CN1850278A - 聚乙二醇修饰的重组人b淋巴细胞刺激因子及其制备方法 - Google Patents
聚乙二醇修饰的重组人b淋巴细胞刺激因子及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1850278A CN1850278A CN 200610023962 CN200610023962A CN1850278A CN 1850278 A CN1850278 A CN 1850278A CN 200610023962 CN200610023962 CN 200610023962 CN 200610023962 A CN200610023962 A CN 200610023962A CN 1850278 A CN1850278 A CN 1850278A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rhblys
- mpeg
- modified
- polyethyleneglycol
- phosphate buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子及其制备方法。采用本发明的方法获得的聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子,具有如上的结构。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组人B淋巴细胞刺激因子的聚乙二醇结合物及其制备方法。
背景技术
随着蛋白质和多肽类药物日益广泛的应用,人们对此类药物的安全性和有效性也日趋关注。该类药物主要通过降解、排泄、受体介导的内吞等作用在体内被清除,其中分子量小于20kDa的多肽在代谢过程中易由肾小球滤过,在通过肾小球时又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出,因而半寿期短。同时,外源性的此类药物又往往存在抗原位点,导致用药者产生不同程度的免疫反应。
聚乙二醇(简称PEG,下同)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物,具有无毒、无免疫原性、微弱的抗原性、较高的柔软性、很低的肾脏排除分子量和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质,可以增加蛋白质的半寿期和减小其抗原性,增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski,Davis等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来,PEG修饰技术在生物医学和生物技术领域得到了广泛的应用,已有数百种蛋白质用这种方法进行了修饰。经过近三十年的发展,蛋白质和多肽的聚乙二醇修饰技术已成为蛋白质和多肽类药物提高循环半寿期与稳定性、降低免疫原性的有效手段。
B淋巴细胞刺激因子(B-lymphocyte stimulator,BLyS;TNF homologuethat activates apoptosis,NF-κB and JNK,THANK;TNF-and apoptosis ligand-ralated leukocyte-expressed ligand 1,TALL-1;B cell activating factor belongingto the TNF family,BAFF)是TNF家族的一个新成员,1999年首先由AsokMukhopadhyag等人克隆成功。BLyS作为新的肿瘤坏死因子超家族成员,它具有TNF的活性,能抑制肿瘤细胞系的生长,可激活caspase-3引起细胞凋亡;能与B淋巴细胞特异结合并诱导其增殖、分化及存活延长,并大量分泌IgG、IgA和IgM等免疫球蛋白,在体液免疫反应中发挥着重要作用。另外还发现其参与了T细胞的活化与应答。由于BLyS对常伴有免疫缺陷或低下的病人有巨大的治疗前景,所以自发现以来受到众多基因工程药物研究者的广泛关注。2000年11月,美国FDA已正式批准人BLyS进入人体临床试验,治疗可变性免疫缺陷症(CVID)。同时,目前的研究表明,其在体内的循环半寿期仅为160分钟,不能满足临床治疗的需要。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子及其制备方法,以克服现有技术存在的上述缺陷,满足临床治疗的需要。
本发明的聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子的结构为一条或一条以上的单甲氧基聚乙二醇通过酰胺键的形式共价结合在人B淋巴细胞刺激因子上,具有如下的结构:
其中n为110~680的整数,m为≥1的整数,且不超过rhBLyS中可结合的氨基的数目,优选的m=1~10;
其中:rhBLyS为重组人B淋巴细胞刺激因子;
所述的聚乙二醇单链分子量为5000~30000Da。
所修饰的BLyS片断的氨基酸序列为aa134~285。
优选的聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子为:
单链修饰的mPEG5000-rhBLyS、
单链修饰的mPEG12000-rhBLyS、
单链修饰的mPEG20000-rhBLyS、
双链修饰的mPEG5000-rhBLyS或多链修饰的mPEG5000-rhBLyS;
本发明的聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子的制备方法包括如下步骤:
1.将rhBLyS溶解于缓冲溶液,调整至0.3~0.7mg/ml,优选0.5mg/ml,pH为3.0~9.0,所说的缓冲溶液选自磷酸盐或醋酸盐缓冲液体系;
2.按mPEG∶rhBLyS=0.5~10∶1的重量之比加入活化后的mPEG,于4~25℃下反应2小时,mPEG的加入比例优选为3~5∶1;
所说的活化的mPEG是采用USP 5,122,614公开的方法进行制备的,mPEG的活化形式为mPEG-NHS酯;
3.向反应体系中加入浓度为1~3mol/L的甘氨酸以终止反应;
4.将反应混合物pH调至5.5~8.0,优选pH7.0,然后上阴离子交换柱(DEAE),并用pH为5.0~8.0的磷酸盐缓冲液洗去未结合的游离修饰剂;再用含0.1~0.2mol/L的NaCl的pH为5.0~8.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集得到未修饰的rhBLyS及其与mPEG的结合物的混合组分;
所说的阴离子交换柱(DEAE)为一种Amersham公司生产的DEAESepharose Fast Flow弱阴离子交换柱;
5.将上述收集所得的组分上凝胶柱(Sephacryl S200)分离,用含0.1~0.2mol/L的NaCl的pH为5.0~8.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集得到rhBLyS与mPEG的结合物;
所说的凝胶柱(Sephacryl S200)为一种Amersham公司生产的烯丙基葡聚糖凝胶。
采用本发明的方法获得的聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子,不仅在体内的循环半寿期明显高于现有技术,而且制备方法简单,能够满足临床治疗的需要。
附图说明
图1为纯化后的各种mPEG-rhBLyS,其中:
泳道1为rhBLyS;
泳道2为单链修饰mPEG5000-rhBLyS;
泳道3为单链修饰mPEG12000-rhBLyS;
泳道4为多链修饰mPEG5000-rhBLyS。
图2为MTT法检测mPEG-rhBLyS细胞活力的结果。
具体实施方式
实施例1.mPEG5000-rhBLyS的制备
将rhBLyS溶液调整至0.5mg/ml,pH4.0,醋酸盐缓冲液体系。向2ml这样的蛋白溶液里加入3.0mg活化后的mPEG5000,于20℃下反应2小时,再加入两滴2mol/L的甘氨酸以终止反应。
将反应混合物pH调至7.0,然后上阴离子交换柱(DEAE),并用pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡,以洗去未结合的游离修饰剂;再用含0.15mol/L的NaCl的pH7.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集得到未修饰的rhBLyS及mPEG5000-rhBLyS的混合组分。
实施例2.mPEG20000-rhBLyS的制备
将rhBLyS溶液调整至0.5mg/ml,pH7.5,磷酸盐缓冲液体系。向2ml这样的蛋白溶液里加入5.0mg活化后的mPEG20000,于20℃下反应2小时,再加入两滴2mol/L的甘氨酸以终止反应。
将反应混合物pH调至7.0,然后上阴离子交换柱(DEAE),并用pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡,以洗去未结合的游离修饰剂;再用含0.15mol/L的NaCl的pH7.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集得到未修饰的rhBLyS及mPEG20000-rhBLyS的混合组分。
实施例3.单链修饰mPEG12000-rhBLyS的分离
将rhBLyS溶液调整至0.5mg/ml,pH6.5,磷酸盐缓冲液体系。向2ml这样的蛋白溶液里加入3.5mg活化后的mPEG12000,于20℃下反应2小时,再加入两滴2mol/L的甘氨酸以终止反应。
将反应混合物pH调至7.0,然后上阴离子交换柱(DEAE),并用pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡,以洗去未结合的游离修饰剂;再用含0.15mol/L的NaCl的pH7.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集得到未修饰的rhBLyS及mPEG12000-rhBLyS的混合组分。
将上述收集所得的混合组分上凝胶柱(Sephacryl S200)分离,用含0.15mol/L的NaCl的pH7.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集单链修饰的mPEG 12000-rhBLyS组分。
结果由SDS-PAGE电泳证实。见图1。
实施例4.单链修饰mPEG5000-rhBLyS的分离
将rhBLyS溶液调整至0.5mg/ml,pH8.0,磷酸盐缓冲液体系。向2ml这样的蛋白溶液里加入1.0mg活化后的mPEG5000,于20℃下反应2小时,再加入两滴2mol/L的甘氨酸以终止反应。
将反应混合物pH调至7.0,然后上阴离子交换柱(DEAE),并用pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡,以洗去未结合的游离修饰剂;再用含0.15mol/L的NaCl的pH7.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集得到未修饰的rhBLyS及mPEG5000-rhBLyS的混合组分。
将上述收集所得的混合组分上凝胶柱(Sephacryl S200)分离,用含0.15mol/L的NaCl的pH7.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集单链修饰的mPEG5000-rhBLyS组分。
结果由SDS-PAGE电泳证实。见图1。
实施例5.多链修饰mPEG5000-rhBLyS的分离
将rhBLyS溶液调整至0.5mg/ml,pH7.0,磷酸盐缓冲液体系。向2ml这样的蛋白溶液里加入1.5mg活化后的mPEG5000,于20℃下反应2小时,再加入两滴2mol/L的甘氨酸以终止反应。
将反应混合物pH调至7.0,然后上阴离子交换柱(DEAE),并用pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡,以洗去未结合的游离修饰剂;再用含0.15mol/L的NaCl的pH7.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集得到未修饰的rhBLyS及mPEG5000-rhBLyS的混合组分。
将上述收集所得的混合组分上凝胶柱(Sephacryl S200)分离,用含0.15mol/L的NaCl的pH7.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集多链修饰的Multi-mPEG5000-rhBLyS混合组分。
结果由SDS-PAGE电泳证实。见图1。
实施例6.mPEG-rhBLyS结合物的细胞活力测定
利用从人外周血中提取的B淋巴细胞进行,检测指标为药物对B淋巴细胞的刺激增殖作用,检测方法为MTT法,如下:
将分离所得的B淋巴细胞用含10%小牛血清的细胞培养液配成106cell/ml的悬液,向96孔板中以105cell/孔的量铺板,并向除对照外的各孔内加入1μg Anti-IgM以激活细胞,并加入一定量的药物。对照各孔加PBS使整板各孔体积相同。37℃培养72小时后,加入10μl 5mg/ml的MTT,再于37℃培养4小时,吸出培养液后,各孔加100μl DMSO,充分振荡后于550nm下比色。
结果见图2。
图中:
1为cell+PBS;
2为cell+Multi-mPEG-rhBLyS(相当于0.5μg rhBLyS);
3为cell+Anti-IgM;
4为cell+Anti-IgM+Multi-mPEG-rhBLyS(相当于0.5μg rhBLyS)。
Claims (8)
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子,其特征在于,m=1~10。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子,其特征在于,所修饰的BLyS片断的氨基酸序列为aa134~285。
4.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子,其特征在于,聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子为:
单链修饰的mPEG5000-rhBLyS、
单链修饰的mPEG12000-rhBLyS、
单链修饰的mPEG20000-rhBLyS、
双链修饰的mPEG5000-rhBLyS或多链修饰的mPEG5000-rhBLyS。
5.制备权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人B淋巴细胞刺激因子的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将rhBLyS溶解于缓冲溶液,调整至0.3~0.7mg/ml,pH为3.0~9.0;
(2)按mPEG∶rhBLyS=0.5~10∶1的重量之比加入活化后的mPEG,于4~25℃下反应2小时;
(3)向反应体系中加入甘氨酸以终止反应;
(4)将反应混合物pH调至5.5~8.0,然后上阴离子交换柱(DEAE),并用pH为5.0~8.0的磷酸盐缓冲液洗去未结合的游离修饰剂;再用含0.1~0.2mol/L的NaCl的pH为5.0~8.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集得到未修饰的rhBLyS及其与mPEG的结合物的混合组分;
(5)将上述收集所得的组分上凝胶柱(Sephacryl S200)分离,用含0.1~0.2mol/L的NaCl的pH为5.0~8.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集得到rhBLyS与mPEG的结合物。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所说的缓冲溶液选自磷酸盐或醋酸盐缓冲液体系。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,mPEG的活化形式为mPEG-NHS酯。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,mPEG的加入比例为3~5∶1。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200610023962 CN1850278A (zh) | 2006-02-17 | 2006-02-17 | 聚乙二醇修饰的重组人b淋巴细胞刺激因子及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200610023962 CN1850278A (zh) | 2006-02-17 | 2006-02-17 | 聚乙二醇修饰的重组人b淋巴细胞刺激因子及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1850278A true CN1850278A (zh) | 2006-10-25 |
Family
ID=37131789
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200610023962 Pending CN1850278A (zh) | 2006-02-17 | 2006-02-17 | 聚乙二醇修饰的重组人b淋巴细胞刺激因子及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1850278A (zh) |
-
2006
- 2006-02-17 CN CN 200610023962 patent/CN1850278A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1088721C (zh) | 干扰素结合物 | |
CN1039015C (zh) | 聚乙二醇-干扰素结合物 | |
CA2312976C (en) | Compositions comprising histidine-linked protein polymer conjugates | |
TW570802B (en) | Improved interferon polymer conjugates | |
CN1187094C (zh) | 多元醇干扰素β偶联物 | |
CN1376164A (zh) | Gcsf缀合物 | |
CN102234310B (zh) | 一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法 | |
CN101198357A (zh) | 人粒细胞集落刺激因子异构体 | |
CN102617736A (zh) | 由一种位置异构体表示的稳定的干扰素α聚乙二醇缀合物 | |
CN101687934B (zh) | 聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物和其制备方法与用途 | |
CN1298734C (zh) | 一种聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法 | |
CN1254496C (zh) | 制备分枝型聚乙二醇的方法 | |
CN1850278A (zh) | 聚乙二醇修饰的重组人b淋巴细胞刺激因子及其制备方法 | |
CN1252254C (zh) | 聚乙二醇修饰的降纤酶 | |
CN1289528C (zh) | 一种重组人干扰素-α1b复合物及其制备方法 | |
CN1871257A (zh) | 干扰素-β复合物 | |
CN1375502A (zh) | 聚乙二醇修饰重组人干扰素 | |
CN1338463A (zh) | 一种增强多肽在体内稳定性的方法及其应用 | |
CN102229667A (zh) | 一种聚乙二醇修饰的猪α-干扰素及其制备方法和应用 | |
CN1477126A (zh) | 长效生长激素及药物组合物 | |
CN1314708C (zh) | 一种人α1-胸腺肽的复合物及其制备方法 | |
CN1305527C (zh) | 乙型肝炎治疗疫苗及其制备方法 | |
CN1457879A (zh) | 脑膜炎球菌疫苗及其制备方法 | |
CN101711876A (zh) | 一种聚乙二醇修饰的重组人粒细胞集落刺激因子及其制备方法 | |
CN1544468A (zh) | 以酰胺键连接的聚乙二醇-干扰素及其制法和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |