CN1842706A - 亚细胞组分的分离和积累和从其得到的蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过从生物样品分离和积累亚细胞细胞器进行蛋白质组分级分离的方法,通过所述方法亚细胞细胞器高度富集、基本上纯并且良好地保留细胞完整性和功能。本发明的方法提供了如此方式,通过其减小蛋白质组的复杂性和方便检测和分离难以研究的蛋白质,如低丰度蛋白质。通过使用连续流动超速离心从生物样品平行分开和分离亚细胞细胞器预先分级分离生物样品的蛋白质组的本发明方法可以通过调节超速离心参数,如转子速度、转子大小和转子几何形状可以容易而有效地缩放。
Description
相关申请/专利和引入的参考文献
本申请要求2003年3月19日提交的美国临时申请号60/455,767和2003年12月19日提交的美国申请序号10/741,313的优先权。参考2001年11月27日提交的美国申请序号09/995,054。
本文中所应用的每个申请和专利,以及每个申请和专利中引用的每篇文献或参考(包括每个公开专利的执行期间;“申请引用的文献”),和相应于这些申请和专利和/或要求它们的优先权的每个PCT和国外申请或专利,和每个申请引用的文献中引用或参考的每篇文献都特意引用作为参考。更一般地,本文中应用的文献或参考文献,这些文献或参考文献的每一篇(“文中引用的参考文献”),以及每个文中引用的参考文献中应用的每篇文献或参考文献(包括生产商的说明书、用法说明,等等)都特意地引用作为本文的参考。
发明领域
本发明一般涉及蛋白质组学领域和可以使用亚细胞蛋白质组的领域。更具体地,本发明涉及分级分离生物样品的蛋白质组以实现改进地检测和分析含有所述蛋白质组的蛋白质,尤其检测和分析低丰度蛋白质。另一方面,本发明涉及通过连续流动超速离心从任意生物样品平行分开和分离不同类型的亚细胞细胞器。此外,本发明的方法提供了纯化、富集、积累和整合分离的亚细胞细胞器和其中所含的蛋白质,从而提供研究和分析亚细胞蛋白质,尤其低丰度蛋白质的增强策略。
背景
蛋白质组学试图通过细胞和/或组织中每种蛋白质的功能、亚细胞或细胞外定位、相互作用、活性和量的详细知识和理解来理解生物现象——例如,疾病、细胞分化、生长周期和进化。这种理解将极大地推动例如,疾病的诊断、治疗和预防的发展。蛋白质组学可用于例如,药物发现、预临床和临床研究、临床诊断、兽医医学、法医、农业化学和生物治疗学。
然而,与基因组学领域相比,蛋白质组学被认为具有显著更高的复杂性水平。该复杂性来自于蛋白质含量、定位、翻译后修饰和蛋白质-蛋白质相互作用通常随时间的动态改变。这些改变在个体、组织、细胞和细胞器之间不同并且对例如生长、分化、衰老、环境改变和疾病响应而产生这些改变。
当前,还没有一种策略可以足够处理蛋白质组组织的所有水平。此外,监测动态蛋白质组改变(如蛋白质定位)需要用于在细胞器水平进行蛋白质组分析的特定技术。
亚细胞分级分离技术通常是细胞生物学和生物化学中用于分离和表征细胞器的关键方法(Bonifacino等人,(2000),Supplement 3-6,John Wiley & Sons,Inc.,NY)。这些方法利用多种分离技术,如密度梯度离心、自由流动电泳和配体亲和层析。在多数情况中,对从不同来源制备的单一靶定的细胞器优化亚细胞细胞器的制备。除了分离靶定的细胞器,制备的剩余物通常认为是残渣并丢弃。
分离靶定的细胞器的一个实例在Price等人((1973),Analytical Biochemistry 54:239-246)中描述,其中作者描述了在硅胶梯度中通过CF-6转子中连续流动分区离心从菠菜brie分离和分开完整的叶绿体。作者报导发现了叶绿体,该发现经过相差显微术和每单位叶绿素物质的叶绿体特定蛋白质的浓度的证实。在另一实例中,Cline和Dagg((1978)Methodological Developments inBiochemistry,Longman,p.61-70)报导使用连续样品流动方法利用等密度分带分区转子如J-1和RK-II从其他植物细胞组分分离叶绿体。
关于在亚细胞水平监测蛋白质组中的动态改变的其他报导在下面提到的文献中描述。
Dreger等人,((2003),Mass.Spec.,22:27-56)报导在细胞器水平上监测动态蛋白质组改变,例如,蛋白质转运事件,是特别困难的任务,因为多数分级分离技术都设计成富集单一类型的细胞器。作者报导本领域需要开发新的细胞分级分离技术以平行监测至少两种类型的细胞器以便为本领域技术人员提供对细胞器特异的蛋白质转运的阐明。
Dreger等人,((2003)Eur.J.Biochem.,270:589-599)等人报导需要改进监测蛋白质转运事件的技术,因为几种蛋白质可能仅在某些生理状态下与某些亚细胞结构有关。尽管作者陈述可能分离主要细胞级分,例如,胞质和核质级分,作者报导这些研究为本领域技术人员提供了关于动态蛋白质组改变的有限信息,因为这些研究不富集细胞器,结果不能阐明细胞器特异的蛋白质转运。
此外,Gerner等人,((2000)J.Biol.Chem.275:39018-39026)分析了Fa s诱导的程序性细胞死亡对TCP-1A蛋白质的细胞定位的影响。然而,该研究没有为本领域技术人员提供关于胞质溶胶中哪种特定细胞器已经获得的TCP-1A蛋白质的信息。获得该信息将可以用于设计针对阻断或增强特定蛋白质转运事件的特定治疗剂。
类似研究由Huber等人((2003)Ciculation Research,92:962-968)综述。在最近的2003年综述中,作者指出本领域现状允许通过差别离心将细胞分级分离成三种主要组分,如胞质溶胶、细胞核和细胞膜。类似于Gerner等人的文章,这些研究没有提供关于细胞器特异的蛋白质转运的动态改变。
当前,本领域仍然需要开发亚细胞分级分离技术,其中至少两种细胞器可以同时富集、积累和分离而保持高纯度和完整性,从而增加蛋白质,例如,低丰度蛋白质的检测阈值。本领域还需要开发分级分离技术,借此亚细胞细胞器的亚型可以以不同量积累和分离并且定性分辨,从而可以确定亚细胞细胞器亚型的蛋白质组谱。
发明概述
本发明的一方面涉及从样品,优选从生物样品分离和积累细胞器,如亚细胞细胞器。通过例如,连续流动方法进行分级分离,从而进行细胞器的分离和积累。连续流动方法又利用了离心力,如通过离心产生离心力。在一个实施方案中,用连续流动超速离心分离和积累细胞器。然而,将理解可以使用其他连续流动方法并且本发明不限于使用超速离心。将细胞器的成分分级分离。例如,可以裂解细胞器并从中释放蛋白质组。蛋白质组的蛋白质和肽可以通过例如,层析、电泳、连续流动离心或者本领域公知的其他技术分离。分离的蛋白质和肽可以通过许多技术如质谱法进行表征和定量分析。之后,如果可能,可以鉴定和表征蛋白质并将其用于下游应用。
更特别地,分离和积累的亚细胞细胞器,和分离和积累的低丰度蛋白质可以用于下游应用中。此类应用包括,例如,出售亚细胞细胞器和/或低丰度蛋白质,出租亚细胞细胞器和/或低丰度蛋白质,许可亚细胞细胞器和/或低丰度蛋白质、保护亚细胞细胞器和/或低丰度蛋白质中的知识产权利益和将关于亚细胞细胞器和/或低丰度蛋白质的信息存入数据库,可以任选将该数据库提供给第三方。
在该背景下,并且根据本发明的一个实施方案,提供了从含有细胞器的样品富集和积累细胞器的方法,该方法包括步骤:a)从样品释放细胞器;b)将细胞器导入连续流动离心机内的密度梯度;c)应用足够至少两种类型的细胞器迁移到密度梯度内的离心力;和d)从密度梯度收集所述至少两种类型的细胞器以便利用所述至少两种类型亚细胞细胞器。
在本发明的另一实施方案中,提供了用于从细胞器积累低丰度蛋白质的方法,该方法具有步骤a)从含有细胞器的样品释放细胞器;b)将细胞器导入连续流动离心机内的密度梯度;c)应用离心力从而细胞器在密度梯度内富集和积累;和d)从密度梯度收集细胞器;e)裂解细胞器以形成蛋白质组;和f)从蛋白质组收集低丰度蛋白质。
在本发明的另一实施方案中,提供了从含有至少两种类型细胞器的生物样品分离所述至少两种类型细胞器的方法,该方法具有步骤:a)从样品以匀浆物释放所述至少两种类型的亚细胞细胞器;b)在密度梯度内连续流动匀浆物并应用一定量的离心力以足够所述至少两种类型的细胞器的每一种都进入密度梯度并迁移到密度梯度的某个位置从而梯度的密度和每种各自细胞器的浮力密度基本上相等;和c)从密度梯度分离所述至少两种类型的细胞器。
在本发明的另一实施方案中,从生物样品富集和积累至少两种类型细胞器的方法具有步骤:a)从组织或细胞材料获得生物样品;b)匀浆组织材料或裂解细胞材料以形成细胞器匀浆物;c)将所述细胞器匀浆物进料到具有密度梯度的连续流动超速离心机;d)应用离心力从而至少两种类型的细胞器在密度梯度内迁移和积累;和e)从密度梯度收集至少两种类型的细胞器以便利用至少两种类型的细胞器。
在本发明的再一个实施方案中,提供了从亚细胞细胞器积累低丰度蛋白质的方法,该方法具有步骤:a)从含有亚细胞细胞器的样品释放亚细胞细胞器;b)向连续流动离心机内的密度梯度导入亚细胞细胞器;c)应用离心力使得亚细胞细胞器在密度梯度内迁移和积累;d)从密度梯度收集亚细胞细胞器;e)裂解亚细胞细胞器以形成蛋白质组悬浮液;f)从蛋白质组悬浮液收集低丰度蛋白质;和g)以一种方法中利用所述低丰度蛋白质,所述方法选自出售低丰度蛋白质,出租低丰度蛋白质,许可低丰度蛋白质,保护低丰度蛋白质中的知识产权利益,将关于所述低丰度蛋白质的信息存入数据库和察看数据库中关于该低丰度蛋白质的信息。
在本发明的另一实施方案中,提供了从含有亚细胞细胞器的生物样品纯化和积累所述亚细胞细胞器的方法,该方法具有步骤:a)将所述生物样品导入离心机,所述离心机含有适于分成离散的层的密度梯度溶液,每个所述层具有容积;和b)以连续模式离心所述生物样品以在所述密度梯度溶液中所述离散的层中产生所述积累和纯化的亚细胞细胞器,其中所述至少两种类型的亚细胞细胞器的每一种在所述密度梯度溶液内的分开的离散层中迁移,其中所述至少两种类型的亚细胞细胞器在所述至少两个离散层的容积的浓度或略低此浓度处积累,并且其中所述至少两种积累的亚细胞细胞器是基本上完整的。
在本发明的再一个实施方案中,提供了积累亚细胞细胞器的方法,该方法具有步骤:使用连续流动超速离心机从生物样品以足够产率和纯度获得所述亚细胞细胞器以便分离和检测其中的低丰度蛋白质。
在本发明的另一实施方案中,提供了积累至少两种不同类型的亚细胞细胞器的方法,其具有步骤:使用连续流动超速离心机从生物样品以足够产率和纯度获得所述至少两种不同类型的亚细胞细胞器以便分离和检测其中的低丰度蛋白质。
在本发明的另一实施方案中,提供了分析作为时间的函数的至少两种类型的亚细胞细胞器的蛋白质组谱的方法,该方法具有步骤:a)在第一时间从生物样品释放所述至少两种类型的亚细胞细胞器;b)将至少两种类型的亚细胞细胞器导入连续流动超速离心机内的密度梯度;c)应用离心力使得至少两种类型的亚细胞细胞器在密度梯度内迁移;d)从密度梯度收集至少两种类型的亚细胞细胞器;e)从所述至少两种类型的亚细胞细胞器分离和纯化蛋白质以确定所述第一时间的所述至少两种类型的亚细胞细胞器的蛋白质组谱;f)在第二时间从第二种生物样品释放至少两种类型的亚细胞细胞器;g)重复步骤b)到d);h)从所述至少两种类型的亚细胞细胞器分离和纯化蛋白质以确定在第二时间的所述至少两种类型的亚细胞细胞器的蛋白质组谱;和i)分析所述第一和第二时间的蛋白质组谱以检测作为时间的函数的所述蛋白质组谱中的改变。
在本发明的其他实施方案中,提供了分析生物样品的转运蛋白质的转运过程的方法,所述转运过程涉及作为时间的函数,转运蛋白质从所述生物样品的第一种细胞器向第二种细胞器的细胞内移动,所述时间的函数具有至少两个时间点,所述方法具有步骤:(a)测定所述第一种生物样品中所述第一种和第二种细胞器中所述转运蛋白质的相对量,所述第一种生物样品在第一个时间点分离,包括步骤:在足够将所述第一种和第二种细胞器释放到匀浆物的条件下匀浆所述第一种生物样品,所述第一种和第二种细胞器每一种均含有亚细胞蛋白质组,将所述匀浆物导入连续流动超速离心机内的密度梯度,对所述匀浆物应用离心力从而所述第一种和第二种细胞器在密度梯度内迁移,从所述密度梯度除去所述第一种和第二种细胞器,溶剂第一种和第二种细胞器的亚细胞蛋白质组,检测第一种生物样品的第一种和第二种细胞器中的所述转运蛋白质,测量第一种生物样品中第一种和第二种细胞器中所检测的转运蛋白质的水平,确定第二种生物样品中第一种和第二种细胞器中的转运蛋白质的相对量,所述第二种生物样品在第二时间点分离并重复上面的步骤;和通过比较在每个所述时间点分离的每种所述生物样品的第一和第二种细胞器中所检测的转运蛋白质的测量水平分析所述作为时间的函数的所述转运蛋白质的所述转运过程。
在本发明的再一个实施方案中,提供了从亚细胞细胞器和其亚型获得蛋白质的方法,其具有步骤:a)从生物样品释放亚细胞细胞器和其亚型;b)将亚细胞细胞器和其亚型导入连续流动超速离心机中的密度梯度;c)应用离心力使得亚细胞细胞器和其亚型在单次运行中迁移和积累在密度梯度中;和d)从密度梯度收集亚细胞细胞器和其亚型并从中获得蛋白质。
在下面的本发明详细描述中提供可本发明的这些和其他实施方案或者根据本发明的实施方案,这些和其他实施方案是显而易见的。
附图简述
给出下面的详细描述作为实例,但是不限制本文描述的特定实施方案,该详细描述可以结合附图更好地理解,附图中:
图1是流程图,其描绘了本发明的一个实施方案中分离和积累细胞器的方法。
图2是流程图,其描绘了蛋白质表征和定量的方法。
图3描绘了大鼠肝脏级分中线粒体、内质网、高尔基体和质膜的百分数。
图4描绘了大鼠肝脏级分中收集的线粒体、内质网、高尔基体和质膜的富集。
图5描绘了如下制备物的百分数(%)完整性:(1)内质网(76.3%),(2)线粒体(72.6%),(3)高尔基体(89.3),和(4)质膜(72.7)。
图6描绘了电子透射显微照片,其比较通过本发明方法制备的大鼠肝细胞的粗提物样品和内质网级分的细胞器含量和超微结构。
图7描绘了对HeLa细胞收集的级分中线粒体、内质网、高尔基体和质膜的百分数。
图8描绘了对HeLa细胞收集的级分中线粒体、内质网、高尔基体和质膜的富集。
图9描绘了通过本发明方法富集的特定细胞器的水平。
图10描绘了图7中显示的每种级分的定量信号。
图11描绘了匀浆和离心的HeLa细胞的收集的离心后级分的蔗糖含量百分数。
图12描绘了对粗提(CE)样品和内质网(ER)级分的2D凝胶电泳分析的比较。
图13描绘了HeLa细胞粗提物、高尔基体级分和质膜级分的2D凝胶电泳分析的结果。
图14描绘了图13的点12、13和14的质谱数据。
图15显示了大鼠肝细胞粗提物和内质网级分的2D凝胶电泳分析。
图16显示了大鼠肝细胞粗提物和线粒体级分的2D凝胶电泳分析。
图17显示了大鼠肝细胞粗提物和高尔基体级分的2D凝胶电泳分析。
图18显示了大鼠肝细胞粗提物和质膜级分的2D凝胶电泳分析。
图19显示了将属于本发明方法的信息提供给第三方的流程图。
图20显示了保护本发明方法产生的知识产权的流程图。
图21A和21B显示了使用从本发明方法获得的肽序列进行同源性检索的方法。
图22A和22B显示了相对于蛋白质拷贝数,使用2D凝胶分析的蛋白质检测限和达到蛋白质检测限所需的生物材料的估计量。图22A和22B分别涉及细胞和组织。
下面的发明详述公开或者显然可以获得和包括这些和其他实施方案。
发明详述
如图1和2中所见到的,本发明的实施方案包括以组织或细胞的形式获得生物样品;匀浆组织和/或裂解细胞以提供匀浆物;任选澄清以除去某些物质,如细胞核;将匀浆物进料到其中具有密度梯度的连续流动超速离心机;对匀浆物应用离心力以分离和积累完整细胞器;收集细胞器;和在进一步的下游过程中使用细胞器。一种该下游过程包括通过裂解细胞器以释放蛋白质组从细胞器获得低丰度蛋白质;从中分离和积累低丰度蛋白质;表征、定量和如果可能,鉴定所述低丰度蛋白质;和在进一步下游过程中使用低丰度蛋白质。
获得样品。如图1中所见,本发明的方法可应用于本领域技术人员公知的任意生物样品,或者使用本领域技术人员公知的任何方法从任意来源分离或获得的含有生物样品的任意样品。
对于本发明,“生物材料”,其可以与“生物样品”、“生物样本”或者“生物物质”,或者本领域技术人员公知的任何其他类似变化形式具有相同的意思,指本领域技术人员公知的任意类型的生物材料,包括,例如,完整细胞、细胞提取物、组织、匀浆细胞和组织、蛋白质溶液、亚细胞结构,如细胞器和细胞器亚型,或者本领域技术人员认为是生物材料的任何其他材料。生物材料可以是任意溶液、混合物、悬浮液、物质、缓冲液、等等,如非生物溶液,如含有加入其中的生物材料,如细胞器或者细胞器亚型的磷酸缓冲液。更具体地,本发明的生物材料可以从任意公知的活的或死的来源,如器官、体液、血液、血清、血浆、唾液、泪液、粪便、尿、精液、粘液、组织、组织匀浆物、细胞提取物或者脊髓液获得,来源于任意公知的生物体或者其部分或者病毒,包括,但不限于,例如,任意原核或真核生物;脊椎动物或无脊椎动物;或者任何生物体,例如,动物、哺乳动物、鸟、马、鱼、啮齿类、昆虫、或者植物等等,或者它们的组合。
在一个实施方案中,生物样品是细胞。根据本发明,“细胞”在普通生物学意义上指能够独立繁殖的最小的、膜包围体。在更广意义上,细胞可以是真核或原核的。此外,将理解可以从多细胞生物体、组织、细胞或组织培养物、细胞培养物中的病毒感染的细胞,或者从任意生物样品获得细胞。还将理解细胞,特别是真核细胞,含有亚细胞结构,包括,例如,细胞器和其他亚细胞结构。
“细胞器”和“亚细胞细胞器”在本发明中具有相同意思,按照本领域技术人员在普通生物学意义上理解。细胞器包括形成细胞的组分并且通常实施特征性功能的任何类型的复杂结构。本发明预计来自本领域技术人员公知的任何生物样品的任意细胞器,例如,线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、高尔基体、内质网、细胞核、蛋白酶体、核糖体、和其他的,包括任何公知的或未知的细胞器亚型,例如,平滑和粗糙线粒体、早期和晚期内质网,或者本领域技术人员将理解或可以发现的特定细胞器的任何亚型或者亚群。
根据本发明,细胞器“亚型”或者“亚群”可以指细胞中特定细胞器群体的子部分,其与相同群体的相同类型细胞器的其余部分以某种方式不同。例如细胞器亚型包括基于,例如,细胞器的总体大小和形状、细胞器密度、表达的特征性蛋白质群体的组成、细胞器膜的成分,或者技术人员将知道的任何其他生理或形态不同的差别。某些细胞器含有膜,其称作“细胞器膜”。
还理解细胞器具有例如,生物分子的特征集合,尤其蛋白质的特征集合,其组成细胞的全体蛋白质组的子集,该子集为细胞的完整蛋白质组的子集。与亚细胞结构相关的蛋白质的子集,例如,细胞器,或者形成细胞、组织或者基因组的完整蛋白质组的子集的那些蛋白质可以称作“亚细胞蛋白质组”。尤其对于细胞器,与细胞器特异性蛋白质相关的亚细胞蛋白质组——包含在细胞器膜内和/或直接或间接结合、整合或者附着细胞器膜的那些蛋白质——可以称作“细胞器蛋白质组”。细胞器亚型可以具有组成独特的蛋白质组,从而其可以与从含有包括该细胞器的剩余细胞器亚型的每一种的部分或全部组合形成的蛋白质组相区别。
本领域技术人员将理解通常认为术语“蛋白质组”是MacquarieUniversity(澳大利亚)的Marc Wilkins构造的,他将蛋白质组定义为“基因组、细胞或者组织表达的所有蛋白质”。例如,并且对于本发明,术语蛋白质组指整个蛋白质组并且包括基因组、细胞、组织或器官表达的所有蛋白质。同样,可以认为蛋白质组是基因组、细胞或组织表达的蛋白质的动态集合,其可以根据多种不同的因素而变,所述因素为例如细胞的生长和/或分化阶段、内部和外部环境因素、疾病因素,和技术人员公知的任何其他因素。
在一些情况中,将理解某些细胞器,例如,线粒体和叶绿体,含有它们自己的染色体,其可以表达与含有染色体的细胞器相关的某些蛋白质。然而,技术人员将理解组成细胞器蛋白质组的主要的蛋白质是由细胞的染色体表达并通过多种机制,例如,转运和囊泡递送运输到目的细胞器中。
对于本发明,术语“蛋白质组学”指建立生物、器官、组织、细胞外空间、细胞、细胞器或者它们的任意组合中所有蛋白质的包括身份、量、结构和生物化学和细胞功能的性质,以及这些性质是怎样在空间、时间和生理状态中改变的努力。还理解蛋白质组学通过表征蛋白质关于时间、空间和生理状态的许多定义性质和行为,例如,蛋白质表达谱、翻译后修饰、细胞内定位和蛋白质-蛋白质相互作用研究细胞过程的性质。蛋白质组学不仅包括鉴定和定量蛋白质,还包括确定它们的定位、修饰、相互作用、活性和最终地,它们的功能。
匀浆/裂解生物样品。再次参考图1,一旦获得生物样品,匀浆和/或裂解生物样品。匀浆步骤的产物通常称作匀浆物。匀浆物具有与本领域公知的相同的意思。从而,匀浆物是生物样品匀浆和/或裂解后的生物样品的形式。匀浆和/或裂解的方法在下文进一步解释。
用于匀浆和/或裂解的方法和材料通常是本领域公知的。根据本发明,术语“匀浆”可以指本领域技术人员用以实现组织破碎成更小或更均匀的组分,如细胞和含有该组织的细胞外材料的多种技术的任意一种。例如,组织的匀浆可以指将组织破碎成单个细胞从而细胞相互或者与其他细胞外材料分开和/或脱离。术语匀浆和/或裂解还可以指将细胞,例如组织的细胞破碎成它们的亚细胞组分的步骤。从而,根据本发明,匀浆的组织或匀浆的和/或裂解的细胞可以导致释放亚细胞组分,包括例如,细胞器。细胞内组分例如细胞器从细胞释放指细胞内组分不再受到细胞或者质膜的限制。
本领域普通技术人员将明白可以用多种方法实施组织和/或细胞的破碎。将理解裂解和/或破碎可以导致细胞膜的破碎从而释放细胞内组分,如细胞器。可以调节匀浆和/或裂解条件从而破坏细胞膜而使细胞器膜的破坏最小。调节这些条件以实现细胞膜裂解而细胞器膜裂解最小化的方法是公知的并且可以在例如Current Protocols in CellBiology(1999),编者J.S.Bonifacino等人和SubcellularFractionation:A Practical Approach,(1997),编者J.M.Graham等人中找到。
本发明考虑用于匀浆和/或裂解生物样品或者本领域普通技术人员将可以获得的任意技术,例如,任意基于化学、机械、压力或者温度的技术。例如,此类方法可以包括通过将细胞和/或组织通过注射器中含有小球和金属块的狭窄环带(“含有球的匀浆器”)应用液体剪切力;将细胞和/或组织强行高压通过小孔;在高压下将细胞和/或组织暴露于氮气然后强行通过针阀门,如注射器阀门;对细胞超声处理以破坏细胞膜;将细胞和/或组织与去污剂,例如,Tween-20或者十二烷基硫酸钠(“SDS”)接触;将细胞和/或组织与提供渗透压的溶液,例如,等渗介质、低渗介质,流入,0.1M蔗糖溶液接触;和应用剪切力,例如,将细胞和/或组织导入组织搅拌器(如WaringTM搅拌器,Waring Laboratory,CT);或者上面方法的任意组合或者本领域技术人员公知的任何其他额外的方法。
本领域技术人员将理解根据设计用于特定细胞和/或组织的技术或步骤可以对来自任何生物材料(例如,心脏、胰脏、腺体、肌肉、骨骼、肾脏、皮肤、肝脏、脑或者血液或者其他器官,和特定细胞来源,包括例如,组织培养细胞、细胞培养细胞,或者悬浮的任何细胞类型)的特定来源和/或类型的组织进行匀浆。例如,肝细胞可以具有设计用于匀浆或者裂解该具体细胞类型的匀浆方法。关于细胞和组织匀浆和/或细胞裂解的许多技术的信息可以见通过商业途径可获得的手册,例如,Sambrook J.等人,Molecular Cloning:a LaboratoryManual,第二版,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
术语“基本上完整的”指本发明方法的任意时间点亚细胞组分,特别是细胞器的相对完整性程度,所述时间点包括细胞器从匀浆和/或裂解后的细胞/或组织释放或者连续流动过程期间或之后,例如,连续流动离心过程,或者本发明方法的任意其他时间点。通过本领域技术人员公知的任意方法可以确定细胞器是否基本上完整,所述方法为例如通过细胞器特异标记的定量酶测定、细胞器特异标记的蛋白质印迹,或者通过使用显微术,例如透射电镜法(TEM)通过视觉检查。对于显微术的使用,技术人员将明白来自任意生物来源和/或细胞或组织类型的任意和所有类型细胞器的形态特征和特点并且将理解怎样基于特定形态特征判断给定细胞器是否完整。
在一个实施方案中,可以通过酶法测量细胞器完整性。例如,目标细胞器制备物,例如,根据本发明方法的线粒体的制备物,可以经离心以沉淀不可溶部分,其可以含有完整细胞器或者其部分,例如,细胞器片段。上清液含有从破碎的目的细胞器释放的任意可溶的组分,包括任意可溶的蛋白质和/或酶。然后,可以对细胞器沉淀和剩余的上清液级分测量细胞器特异标记,例如,给定目的细胞器的特定酶的相对水平或者量。将明白可以在测量或者检测细胞器特异标记之前裂解沉淀的细胞器。
本领域普通技术人员将明白不同的亚细胞细胞器将具有不同的“细胞器特异标记”,其可以用抗体检测、测定或探测以便确定具体细胞器的富集因子。例如,细胞色素c氧化酶和/或Tom20(18kDa)可以用于检测线粒体;β-氨基己糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶可以用于检测溶酶体;过氧化物酶可以用于检测内体;碱性磷酸二酯酶I和/或NaKATPase(150kDa)可以用于检测质膜;α-甘露糖苷酶II和/或GM130(130kDa)和/或P115(115kDa)可以用于检测高尔基体;过氧化氢酶可以用于检测过氧化物酶体;乳糖脱氢酶可用于检测胞质溶胶级分;RNA和/或BiP/GRP78(78kDa)可用于检测粗糙内质网。优选地,可以用针对线粒体特异的Tom20(18kDa)的抗体、针对内质网特异的BiP/GRP78(78kDa)的抗体、针对质膜特异的NaKATPase(150kDa)的抗体、针对高尔基体特异的GM130(130kDa)的抗体和针对高尔基体特异的P115(115kDa)的抗体,使用技术人员公知的任意适宜的方法,例如,蛋白质印迹和免疫印迹检测和定量本发明的离心生物样品的级分中特定细胞器。这些抗体可以从商业来源,例如,BDBIOSCIENCES(CA)、STRESSGEN(Victoria,BC加拿大)和从学术界获得。
从而,通过将细胞器制备物分离成可溶的(上清液)和不可溶(固体沉淀)级分,分析或检测两种级分中细胞器特异标记的存在,然后比较来自两种级分的相对水平或者量可以评估完整性。通常,将理解不可溶级分(与可溶级分比较)中所含细胞器特异标记的量的更高相对水平相应于更高程度的细胞器完整性。优选地,本发明考虑在细胞器裂解阶段之前本发明方法的任何阶段细胞器具有等于或大于约60%、70%、80%或90%以上的完整性。
在一个实施方案中,通过将对不可溶级分测量的细胞器特异标记的相对量除以两种级分中细胞器特异标记的相对量之和再乘以100得到完整性百分数(%)可以计算细胞器完整性。例如,可以将线粒体制备物离心形成线粒体沉淀(和线粒体片段,如受到破坏和/或裂解从而释放细胞器内可溶物质,如可溶性线粒体蛋白质,包括线粒体特异标记的那些线粒体)和含有所破坏的和/或裂解的细胞器的可溶组分的上清液。然后可以为可溶和不可溶级分测定线粒体特异蛋白质和/或酶(线粒体标记,如Tom20)的相对水平。然后可以通过将不可溶级分中线粒体标记的量除以不可溶和可溶级分中线粒体标记量的总和再乘以100得到反映含有完整线粒体的线粒体制备物的相对比例的百分数,可以计算完整性百分数。
技术人员将明白在匀浆过程中通常使用缓冲液。本发明考虑本领域技术人员公知的任意适宜的缓冲液,包括,例如,去污剂,如Triton-X、十二烷基硫酸钠(SDS)等等,盐,如氯化钠、蛋白酶,如蛋白酶K,DNA和RNA降解酶抑制剂,和适宜用于匀浆缓冲液中的任何其他额外的组分。技术人员将明白缓冲液的组成可以取决于生物样品的类型和/或来源。
任选澄清步骤。再次参考图1,生物样品的细胞和/或组织匀浆物通常经“澄清”以除去某些细胞内组分,如细胞核,其中所述匀浆物含有完整细胞器。细胞核通常阻碍样品中其组分如其他细胞器进入梯度。从而,可以在本发明的连续流动离心过程之前从样品除去细胞核。
本发明考虑适于除去细胞核的任意方法,包括,但不限于,离心。例如,为了使用离心机澄清匀浆物,可以使用本领域技术人员公知的任意离心机,如分批或者分析离心机,使用适宜的相对离心力(RCF)(×g),例如约500×g到约40,000×g。通过对匀浆物应用导致细胞核但不导致剩余细胞器向离心管的一个末端迁移,例如,向离心管的底部迁移的离心力可以用离心机分离例如,细胞核。在一个实施方案中,本领域公知的低速澄清离心机可以用于澄清匀浆物。低速澄清离心机可以是连续流动离心机。
离心机。如在图19中可以看到,一旦生物样品经匀浆和/或细胞受到裂解,从中得到的匀浆物和/或产物导入连续流动离心机内的密度梯度。
对于本发明,“连续流动离心机”是一种类型的离心机或者超速离心机,其转子具有入口和通常具有出口,其中生物材料可以通过入口导入转子,允许生物材料在转子中接触梯度,并且允许生物材料通过出口出去。连续流动离心机可以包括半连续流动离心机。
本发明考虑连续流动离心机和连续流动离心机转子的任何公知的结构。例如,连续流动转子可以具有一个入口或者一个入口和一个出口从而样品可以通过入口连续或间歇地导入并通过出口连续或间歇地释放。转子还可以具有入口而无出口,允许样品连续导入转子,但是不连续释放。当转子旋转时,梯度可以预形成或者预先建立。从出口释放的样品也可以是连续或间歇再循环的或者通过入口再导入转子以提供样品材料多次“通过”梯度。本发明考虑任意次数通过梯度以足以富集和积累细胞器。
还可以让转子连续旋转而在运行结束时从连续流动离心机的转子除去梯度。在其位置,可以将新鲜梯度材料加入到运动的转子。一旦在转子中建立了新的梯度,就可以将另一生物样品,如另一种生物样品的匀浆物导入转子并允许接触梯度。在该意思上——连续流动离心机如此运行使得其中含有在其中分离的第一种生物样品的第一种梯度在转子旋转时除去并用新鲜体积的梯度材料替换而转子继续旋转以分离第二种生物样品——称作“连续流动模式”。连续流动模式不限于加入和除去仅第一和第二个梯度,而是可以连续从离心机转子加入和除去任意数目的梯度以连续分离任意数目的生物样品而转子持续旋转,例如不用关闭或者停止离心机的转子。
本发明还考虑本发明的生物样品,如生物样品的匀浆物,可以以人工、自动或者半自动方式加载到连续流动离心机。例如,可以以适宜的方式使用模拟机器人系统,包括适宜的传感器或电子仪器,以实现生物样品自动或半自动加载到连续流动离心机的转子中。除了加载生物样品,还可以将梯度物质人工、自动或半自动方式加载到连续流动离心机的转子并可以使用任何适宜的模拟机器人、传感器、电子仪器或者计算机系统和/或用于控制和/或编程自动化或半自动系统的软件。
适宜的连续流动离心机的实例为Alfa Wassermann,Inc.(WestCaldwell,NJ)生产的那些,包括,但不限于,KII、PKII和RK。某些代表性转子模型包括,但不限于AW K3-3200、AW PK3-1600、AWPK3-800、AW PK3-400、AWPK3-200、和AW PK3-100。预计具有更大或更小体积的转子在本发明的范围内。
本发明可以使用其他连续流动离心机。这些连续流动离心机包括例如,Beckman CF32Ti、Beckman JCF-Z-standard core、BeckmanJCF-Z small pellet core、Beckman JCF-Z large pellet core、Beckman Z60、Sorvall SS34/KSB、Sorvall TZ-28/GK、Sorvall TCF-32(P32CT,具有940ml芯)、Sorvall TCF-32、和Hitachi生产的那些,例如,离心机CC40、CP40Y、C40CT2-H、C40CT和CP60Y。Hitachi离心机由Kendro经销。
在另一实施方案中,连续流动离心机是速率分区离心机。分区转子组件已经多年使用并且关于该主题由大量文献。关于分区转子的信息包括在多数纯化手册和生物化学教材中。具体信息可以见Anderson,An Introduction to Particle Separations in Zonal Centrifuges(National Cancer Institute Monograph No.21,1966);Anderson,Separation of Sub-Cellular Components and Viruses by CombinedRate and Isopycnic Zonal centrifugation(National CancerInstitute Monograph No.2191966);和Anderson,PreparativeZonal Centrifugation,in Methods of Biochemical Analysis(1967),将它们全部并入本文作为参考。
对于本发明,离心机“运行”指样品加入转子时(转子已经在运动并具有预先形成的梯度或者转子停止)直到样品被离心机处理(包括任何通过次数,例如,一次通过(无样品再循环)、两次通过(样品再循环一次)、三次通过(样品再循环2次)等)。可以进行通过,从而转子不停止或减慢。此外,样品还可以连续再循环任意时间。还考虑离心机运行可以以恒定或者可变速度进行。
在一个实施方案中,本发明所用的离心机运行可以是单次运行。例如,亚细胞细胞器和其亚型的迁移、分离和积累在一次离心机运行中进行。
通常,进行连续流动离心机运行的准备是通过人工、自动,例如,计算机或者人工形成和自动化联合形成的。优选地,用计算机和软件控制离心机和计算离心方案。此类计算机和软件为操作人员提供了“实时”显示在控制屏上的操作参数。自动化程序也可以从预先存储的文件,或者通过控制屏手动运行。
在一个实施方案中,在每次离心运行期间,产生监测和记录设置参数、运行参数和警报状态的在线数据并将它们下载到系统存储器中。此类下载也可以涉及外部数据存储位置。
计算机自动化、人工进行的或者两者的联合的分离方案通常包括操作许多变量。此类变量包括,例如,靶细胞器的物理特征;梯度的形成;和运行参数的计算。
用于定义分离方案的靶细胞器的物理特征包括,例如,靶细胞器的沉降系数(S20ω)和浮力密度。这些值可以用于例如,减小尝试和错误试验的次数(见,Rickwood等人,Centrifugation Essential Data,BIOS Scientific Publishers Limited 1994,Publisher J Wiley &Sons;Preparative Centrifugation:A Practical Approach,DRickwood编著,Oxford University Press 1921;和Methods inEnzymology,卷182:Guide to Protein Purification,Murray P编著.Deutscher,Academic Press 1990)。
分离方案还通常包括梯度的知识。梯度可以包括但不限于,密度梯度。密度梯度又可以是例如,连续梯度、不连续梯度或者分级梯度。梯度材料的选择取决于例如,产物、杂质稳定性和产物密度。常用的梯度材料包括本领域技术人员公知和可以通过商业途径得到或者由技术人员制备的任意适宜的梯度材料。梯度材料包括,但不限于:碱金属溶液,例如,氯化铯(CsCl)、硫酸铯(Cs2SO4)、酒石酸钾或者氯化钾;非电解质溶质,例如,蔗糖、甘露醇或者甘油;多糖,例如,Ficoll400(Pfizer,CT);碘化非电解质,例如,三碘苯甲酰氨基葡萄糖、Nycodenz(Nycomed,Inc.,NJ)、Iodixanol或者Optiprep;Percoll(用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶)(Pfizer,CT),或者本领域技术人员公知的任何其他适宜的材料。
将理解含有碱金属的梯度尽管具有腐蚀性,但是产生低粘度的高密度。例如,常用作梯度材料的氯化铯可以实现高密度,其通常高达约1.9g/cm3。在另一实例中,溴化钾也可以形成高密度,但是仅在更高温度,例如25℃下形成高密度。此类更高温度可能与目标蛋白质的稳定性不相容。
上面提到的梯度的实例还包括Nycodenz、Optiprep、Iodixanol和蔗糖。蔗糖是一种划算的梯度材料并对于多数操作利用足够的密度范围(高达例如,1.3g/cm3)。蔗糖梯度的粘度允许形成用于产物显带的陡梯度,或者备选地,在同一转子中产生宽的产物容量。如果例如非靶蛋白的进入将最小化时,陡梯度对于连续流动操作通常是有效的。由于在连续流动转子中长时间形成陡梯度,蔗糖的粘性也是希望的。相比,低粘度溶液,如CsCl可能需要加入更高粘度的材料,如甘油,以增加粘度和减小连续流动运行期间梯度腐蚀。
本发明考虑使用具有任意浓度谱的任意类型的梯度。“浓度谱”将被技术人员理解为沿着垂直于水平、垂直、对角或者它们之间的任意方向的梯度的路径上密度介质或者材料的浓度变化。同样,梯度可以是“线性梯度”、“凹梯度”或者“凸梯度“,或者“不连续梯度”,或者技术人员公知的任意其他适宜的形式。
蔗糖是优选的密度梯度材料。表1描述了使用蔗糖密度梯度分离经匀浆的生物样品中所含线粒体、内质网、质膜和高尔基体的理论分离要求。
表1.经匀浆的生物样品的理论分离要求
组分 | 量 | 蔗糖中显带* | 密度范围 | 分离条件 |
线粒体 | 16%细胞蛋白质16%细胞蛋白质 | 42.5% | 1.19g/cm31.17-1.21g/cm3 | 5,000×g,10分钟10,000×g 25分钟 |
内质网 | 5%细胞蛋白质24%细胞蛋白质 | 37%*** | 1.16g/cm3***1.06-1.23光滑1.18-1.23粗糙 | 100,000×g,120分钟150,000×g,50分钟 |
质膜 | 2%细胞蛋白质0.4-2.5%匀浆物 | 37% | 1.16g/cm31.12-1.14 | 80,000×g,60分钟**100,000×g,60分钟 |
高尔基体 | 1%细胞蛋白质 | 33到36%** | 1.14到1.15g/cm31.12-1.16 | 100,000×g,55分钟150,000×g,20分钟 |
*来源于使用蔗糖的密度数据表
**基于分级梯度
***基于类似于质膜的显带
如上所述和本文中定义的,连续流动离心机运行可以包括许多通过。例如,匀浆的生物样品可以两次通过本发明的连续流动离心机。第一次通过可以以20,000RPM在PK-3-800转子中使用20ml/分钟(1.2L/小时)的流速进行。同样,预期高于487 Svedberg(S)的材料进入梯度。对于第一次运行使用下面的参数:
G力芯 | 24,379×g |
转鼓 | 29,562×g |
K因子 | 121.94 |
沉淀时间 | 15.00分钟 |
过渡时间 | 20.00分钟 |
Svedberg值 | 487S |
第二次通过可以以40,000RPM进行。同样,预计超过122S的物质进入梯度。下面的参数可以用于第二次运行:
G力芯 | 97,515×g |
转鼓 | 118,250×g |
K因子 | 30.49 |
沉淀时间 | 15.00分钟 |
过渡时间 | 20.00分钟 |
Svedberg值 | 122S |
备选地,第二次通过可以以35,000RPM在PK-3-800转子中进行,使用20ml/min(1.2L/hr)的流速。同样,预计超过159S的物质进入梯度。对这种备选通过可以使用下面的参数:
G力芯 | 74,660×g |
转鼓 | 90,535×g |
K因子 | 39.82 |
沉淀时间 | 15.00分钟 |
过渡时间 | 20.00分钟 |
Svedberg值 | 159S |
用于实施以特定RPM值离心所用时间长度决定了特定物质是否将沉淀出来,其又通常取决于该物质的Svedberg值。例如,使用PK-3-800转子在35,000RPM下,超过53S的物质通常在45分钟内沉淀出来。对于120分钟,超过19.9S的物质通常沉淀出来。在两种情况中,在芯和转鼓的RCF值将分别为74,660×g和90.535×g。
基于如下所示的细胞器,例如,线粒体、质膜、内质网和高尔基体的公知的理论沉降范围,可以估计沉淀所需的时间。例如,线粒体、质膜、内质网和高尔基体的公知的沉降范围分别如下:10,000到50,000S;50到1,000S和100,000到500,000S;1到5,000S;和1,000到10,000S。
可以确定以不同速度沉淀出细胞器所需的时间。例如,基于PK-3-800转子中以20,000PRM和20ml/min样品流速的离心,沉淀下面组分的时间在下表中显示:
组分 | Svedberg常数 | 沉淀时间(分钟) | 捕获率 |
线粒体 | 10 000S | 0.73 | 100% |
线粒体 | 50 000S | 0.15 | 100% |
质膜 | 50S | 146.33 | 0% |
质膜 | 1 000S | 7.32 | 100% |
质膜 | 100 000S | 0.07 | 100% |
质膜 | 500 000S | 0.01 | 100% |
内质网 | 1S | 7316 | 0% |
内质网 | 5 000S | 1.46 | 100% |
高尔基体 | 1000S | 7.32 | 100% |
高尔基体 | 10 000S | 0.73 | 100% |
在35,000RPM下,在PK-3-800转子中以20ml/min的样品流速沉淀下面的组分所需时间如下:
组分 | Svedberg常数 | 沉淀时间(分钟) | 捕获率 |
质膜 | 50S | 224.29 | 0% |
内质网 | 1S | 11214 | 0% |
备选地,在40,000RPM下,在PK-3-800转子中以20ml/min的样品流速沉淀下面的组分所需时间如下:
组分 | Svedberg常数 | 沉淀时间(分钟) | 捕获率 |
质膜 | 50S | 36.58 | 0% |
内质网 | 1S | 1829 | 0% |
可以确定具有特定Svedberg常数的特定组分的显带时间。例如,可以基于35,000RPM下使用第一次通过45分钟和第二次通过120分钟在PK-3-800转子中离心进行预测,如下表所示。该表还显示了45分钟和120分钟后是否显带完成。
组分 | Svedberg常数 | 沉淀时间(分钟) | 显带完成45分钟/120分钟 |
线粒体 | 10 000S | 0.24 | 是/是 |
线粒体 | 50 000S | 0.05 | 是/是 |
质膜 | 50S | 47.78 | 否/是 |
质膜 | 1 000S | 2.39 | 是/是 |
质膜 | 100 000S | 0.02 | 是/是 |
质膜 | 500 000S | 0.005 | 是/是 |
内质网 | 1S | 2389 | 否/否 |
内质网 | 5 000S | 0.48 | 是/是 |
高尔基体 | 1 000S | 2.39 | 是/是 |
高尔基体 | 10 000S | 0.24 | 是/是 |
在一个实施方案中,本文中考虑的连续流动离心机可以使用不同几何形状的不同大小的转子以便提供可缩放的分离。例如,本发明的连续流动离心机可以配置不同大小的转子,例如,15英寸或者30英寸的转子。将理解用于本发明的转子的几何性状可以影响可以处理的样品的体积、沉降途径的缩窄和分离所需的总持续时间。此外,本发明考虑的连续流动离心机转子可以以“再定向梯度模式”运行,其中梯度从上样位置(水平位置)移动到运行位置(垂直位置)并返回到上样位置以允许产物收集。在本发明考虑的转子的使用期间,样品材料的流动路径可以通过芯的中心口进入每端(顶端或底端),然后样品材料可以通过长的薄管状轴流出所连接的产物线路或者管。
在另一实施方案中,使用具有相同转子长度但是改变转子芯的构造以减小或者增加体积来进行缩放分离。例如,如共同未决的美国申请序号09/995,054中所描述的(并入本文作为参考),该方法通常包括使用不同设计的芯,如具有轴向伸出的“鳍”的芯。在一个实施方案中,改变鳍的尺寸调节转子芯所排出的体积。例如,通过增大鳍大小通常实现按比例缩小,从而减小离心机运行可利用的体积。通过减小鳍的大小通常得到按比例增大,从而允许离心机运行的更多体积。
为了利用不同大小的转子,例如,Alfa Wassermann,Inc生产的那些转子可以实施缩放分离,通常考虑许多参数。这些参数包括但不限于,转鼓的Rmax、芯的Rmin、转鼓的×g力、沉淀时间、过渡时间、K因子和样品流速。这些参数取决于所分离的具体颗粒的Svedberg值。
例如,下文描述转子,例如Alfa Wassermann,Inc生产的那些转子1,000S颗粒的分离参数。以厘米表示的转子的Rmax(最大半径)、以厘米表示的转子Rmin(最小半径),和超速离心机(UCF)转子最大速度(rpm)通常是公知的并且由转子的生产商说明并再次引用作为参考。技术人员还公知转子体积(ml)和转子的最大流速(L/hr或者ml/min)可以容易地从生产商得到并且此处引用作为参考。
所计算的一个参数是转子相对离心力(RCF)(×g)(见Rickwood,1994)。可以使用下面的等式计算RCF:RCF=11.18×R×(Q/1,000)2,其中RCF=相对离心力(×g),R=半径(cm),Q=速度(转/分钟)。例如,基于下面的参数可以在PK3-800转子中分离1000S的颗粒:Rmax 6.6cm,Rmin 5.45cm,转子最大速度40,500rpm。计算如下:
RCF=11.8×6.6×(40,500/1,000)2
RCF=73.788 1,640.25
RCF=12,1030xg
RCF=121,000xg
同样,对于Rmin值为5.45的转子,计算RCF为99,900xg。
用于计算的另一参数是运行持续时间,其是K因子的函数。运行持续时间通常称作“运行时间”或者“沉降时间”。为了测定1,000S颗粒的运行持续时间,可以从文献确定或者如下计算转子的K因子:
例如,对于用于1,000S颗粒和转子最大速度为40,500RPM的PK3-800转子(Rmax 6.6cm,Rmin 5.45cm),可以如下计算K因子:
154.244 0.19145
K=29.53
K也可以用于计算备选速度。例如,在35,000rpm或20,000rpm的速度下,通常使用下面的公式:
Knew=K(Qmax/Qnew)2
Qmax-转子最大速度(rpm)
Qnew-新设定的速度(rpm)。
从而,为了计算20,000rpm的K因子:
Knew=K(Qmax/Qnew)2
Knew=29.53(40500/20000)2
Knew=29.53×4.100
Knew=121。
类似地,对于35,000rpm的K因子计算为39。
当确定K因子后,可以计算运行时间。例如,可以如下计算沉降时间(T):
T=K/S
T-沉降时间(小时)
S-沉积系数(S)。
从而,对于以20,000rpm在PK3-800转子中离心的1,000S颗粒,可以如下计算运行时间:
T=K/S
T=121/1000
T=0.211小时
T=7分16秒。
在另一实施方案中,可以以备选方式计算运行时间。更具体地,可以用下面的公式确定可缩放离心机运行中另一转子的运行时间:
T转子2=T转子1×(K转子1/K转子2),
其中T转子1是第一个转子的沉降时间,T转子2是第二个转子的沉降时间,K转子1是第一个转子的K因子,K转子2是第二个转子的K因子。
可以计算的另一参数是样品流动速度。样品流动速度是沉降时间(T)的函数并且如下计算:
F=VF/T
F-流动速度(L/hr)
VF-流过体积(L)
T-沉降时间
PK3-800转子通常具有50%的流过体积。从而,对于以20,000RPM运行的1,000S颗粒,可以如下计算流动速度:
F=VF/T
F=0.4/0.121
F=3.3L/hr
F=55ml/min。
在本发明实施方案中离心机运行期间,细胞器在密度梯度内富集和积累(其中积累也可以指扩增)。在一个实施方案中,通过连续流动超速离心机,在密度梯度内富集和积累至少两种或多种细胞器和/或它们的亚型。在另一实施方案中,积累至少两种或多种类型的细胞器直到梯度被所述至少两种或多种类型饱和。本发明的连续流动方法有利地以一定量积累至少两种或多种细胞器和/或它们的亚型,所述量足够分离和鉴定,例如,存在于所述至少两种或多种细胞器和/或它们的亚型中的公知的和/或未鉴定的低丰度蛋白质。本发明的连续流动方法还有利地允许积累和富集大量特定亚型的细胞器,它们相对于生物样品中细胞器群体的整个蛋白质组具有较不复杂的蛋白质组。
对于本发明,“富集”定义为如在标准条件下测量的相对于生物样品中相同细胞器或者蛋白质,梯度位置中细胞器或者其蛋白质增加的倍数(例如,1.1X、2X、5X、10X、50X,等等)。在更一般的术语中,富集涉及与原始生物样品中相同细胞器或者多种细胞器的相对量相比,特定梯度中细胞器或者多种细胞器的相对量的增加。富集还是匀浆物中两种细胞器群体纯化的形式,因为其将细胞器类型分离成相应于细胞器类型密度的密度梯度中的离散部分。
用于测定梯度,尤其特定梯度级分中细胞器或者其蛋白质富集的一般方法是对细胞器特异标记,如前面提到的那些特异标记进行蛋白质印迹分析。具体地,通常使用两种目标梯度级分的归一化量(例如,材料的标准化和/或可比较的量)进行蛋白质印迹分析,其中所述目标梯度级分来自本发明的分离和积累方法或者相应的原始生物样品。然后通过将所测量的目的梯度级分中细胞特异标记的相对量除以相应原始生物样品中的量计算富集。
例如,并且作为第一步,使用本领域公知的技术,例如Bradford或者Lowry蛋白质测定法将目的梯度级分和原始相应生物样品的总蛋白质浓度归一化。用于此类测定法的试剂和材料可以由本领域技术人员按照公知的方法(例如,Current Protocols in Biochemistry,JohnWiley & Sons,Inc.,1999,编者Juan S.Bonifacino)或者从商业来源购买(例如QIAGEN,INC.,CA)得到。测定两种梯度级分和原始生物样品的总蛋白质浓度可以包括溶解蛋白质,特别是其中的不溶蛋白质,例如,膜蛋白的步骤。溶解步骤通常包括例如,适宜的去污剂,如SDS或者Triton-X。一旦每种样品中的蛋白质溶解,就通过离心沉淀可溶物质,如残留的膜材料和/或残渣,并除去含有可溶蛋白质的剩余上清液。然后使用标准方法,如上面提到的Bradford和Lowry测定法测量上清液的蛋白质浓度。
作为第二步,可比较的量-其可以等价于梯度级分和相应原始生物样品的上清液-可以以相同或不同装置,使用适宜的蛋白质分离材料,例如,聚丙烯酰胺进行电泳分离。通常,使用一维聚丙烯酰胺凝胶电泳。
通过本领域公知的印迹技术将分离的蛋白质转移的适宜的支持介质(例如,“印迹纸”),如硝酸纤维素。然后,可以通过本领域公知的蛋白质印迹分析技术测定细胞器特异标记的相对量。通常,在蛋白质印迹中,允许对所述细胞器特异的标记特异的第一抗体与印迹纸上分离的蛋白质反应适宜的时间,其中第一抗体将以一定量结合细胞器特异的标记,所述量与印迹中存在的细胞器特异标记的量成正比。
然后通过任意适宜的方法,例如,导入和检测对第一抗体特异的第二抗体来检测第一抗体的量。第一和/或第二抗体可以共价连接到可检测的部分,例如,荧光分子,如酶,或者生色团。对于酶,可检测的酶底物,如生色或荧光底物可用于检测第一和/或第二抗体。然后可以测量并以数字形式,如象素代表印迹中存在的第一和/或第二抗体的量。
例如,通过蛋白质印迹分析通过测量来自目的线粒体级分或者相应原始生物样品的蛋白质的归一化量中线粒体特异标记的相对量可以通过蛋白质印迹分析测定含有线粒体的级分中线粒体的富集。梯度级分和原始生物样品中线粒体特异标记的检测可以通过荧光标记的第一和/或第二抗体和通过使用数字成像和/或照相检测印迹中存在的荧光信号的量来检测。可以使用检测和测量第一和/或第二抗体的荧光信号强度的任意本领域公知的仪器和/或计算机软件,例如,可以从MOLECULAR DYNAMICS,INC(CA)得到的那些软件。
数字信号的数目和/或强度相应于印迹上第一和/或第二抗体的相对量,其又相应于印迹上细胞器特异标记的相对量,其又相应于样品中目的细胞器的相对量。以从目的梯度测量的细胞器特异标记的相对量与从原始生物样品测量的细胞器特异标记的相对量的比率确定富集。
根据本发明方法的连续流动离心运行期间细胞器被富集并积累。例如,如上文解释的,可以在导入生物样品之前在连续流动离心机的转子中建立密度梯度。同样,可以将梯度材料加入到连续流动转子中然后以足够建立梯度的速度离心。一旦建立梯度,可以将生物样品导入转子中而转子持续旋转。如前面描述的,生物样品通常是生物样品的匀浆物并且含有细胞器、胞质溶胶组分和可能的膜碎片。如前面解释,任选地在将生物样品导入连续流动离心机的转子之前,可以澄清生物样品以除去大的颗粒物质,如细胞碎片和细胞核。
如前面解释的,可以以连续方式向连续流动离心机的旋转的转子中导入生物样品。例如,将生物样品进料到转子而转子持续旋转。加入生物样品时转子的速度可以保持恒定或者可以增加或者减小。可以使用任意适宜的方法向转子导入样品,所述方法包括但不限于,蠕动泵。此外并且如前面解释的,样品向转子中的导入可以以任意适宜的人工、自动或者半自动方式进行并且可以包括使用任意适宜的模拟机器人和/或计算机控制系统。此外,可以向转子导入任意适宜体积的生物样品,包括,例如,小于、等于或者大于转子中梯度物质体积的任意体积。
随着生物样品进入和开始通过转子流动,其与转子中的密度梯度接触。密度梯度具有近端和远端,其中近端的密度低于远端密度。从梯度的近端移动到远端,梯度根据特定密度谱增加密度。如前面解释的,梯度的密度谱也可以称作浓度谱,其可以为例如,线性、凸的或者凹的。密度梯度也可以认为含有不同的“部分”,其中每个部分具有在第一个密度下的近端和第二个密度下的远端,其中第二个密度大于第一个密度。
生物样品的特定组分是否进入梯度可以通过组分的物理特征以及连续流动离心机所用的参数来确定。此类物理参数包括,例如,组分的沉降值和浮力密度,和离心参数,例如,转子的RCF(xg)和生物样品的流速,所述物理参数可以在离心机运行期间增加或减小以影响不同组分向梯度的进入。在连续流动离心机的操作整个期间,包括生物样品的导入期间可以改变离心机的参数,特别是RCF(xg)。
一旦生物样品的组分进入梯度的近端,离心过程应用于组分的离心机导致组分通过一定速率经密度梯度迁移,所述速率部分取决于组分的物理性质,包括组分的浮力密度和沉降系数。组分通过梯度迁移直到到达等密度点,在该等密度点组分基于其浮力密度富集。
在离心运行期间,如前描述,可以向离心机引入其他生物样品,以便积累生物样品的组分。例如,当线粒体及其亚型在等于它们的浮力密度的部分富集时,向离心机加入更多的含有线粒体及其亚型的生物样品导致在该梯度部分积累线粒体及其亚型。
收集细胞器。如图1中所见,一旦完成了离心运行,就收集迁移到梯度中的细胞器。本发明公知的用于收集细胞器的任意技术在本发明的范围内。例如,通过人工、自动化或者两者的联合除去梯度的容量级分可以收集细胞器并将它们保存和/或置于容器,例如,样品管中。考虑任意适宜的级分体积,例如,梯度总体积的1/10,000、1/1,000、1/100或1/10,或者它们的任意其他适宜的体积。容积级分可以是相同或不同的体积。此外,一旦收集,就可以将不同的容积级分合并在一起。
还可以基于所指定的密度范围收集级分。在一个实施方案中,可以认为级分是第一个密度点和第二个密度点之间的并且包括第一个密度点和第二个密度点的梯度材料,其中第一个和第二个密度点是不同的。例如,可以收集10%和15%蔗糖之间并包括10%和15%蔗糖的所有梯度材料作为级分。特定级分的梯度密度可以使用通过商业途径可以获得的反射率分析器,例如,DMA4500、RXA156、或RXA170(ANTONPAAR,GMBH,奥地利)进行估计或者测量。
本发明的范围考虑和包括用于收集梯度级分的任意其他自动化、半自动或者人工方法。对于用于从梯度收集级分的自动化或半自动化系统,本发明考虑任意适宜的模拟机器人系统,包括任意适宜的传感器、电子仪器或者其他有用和/或必要的组件。用于收集梯度级分的自动化或半自动化系统可以称作自动化或半自动化级分收集器,可以使用任意适宜的软件或者计算机系统控制和/或编程。自动化和半自动化级分收集器可以是独立装置或者,在另一实施方案中,作为单板装置与连续流动离心机集成。
细胞器分析。根据图1,一旦收集细胞器,就通过本领域公知的方法分析细胞器。例如,使用本领域公知的任意适宜的方法可以鉴定和/或表征所收集的级分中的细胞器,所述方法为例如蛋白质印迹分析、酶测定法、使用对细胞器特异标记特异的荧光标记的抗体,和显微术,例如,电子显微术,或者任意公知的其他方法。通过这些方法,例如,可以例如针对级分中存在的不同类型的细胞器的相对量评估和表征级分的细胞器组分。例如,通过对级分进行蛋白质印迹分析并试验细胞器(如线粒体、内质网、质膜和高尔基体)特异标记的存在,可以评估级分含有的这些细胞器的每种的相对量。关于前面方案的信息可以见通过商业途径可获得的文献,例如,Current Protocols in CellBiology,John Wiley & Sons,Inc.,1999,编者Bonifacino等人或者Current Protocols in MolecularBiology.John Wiley & Sons,Inc.,1999,Juan S.Bonifacino编著。
而且,通过本领域中任意适宜的方法可以测定细胞器的完整性,所述方法为例如,定量酶测定法、对细胞器特异标记蛋白质的蛋白质印迹和电子显微术实验。可以用透射电子显微术(TEM)鉴定细胞器和定量地通过它们的形态(例如,大小、形状、结构组织和密度)表征细胞器,所述完整性通常与细胞器的功能相关。换句话说,具有更高程度完整性的细胞器将具有更完整的功能。
细胞器应用。通过本发明所得细胞器可以用于蛋白质组学领域,以及其他领域。此类其他领域包括,但不限于,基因组学、神经化学、免疫化学、生物化学、组织学、植物学、植物生物化学、生理人类学、法医病理学及其组合。技术人员将理解细胞器可以怎样用于这些学科。此外,通过本发明方法所得细胞器可以用于开发诊断剂、药物、化学品和疫苗,它们用于例如人、动物、牲畜和宠物护理。
蛋白质表征和定量。图2涉及表征和定量细胞器中存在的蛋白质。根据本发明方法的亚细胞细胞器和其他亚细胞结构的分离、富集和积累可以认为是“预先分级分离”生物样品的蛋白质组的方法,因为细胞的蛋白质组分成不同类型的亚细胞细胞器和结构。从而,一旦分离和纯化了细胞器,就可以将完整的整个生物样品的蛋白质组有效分级分离成亚蛋白质组组分。本发明的方法减小了生物样品的蛋白质组的复杂性并方便了蛋白质组的蛋白质组分的随后分离。
裂解细胞器。如图1中所见,通过本领域公知的任意技术裂解积累的细胞器。通常进行裂解从而以足够释放细胞器内含物的方式破坏细胞器的膜。细胞器内含物包括,例如,细胞器的蛋白质组。
分离蛋白质和肽。一旦实现了亚细胞细胞器的富集、积累和裂解,可以分析每种分离的细胞器(例如,每种细胞器的亚细胞蛋白质组)的蛋白质组分以方便检测目的蛋白质,如低丰度蛋白质。分析多种蛋白质和肽,如细胞器的亚细胞蛋白质组的不同方法是本领域公知的。本领域普通技术人员可以选择最适宜的蛋白质分离和纯化技术而不背离本发明的范围。
具体方法的一个实例是二维(2D)凝胶电泳。复杂蛋白质溶液,如亚细胞蛋白质组的二维凝胶电泳导致多肽的分离的图案,本领域通常称作分辨图案,其可以用于进一步研究所述多肽的身份。例如,可以用蛋白质印迹通过用特定抗体探测来鉴定特定类型、类别或者特定蛋白质或者其片段。此外,通过将质谱仪产生并检测的所得多肽片段的分子量谱与质谱法数据库或者完整基因组序列或者多肽数据库进行比较可以用质谱法确定凝胶中分辨的蛋白质的身份。
检测和鉴定方法可以自动化或半自动化。而且,可以使用本领域技术人员公知的模拟机器人或者高通量仪器。
用于研究蛋白质的其他技术包括,例如,液相层析,如正常和反相的,使用HPLC、FPLC等等;大小排阻层析;固定化金属螯合层析;亲和层析;和任意其他层析方法;蛋白质结合分析;酵母双杂交分析;三维结构研究;凝胶电泳,如一维和二维凝胶电泳;和最近的蛋白质/多肽微阵列,和生物信息学。
本发明范围内用于分离蛋白质和多肽另一种技术是多维液相层析(“MDLC”),也称作“MudPIT”。MudPIT用作二维凝胶电泳的备选方法鉴定蛋白质组中不同的、部分重叠的蛋白质集合。不是使用最初蛋白质分离步骤,像二维凝胶电泳,而是将生物样品的完整蛋白质组,如用于富集细胞器的梯度级分首先用胰蛋白酶消化。所得肽的复杂混合物通过MDLC,使用强阴离子交换(SAX)和反相(RP)柱联合进行分辨,通过串联的质谱法(MS/MS)分析分离的肽。从肽的MS/MS所得信息用于预测蛋白质身份。
通常通过联合2D-GE的高分辨分离技术与基质辅助的激光解吸-电离(“MALDI”)质谱法的高灵敏鉴定能力进行蛋白质组分析。已经开发了基于该联合的几种策略。最近,已经出现了基于ESI/MS/MS的方法,其用作蛋白质组分析的补充或者备选技术。此类方法包括对复杂样品的总体蛋白质酶解消化,然后使用一次或多次重复的串联的层析步骤部分分离蛋白质酶解混合物,然后使用MS/MS,通常通过电喷雾电离界面分析肽独立于用于得到数据的策略,将所消化肽的通过实验得到的质量输入数据库检索程序以便将所得值与给定数据库内对来源于所有蛋白质的胰蛋白解肽的理论计算值匹配。
表征和定量蛋白质和肽。再次参考图2,表征和定量蛋白质,如低丰度蛋白质,和来源于本发明的肽的技术包括,例如,任意公知的生物化学方法、酶测定法、抗体免疫反应、配体分析、蛋白质/肽质谱法、底物分析或者它们的联合。用于验证蛋白质功能的实验法类型通常取决于关于该蛋白质的预测功能的知识并且由所述知识指导。
在一个实施方案中,可以从二维凝胶得到蛋白质水平的相对定量,这可以通过使用计算机软件,例如,Nonlinear Dynamics的Phoretix 2D Evolution来分析凝胶图像的数字形式的蛋白质/肽点的强度来实现。可以使用不包括二维凝胶的其他方法,如同位素编码的亲和标记(
ICAT)(APPLIED BIOSYSTEMS,CA)。
ICAT方法使用与蛋白质反应的试剂的重和轻形式。除了该“同位素编码”,该试剂还具有化学基团碘乙酰胺,其与半胱氨酸巯基反应,还具有亲和标记生物素,其方便纯化。ICAT实验通常包括将蛋白质组与试剂的轻形式反应并将另一蛋白质组与重形式反应。然后合并标记的蛋白质组并使用适宜的工作流仪器分析。例如,通过胰蛋白酶产生的经标记的肽可以从非标记肽亲和纯化以减小所分析的肽混合物的复杂性。然后通过MS分离和分析亲和纯化的肽。
ICAT标记的肽的质谱通常含有质量不同的离子对,所述不同与重和轻试剂重的质量的差异相等。因为在相同质谱中测量肽,所以可能得到两种蛋白质组中肽和蛋白质的相对定量。ICAT用于定量不适于二维凝胶电泳的蛋白质或者亚蛋白质组。
鉴定蛋白质。技术人员可以利用的任意鉴定和分析技术可以用以鉴定通过本发明所得蛋白质和肽。用于鉴定和研究蛋白质的技术包括,例如,质谱法、共免疫沉淀、亲和层析法、蛋白质结合分析、酵母双杂交分析、三维结构研究和最近的蛋白质/多肽微阵列和生物信息学。一些更常见的鉴定技术包括2D-GE联合MALDI;ESI/MS-MS和串联质谱法(MS-MS),其通常通过电喷雾电离界面。
在一个实施方案中,本发明从通过本文方法积累的细胞器分离了基本上纯形式的蛋白质,尤其一种或多种低丰度蛋白质。例如,可以从聚丙烯酰胺凝胶,如本发明的二维聚丙烯酰胺凝胶除去低丰度蛋白质,并使用标准技术从中纯化。使用其他本领域公知的技术,如使用特定目的低丰度蛋白质的特异抗体的免疫沉淀或者免疫亲和层析。此外并且如本文更详细解释的,使用本领域中公知的技术可以克隆编码目的低丰度蛋白质的基因,在宿主生物体中表达,并分离和纯化。
本发明的低丰度蛋白质不限于任何具体类别。低丰度蛋白质可以基于细胞中它们的相对量或者拷贝数分类。例如,公知通常的细胞具有约109个蛋白质分子,至少104个独特蛋白质种类并针对拷贝数具有数量级的“动态范围”(即,少于102个拷贝到大于107个拷贝)。“动态范围”是细胞中蛋白质显示出最低拷贝数到最高拷贝数的范围。细胞中约9,000种蛋白质以少于约1,000个拷贝/细胞存在并且称作“低丰度蛋白质”。细胞中低丰度蛋白质的和通常构成约3%以下的细胞质量。例如,酪氨酸激酶以每个细胞30-40个拷贝存在。此外。某些低丰度蛋白质可以以约皮摩尔(pM)或者10-9到约飞摩尔(fM)或者10-12浓度,例如约10-9、约10-12,或者低于约10-9的浓度存在。
使用公知的蛋白质分析仪器和/或方法通常难以检测低丰度蛋白质。例如,在二维凝胶电泳中低丰度蛋白质由于低拷贝数和/或它们与多种优势蛋白质重叠而难以以“点”(凝胶上电泳分离的多肽)检测。本发明考虑任意低丰度蛋白质,甚至以小于约750、500、250或者100个拷贝/细胞,或者甚至约1个拷贝/细胞存在的已知或未知、细胞内或细胞外的低丰度蛋白质(如间质间隙中的蛋白质、神经递质和信号蛋白)。
经表征的公知和未知蛋白质的蛋白质应用。
再次参考图2,有许多方法可以利用通过本发明方法得到的蛋白质,如低丰度蛋白质。例如,通过本发明方法得到的蛋白质可用于开发诊断剂、药物、化学品和疫苗,用于例如,人、动物、牲畜和宠物护理领域。
本发明的一个应用提供了分析两组生物样品之间或者作为时间的函数的蛋白质组改变的方法。时间涉及采集生物样品,如活组织检查的时间点。在该实施方案中,通常通过本领域公知的匀浆或者裂解方法从生物样品释放至少两种类型的亚细胞细胞器。然后所述至少两种类型的亚细胞细胞器导入连续流动离心机内的密度梯度。应用离心力,优选大于或者约100,000×g的离心力,从而至少两种类型的亚细胞细胞器在密度梯度内迁移。在一个实施方案中,以单次运行进行离心。离心后,从密度梯度收集所述至少两种类型的亚细胞细胞器。然后从所述至少两种类型的亚细胞细胞器分离和纯化蛋白质以在第一时间测定所述至少两种类型的亚细胞细胞器的蛋白质组谱。该方法还可以用一种类型的亚细胞细胞器进行。
提供第二种生物样品并从中收集至少两种不同类型的亚细胞细胞器。然后所述至少两种类型的亚细胞细胞器导入连续流动离心机内的密度梯度;应用离心力,从而至少两种类型的亚细胞细胞器在密度梯度内迁移,优选单次运行。离心后,从密度梯度收集所述至少两种类型的亚细胞细胞器。然后从所述至少两种类型的亚细胞细胞器分离和纯化蛋白质以在第二时间测定所述至少两种类型的亚细胞细胞器的蛋白质组谱。该方法的该部分也可以以一种类型的细胞器进行。最后,通过本领域公知的技术分析在第一时间和第二时间的蛋白质组谱以检测蛋白质组谱随时间的改变。本发明发现了在例如,在疾病分析和当比较个体或者不同组的个体的蛋白质组谱时的应用性。
在另一蛋白质应用实施方案中,使用本领域的方法可以分析蛋白质转运事件。更具体地,转运过程涉及转运蛋白质或者作为时间的函数的转运蛋白质的细胞内和/或细胞间运动。首先测定第一种生物样品的第一种和第二种类型细胞器中转运蛋白质的相对量。该方法包括,例如,在足够将第一种和第二种细胞器释放到匀浆物的条件下匀浆第一种生物样品,其中第一种和第二种细胞器每种含有一种亚细胞蛋白质组。然后将匀浆物导入连续流动离心机内的密度梯度。对匀浆物应用离心力从而第一和第二种细胞器在密度梯度内迁移。从密度梯度除去第一和第二种细胞器,并随后溶解第一和第二种细胞器的亚细胞蛋白质组。溶解后,检测第一种生物样品中第一和第二种细胞器中的转运蛋白质,并测量所检测的转运蛋白质的水平。
第二种生物样品也按照第一种生物样品的途径类似处理。即,在足够将第一种和第二种细胞器释放到匀浆物的条件下匀浆第二种生物样品,其中第一种和第二种细胞器每种含有一种亚细胞蛋白质组。然后将匀浆物导入连续流动离心机内的密度梯度。对匀浆物应用离心力从而第一和第二种细胞器在密度梯度内迁移。从密度梯度除去第一和第二种细胞器,并随后溶解第一和第二种细胞器的亚细胞蛋白质组。溶解后,检测第二种生物样品中第一和第二种细胞器的转运蛋白质,并测量所检测的转运蛋白质的水平。
检测和侧链第一个和第二种生物样品的一种和/或几种转运蛋白质后,分析转运过程。例如,通过比较第一次和第二次每种生物样品的第一和第二种细胞器中所检测的转运蛋白质的测量水平可以测定作为时间的函数的转运蛋白质的转运过程。
如图19(A)(3-4)所示,本发明还考虑涉及分析和分离细胞器蛋白质和检测和/或鉴定其低丰度蛋白质的信息可以提供给、传输或者储存到数据库,该数据库可以在以后的时间点由相同或另一用户进入。本发明考虑在分离蛋白质组的所述蛋白质或者检测低丰度蛋白质的方法期间产生或收集的任何数据可以传输或者转移到第三方。例如,涉及二维电泳上分辨的蛋白质的模式的图像数据或者涉及凝胶上分辨的蛋白质的不同表达水平的信息可以通过电子传输,例如,通过email,或者通过因特网或者网络传输给第三方、传输到数据库或从数据库输出、传输到实验室、个人或者研究组。所述数据还可以电子转移(“例如,发布)到网络,如万维网或者其他全球通讯网络。
本领域技术人员将理解本发明的数据库可以具有许多不同形式和/或结构并且可以使用用于电子存储和信息检索的任意公知的方案。本发明还考虑为了商业目的提供数据库的存取。存取可以通过全球通讯网络,如万维网。
一旦通过本发明考虑的检测方法,如通过质谱法鉴定了低丰度蛋白质,就可以从完整基因组序列数据库得到蛋白质或者蛋白质片段的完整氨基酸序列。本发明还考虑通过比较序列分析方法评估目的低丰度蛋白质的假想功能。此类方法是本领域熟知的并且涉及在桌面电脑或者工作站本地可以得到或者可以通过网络,如万维网可以得到的计算机软件,其使用算法比较目的氨基酸序列(例如,“查询序列”)与数据库中所含氨基酸序列以鉴定与功能已知多肽序列相似的多肽。该一般方法可以鉴定为“同源性搜索”。同源性搜索不是肯定鉴定查询序列的功能,而是建立特定序列具有相同或相似序列的可能性。可以进行实验以进一步证实或验证目的蛋白质,例如,低丰度蛋白质的功能。
从而,本发明的低丰度蛋白质可以基于与多种数据库,例如GenBank、Swiss-Prot、和Protein Data Bank等中的蛋白质序列的比较序列分析(例如,同源性搜索)可以将预测的功能分配给本发明的低丰度蛋白质。术语“百分数同一性”在氨基酸序列上下文中指当进行最大对应比对时两个序列中相同的残基。本领域公知的多种不同的算法可用于测量序列相似性或同一性。例如,使用NCBI BLASTp和/或GCG版本6.1中的程序可以比较多肽序列。FASTA提供了查询和搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分数同一性。
备选地,在DNA或RNA上下文中,使用可以从NCBI得到的Myers和Miller,(″Optimal Alignments in Linear Space″,CABIOS 4,11-17,1988)的“Align”程序可以确定核苷酸序列相似性或同源性或同一性。术语“相似性”或“同一性”或“同源性”例如当关于核苷酸序列时,意在表示两种序列之间同源性的定量测量。百分数序列相似性可以计算为(Nref-Ndif)*100/Nref,其中Ndif是两种序列比对时不同一残基的总数,并且其中Nref是序列之一中的残基数。因此,DNA序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC具有75%的序列相似性(Nref=8;Ndef=2)。备选地或者额外地,对于序列,“相似性”指相同核苷酸的位置数除以两条序列的较短者中核苷酸数,其中可以根据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman,1983 PNAS USA 80:726)确定两条序列的比对,例如,使用20个核苷酸的窗口大小,字长4个核苷酸和空位罚分4,和计算机辅助分析并且包括比对的序列数据解释可以使用通过商业途径可获得的程序(例如,IntelligeneticsTMSuite,Intelligenetics Inc.CA)方便地进行。当提到RNA序列与DNA序列相似或者具有一定的序列同一性程度时,认为DNA序列中胸苷(T)等于RNA序列中尿嘧啶(U)。
一旦对给定目的蛋白质,特别是低丰度蛋白质确定了假想或者预测的功能,可以起草专利申请并提交合适的国家和/或国际专利局。该申请可以涉及例如,目的蛋白质,从同源性搜索预测所述蛋白质的功能。权利要求可以涉及例如,目的蛋白质的氨基酸序列,其基于预测功能的用途,或者携带编码所述目的蛋白质的DNA的任意克隆载体或者表达载体。
如图19(C)(8)中所见,本发明还考虑证实目的蛋白质,如低丰度蛋白质的所预测的功能。可以使用生物化学、免疫学、生理化学、蛋白质结构和遗传技术或者本领域技术人员公知的任意技术进行证实。在一个实施方案中,如图19(B)(7)中所见,本发明考虑克隆编码目的蛋白质的核酸序列。可以用不同的策略克隆编码目的蛋白质的基因、基因片段或者核苷酸序列。例如,基于目的蛋白质的序列可以设计简并核苷酸探针并用于从DNA或者cDNA文库筛选携带DNA编码片段的质粒或者载体克隆。在另一实例中,通过PCR使用基于目的蛋白质的序列的引物可以扩增编码目的蛋白质的核苷酸序列。此外,可以随后进行克隆步骤以得到编码核苷酸序列的转录控制区。不仅可以从生物材料的最初来源,还可以从含有相似序列的生物材料的另一来源得到核苷酸序列。
一旦克隆了编码核苷酸序列,其可以进一步工程化到表达载体中,在宿主细胞中表达,分离,并进一步分析,以通过对目的蛋白质的功能的实验法进行评估和证实。从而,本发明的多肽,如所检测的低丰度蛋白质,可以重组产生并在单细胞宿主中表达。为了得到外源DNA序列在宿主中的高水平表达,序列通常可以可操作性连接到转录和翻译表达控制序列,其在所选宿主中是有功能的。优选地,表达载体可以含有表达控制序列和目的基因,还含有选择标记。
编码本发明的多肽的DNA序列可以编码或不编码信号序列。如果表达宿主是真核的,通常优选编码信号序列从而成熟糖蛋白从真核宿主分泌。
本发明组合物中的所表达的多肽上可以存在或不存在氨基末端甲硫氨酸。如果末端甲硫氨酸不被表达宿主切割,其可以(如果希望)通过标准技术用化学方法除去。
多种表达宿主/载体组合可用于表达编码WNV多肽的DNA序列,WNV多肽可以用于本发明的药物组合物和疫苗。可用于真核宿主的表达载体包括,例如,含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺伴随病毒、巨细胞病毒和逆转录病毒(包括慢病毒属)的表达控制序列的载体。可用于在细菌宿主中表达的载体包括细菌质粒,如来自大肠杆菌的质粒,如pBluescript、pGEX-2T、pUC载体、colE1、pCR1、pBR322、pMB9和它们的衍生物、pET-15、更宽宿主范围的质粒,如RP4、噬菌体DNA,例如,λ噬菌体的多种衍生物,如λGT10和λGT11,和其他噬菌体。可用于酵母细胞的表达载体包括2μ质粒及其衍生物。可用于昆虫细胞的载体包括pVL 941。
此外,多种表达控制序列——控制与其可操作性连接的DNA序列表达的序列的任意一种可以用于这些载体中表达用于本发明组合物的多肽。此类有用的表达控制序列包括结合前面的表达载体的结构基因的表达控制序列。有用的表达控制序列的实例包括,例如,SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、trp系统、TAC或者TRC系统、T3和T7启动子、λ噬菌体主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油激酶或者其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子,例如,Pho5,酵母交配系统的启动子和其他组成性和可诱导的启动子序列,公知所述启动子序列控制原核或真核细胞或者它们的病毒的基因的表达,和所述表达控制序列的多种组合。
术语“宿主细胞”指导入重组DNA分子的一种或多种细胞。本发明的宿主细胞包括,但不限于,细菌、酵母、动物、昆虫和植物细胞。宿主细胞可以是单细胞的,或者可以以组织培养作为液体培养物、单层等等生长。宿主细胞还可以直接或间接来源于组织。
多种单细胞宿主细胞可用于表达编码用于本发明的药物组合物的多肽的DNA序列。这些宿主可以包括熟知的真核和原核宿主,如大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢菌属、链霉菌属、真菌、酵母菌株,昆虫细胞,如草地夜蛾(SF9)、动物细胞,如CHO和小鼠细胞,非洲绿猴细胞,如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10,和人细胞,以及植物细胞。
当核酸从细胞外环境转移到细胞中时,宿主细胞被核酸“转化”。可以使用用于转移核酸的任意方法;除非另外说明,该术语不暗含将核酸递送到细胞的任何具体方法,也不暗含任何用于转化的具体细胞类型。
“表达控制序列”是调节基因表达(即,转录、RNA形成和/或翻译)的核酸序列。表达控制序列可以取决于例如,所选的宿主细胞或生物体(例如,原核和真核宿主之间)、转录单位类型(例如,哪一种RNA聚合酶必须识别该序列)、基因通常在其中表达的细胞类型(和通常存在于该细胞类型中的生物学因子)而改变。
“启动子”是一种这样的表达控制序列,和如本文所用的,指控制、调节和/或指导下游(3’)核酸序列转录的一组核酸序列。文中所用启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列,对于II型聚合酶启动子,为TATA元件。
“组成性”启动子是在多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“可诱导的”启动子是在至少一种环境或者发育条件下无活性并且可以通过改变所述条件“开启”的启动子。“组织特异”启动子在生物体的某些组织类型下是有活性的,但是在来自同一生物体的其他组织类型中是无活性的。类似地,发育调节的启动子在宿主生物体的某些但不是所有发育阶段是有活性的。
表达控制序列还包括远端增强子或者抑制子元件,其可以距离转录起始位点几千个碱基对。它们可以包括RNA形成(例如,适宜时,加帽、剪接、3’末端形成和多腺苷酸化);翻译(例如,核糖体结合位点);和翻译后修饰(例如,糖基化、磷酸化、甲基化、异戊二烯化,等等)所需的序列。
术语“可操作性连接”指核酸表达控制序列(如启动子,或者转录因子结合位点排列)和第二核酸序列之间的功能连接,其中表达控制序列指导相应于第二序列的核酸的转录。
当然应该理解不是所有载体和表达控制序列相等地发挥功能以表达所提到的多肽。也不会所有宿主对相同的表达系统相等地发挥功能。然而,技术人员将在这些载体、表达控制序列和宿主之间进行选择而不用过多实验并且不背离本发明范围。例如,选择载体时,通常应该考虑宿主,因为载体在宿主中复制。还应该考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、控制整合的能力(如果存在),和载体编码的任意其他蛋白质,如抗生素或其他选择标记的表达。
在选择表达控制序列时,还应该考虑多种因素。这些因素包括例如,启动子序列的相对长度,其可控制性,和其与本发明描述的肽的DNA序列,尤其与潜在二级结构的相容性。应该通过考虑单细胞宿主与所选宿主的相容性、编码用于药物组合物的糖蛋白的DNA序列编码的产物的毒性、它们的分泌特征,它们正确折叠成多肽的能力,它们的发酵或者培养要求,和从DNA序列编码的产物纯化它们的容易性来选择单细胞宿主。
在这些参数中,技术人员可以选择多种载体/表达控制序列/宿主组合,其将表达发酵或者其他大规模培养产生的用于药物组合物的DNA序列编码产物。
使用本文别处描述的多种常规方法可以从发酵或者细胞培养分离并纯化本发明描述的多肽。本发明技术人员可以选择最合适的分离和纯化技术而不背离本发明的范围。如果多肽是膜结合的或者怀疑为脂蛋白,那么可以使用本领域公知的用于此类蛋白质的方法,如使用多种适宜的去污剂分离所述多肽。
一旦通过实验了解或者证实了目的蛋白质的功能,那么人们可以具有有价值的知识产权,其可以通过申请国家或者国际专利来保护,所述专利涉及目的蛋白质,例如低丰度密度蛋白质、其氨基酸序列、其功能和/或生物活性、其伴随的核苷酸序列,和含有该伴随核苷酸序列的克隆载体和表达载体。具体地,目的蛋白质的经证实的功能可以实际上建立得到国家或者国际专利的实用性要求。通过上面的步骤产生的信息,尤其目的蛋白质,如低丰度蛋白质的经证实的功能可以分发或者传输到第三方用户,例如,制药公司、生物技术公司、数据库部门、生物信息公司,或者私人或者公共研究所。如图20(C)(11-12)所指出的,本发明考虑涉及分析和分离细胞器蛋白质和检测和/或鉴定其低丰度蛋白质的信息可以提供给或者传输到或者储存在数据库,该数据库可以在以后由相同或者另一使用者使用。
本发明还包括传输信息数据,例如公开所鉴定的蛋白质的氨基酸序列或者编码所鉴定蛋白质的核酸分子、关于特定一种或几种细胞器的疾病相关的蛋白质组谱的信息、关于应用特定刺激,例如药物时特定一种或几种细胞器的蛋白质组谱中的改变的信息的方法,所述每种信息都通过数字方法,如通过传真、电子邮件、电话或者全球通讯网络,如万维网传输。例如,可以通过网站录入,如通过预约或选择/保护对网站的进入和/和通过电子邮件和/或通过电话、IR、收音机、电视或者其他频率信号,和/或通过电缆和/或卫星传输电子信号和/或通过磁盘、光盘(CDs)、计算机、硬驱或者含有电子形式的信息的其他装置传输,和/或通过信息的书写形式传输,例如,通过传真传输等等。从而,本发明包括用于根据本发明进行和传输信息;例如,传输到一个或多个用户,所述用户然后再利用一些或者全部所述数据或者信息,例如,用于生产产品,如治疗剂、测定法和诊断试验等等。本发明包括用于储存或接受或传输含有来自本发明方法和/或使用本发明方法得到的信息的数据或者信息的唱片、CD、计算机或者其他装置或方法。从而,本发明包括传输信息的方法,其包括实施如本文讨论的方法并传输其结果。
此外,本发明包括商业方法,其包括实施或者使用一些或者所有本文的方法或者从该方法得到的细胞器、蛋白质、化合物、组合物或者产品,和通信或传输或者公布其一个或多个结构,有利地用于交换补偿,如费用。有利地,信息的通信、传输或者公布是通过电子方式,例如,通过因特网或者电子邮件,或者通过本文讨论的任意其他传输方法。从而,本发明包括商业的方法,其包括从本发明方法得到的细胞器、蛋白质、组合物、化合物和产物,和本发明的方法。
从而,第一方“客户”可以通过例如,本文提到的传输方法的任意一种向第二方“厂家”要求以前准备的信息或者专门定购关于所检测的低丰度蛋白质的具体氨基酸序列的信息,例如通过电子方式如通过因特网(例如,要求输入网站)或者通过电子邮件要求信息。厂商可以通过例如本文提到的传输方法的任意一种,有利地通过电子方式,如通过因特网(例如,保护或者预定或者选择进入网站)或者电子邮件传输所述信息。信息可从根据要求进行本文提到的部分或所有方法或者使用本发明的方法得到,或者从进行本文提到的部分或所有方法,并产生进行本文提到的部分或所有方法或者使用本文的算法得到的信息的文库。然后通过响应要求允许客户存取文库或者从该文库选择数据可以满足所述要求。
因此,本发明甚至还包括通过进行或者使用本文方法或者装置得到的例如电子形式(如上面讨论的传输形式)的信息集。
此外通过下面的阐明性非限制性实施例描述本发明,所述实施例提供了对本发明以及其优点的更好的理解。
实施例
给出下面的实施例用以阐明根据本发明的多种实施方案。然而,下面的实施例绝不限制本发明。
实施例1.从肝细胞平行分离、纯化和富集线粒体、高尔基体、内质网和质膜
肝脏匀浆。组织分离前从禁食过夜的Wistar大鼠(150-200g)收获约100g大鼠肝脏。用Waring搅拌器(10秒低、10秒高和10秒低)将肝脏在5体积的匀浆缓冲液(补加无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的0.5M蔗糖、20mM HEPES-KOH、5mM MgCl2)中匀浆。匀浆后,通过以4-5000×g离心10分钟得到核后(post-nuclear)上清液。第一次核后旋转后,小心倾析上清液。通过加入等体积稀释缓冲液(20m MHEPES-KOH,pH7.2,5mM MgCl2)将核后上清液平衡到等渗条件。
连续流动离心。对于连续流动离心,在PK3-800转子中建立蔗糖梯度,之后将大鼠肝匀浆物进料到机器。使用约20ml/分钟的流速并且PKII对于第一次通过最初使用20,000rpm,然后对于第二次通过使用最大速度40,000rpm。捕获流出的样品并以后进行分析以确定对靶细胞器的捕获效率。所有匀浆物都进料入系统给予细胞器额外的时间以达到它们的成带密度。将转子进行受控的停止并以25ml等分试样从底部除去转子内含物。
在另一实验中,将缓冲液(250mM蔗糖、20mM HEPES-KOH,pH7.2,5mM MgCl2)装入PK3-800转子并通过将转子以10,000rpm从系统除去空气。通过管线的流量增加到300ml/分钟并且通过转子的流量减小到几分之一直到从系统除去了空气。停止转子并将梯度材料(即蔗糖)泵入以装填转子体积的一半(约400ml)。
转子在自动运行条件下加速到最大速度(35,000rpm或40,000rpm)。在梯度形成期间允许缓冲液流量持续为约40ml/分钟。一旦匀浆物合并物可以进行处理,将转子速度降低到20,000rpm。匀浆物以20ml/分钟进料并收集流出材料,并保留样品用于以后分析。
将装入物转换回缓冲液并且转子速度增加到35,000rpm或40,000rpm。然后将从20,000rpm装入物收集的流出物再以20ml/分钟装入PKII。收集流出物并保留样品用于以后分析。
将装入物转换回缓冲液并且管线变得清澈。然后关掉物流并允许转子中的材料在45分钟或2小时内成带。停止转子并立即收集级分。制备等分试样并保存在-80℃。工作等分试样保存在4℃用于立即分析。
离心后鉴定细胞器。离心后,通过蛋白质印迹、酶测定法和电子显微术测定所分离细胞器的完整性、分离和富集。这些实验的结果在图3-6中总结。
图3显示了如上所述分离和积累这些细胞器后蔗糖梯度的不同级分中线粒体、高尔基体、内质网和质膜和它们的亚型的分布。该图的X轴相应于用于测量细胞器含量的每个级分。Y轴指出相对于检测这些细胞器和它们的亚型的每一种的梯度范围内的群体,在相应蔗糖梯度级分中检测的这四种细胞器和其亚型的百分数。Y2轴显示了每种相应的梯度级分的蔗糖百分数。图3指出了这些细胞器和它们的亚型的每一种在梯度中不同且明确的位置分布。
图4显示了如上面描述的分离和积累如下细胞器后,线粒体、高尔基体、内质网和质膜和它们的亚型在蔗糖梯度的不同级分中的相对富集。图的X轴对应于用于测量相对细胞器标记应答的每种级分。Y轴指出在相应蔗糖梯度级分中检测的相对于对这些细胞器和它们的亚型的每一种检测的梯度范围内的群体,这四种细胞器和它们的亚型的相对于细胞器标记应答(象素)。Y2轴显示每种相应的梯度级分的蔗糖百分数。图4表明使用本发明的方法,这些细胞器和它们的亚型的每一种在梯度中不同且明确的位置中的相对富集。
图5显示了分离的细胞器的高度完整性水平-高于本领域中通常见到的值。数据表明内质网、线粒体、高尔基体和质膜和它们的亚型分别达到76.3%(内质网)、72.6%(线粒体)、89.3%(高尔基体)和72.7%(质膜)的完整性水平。通过比较本发明的细胞器制备物的可溶和不可溶相之间的细胞器特异酶活性确定完整性。将不可溶级分(细胞器)的酶活性相对于对可溶(上清液)和不可溶级分确定的总的酶活性进行比较。
通过定量酶测定、对细胞器特异标记蛋白质的蛋白质印迹和电子显微术实验一起测定内质网的完整性。具体地,平行测定沉淀和上清液的细胞器特异标记酶和蛋白质。检测到沉淀中标记水平>60%表明是完整的。相比,在上清液中检测到标记蛋白质表明细胞器的外周受到损伤。对于蛋白质印迹,用与用于测定纯度的方法相同的抗体检测细胞器特异标记。即,用抗-BiP/GRP78抗体(BD BIOSCIENCES)检测内质网。
用发射电子显微术(TEM)通过细胞器的形态(大小、形状、结构组织)定性地表征细胞器的完整性,所述形态与功能相关。为了通过电子显微术确定细胞器完整性,离心运行后立即从分级分离步骤收集样品以避免进一步操作的潜在损害。基于文献中关于各自细胞器报导的预期的密度范围选择样品。所选的级分经沉淀并在溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)的4%甲醛、1%戊二醛的溶液中固定,并在4℃保存直到需要制备。将样品包埋、切片,用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色,并使用Zeiss电子显微镜观察。
图6比较粗提样品和按照上述方法分级分离后内质网级分的TEM。如与粗提物的TEM相比的,可以看出ER级分中存在的亚细胞结构几乎仅是内质网。该观察定性地阐明了通过本发明的分级分离方法得到的高纯度和富集。进一步检查时,粗样品和ER样品中细胞器的超结构看上去很完整,与定量确定的高水平完整性(图2)相一致。
实施例2从HeLa细胞平行分离、纯化和富集用于蛋白质组分析的线粒体、内质网、高尔基体和质膜
将HeLa细胞培养在补加碳酸氢钠(Amresco#0865)、10%胎牛血清(Paragon BioServices,#30101121)和50μg/ml庆大霉素(Amresco,#0304)的Joklik改良的SMEM(Sigma,#61100-103)中。将细胞从滚瓶按比例增加到40L完全控制的生物反应器以接种到200L生物反应器中。反应器以1.0×105个细胞/ml接种。
三天后,从反应器收获细胞并通过切向流过滤浓缩到8升体积,将其随后以2000rpm离心12分钟。洗涤细胞沉淀并重悬浮在DPBS(Invitrogen,#14190-136)中,然后再次以2000rpm离心12分钟。除去上清液并在-80℃下以30g等分试样保存细胞沉淀。从-80℃保存物除去Hela细胞沉淀。将沉淀解冻,合并并在5体积匀浆缓冲液(0.25M蔗糖,20mM HEPES-KOH,pH7.2,5mM MgCl2,无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche))中使用Dounce匀浆器(25冲程)匀浆。匀浆后,通过以4000×g离心10分钟得到核后上清液。第一次核后旋转后,倾析上清液。然后用混合器(10秒低、10秒高,和10秒低)(以5体积缓冲液)并使用上面相同的离心参数再处理核沉淀以产生第二次核后上清液。倾析第二次核后上清液并与第一次核后上清液合并。所得合并的匀浆物用于PKII中进行细胞器的分级分离。将粗品匀浆物的等分试样在-80℃保存用于以后分析。
为了测量给定级分的总体细胞器含量和比较级分,使用Abbe折光仪测定每个样品的折射率。从折射率测量可以计算蔗糖百分数(%)。备选地,通过参考教科书如CRC Handbook of Chemistry and Physics(Ed.R.Weast,CRC Press Inc.,第58版)中的折射率向蔗糖百分数的转化表可以得到蔗糖百分数。图11描绘了HeLa细胞经匀浆和离心后收集的离心后级分的蔗糖百分数含量。该图直接与图7和8(下文描述)和本实施例中阐明的级分相关。
为了测试所分离的细胞器的完整性和富集,将分离的级分进行电子显微术分析、蛋白质印迹和琥珀酸脱氢酶酶测定的联合分析。
为了测试分离细胞器的完整性,运行后立即从分级分离收集样品以避免进一步操作的潜在损害。基于文献中关于各自细胞器报导的预期的密度范围选择样品。所选的级分经沉淀并在溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)的4%甲醛、1%戊二醛的溶液中固定,并在4℃保存直到需要制备。将样品包埋、切片,用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色,并使用Zeiss电子显微镜观察。
为了标准化蛋白质印迹和酶测定法,通过Bradford测定法(BIO-RAD,#500-0006)测定含有细胞器的级分中蛋白质浓度。将样品与考马斯试剂在室温下孵育5分钟,测量吸收(595nm)。使用BSA(Pierce#23210)产生标准曲线。
测定含有细胞器的级分的蛋白质浓度后,使用针对已知的细胞器特异标记的抗体通过用蛋白质印迹(免疫印迹)筛选每种级分确定级分的细胞器组成。从含有细胞器的级分提取的等量蛋白质提取物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析分辨后使用适宜的抗体检测细胞器特异标记。例如,用抗-Tom20抗体(BD BIOSCIENCES)检测线粒体、抗GM130/P115抗体(BD BIOSCIENCES)用于检测高尔基体、抗-BiP/GRP78抗体(BDBIOSCIENCES)用于检测内质网,抗NaKATPase抗体(US.OF IOWA)用于检测质膜。
为实施聚丙烯酰胺凝胶电泳,将样品与4×NuPAGE SDS样品缓冲液(INVITROGEN #NP0007)和50mM DTT混合后装入1.0mm×10孔或者1.5mm×15孔4-12 Bis-Tris梯度微型凝胶(INVITROGEN,#NP0335或NP0323)。使用MES SDS电泳缓冲液,在150V下电泳样品约40分钟。对于总蛋白质分析,将凝胶在溶于40%甲醇、10%乙酸的考马斯蓝溶液中染色0.5小时,随后在10%甲醇、10%乙酸溶液中脱色。使用ECL检测(#RPN2108,ECL Western Blotting AnalysisSystem,AMERSHAM,INC.)检测免疫反应性条带并使用Kodak DigitalScience 1D Image Analysis软件(KODAK)分析。
除了蛋白质印迹,还用酶测定法,例如,琥珀酸脱氢酶酶测定法进一步评估所回收的级分中分离的细胞器的完整性。对于这些实验,每50μl细胞器级分样品与溶于0.05M磷酸缓冲液(pH7.5)中的的0.1M琥珀酸钠(Sigma,#S2378)溶液0.3ml孵育。在37℃孵育10分钟后,加入溶于0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.5)的0.1ml 2.5mg/ml对-碘硝基四唑紫(INT)溶液。将管在37℃孵育10分钟。以5∶5∶1(v,v,w)的比例加入1.0ml乙酸乙酯∶乙醇∶三氯乙酸停止反应。将管以15,000rpm离心1分钟后测量490nm处的吸收。这些实验的结果在图7-11中总结。
图7显示了如上所述分离和积累这些细胞器后蔗糖梯度的不同级分中线粒体、内质网和质膜和它们的亚型的相对分布。该图的X轴相应于用于测量细胞器含量的每个级分。Y轴指出相对于检测这些细胞器和它们的亚型的每一种的梯度范围内的群体,在相应蔗糖梯度级分中检测的这三种细胞器和其亚型的百分数。Y2轴显示了每种相应的梯度级分的蔗糖百分数。图7指出这些细胞器和它们的亚型的每一种分布在梯度中不同且明确的位置。
图8显示了如上面描述的分离和积累如下细胞器后,线粒体、内质网和质膜和它们的亚型在蔗糖梯度的不同级分中的相对富集。图的X轴对应于用于测量相对细胞器标记应答的每种级分。Y轴指出在相应蔗糖梯度级分中检测的相对于对这些细胞器和它们的亚型的每一种检测的梯度范围内的群体,这三种细胞器和它们的亚型的相对细胞器标记应答(象素)。Y2轴显示每种相应的梯度级分中蔗糖百分数。图8表明使用本发明的方法,这些细胞器和它们的亚型的每一种在梯度中不同且明确的位置中的相对富集。
实施例3:使用HeLa细胞进行比较富集研究
参考上面的实施例2中给出的实验条件,根据下面的数据研究了比较富集。
图9和10阐明了通过本发明方法实现的富集的比较水平。使用细胞器特异标记和/或酶的蛋白质印迹或者酶测定法,将来自具体目的级分的信号/活性与另一级分或者分级分离前生物样品的最初粗提物的信号/活性向对照,可以定性确定富集。基于细胞器级分中标记蛋白质相对于另一种细胞器级分的积累可以确定相对富集。此外,目的细胞器的细胞器特异标记的活性与另一级分或者粗匀浆物中相同标记酶的活性的比较可以测量富集。图9显示了通过生物样品的每种级分的抗NaKATPase抗体检测的NaKATPase的蛋白质印迹。
图10显示了来自样品的每种级分得到NAKATPase的测量水平。图9和10的比较表明级分14和15具有NaKATPase的最高相对水平。因为NaKATPase是质膜的细胞器特异标记,所以该数据表明级分14和15具有最大浓度的质膜。
为通过蛋白质印迹和/或酶测定法确定细胞器完整性和富集,首先,通过基于Bradford的测定法(Bio-Rad,#500-0006)测定蛋白质含量。将样品与考马斯试剂在室温下孵育5分钟,测量吸收(595nm)。使用BSA(Pierce#23210)产生标准曲线。
蛋白质印迹之前,将样品与4×NuPAGE SDS样品缓冲液(INVITROGEN,#NP0007)和50mM DTT混合后装入1.0mm×10孔或者1.5mm×15孔4-12 Bis-Tris梯度微型凝胶(INVITROGEN,#NP0335或NP0323)。使用MES SDS电泳缓冲液,在150V下电泳样品约40分钟。对于总蛋白质分析,将凝胶在溶于40%甲醇、10%乙酸的考马斯蓝溶液中染色0.5小时,随后在10%甲醇、10%乙酸溶液中脱色。
为实施聚丙烯酰胺凝胶电泳,将样品与4×NuPAGE SDS样品缓冲液(INVITROGEN #NP0007)和50mM DTT混合后装入1.0mm×10孔或者1.5mm×15孔4-12 Bis-Tris梯度微型凝胶(INVITROGEN,#NP0335或NP0323)。使用MES SDS电泳缓冲液,在150V下电泳样品约40分钟。对于总蛋白质分析,将凝胶在溶于40%甲醇、10%乙酸的考马斯蓝溶液中染色0.5小时,随后在10%甲醇、10%乙酸溶液中脱色。使用ECL检测(#RPN2108,ECL Western Blotting AnalysisSystem,AMERSHAM,INC.)检测免疫反应性条带并使用Kodak DigitalScience 1D Image Analysis软件(KODAK)定量。对于琥珀酸脱氢酶酶测定法,每50μl匀浆物与溶于0.05M磷酸缓冲液(pH7.5)中的的0.1M琥珀酸钠(Sigma,#S2378)溶液0.3mi孵育。在37℃孵育10分钟后,加入溶于0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.5)的0.1ml 2.5mg/ml对-碘硝基四唑紫(INT)溶液。将管在37℃孵育10分钟。以5∶5∶1(v,v,w)的比例加入1.0ml乙酸乙酯∶乙醇∶三氯乙酸停止反应。将管以15,000rpm离心1分钟后测量490nm处的吸收。
实施例4通过二维凝胶电泳和质谱法分析细胞器级分的亚细胞蛋白质组揭示了新蛋白质
对实施例1和2中提供的级分的细胞器的亚细胞蛋白质组通过二维凝胶电泳和质谱法进一步分析。为了分析亚细胞细胞器蛋白质组,通过二维凝胶电泳(“2D-GE”)分离蛋白质。本领域技术人员将理解2D-GE是分离蛋白质复杂混合物的有效方法。电场中的所有蛋白质迁移到限定的距离,该距离取决于蛋白质的构象、分子大小和电荷。2D-GE使用分子大小和电荷以允许高分辨率分离蛋白质。在第一维中,用等电聚焦基于蛋白质的等电点将它们分离。在第二维中,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳根据它们的分子量分级分离蛋白质。所得结果是蛋白质点阵列,将它们分配X和Y坐标。
这里,通过2D-GE进行细胞器裂解后细胞器蛋白质提取物的分离,并通过考马斯蓝、银染或者Sypro RubyTM(MOLECULAR PROBES)检测。在2D-GE凝胶上将细胞器蛋白质提取物与未分离的粗提物相比较,其中所有凝胶都用考马斯蓝、银染或者Sypro RubyTM染色。用Z3TM软件(COMPUGEN)或者ProgenesisTM软件(NON LINEAR)产生并注解2E凝胶的数字图像。将所得图像重叠以鉴定普通和新的点,特别是低丰度蛋白质。
用Bio-Rad 7cm IPG条板在完整pH范围(3-10)内进行等电聚焦步骤。然后使用预制NuPAGE 4-12% Bis-Tris ZOOM明胶与分子量标准进行SDS-PAGE。样品以一式两份进行,一个凝胶用考马斯染色,另一个凝胶用银染。用2D凝胶介质将细胞器级分和粗匀浆物进行质谱法并通过MALDI分析。
图12比较了实施例1的大鼠肝脏组织的粗提物(A)和内质网级分(B)的蛋白质点图案。与粗提物凝胶相比,内质网凝胶显示出更多的蛋白质含量,即更多的可见和/或可检测的蛋白质或者多肽点。
除了图12中显示的关于分析内质网级分的二维凝胶的结果,对含有线粒体、质膜和高尔基体的级分也进行了类似的2D凝胶分析(数据未显示)。通过质谱法进一步分析了所得2D凝胶。通过质谱法分析了图12(A)的许多点,以及线粒体、质膜和高尔基体级分的凝胶。为每个点所测定的所得肽图与已知肽图数据库,例如GENBANK和SWISS-PROT相比较以确定蛋白质点的身份(如果存在)。
所得结果表明可以在线粒体、内质网、高尔基体和质膜级分中可以检测到许多蛋白质,它们在粗提物的2D凝胶中不存在或者不可检测。此外,在每个细胞器级分的2D凝胶上发现的蛋白质鉴定为具有宽范围的分子量,即约80-125kD的高分子量到约小于20kD的低分子量。从而,所得结果表明本发明的方法不是有偏的或者局限于任何特定分子量。通过质谱法分析了在起始生物材料的2D凝胶上观察不到或者在含有细胞器的级分的2D凝胶上为低强度的许多蛋白质点。检查了来自HeLa细胞(数据未显示)和大鼠肝脏组织的样品。在对大鼠肝脏组织所检查的蛋白质点中,发现约50%与SWISS-PROT中存入的蛋白质匹配。而且,通过序列分析和与GENEBANK中已知序列比较证实了约50%蛋白质点的身份。需要时,对非大鼠数据库实施同源性搜索。从大鼠肝脏组织得到的结果在图21A和21B中显示。
基于与现有数据库中已知蛋白质匹配的蛋白质的身份,本发明的方法检测了多种蛋白质,包括代谢酶、蛋白酶体组分、翻译因子、受体、免疫组分(补体)和核糖体蛋白质。
实施例5通过二维凝胶电泳和质谱法分析高尔基体和质膜级分的亚细胞蛋白质组表明检测到翻译后肽基脯氨酸顺反异构酶(环孢菌素A-结合蛋白质)或者其他变体
通过2D凝胶电泳和质谱法分析了根据实施例2从HeLa细胞分离的含有高尔基体和质膜的分离级分以及HeLa粗提物。裂解级分以释放含有蛋白质的细胞器。用Bradford测定法(Bio-Rad,#500-0006)测定高尔基体样品、质膜样品和粗提样品中蛋白质浓度。然后,如上面概述的,对来自每种样品的等量蛋白质进行2D凝胶电泳。如前面描述的,对2D凝胶适当染色以显现蛋白质点,然后通过ProgenesisTM软件LINEAR)成像。
图13B显示了粗提物、高尔基体级分和质膜级分的二维凝胶电泳结果。每个结果以来自三个单独2D凝胶的一式三份提供。图13A显示了高尔基体样品3的特写镜头并指出蛋白质点12、13和14。点12、13和14在高尔基体和质膜级分中都是可见的,然而所述相同点在粗提样品中布明显。同样,点12、13和14可能代表低丰度蛋白质。
对点12、13和14进行了质谱法以鉴定其中的多肽。图14显示了每个肽点的质谱数据。该表为每个点列出了所检测的肽片段的序列(从左到右为N末端到C末端方向)和每个片段的平均分子量。检查图14时,可以注意到检测到相同或基本上重叠的肽片段,这与每个2、13和14是相同的蛋白质吻合。从而,每种蛋白质是相同或基本上相同的分子量,则会与它们从凝胶顶部迁移相同距离吻合。然而,因为2D凝胶电泳以二维分辨蛋白质,即一个方向基于分子量,另一个方向基于电荷,所以蛋白质的总体电荷与电泳所分辨的程度不同。从而,该观察表明蛋白质点12、13和14是相同蛋白质的三种不同的翻译后或者其他变体。可能,一个点代表未修饰的蛋白质产物,剩下的点代表两种独特的翻译后修饰的或者氨基酸替换变体。可能所有三种都代表不同的变体。
所述结果证明了本发明的两个优点。第一,所述结果表明了在检测低丰度蛋白质中的增强的灵敏性,所述低丰度蛋白质为例如在粗提物中检测不到但是在通过本发明方法制备的细胞器级分中可检测到的蛋白质。第二,所述结果表明本发明的分级分离方法提供了对低丰度蛋白质的不同变体的增强的分离和检测,考虑到蛋白质组的大部分复杂性来自蛋白质翻译后或者期间发生的蛋白质的多种修饰,所述增强的分离和检测是有利的,其中所述蛋白质修饰改变蛋白质特征,例如,酶活性、溶解性和稳定性。
实施例6通过二维凝胶电泳和质谱法分析多种细胞器级分的亚细胞细胞组
对根据本发明方法制备的多种细胞器级分实施二维凝胶电泳。对所得凝胶适当染色并通过前述ProgenensisTM软件成像。如前对多个蛋白质点进行质谱法。为每个蛋白质点鉴定的所得肽片段与现有数据库(包括GENBANK和SWISS-PROT)中所含蛋白质的序列比较。
图15、图16、图17和图18分别显示了内质网、线粒体、高尔基体和质膜的结果。对于每个图,图片A显示了对每个细胞器级分所分辨的亚细胞蛋白质组的完整2D凝胶图像。未显示完整粗提物凝胶。圆圈显示通过质谱法检测的蛋白质点的位置。对于每个图,图片B一式三份地显示了对于三个单独的2D凝胶图片A中凝胶的局部部分。图片B的最上面排显示了粗提物2D凝胶的相应的局部图片,也以三个单独2D凝胶的一式三份显示。
从粗提物和细胞器级分2D凝胶的局部图像的比较可以看出在细胞器级分图片可以看到多种蛋白质点,而从粗提物图片却不能看到。具体地,在各自细胞器的2D凝胶中缺少的蛋白质点在每种细胞器级分凝胶图像中以圆圈圈出。从而,这表明存在于细胞器级分凝胶中的蛋白质点为在粗提物样品中检测不到的蛋白质。在图片A中,通过前述质谱法分析了每个图的凝胶中每个点。
该实施例表明本发明的分级分离方法提供了对通过本发明制备的亚细胞级分中蛋白质的检测,所述蛋白质在相应粗提物中检测不到。
实施例7从健康和患病胰腺组织平行分离、纯化和富集内质网和质膜用于进一步蛋白质组比较研究
胰腺匀浆。对于这些实验,将20只健康和糖尿病Wister大鼠(每只150-200g)禁食过夜后处死、解剖并收获胰腺。将胰腺(共100g)在5体积匀浆缓冲液中匀浆并通过机械剪切方法使用Waring搅拌器匀浆。
匀浆后,通过以4-10,000×g匀浆10-20分钟得到核后上清液。然后通过加入等体积补加蛋白酶抑制剂的稀释缓冲液将上清液调节到等渗条件。
连续流动离心。将大鼠胰腺匀浆物装入其中具有预先建立的蔗糖梯度的PK3-800转子中。使用约10-30ml/分钟的流速并且在第一次通过PKII以约15,000-25,000rpm运行,然后对于第二次通过使用最大速度40,500rpm。在离心运行结束时,从转子底部除去转子内含物,其为25ml级分。分析每个级分的样品以确定靶细胞器,如ER和质膜的捕获效率。
通过蛋白质印迹、酶测定法和电子显微术确定分离的细胞器的完整性和富集。对于这些实验,将含有质膜和ER的级分裂解并通过Bradford测定法(Bio-Rad,#500-0006)测定其中的蛋白质。将样品与考马斯试剂在室温孵育5分钟并测量595nm的吸收。使用BSA(Pierce,#23210)产生标准曲线。
确定含有质膜和ER的级分的蛋白质浓度后,将样品与4xNuPAGESDS样品缓冲液(INVITROGEN,#NP0007)和50mM DTT混合后装入1.0mm×10孔或1.5mm×15孔,4-12% Bis-Tris梯度微型凝胶(INVITROGEN#NP)335或NP0323)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用MESSDS电泳缓冲液,样品在150V下电泳约40分钟。对于总蛋白质分析,将凝胶在溶于40%甲醇、10%乙酸的考马斯蓝溶液中染色0.5小时,随后在10%甲醇、10%乙酸溶液中脱色。对于质膜使用抗-NaKATPase抗体,对于内质网检测使用抗-BiP/GRP78,通过蛋白质印迹筛选每种级分测量级分的细胞器组分富集。使用ECL检测(#RPN2108,ECLWestern Blotting Analysis System,AMERSHAM,INC.)表征级分并使用Kodak Digital Science 1D Image Analysis软件定量。
为了估计分离的细胞器的完整性,使用跃迁电子显微术(TEM)。
为了通过电子显微术确定细胞器的完整性,离心运行后立即收集分级分离步骤的样品以避免进一步操作的潜在损害。基于文献中关于ER和质膜报导的预期的密度范围选择样品。所选的级分经沉淀并在溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)的4%甲醛、1%戊二醛的溶液中固定,并在4℃保存直到进一步制备。选择后,将样品包埋、切片,用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色,并使用Zeiss电子显微镜观察。
额外地,为确定细胞器完整性,进行琥珀酸脱氢酶酶测定法。对于这些实验,将50μl细胞器级分与0.3ml溶于0.05M磷酸缓冲液(pH7.5)的0.01M琥珀酸钠(Sigma,#S2378)溶液孵育。在37℃孵育10分钟后,加入溶于0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.5)的0.1ml 2.5mg/ml对-碘硝基四唑紫(INT)(Sigma,#I8377)溶液。将管在37℃孵育10分钟。以5∶5∶1(v,v,w)的比例加入1.0ml乙酸乙酯∶乙醇∶三氯乙酸停止反应。将管以15,000rpm离心1分钟后测量490nm处的吸收。
为确定胰岛素受体是否定位于健康对糖尿病大鼠的胰腺组织的质膜或者ER中,将分离的细胞器裂解并如实施例9中描述的将所得蛋白质进行2D PAGE分析。然后比较健康和糖尿病大鼠的凝胶以确定胰岛素受体的定位。
实施例8罗格列酮处理糖尿病大鼠前后分析胰岛素受体的细胞定位
罗格列酮(Rosiglitazone ameleate)(也称作Avandia,GSK)是公知的施用于II型糖尿病患者用于糖控制的药物。该药物作用的潜在分子基础还未知并且最近研究暗示罗格列酮与改善胰岛素分泌和胰岛素丰度和信号转导的改变有关(Diabetes,卷52,1943-1948页,2003)。该实施例阐明本发明用于进一步阐明罗格列酮的分子基础,特别是该药物改变胰岛素受体的细胞定位的作用。
对于这些实验,将成年Wistar大鼠四只一笼圈养,可以随时得到食物和水。没有一种药物治疗是设计用于影响动物的一般健康的。将罗格列酮以饮用水施用于大鼠。最后结束时,通过断头处死大鼠。从有和没有药物治疗的约20只糖尿病大鼠收获胰腺(共100g)。没有罗格列酮治疗的糖尿病大鼠用作对照。
胰腺匀浆。通过机械剪切方法使用Waring搅拌器匀浆罗格列酮治疗前后得到的胰腺。匀浆后,通过以4-10,000×g匀浆10-20分钟得到核后上清液。然后通过加入等体积补加蛋白酶抑制剂的稀释缓冲液将上清液调节到等渗条件。
使用与上述相同的破坏和相同的离心条件再处理所得SI匀浆物以产生第二次核后上清液。将第二次核后上清液平衡到等渗条件并用作PKII(Alfa Wasserman)离心的加样材料。
连续流动离心。对于这些实验,在PK3-800转子中建立蔗糖梯度,之后将大鼠胰腺匀浆物装入离心机。使用约10-30ml/分钟的流速,并且在第一次通过PKII以约15,000-25,000rpm运行,然后对于第二次通过使用最大速度40,500rpm。捕获来自流出物的样品并确定ER和和质膜的捕获效率。所有匀浆物送入系统后对这些细胞器给以额外的时间以达到它们的密度。控制转子停止并以25ml等分试样从底部取出内含物。
离心后,通过如实施例7中描述的蛋白质印迹、酶测定法和电子显微术确定分离的ER和质膜的完整性和富集。
为确定罗格列酮处理前后胰岛素受体的细胞定位的不同,将分离的细胞器裂解并如实施例9中描述的进一步进行2D PAGE。
实施例9:通过2D凝胶电泳分析质膜和ER蛋白质组
通过2D凝胶电泳进一步分析实施例7和8提供的级分的ER和质膜的亚细胞蛋白质组。为了分析亚细胞蛋白质组,通过二维凝胶电泳分离蛋白质。细胞器裂解后ER和质膜提取物的分离通过2D-PAGE进行并通过考马斯蓝、银染或者Sypro Ruby(Molecular Probes)检测。使用Z3软件(Compugen)或者Progenesis软件(Nonlinear)产生并注解2E凝胶的数字图像。将所得图像重叠以鉴定相应于胰岛素受体的点。
从而,分析ER和质膜的蛋白质点图案并将罗格列酮处理前后糖尿病胰腺组织中的胰岛素受体定位与健康胰腺组织中胰岛素受体定位比较。
该实施例阐明通过PKII系统与2D凝胶电泳得到的组合亚细胞组分是怎样允许本领域技术人员实现亚细胞蛋白质组学的一个主要目的,即监测蛋白质转运事件的。
实施例10相对于蛋白质在细胞中的拷贝数检测蛋白质所需的生物材料的理论量的估计
图22A和22B阐明使用本发明的连续流动方法的优点。例如,所述图表明相对于细胞中蛋白质的拷贝数,达到50ng检测限通常所需的起始生物材料的具体量。在一个实施方案中,参考图22A,假定1×109个细胞起始生物材料,将需要使用细胞数增加819倍来达到在每个细胞以一个拷贝存在的蛋白质的50ng检测限。
本领域技术人员将将不用过度实验就能够认识到,或者能够确定本文描述的实施方案的多种等同方案。认为所有这些等同方案都在本发明的范围内并且被后面的权利要求所包括。
除非另外解释,本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属的领域中普通技术人员通常理解的意思。尽管本文描述的那些方法和材料相似或等价的方法和材料也可用于本发明的实践或者试验中,但是下面描述的适宜的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都完整引用作为参考。如果出现冲突,将以本说明书,包括术语的解释为准。此外,所述材料、方法和实施例仅是阐明性的而非限制性的。
尽管已经在本文详细描述的本发明的优选实施方案和其修改方案,但是应该理解本发明不限于这些精确的实施方案和修改方案,并且本领域技术人员可以实现其他修改或变更而不背离所附权利要求书限定的本发明范围的精神和范围。
Claims (39)
1.从含有细胞器的样品收集细胞器的方法,其包括步骤:
a)从样品释放细胞器;
b)将细胞器导入连续流动离心机内的密度梯度;
c)应用足够至少两种类型的细胞器迁移到密度梯度内的离心力;和
d)从密度梯度收集所述至少两种类型的细胞器。
2.权利要求1的方法,其中所述细胞器含有细胞器的亚型。
3.权利要求1的方法,其中所述样品是生物样品。
4.权利要求3的方法,其中所述生物样品包括器官、体液、血液、血清、血浆、唾液、泪液、粪便、尿、精液、粘液、组织、组织匀浆物、细胞提取物或者脊髓液或者它们的组合。
5.权利要求1的方法,其中所述连续流动离心机是连续流动超速离心机。
6.权利要求1的方法,其中所述连续流动离心机包分区转子。
7.权利要求1的方法,其还包括步骤:通过出售细胞器、出租细胞器、许可细胞器、保护细胞器中的知识产权利益、将细胞器的信息存入数据库、或者查看关于存入数据库的细胞器的信息而利用所收集的至少两种类型的细胞器。
8.权利要求1的方法,其中密度梯度选自氯化铯、硫酸铯、非电解质溶质、多糖、碘化非电解质和用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶。
9.权利要求1的方法,其中释放步骤包括匀浆和/或裂解。
10.权利要求1的方法,其中所述至少两种类型的细胞器每一种都具有浮力密度并且其中所述离心力足够导致所述至少两种类型的细胞器的每一种迁移到密度梯度内与每种各自浮力密度基本上相等的密度。
11.权利要求1的方法,其中所述至少两种类型的细胞器在一次运行中迁移到所述密度梯度内。
12.权利要求1的方法,其中收集的所述至少两种类型的细胞器至少约60%完整。
13.权利要求1或者权利要求10的方法,其还包括裂解至少两种类型的细胞器以形成含有蛋白质的蛋白质组;和从蛋白质组收集蛋白质的步骤。
14.权利要求13的方法,其中收集的蛋白质是低丰度蛋白质。
15.权利要求14的方法,其中所收集的蛋白质以小于每个细胞约100个拷贝的量存在于细胞中。
16.权利要求15的方法,其中所收集的蛋白质以每个细胞约1个拷贝的量存在于细胞中。
17.权利要求1或10的方法,其中所述至少两种类型的细胞器在密度梯度中富集和积累。
18.权利要求5的方法,其中连续流动超速离心机包含容积为约100ml到约8升的转子。
19.从细胞器群体获得低丰度蛋白质的方法,其包括步骤:应用离心力时将细胞器群体导入连续流动离心机内的密度梯度,应用的离心力足够细胞器类型在密度梯度的部分内富集和积累,所富集和积累的量足够在收集细胞器类型的量时含有可检测量的低丰度蛋白质。
20.权利要求19的方法,其还包括在将细胞器群体导入密度梯度前从来自匀浆和/或裂解生物样品的生物样品释放细胞器群体的步骤。
21.权利要求19的方法,其还包括收集低丰度蛋白质的步骤。
22.权利要求21的方法,其中低丰度蛋白质的收集包括裂解细胞器。
23.权利要求22的方法,其中低丰度蛋白质以基本上纯的形式分离。
24.权利要求19或21的方法,其中当连续对密度梯度应用离心力时将细胞器群体连续或者间歇地导入。
25.权利要求24的方法,其还包括步骤:通过出售低丰度蛋白质、出租低丰度蛋白质、许可低丰度蛋白质、保护低丰度蛋白质中的知识产权利益、将关于低丰度蛋白质的信息存入数据库、或者查看关于存入数据库的低丰度蛋白质的信息而利用低丰度蛋白质。
26.从生物样品分离至少两种类型细胞器的方法,其包括步骤:
a)匀浆生物样品和/或裂解细胞材料以形成匀浆物;
b)连续或间歇地将匀浆物进料和再循环至含有密度梯度的旋转的连续流动超速离心机中;
c)在向超速离心机中的密度梯度进料步骤期间和之后应用离心力使得至少两种类型的亚细胞细胞器的每一种在密度梯度内的一个位置富集和积累;和
d)从密度梯度中各自位置收集至少两种类型的亚细胞细胞器的每一种。
27.获得细胞器类型的方法,其包括以下步骤:使含有多种细胞器类型的生物样品通过旋转的连续流动离心机以从生物样品富集和积累一种单独的细胞器类型,所富集和积累的量足够分离和检测来自所述单独的细胞器类型的低丰度蛋白质。
28.权利要求27的方法,其中低丰度蛋白质以小于每个细胞约100个拷贝的量存在于细胞中。
29.权利要求28的方法,其中低丰度蛋白质以小于每个细胞约10个拷贝的量存在于细胞中。
30.权利要求28的方法,其中低丰度蛋白质以小于每个细胞约1个拷贝的量存在于细胞中。
31.分析至少两种不同类型的细胞器的蛋白质组谱方法,其包括步骤:
a)获得含有至少第一种和第二种类型细胞器的第一种生物样品,所述第一和第二种细胞器类型为不同的细胞器类型,第一种细胞器类型含有第一种细胞器,第二种细胞器类型含有第二种细胞器,第一种和第二种细胞器类型的每一种都具有浮力密度;
b)从第一种生物样品释放第一和第二种细胞器;
c)应用离心力时将第一种和第二种细胞器导入连续流动离心机内的密度梯度,应用的离心力足够第一种细胞器迁移到密度梯度内的第一个位置,在该位置的密度梯度的密度基本上等于第一种细胞器的浮力密度,并且应用的离心力足够第二种细胞器迁移到密度梯度内的第二个位置,其可以与第一个位置相同或不同,在所述第二个位置的密度梯度的密度基本上等于第二种细胞器的浮力密度;
d)收集第二种细胞器和第二种细胞器;
e)从第一种细胞器分离第一种蛋白质并从第二种细胞器分离第二种蛋白质;和
f)分析第一种能和第二种蛋白质的蛋白质组谱。
32.权利要求31的方法,其还包括步骤:
a)获得含有至少第三种和第四种类型细胞器的第二种生物样品;所述第三和第四种细胞器类型是不同类型的细胞器,第三种细胞器类型含有第三种细胞器,第四种细胞器类型含有第四种细胞器,第三和第四种细胞器的每一种都具有浮力密度;
b)使用第三种和第四种细胞器代替第一和第二种细胞器重复权利要求31的步骤b)、c)和d);
c)从第三种细胞器分离第三种蛋白质,从第四种细胞器分离第四种蛋白质;和
d)分析第三种细胞器和第四种细胞器的蛋白质组谱。
33.权利要求32的方法,其中第一种细胞器类型与第三种细胞器类型相同,第二种细胞器类型与第四种细胞器类型相同。
34.权利要求33的方法,其中将第一种细胞器的蛋白质组谱与第三种细胞器的蛋白质组谱比较,将第二种细胞器的蛋白质组谱与第四种细胞器的蛋白质组谱比较。
35.权利要求34的方法,其中在第一时间从来源获得第一种生物样品并且在第二时间从相同来源获得第二种生物样品。
36.权利要求35的方法,其中相同来源是一种或多种活的宿主。
37.权利要求36的方法,其中相同来源是一种活宿主。
38.分析含有第一种和第二种细胞器的生物样品中蛋白质在第一时间和第二时间转运的方法,其包括步骤:
a)获得生物样品的第一种细胞器中的蛋白质,所述生物样品在第一时间通过以下步骤获得:
i)在足够释放具有一种密度的第一种细胞器到匀浆物的条件下匀浆第一种生物样品,所述第一种细胞器包括第一种蛋白质;
ii)将匀浆物导入旋转的连续流动超速离心机的密度梯度;
iii)从超速离心机对匀浆物应用离心力,使得第一种细胞器在密度梯度内迁移到密度梯度中基本上等于第一种细胞器的密度的位置;
iv)从密度梯度除去第一种细胞器;
v)检测和表征第一种生物样品的第一种细胞器中的第一种蛋白质;
b)从生物样品获得第二种细胞器中的第二种蛋白质,其与第一种类型的蛋白质类型相同,所述生物样品在第二时间获得,包括使用在第二时间获得的生物样品实施上面的步骤(a)(i)到(a)(v);和
c)比较第一和第二种蛋白质的位置。
39.权利要求38的方法,其中所述第一种细胞器包括许多第一种细胞器并且第二种细胞器包括许多第二种细胞器,并且所述第一种蛋白质包括许多第一种蛋白质,所述第二种蛋白质包括许多第二种蛋白质。
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