用第二触减程序的多重独立链聚合酶连锁反应，每一该独立链聚合酶连锁反应通过一对指定的引子扩增来自前一步骤制造的多重PCR产物中的一特定的核甘酸序列分子。
该第一触减程序使用一粘合温度低于一最佳化的粘合温度，并且该第二触减程序使用第二粘合温度实质上高于该最佳化的粘合温度。该第一触减程序使用一粘合温度低于一最佳化的粘合温度，并且该第二触减程序使用第二粘合温度实质上等于该最佳化的粘合温度。该第一触减程序使用一粘合温度低于一最佳化的粘合温度，并且该第二触减程序使用第二粘合温度高于该最佳化的粘合温度。
该基因组DNA的数量低于50微毫克。该基因组DNA的数量等于或大于50微毫克。该同步扩增多种核甘酸序列分子的步骤采用一触减热循环模式。该循环模式包括如下步骤：
(1)第一种模版分子变性分离；
(2)引子粘合温度的下降梯度的许多第一循环，该第一循环包括第二种模版分子变性分离的第一时间区段，跟随着第二时间区段在一指定的梯度温度的第一种引子粘合反应，然后第三时间区段的第一种引子延伸反应；
(3)许多的第二循环，该第二循环包括第三种模版分子变性分离的第四时间区段，跟随着第五时间区段在最终触减点的第二种引子粘合反应，然后第六时间区段的第二种引子延伸反应；
(4)第三种引子延伸反应。
它更包括在该多重独立链聚合酶连锁反应的步骤之前的纯化该多重链聚合酶连锁反应产物的步骤。该多重独立链聚合酶连锁反应的步骤采用一触减热循环模式。该循环模式包括如下步骤：
(1)第一种模版分子变性分离；
(2)引子粘合温度的下降梯度的许多第一循环，该第一循环包括第二种模版分子变性分离的第一时间区段，跟随着第二时间区段在一指定的梯度温度的第一种引子粘合反应，然后第三时间区段的第一种引子延伸反应；
(3)许多的第二循环，该第二循环包括第三种模版分子变性分离的第四时间区段，跟随着第五时间区段在最终触减点的第二种引子粘合反应，然后第六时间区段的第二种引子延伸反应；
(4)第三种引子延伸反应。
它更包括在该同步扩增多种核甘酸序列分子的步骤之前的一最佳化引子混合物和相关链聚合酶连锁反应条件的步骤。它更包括一凝胶分析及定序分析的步骤以评估链聚合酶连锁反应和基因型定型结果。
本发明还提供一种荧光偏极化侦测法的方法，其特征是：它包括下列步骤：
(1)通过采用第一触减程序的多重链聚合酶连锁反应在一带有许多引子对以及基因组DNA的混合液中，同步扩增多种核甘酸序列分子；
(2)采用第二触减程序的多重独立链聚合酶连锁反应，每一该独立链聚合酶连锁反应通过一对指定的引子扩增来自前一步骤制造的多重链聚合酶连锁反应产物中的一特定的核甘酸序列分子。
该第一触减程序使用一粘合温度实质上等于一最佳化的粘合温度，并且该第二触减程序使用第二粘合温度高于该最佳化的粘合温度。该第一触减程序使用一粘合温度低于一最佳化的粘合温度，并且该第二触减程序使用第二粘合温度实质上等于该最佳化的粘合温度。该第一触减程序使用一粘合温度低于一最佳化的粘合温度，并且该第二触减程序使用第二粘合温度高于该最佳化的粘合温度。
它更包括一设计该引子的步骤，以具备一融解温度在一范围内，供一数量的链聚合酶连锁反应产物的扩增。
在本发明的方法中，将触减PCR结合到多重PCR是为了要解决在PCR多重化时所遭遇到的引子起始错误的困难。触减PCR是一个PCR的变化方法，它已经被采用来避开为了要判断粘合温度所需的更复杂的最佳化过程。它包含了每下一个回合降低温度1℃，一般大约使用10个回合，以触减(touchdown)方式达到最适合的粘合温度。
它的精髓在于任何正确和不正确于融解温度(Tm)的粘合之间的差异会造成每回合产物数量2倍的差异，因此会造成正确的产物数量超过任何不正确的产物，参考Don等人的“在基因扩增过程中，触减PCR以回避假性的引子起始”(Touchdown PCR to circumvent spurious priming during geneamplification)，Nucleic Acids Res(1991)19：4008。这个将触减策略整合到多重PCR的发明方法，在需要大量引子对时是非常有价值的，尤其是在SNP基因型定型操作。本发明的方法被设计来改进高度要求正确度、低成本效益和高产出率的SNP基因型定型的表现。
此外，在所有传统SNP基因型定型过程，每个SNP位置至少都需要数十毫微克(ng)的基因组DNA。因为每个个体有数以万计的SNP位置需要检测，所以实际上要得到足够的基因组DNA是不可能的。相反的，利用本发明的方法进行多重SNP位置的定型，可以大量减少每个个体所需的基因组DNA的数量，因此它在临床样品收集上相当具有价值，甚至，它的检测的简单设计也令人相当向往能在SNP基因型定型繁琐、冗长的过程中使用这个方法。
根据本发明的方法，在一个条件化的触减多重PCR反应的中，包括同步PCR和特异性PCR。在同步PCR中，扩增的目的是要增加各引子粘合到模版上的机会，而特异性PCR则是用来增加想要的特定序列的数量。这两种PCR的粘合温度都可以采用触减策略。特别是特异性PCR的粘合温度高于同步PCR的粘合温度。
在本发明的一个较佳实施例当中，一个基因型定型包括采用宽松触减策略(Loose Touchdown Strategy；LTS)的多重PCR的同步扩增步骤，加上采用严谨触减策略(Stringent Touchdown Strategy；STS)的特异性PCR产物扩增步骤。另外，在使用预先调整好的引子对的多重PCR的扩增步骤的前可包含最佳化步骤，以改善其后的扩增步骤的效率。
在本发明的最佳化步骤中，例如，一个全面性的引子最佳化提供了一个用来增加后续的PCR反应的可用率的方法。这个方法是利用触减PCR操作流程，并且缩小最佳温度下降梯度区段到70～60℃和75～65℃。之后引子对能够被置于这两个温度梯度区段。在一实际运作中，96个引子对被置入反应中，而多重PCR产物的可用率达到92.7％。在之后的基因型定型应用中，成功的比率能够达到84.4％。
在PCR反应中，较佳者，是使用热稳定的Taq DNA链聚合酶加上能够校读产物的pfu(商品名)DNA链聚合酶，以提高PCR产物的序列可信度。
同步PCR扩增反应是采用多重PCR和宽松触减策略来进行，如此整体的目标DNA序列分子可以通过这个步骤被增加。在一同步扩增反应的实际操作中，粘合温度梯度(例如67～57℃和72～62℃)的3℃温度下降量已经被证实是一个适当的温度下降量。这些数量增加的目标序列分子群在纯化处理之后就可以进行接下来的特异性扩增。
特定引子的特异性扩增反应可以借着采用PCR和严谨触减策略，扩增特定目标序列分子的数量。在一特异性扩增的实际操作中，粘合温度梯度(例如73-63℃和78-68℃)的3℃的温度增加量已经被证实是适当的温度增加量。特异性的PCR产物需要进一步的纯化处理，然后使用在其它的应用中。要判断SNP位置的比较好的具体运用方法，是将PCR产物予以定序。在一含有96个引子对的实际操作中，SNP定型的成功率达到88.5％。
在另一模版引导的终止染料分子并入的荧光偏极化侦测(FP-TDI)的实际运用过程中，根据本发明的方法，PCR的引子被设计成具有52～56℃的融解温度(melting temperature)，用以扩增100到250个碱基对的PCR产物，而触减程序在同步PCR时是设定在50～60℃之间，在特异性PCR时是设定在56～66℃。
因此，它展现了高产出率、具有低成本效益，而且正确进行例如SNP基因型定型和侦测的应用。临床样本进行多重PCR所需费用的减少对于大规模的基因型定型也有所助益。在一个PCR反应中以高度序列可信度进行96个或更多样本的多重扩增的能力，使得这项创新方法的应用极具有价值，尤其是使用在高产出率的SNP研究上。
从本发明的观点来看，获得解决的问题至少包括：
(1)进行多重PCR的引子对数目限制；
(2)多重PCR由于假性PCR产物形成和较短DNA片段扩增效果增强所造成的可用率低下；
(3)使用多重PCR时，SNP基因型定型的成功率低下。
由于它的各种特性，这个方法在以PCR为基础的基因型定型应用上占有优势地位。
对于熟悉本技艺的人士而言，从以下所作的详细叙述配合附图，本发明将能够更清楚地被了解，其上述及其它目的及优点将会变得更明显。
附图说明
图1是本发明所采用的较好的触减策略及其步骤；
图2是本发明所采用的三种触减策略的粘合温度；
图3是本发明的基因型定型流程，其中包括有最佳化步骤、同步扩增步骤和特异性扩增步骤；
图4-图5是图标SNP基因型定型扩增步骤结果的凝胶分析；
图6是以fas相关死亡区域蛋白(fas-associated death domain；FADD)基因的特定DNA区域图标示范性的序列分析的传统PCR；
图7是以fas相关死亡区域蛋白(fas-associated death domain；FADD)基因的特定DNA区域图标示范性的序列分析的采用结合触减策略的多重PCR的基因型定型方法；
图8-图9是在多重-荧光偏极化检测中的特异性PCR结果的凝胶分析；
图10是本发明的多重-荧光偏极化检测的分别图标示范性的点状图表；
图11是传统的单纯-荧光偏极化检测的分别图标示范性的点状图表。
具体实施方式
参阅图1-图3所示，根据本发明，在条件化的触减策略多重PCR中包括用来增加粘合到模版上的引子的同步扩增步骤，接着是特异性扩增步骤，它是用来增加所要的序列的数量，如图1所示，同步扩增PCR和特异性PCR都采用了触减策略。特别是，宽松的触减策略(LTS)被加入同步扩增PCR之中，目的是为了大量增加粘合到模版的引子数量，这里是以低于理想粘合温度(To)一个温度下降量(Td)的粘合温度来进行。相反的，严谨的触减策略(STS)是用在特异性PCR，以高于理想粘合温度一个温度增加量(Ti)的粘合温度，特异性地扩增指定的DNA序列。这个结合了触减策略的同步扩增PCR和特异性PCR的方式，达到了快速而且经济上能够负担的多重目标DNA序列分子同步扩增的目的。
不过，这两个扩增步骤的任何一个都能够以触减策略进行。详细的说，有两个不同于图1所显示的运用方法的变化方法。
如图2所示，除了图1所显示的以第三型所设计运用的方法以外，第一型是宽松触减策略的同步扩增PCR，而第二型是严谨触减策略的特异性PCR。
关于多重基因型定型：
根据本发明的方法，在典型的基因型定型应用中会使用多个引子对一起扩增多个目标序列，例如使用基因组DNA分析多重SNP位置，这可以以三个步骤完成：
(1)对预先调整好的引子对进行最佳化步骤；
(2)对多重PCR的引子对进行宽松触减策略的同步扩增步骤；
(3)以严谨触减策略对数种PCR产物进行特异性扩增。
图3为示范性的工作流程。图3说明了一个比较好的基因型定型工作流程，其中整合了本发明的条件化触减策略多重PCR，它包含最佳步骤10、同步扩增步骤20、以及特异性扩增步骤30。
在标准的最佳化过程(MOPCR)中，两个基因组DNA样本和混和的多个引子对被置入以各种触减热循环条件执行的扩增反应步骤中，以便调整出最佳化的多重PCR条件。接着凝胶分析40、DNA定序分析50被用来评估PCR和基因型定型的成果。
在PCR条件最佳化步骤之后，大规模的多重PCR在96孔的检测盘上进行，每一个孔包含了一个来自特定个体的基因组DNA样本。该结果由凝胶分析40和定序分析50进行解析。这个方法的核心技术包括了分别采用LTS和STS的同步扩增20和特定扩增30步骤。
相较于传统的多重PCR，这个方法使用宽松触减策略和严谨触减策略，因此增加多重PCR的可用率、其后的应用的成功率、以及PCR扩增产物的序列可信度。
1、最佳化步骤：
使用在多重PCR中的引子，最好是以多个预先调整参数仔细设计，这些参数包括产物大小、引子寡核甘酸长度、融解温度、GC碱基含量、以及其它参数，如表1所示。要设计数十个或数百个引子时建议使用精密的引子设计软件。在一较佳实施例中，采用Primer3(麻省理工学院，美国麻州)。
表1
参数     调整细节
包含区域     200个碱基-可转录区段200个碱基
产物大小     750-950个碱基
引子寡核甘酸长度     21，23，25(最小，最佳，最大)
融解温度     55，60，65(最小，最佳，最大)
允许左右引子最大融解温度差     5度
GC碱基含量百分比     45，50，60(最小，最佳，最大)
允许引子最大自我互补度     6
允许引子3′端最大互补度     3
允许引子单一碱基最大连续数目     5
用以筛选出散置重复性序列或其它序列的基因组来源数据库，以避免成为引子的设计位置 人类的
引子3’端     不要有T碱基
最佳化步骤是通过使用同一个基因组DNA样本和每一个引子对进行PCR来完成触减PCR的循环模式，也就是所谓的触减程序包括：
(1)模版置于94℃4分钟变性分离；
(2)模版置于94℃变性分离40秒，接着置于粘合温度40秒，此时粘合温度依照设计的温度梯度每个循环粘合温度下降1℃，之后置于72℃进行引子延伸反应，总共要进行10个循环下降10℃；
(3)模版置于94℃变性分离40秒，接着置于最终触减点(touchdownpoint)温度40秒，然后在72℃进行引子延伸反应3分钟，总共要进行25次循环；
(4)引子置于72℃进行延伸反应5分钟。为了要调整到最佳的触减策略多重PCR的反应条件，有多个粘合温度温度梯度下降区段被拿来测试，用以判断出多重PCR最佳的温度区段。在较佳实施例中，这些温度区段包括60～50℃、65～55℃、70～60℃、以及75～65℃。在例示程序中，70～60℃涵盖了大部分各种多重PCR的最佳区段。较佳者，在最佳化过程的某个温度梯度中被证实有最佳表现的引子对最好混合在一起，并且使用在之后的多重PCR中。
2、同步扩增步骤
在同步扩增步骤20中，借着引进多个会粘合在目标序列两旁的引子，对到每一个单独的PCR反应中，想要的DNA片段就能被同时扩增。在这个例子中，96个引子对被混合，并且在96孔的检测盘中被使用来进行多重PCR，每一个孔都含有一个不同个体的基因组DNA样本。为了要增加目标序列能同时被他们的特异性引子对粘合上，并且一起扩增的机率，在这里采用了一个宽松的条件，例如LTS。在一较佳实施例中，在温度梯度(例如67～57℃以及72～62℃)中采用3℃的温度下降量已经被证实是适当的温度下降量。
借着使用宽松的触减策略以及将试剂调整到适当的条件来进行PCR。在较佳实施例中，使用热稳定的DNA链聚合酶(例如Taq DNA链聚合酶)加上pfu DNA链聚合酶(一个具校读功能的DNA链聚合酶)，而且缓冲液中的氯化钾(KCl)和氯化镁(MgCl2)的浓度要调整到制造厂商所建议的浓度的1.5倍。
另外一种选择是使用TPC(Taiwan Proteomics Company，台湾蛋白体生物科技公司)的Taq DNA链聚合酶(最后浓度：0.04U/微升(μl))、pfu DNA链聚合酶(最后浓度：0.0005U/微升；美国加州Stratagene公司制造)、1.5倍浓度的制造商的10X PCR缓冲液(内含100毫摩尔浓度的三氢氧甲胺基甲烷-氯化氢盐(Tris-HCl)pH9.0、15毫摩尔浓度的MgCl2、500毫摩尔浓度的KCl、1％明胶蛋白(gelatin)、以及1％Triton X-100(接口活性剂商品名))、0.25毫摩尔浓度的dNTP、0.025或0.05微摩尔浓度(μM)的每一种引子、以及25-50毫微克(ng)的基因组DNA。同步扩增所使用的热循环模式已经在具有延长的延伸反应时间和宽松触减程序的最佳化步骤20的部分描述过了。所有的PCR产物会被70％的酒精或是其它过滤方法来纯化(clean up)。较佳者，使用多重筛选PCR96孔过滤系统(Multi-screen PCR 96-well filtration system，美国麻州的Millipore公司所制造)。在纯化之后，这些PCR产物已经可以准备用在下一步的特异性扩增步骤。在每一个反应产生的PCR产物都拥有大量的目标DNA序列分子，例如想要的SNP位置的序列分子群。
3、特异性扩增步骤：
在特异性扩增步骤30中使用特异性的引子对，并且进一步地扩增每一个PCR反应中特定目标序列分子的数量。这里会采用一个严谨的条件，也就是采用较高的粘合温度梯度的STS，以便能够达到引子粘合到模版的的特异性。在一较佳实施例中，在温度梯度(例如73～63℃以及78～68℃)中采用3℃的温度升高量已经被证实是适当的温度增量。
这里的PCR反应的细节，除了DNA模版是来自于扩增步骤20的产物，以及采用了严谨的触减程序之外，就如同最佳化步骤10中所提到的一样。此外，在每一个扩增循环中引子延伸反应的时间缩短到1分30秒，而不是同步扩增步骤20的3分钟。
在较佳实施例中，将同步扩增反应中PCR产物的1/150置入PCR反应。如果要进行进一步的应用，纯化的步骤是需要的。例如，最后的PCR产物为了要做SNP基因型定型，以美商应用生命系统公司(Applied Biosystems)的DNA分析仪3700做DNA定序。
[实验]
提供下列的资料是为了要以更具体的方式描述上述的DNA基因型定型过程，不过本发明的技术范畴并不局限于这个例子。
在本发明的一个实施例中，从国立台湾大学附设医院收集了96个基因组DNA样本。样本的详细使用经过完善的说明，并且从每个样本捐赠者取得了同意书。所有的基因组DNA样本都经过标准程序纯化，并且在使用之前都储存在零下20℃。为了要达到多重PCR最好的条件，先将两个基因组DNA样本使用在最佳化步骤10。在同步扩增步骤20中，96个引子对被混合在100微升的PCR试剂中，试剂中包括了的前所叙述的成分。操作PCR试剂的详细过程也被叙述在相关的地方。在特异性扩增步骤30中，每一个被设计来判定特定基因座的96个引子对分别被置于检测盘的96个不同的孔中。从同步扩增步骤20所得到的PCR产物的1/150，被当作模版使用在这每一个平行的严谨触减策略PCR反应之中。这些PCR反应所产生的PCR产物利用2％凝胶以及美商应用生命系统公司的DNA分析仪3700进行解析，用以确认它们的基因型。在同步扩增和特异性扩增步骤中，所得的PCR产物被置入美商密理博生命科学公司(Millipore)的多重筛选PCR96孔过滤系统进行纯化。
图4说明了从特异性扩增步骤所得到的部分结果。96个PCR产物中的24个被图标在图4，此处有两个不同的引子浓度0.05微摩尔浓度和0.025微摩尔浓度。结果从凝胶上的观察得知这在两个浓度之间的引子浓度所得到的结果并无不同，甚至使用0.025微摩尔浓度时所得的结果也是一样。
另一方面，在图5中，以50和25毫微克的基因组DNA在同步扩增步骤中当作模版证实了较低量的基因组DNA，25微毫克在多重PCR中可以达到较高的可用率。换句话说，以25微毫克的基因组DNA在同步扩增步骤中当作模版，在相同的方法的下被发现相较于50微毫克的基因组DNA，可以提高特异性扩增步骤所得的可用率。由这些资料证实了以本发明的方法进行基因型定型只需要微量的基因组DNA，25微毫克或是更少的量。
提供图6和图7是为了提出一个实例，证实只使用传统PCR和使用LTS与STS的多重PCR进行SNP基因型定型所得的结果之间的一致性。定序结果的型态的一致性分别被显示在图6及图7，以封闭长方形圈出的是SNP的位置。使用本发明的多基因型定型方法被发现不会有偏向判定出某个特定的基因型，在两个基因定序结果的型态上也没有不同之处。
除此之外，已经检验过了50个SNP基因座，而且使用两种中任何一种方法都不会有偏向特定的基因型的结果出现。
模版引导的终止染料分子并入的荧光偏极化侦测法(FP-TDI)
虽然FP-TDI测量是目前数种不同的自动化基因型定型方法中的一种，但是它有许多优点，例如容易使用、稳定的表现和能够负担的费用。它也是本发明的一种相当好的应用。
下面是一个实际的实验，用以说明目前本发明的特点。
1、引子的设计：PCR引子被设计成具有52～56℃的融解温度，用来扩增100个碱基对到250个碱基对长的PCR产物。
2、多重PCR扩增：方法与前面所叙述的方法相同，除了在同步PCR步骤的触减程序改为60～50℃，而特异性扩增PCR步骤的触减程序则为66～56℃。
图8-图9是多重荧光偏极化检测(multiplex-FP)中的特异性PCR产物的凝胶分析，有46个引子对，而且其可用率将近89.1％。
图10显示的是根据本发明所做的多重荧光偏极化检测的点状图，而图11是传统的单一荧光偏极化检测(simplex-FP)的点状图。TAMRA的学名为Carboxytetramethylrhodamine，即羧基四甲基若丹明，为一荧光标记分子，此处并使用另一种若丹明荧光标记分子R110。此图可分成四个区域，左上和右下角区域都是同型合子(homozygote)基因型，右上角为异型合子(heterozygote)基因型，左下角为阴性控制组(negtive control)。XY轴的数值代表的是测得的荧光偏极化值的千分之一(milli-polarization(mP))。
将条件化的触减策略整合到这里所提的多重PCR是从未有过，首次出现的，而且已经被证实对于解决在基因型定型中所采用的多重PCR技术所遭遇到的，由于引子错误起始造成的PCR产物的困难有所助益。在多重PCR中的引子有效数目，已经不再像传统的方法无法超过10对，而能够达到至少96个引子对。
当本发明被运用在疾病诊断上时，至少有96个基因上的位置能够被判断出来，就如同例子中所描述的，而不像传统方法只能判断1个或多个基因。
此外，相较于其它方法用在大规模基因型定型上时，本发明的方法只需要少量的基因组DNA样本。更有甚者，相较于其它基因型定型方法必需配备昂贵、复杂的设备和试剂，本发明的高产出率和具低成本效益的特性也不会妨碍到检测设计上的简单性。
关于本发明的有力的应用：
本发明可以运用在下面所举列的不同方面，但不仅限于此：
1、从少量的基因组DNA进行大规模和高产出率的基因型定型；
2、作为多重疾病或复杂疾病的筛检套件；
3、作为遗传或感染疾病的筛检套件；
4、作为药物效力的预测套件。
以上对于本发明的较佳实施例所作的叙述是为阐明的目的，并非限定本发明的保护范围，凡从本发明的实施例学习而作修改或变化，都属于本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1、一种荧光偏极化侦测法的方法，其特征是：它包括下列步骤：
(1)通过采用第一触减程序的多重链聚合酶连锁反应在一带有许多引子对以及基因组DNA的混合液中，同步扩增多种核甘酸序列分子；
(2)采用第二触减程序的多重独立链聚合酶连锁反应，每一该独立链聚合酶连锁反应通过一对指定的引子扩增来自前一步骤制造的多重链聚合酶连锁反应产物中的一特定的核甘酸序列分子。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征是：该第一触减程序使用第一粘合温度等于一最佳化的粘合温度，并且该第二触减程序使用第二温度高于该最佳化的粘合温度，该最佳化的粘合温度是通过两个基因组DNA样本和混和的多个引子对被置入以各种触减热循环条件，执行的扩增反应步骤中，调整出最佳化的粘合温度。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征是：该第一触减程序使用第一粘合温度低于一最佳化的粘合温度，并且该第二触减程序使用第二温度等于该最佳化的粘合温度，该最佳化的粘合温度是通过两个基因组DNA样本和混和的多个引子对被置入以各种触减热循环条件，执行的扩增反应步骤中，调整出最佳化的粘合温度。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征是：该第一触减程序使用第一粘合温度低于一最佳化的粘合温度，并且该第二触减程序使用第二温度高于该最佳化的粘合温度，该最佳化的粘合温度是通过两个基因组DNA样本和混和的多个引子对被置入以各种触减热循环条件，执行的扩增反应步骤中，调整出最佳化的粘合温度。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征是：它更包括一设计该引子的步骤，以具备一融解温度在一范围内，供一数量的链聚合酶连锁反应产物的扩增。
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EP4001427A1 (en) 2012-04-24 2022-05-25 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
PL3539666T3 (pl) * 2012-05-24 2022-01-31 University Of Utah Research Foundation Urządzenie do ekstremalnej pcr
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