CN1700930A - 炎症和细胞凋亡相关的方法与试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明连同其它实施方案一道涉及包括肿瘤坏死因子α(TNF－α)和/或肿瘤坏死因子α受体(TNFR)的蛋白复合物。所述复合物优选包括至少一种选自以下的多肽：NF－κB活化激酶(NAK)、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。本发明还提供鉴定用于调节所述复合物稳定性和活性的化合物的试验。本发明也提供调节细胞凋亡和炎症的方法，以及治疗TNF－α相关疾病的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2002年8月1日申请的美国临时申请第60/400410号优先权的权益，所述临时申请的说明书通过引用全部结合到本文中。
发明背景
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是主要由巨噬细胞产生的促炎细胞因子。TNF-α的多效作用包括炎症、细胞增殖、分化及细胞凋亡(Tracey等，(1993)Annu.Rev.Cell Biol.9：317-313；Baud等，(2001)Trends inCell Biol.11：372-377)。这些作用由TNF-α与其绝大多数种类细胞所表达的受体(即TNFR)结合而引发(Baglioni等，1985；Beutler等，1985；Kull等，1985；Tsujimoto等，1985；Aggarwal等，1985；Israel等，1986)。此受体为TNF-α所引发的细胞应答提供细胞内信号(Engelmann等，1990a)。
TNF-α和TNFR在炎症应答中起作用。一方面，TNF-α刺激免疫，赋予对感染因子和肿瘤的抗性(Vilcek等，(1991)J.Biol.Chem.266：7313-7316)。另一方面，TNF-α又涉及许多自身免疫病诸如类风湿性关节炎、移植排斥以及移植物抗宿主疾病(Beutler等，(1998)BloodCells Mol.Dis.24：216-230；Beutler，(1999)J.Rheumatol.26(增刊)57：16-21)。
TNF-α和TNFR在细胞凋亡即程序性细胞死亡中起另一种作用。细胞凋亡是对多细胞生物的正常发育和体内平衡必不可少的生理过程(H.Steller，(1995)Science 267：1445-1449)。细胞凋亡紊乱可引发一些人类疾病，包括癌症、神经变性性疾病以及获得性免疫缺陷综合征(C.B.Thompson，(1995)Science 267：1456-1462)。
TNF-α配体和受体的效应多种多样，在哺乳动物系统的生物过程中可影响多种功能，既有正常的也有异常的。因此，显然需要对包含此类受体和配体的蛋白复合物进行鉴定和表征，所述蛋白复合物在正常和疾病状态下都会影响生物学活性。
简要概述
在某些方面，本发明提供分离、纯化或重组的蛋白复合物，所述蛋白复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽和至少一种选自以下的多肽：NF-κB活化激酶(NAK)、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。NAK又称为TBK1(TANK结合激酶)或T2K(TRAF2结合激酶)。在某些实施方案中，该分离、纯化或重组的蛋白复合物还包含至少一种选自TRADD、TRAF2和TRAP2的多肽。
在某些方面，本发明提供分离、纯化或重组的蛋白复合物，所述蛋白复合物包含TNFR多肽以及至少一种选自以下的多肽：NF-κB活化激酶(NAK)、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在某些实施方案中，所述分离、纯化或重组的蛋白复合物还包含至少一种选自TNF-α、TRADD、TRAF2和TRAP2的多肽。
在一个具体的实施方案中，本发明的蛋白复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽、NAK多肽、RasGAP3多肽、TRCP1多肽、TRCP2多肽、TRADD多肽、TRAF2多肽和TRAP2多肽。例如，所述复合物的TNFR多肽可以是TNFR1多肽或TNFR2多肽。
在某些实施方案中，本发明的复合物中一种或多种多肽是变异体，如片段、融合蛋白、标记蛋白等，并且所述变异体最好为功能性变异体。
在进一步的方面，本发明提供包含一种或多种重组核酸的宿主细胞，所述核酸编码本文中所公开的复合物的一种或多种多肽组分。在某些实施方案中，所述宿主细胞包含第一核酸、第二核酸和第三核酸，其中第一核酸包含编码TNFR多肽的重组核酸，第二核酸包含编码TNF-α多肽的重组核酸，第三核酸包含编码选自以下多肽的重组核酸：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在某些实施方案中，所述宿主细胞包含第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含编码TNFR多肽的重组核酸，第二核酸包含编码选自以下多肽的重组核酸：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
在某些方面，本发明提供用于鉴定抑制或增强本文所公开的蛋白复合物稳定性的试验化合物的试验。在某些实施方案中，所述试验包括：形成包含TNF-α、TNFR和至少一种多肽以及试验化合物的反应混合物，所述多肽选自NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；然后检测复合物中TNF-α或TNFR的存在。在所述试验化合物存在下所述复合物中TNF-α或TNFR的存在情况，相对于在不存在所述试验化合物的情况下所述复合物中TNF-α或TNFR的存在情况，这两者存在情况之间的变化说明所述试验化合物增强或抑制所述复合物的稳定性。
在某些实施方案中，本发明的试验包括以下两个步骤：(i)形成包括TNF-α、TNFR和至少一种多肽以及试验化合物的反应混合物，所述多肽选自NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；(ii)检测TNF-α或TNFR与选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在所述试验化合物存在下TNF-α或TNFR与选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，相对于在不存在所述试验化合物的情况下TNF-α或TNFR与选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，这两者结合之间的变化说明所述试验化合物增强或抑制所述复合物的稳定性。在某些实施方案中，本发明的试验包括以下两个步骤：(i)形成包括TNFR、至少一种多肽和试验化合物的反应混合物，所述多肽选自NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；(ii)检测TNFR与选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。所述反应混合物可任选含有TNF-α。在所述试验化合物存在下TNFR与选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，相对于在不存在所述试验化合物的情况下TNFR与选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，这两者结合之间的变化说明所述试验化合物增强或抑制所述复合物的稳定性。
在进一步的实施方案中，试验化合物筛选试验包括(i)形成蛋白复合物，所述蛋白复合物包含TNFR及选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；(ii)使所述蛋白复合物与试验化合物接触；(iii)测定试验化合物对一种或多种活性的影响。该蛋白复合物也可包含TNF-α。所述活性选自蛋白复合物水平的变化；所述复合物中TNFR多肽或TNF-α多肽水平的变化；所述复合物中信号转导酶活性的变化；或者TNFR多肽或TNF-α多肽与选自以下多肽相互作用的变化：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
在进一步的实施方案中，本发明提供筛选试验，所述筛选试验包括：提供双杂合试验系统，所述双杂合试验系统包括第一融合蛋白(例如包含TNFR多肽部分)和第二融合蛋白(例如包含选自以下多肽的一部分：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2)，条件是其中所述双杂合试验对第一融合蛋白(例如包含TNFR多肽)和第二融合蛋白(例如包含选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2)之间的相互作用敏感；在存在和不存在试验化合物的情况下，测定所述融合蛋白之间的相互作用水平；并比较所述融合蛋白的相互作用水平。相互作用水平降低说明化合物将抑制所述融合蛋白(例如TNFR多肽和选自NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2的多肽)间的相互作用。本发明的该项试验可用于复合物(例如包含以下组分的复合物：TNF-α、TNFR、NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2)中的任何两种蛋白。
在进一步的方面，本发明提供与本文中公开的复合物多肽表位特异性免疫反应的抗体或其片段，诸如选自以下的多肽：TNF-α、TNFR、NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。所述抗体最好破坏TNF-α或TNFR与选自以下多肽之间相互作用的形成：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
在某些方面，本发明提供调节细胞内蛋白复合物的方法，所述蛋白复合物包含第一蛋白、第二蛋白和第三蛋白，其中所述第一蛋白是TNF-α，所述第二蛋白是TNFR，所述第三蛋白选自NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在某些方面，本发明提供调节细胞内蛋白复合物的方法，所述蛋白复合物包含第一蛋白和第二蛋白，其中所述第一蛋白是TNF-α或TNFR，所述第二蛋白选自NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。所述方法包括给予所述细胞能够调节所述蛋白复合物的化合物。
本发明的进一步方面涉及产生功能性复合物的方法，所述方法包括：用编码选自以下多肽的多核苷酸转染细胞：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；使所述细胞与TNF-α或TNFR多肽接触；从而形成蛋白复合物。
本发明的一个进一步方面涉及治疗TNF-α相关疾病的方法，所述方法包括给予有效量的化合物，所述化合物抑制TNF-α或TNFR与选自NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2的多肽之间的相互作用。
本发明的其它方面涉及鉴定作为炎症或细胞凋亡候选调节剂的试验化合物的方法。所述方法包括：(i)形成包含TRCP1多肽或TRCP2多肽或其变异体多肽及试验化合物的混合物；(ii)测定TRCP1多肽或TRCP2多肽或其变异体与所述试验化合物之间的相互作用；其中与TRCP1多肽或TRCP2多肽或其功能性变异体相互作用的试验化合物，是炎症或细胞凋亡的候选调节剂。在所述方法中，第一步(i)可以包括在体外形成混合物或者包括使表达TRCP1多肽或TRCP2多肽或其变异体的细胞与该试验化合物接触。
因此，本发明一个进一步方面涉及治疗TNF-α相关疾病(包括炎性组分或细胞凋亡组分)的方法，所述方法包括给予有效量的调节TRCP1或TRCP2的治疗性组合物。
根据本发明的说明书、附图和权利要求书，本发明实施方案和实践、其它实施方案及其特点和特征将会是显而易见的，并且权利要求书的所有内容通过引用结合到发明概述中。
附图简述
图1说明通过加入TNF-α配体诱导的TNF-α受体复合物的形成。A.TNF-α受体复合物中的蛋白用SDS-PAGE凝胶分离并用银染色法显色。B.在TNF-α受体复合物中存在TRADD蛋白通过蛋白质印迹法加以证实。
图2显示肿瘤坏死因子α(TNF-α)的氨基酸序列(SEQ ID No：1)。
图3显示编码TNF-α的cDNA序列(SEQ ID No：2)。
图4显示TNF-α受体1(TNFR1)的氨基酸序列(SEQ ID No：3)。
图5显示编码TNFR1的cDNA序列(SEQ ID No：4)。
图6显示TNF-α受体2(TNFR2)的氨基酸序列(SEQ ID No：5)。
图7显示编码TNF-α受体2(TNFR2)的cDNA序列(SEQ ID No：6)。
图8显示TNF-α受体复合物中鉴定的蛋白TRADD的氨基酸序列(SEQ ID No：7)。
图9显示编码TRADD的cDNA序列(SEQ ID No：8)。
图10显示TNF-α受体复合物中鉴定的蛋白TRAF2的氨基酸序列(SEQ ID No：9)。
图11显示编码TRAF2的cDNA序列(SEQ ID No：10)。
图12显示TNF-α受体复合物中鉴定的蛋白TRAP2的氨基酸序列(SEQ ID No：11)。
图13显示编码TRAP2的cDNA序列(SEQ ID No：12)。
图14显示TNF-α受体复合物中鉴定的蛋白NAK(也称为TBK或T2K)的氨基酸序列(SEQ ID No：13)。
图15显示编码NAK(也称为TBK或T2K)的cDNA序列(SEQ IDNo：14)。
图16显示TNF-α受体复合物中鉴定的蛋白RasGAP3的氨基酸序列(SEQ ID No：15)。
图17显示编码RasGAP3的cDNA序列(SEQ ID No：16)。
图18显示TNF-α受体复合物中鉴定的蛋白TRCP1(也称为KIAA0143)的氨基酸序列(SEQ ID No：17)。
图19显示编码TRCP1(也称为KIAA0143)的cDNA序列(SEQ IDNo：18)。
图20显示TNF-α受体复合物中鉴定的蛋白TRCP2(类似于FLJ20758)的氨基酸序列(SEQ ID No：19)。
图21显示编码TRCP2的cDNA序列(SEQ ID No：20)。
图22说明TNF-α依赖于TNFR1的NAK、TRAF2和TRADD募集。
发明详述
I.
概述
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是主要由淋巴细胞、巨噬细胞和几种其它细胞类型产生的细胞因子，并且涉及各种各样的细胞反应，包括自身免疫反应、细胞增殖、分化和细胞凋亡。TNF-α属于三聚细胞因子家族，所述细胞因子可结合其细胞表面的靶受体，并引发TNF受体的三聚化/聚集，诸如作为较大TNF受体超家族部分的TNFR1和TNFR2。TNF-α与其受体的相互作用及随后复合物的形成都与细胞内信号反应有关，所述反应包括激活引发细胞凋亡的胱冬蛋白酶(caspase)级联，或者激活转录因子AP-1和NF-κB，进而导致转录性激活涉及慢性和急性炎症反应的基因。另外，后者一些主要是依赖于NF-κB的基因，在某些环境或细胞类型中发挥抑制细胞凋亡的作用。
II.
定义
为方便起见，本说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语收集于此。除非另有定义，本文所用所有科技术语的含义与本发明所属领域普通技术人员所理解的含义相同。
术语“结合”是指两个分子间直接或间接的结合。例如，直接结合可包括生理条件下共价、静电、疏水、离子和/或氢键相互作用。间接结合包括例如作为复合物组成部分但没有任何直接相互作用的两种蛋白。
术语“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文可互换使用。人们知道，这些术语不仅指特定题述细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。因为在后代中可能由于突变或环境影响而发生某些修饰，这样的后代可能实际上与亲代细胞不相同，但仍包括在本文所用的术语的范围内。
“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是指编码多肽的第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的融合物，其中所述第一和第二氨基酸序列天然状态下并不是作为单一多肽链部分存在。
短语“保守氨基酸取代”是指在某些共同性质基础上的氨基酸分类。一种定义各个氨基酸间共同性质的有效方法是分析同源生物相应蛋白间的氨基酸变化的正态化频率(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer.，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。根据所述分析，可确定氨基酸组，即组内氨基酸能优先彼此互换，因此对整个蛋白质结构影响方面彼此最相似(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer.，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。以这种方式定义的氨基酸组的实例包括：
(i)带电荷组，包括谷氨酸和天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，
(ii)带正电荷组，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸，
(iii)带负电荷组，包括谷氨酸和天冬氨酸，
(iv)芳族组，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，
(v)氮环组，包括组氨酸和色氨酸，
(vi)大脂肪族非极性组，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，
(vii)弱极性组，包括甲硫氨酸和半胱氨酸，
(viii)小残基组，包括丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸，
(ix)脂肪族组，包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸，和
(x)小羟基组，包括丝氨酸和苏氨酸。
除上述组以外，每一氨基酸残基可形成其自己的组，并且单个氨基酸形成的组可用一个和/或三个字母缩写简单指代本领域中常用的氨基酸。
本文所用的术语“化合物”、“试验化合物”和“分子”在本文可互换使用，并且意指包括但不限于肽、核酸、糖类、有机小分子、天然产物提取物文库和任何其它分子(包括但不限于化学物质、金属和有机金属化合物)。
“保守残基”是在相似蛋白质范围内相对不变的氨基酸。通常保守残基将只发生被相似氨基酸取代的变化，如以上“保守氨基酸取代”所述。
本文所用的术语“域”是指包含特定结构和/或执行特定功能的蛋白质区。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽间或两个核酸分子间的序列相似性。同源性和同一性的每一个可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列为达比较目的而进行序列比对。当所比较的序列中的等同位置被相同的碱基或氨基酸占据，即该分子在此位置是相同的；当等同位置由相同或相似氨基酸残基(例如空间位置和/或电性相似的)占据，即该分子可认为在此位置具同源性(相似)。同源性/相似性或同一性的百分率的表述是指所比较的序列共享的相同或相似氨基酸数目的函数。“无关”或“非同源性”序列与本发明的序列共享小于40％同一性，优选小于25％同一性。在比较两个序列中，残基(氨基酸或核酸)缺失或多余也会降低同一性和同源性/相似性。
术语“同源性”是描述基于数学上的序列相似性比较，所述序列相似性用来鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白。本发明的核酸序列和蛋白质序列还可以用作“查询序列”，对公共数据库进行搜索，以便例如鉴定其它家族成员，即相关序列或同系物。这样的搜索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)来进行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序、score(分值)＝100、wordlength(字长)＝12来进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序、score(分值)＝50、wordlength(字长)＝3来进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得加入空位的比对以供比较，可以如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述，利用Gapped BLAST。当用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见
http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
本文所用的“同一性”是指当把两个或两个以上序列进行比对以使序列匹配最大化时，即考虑空位(gap)和插入时，所述序列中相应位置上相同核苷酸残基或氨基酸残基的百分比。同一性可用已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于以下文献中描述的方法(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编著，Oxford UniversityPress，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编著，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编著，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。设计测定同一性的方法以给出所测序列间的最大匹配。此外，测定同一性的方法已编入公众可得的计算机程序中。测定两个序列间同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic AcidsResearch 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)和Altschul等Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1997))。BLAST X程序公众可得自NCBI及其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。著名的SmithWaterman算法也可以用于测定同一性。
本文所用的术语“包括”，其意义与短语“包括但不限于”相同并可与之互换使用。
本文关于题述蛋白和蛋白复合物所用的术语“分离的”，是指蛋白或蛋白复合物的制剂，所述蛋白或蛋白复合物基本上不含污染蛋白，所述污染蛋白通常可能与所述蛋白或蛋白复合物共存，例如在所述蛋白或蛋白复合物内源性存在的细胞环境中。因此，分离的蛋白复合物与细胞组分分离，该细胞组分通常可能“污染”或干扰分离状态下的复合物的研究，例如筛选其调节剂时。然而，人们知道，这样的“分离的”复合物可以掺混其它蛋白，其通过题述蛋白或蛋白复合物的调节作用正在研究之中。
本文使用的术语“分离的”就核酸如DNA或RNA来说，是指自然界中并不存在的分子形式。此外，“分离的核酸”意指包括在天然状态下作为片段并不存在以及在天然状态下不存在的核酸片段。
本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸诸如脱氧核糖核酸(DNA)，适当时也指核糖核酸(RNA)。该术语也应理解为包括作为由RNA或DNA核苷酸类似物构成的等同物、类似物，以及适用于所述实施方案的单链(例如有义链或反义链)和双链多核苷酸。
本文所用的术语“或”与术语“和/或”意义相同，并可互换使用，除非上下文另有明示。
术语“蛋白”和“多肽”在本文可互换使用。
术语“纯化的蛋白”是指一种或多种蛋白的制剂，该蛋白从其它蛋白中分离出来，或者换句话说，基本上不含其它蛋白，在细胞或细胞裂解物中，所述其它蛋白正常情况下与所述蛋白同时存在。术语“基本上不含其它细胞蛋白”(在本文也称为“基本上不含其它污染蛋白”)定义为含有的污染蛋白小于20％(干重)、优选小于5％(干重)的各组分蛋白的不同制剂。各组分蛋白的功能形式可用在所附实施例中描述的克隆基因制备成纯化制剂。所谓“纯化的”，意思是，当指用来产生重建的蛋白混合物的组分蛋白制剂时，只有指示分子而基本上不含其它生物大分子，诸如其它蛋白(特别是在题述重建混合物中基本上掩蔽、减弱、混淆或改变所述组分蛋白或者作为纯化制剂或者在其功能方面的特征的其它蛋白)。本文所用的术语“纯化的”优选指占存在的同类型生物大分子至少80％(干重)，更优选在85％(干重)范围内，更优选95-99％(干重)，最优选至少99.8％(干重)(但水、缓冲剂及其它小分子，尤其是分子量小于5000的分子可以存在)。本文所用的术语“纯的”最好与刚才描述的“纯化的”具有相同数字限制。
术语“重组核酸”包括任何包含至少两个自然界中并不同时出现的序列的核酸。重组核酸可以在体外产生，例如用分子生物学方法产生；或者在体内产生，例如在新染色体位置通过同源重组或非同源重组插入核酸来产生。
术语“重组蛋白”是指用重组DNA技术产生的本发明蛋白，其中通常将编码被表达蛋白的DNA插入到合适的表达载体中，然后用其转化宿主细胞，产生异源蛋白。此外，短语“源于”就重组基因编码重组蛋白而言，意指包括在“重组蛋白”含义之中，所述蛋白含有天然蛋白的氨基酸序列或者与其相似的氨基酸序列，该相似的氨基酸序列因天然存在的蛋白突变(包括取代和缺失)而产生。
本文所用的“小分子”意指分子量小于约5kD、最优选小于约2.5kD的组合物。小分子可以是核酸、肽、多肽、肽模拟物、糖类、脂类或其它有机(含碳)分子或无机分子。许多制药公司具有庞大的化学和/或生物学混合物文库，包括一系列可用任何本发明试验方法筛选的小分子，通常是真菌提取物、细菌提取物或藻类提取物。
本文所用的术语“特异性杂交”是指本发明的核酸探针/引物与靶序列或其互补序列或其天然存在的突变体序列的至少12、15、20、25、30、35、40、45、50或100个连续核苷酸杂交的能力，致使其与细胞核酸(例如mRNA或基因组DNA)而不是靶基因的背景杂交小于15％、优选小于10％、更优选小于5％。许多杂交条件可用来检测特异性杂交，其严格性主要由杂交试验的洗涤阶段决定。一般而言，高温和低盐浓度严格性高，而低温和高盐浓度严格性低。低严格性杂交通过在例如约2.0×SSC于50℃洗涤而实现，高严格性用约0.2×SSC于50℃而实现。严格性的进一步说明见下述。
至于多肽，“基本序列同一性”指两个肽序列，当诸如通过使用缺省空位的GAP或BESTFIT程序进行最佳比对时，共享至少90％序列同一性，优选至少95％序列同一性，更优选至少99％序列同一性或更高。优选不同的残基位置差别是保守氨基酸取代。举例来说，化学性质如电荷或极性相似的氨基酸取代不会影响蛋白质的性质。实例包括天冬酰胺替代谷氨酰胺或天冬氨酸替代谷氨酸。
术语“肿瘤坏死因子α受体”或“TNFR”包括TNFR1、TNFR2及其功能性片段和类似物。术语TNFR也包括任何与TNF-α结合并转导此结合以至影响细胞内信号转导途径的多肽。
多肽的“变异体”，例如TNF-α、TNFR、TRCP1或TRCP2等的变异体包括嵌合蛋白、融合蛋白、突变蛋白、序列相似但不同的蛋白、蛋白片段、模拟物等等，只要所述变异体具有天然蛋白氨基酸序列的至少一部分或者与天然蛋白基本相同的氨基酸序列的至少一部分即可。“功能性变异体”包括至少保留天然蛋白的一种功能的变异体。本文所用的“肿瘤坏死因子α”或“TNF-α”包括TNF-α的功能性变异体。
III.
蛋白复合物
在某些实施方案中，本发明涉及新蛋白复合物的发现。在某些实施方案中，本发明的蛋白复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽和至少一种选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。所述蛋白复合物任选还包含至少一种选自以下的多肽：TRADD、TRAF2和TRAP2；或者已知与TNF-α或TNFR形成复合物的多肽，诸如TRAF1、RIP、RAIDD或FADD。
在一个具体的实施方案中，本发明的蛋白复合物包含TNF-α多肽、TNFR1多肽、NAK多肽、TRAF2多肽和TRADD多肽。
在另一个具体的实施方案中，本发明的蛋白复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽、NAK多肽、RasGAP3多肽、TRCP1多肽、TRCP2多肽、TRADD多肽、TRAF2多肽和TRAP2多肽。例如，所述复合物的TNFR多肽可以是TNFR1多肽或TNFR2多肽。
在进一步的实施方案中，本发明的蛋白复合物包含TNFR多肽和至少一种选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。所述蛋白复合物任选还包含至少一种选自以下的多肽：TRADD、TRAF2和TRAP2；或者已知与TNFR形成复合物的多肽，诸如TRAF1、RIP、RAIDD或FADD。
本发明也考虑了包含任意两个选自以下多肽的蛋白复合物：TNF-α、TNFR、NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。所述蛋白复合物任选还包含至少一种选自以下的多肽：TRADD、TRAF2和TRAP2；或者已知与TNFR形成复合物的多肽，诸如TRAF1、RIP、RAIDD或FADD。
复合物中一种或多种多肽任选是所述多肽的变异体，优选是所述多肽的功能性变异体。例如，在一个实施方案中，本发明的蛋白复合物包含TNF-α和NAK，其中TNF-α和/或NAK可以由TNF-α和/或NAK变异体表示。
本发明的复合物可以基本形式获得，例如以分离的复合物、重组复合物、纯化复合物等形式获得。在一个实施方案中，本发明提供例如从含此复合物的细胞中提取而制备的蛋白复合物。从细胞中提取可以用任何本领域许多已知方法完成。例如，复合物可以用一系列传统蛋白纯化步骤从细胞中提取，诸如离心、凝胶过滤、离子交换层析等，并且通常最好选择不使复合物解离的纯化步骤和条件。从细胞中提取也可用亲和纯化来完成。例如，所需复合物中一种或多种蛋白可以用包含亲和纯化标记(例如六组氨酸标记、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标记等)的融合蛋白形式来表达。所述复合物接着可用适当的亲和纯化法进行纯化(例如在六组氨酸标记的情况下，使其与镍或铜树脂接触；而在GST标记的情况下，使其与谷胱甘肽树脂接触)。在另一个优选形式中，本发明提供例如通过纯化表达于细胞如大肠杆菌(E.coli)的重组多肽形式以及体外重新构建复合物形式而制备的蛋白复合物。在某些实施方案中，复合物的一种或多种组分多肽由细胞的内源基因表达。在某些实施方案中，复合物是重组复合物，其中一种或多种组分多肽由重组核酸表达。
在某些实施方案中，本发明也包括标记的蛋白复合物，其中复合物中至少一种多肽是标记的。最优选所述标记是可检测标记，所述可检测标记选自但不限于放射性同位素、荧光化合物、酶和酶辅因子。在另一个实施方案中，所述标记是便于纯化、分离或检测所述多肽的标记。所述标记可以是多聚组氨酸、FLAG、谷氨酸-谷氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白和免疫球蛋白重链恒定区。在一个优选实施方案中，所述标记蛋白是TNF-α。在另一个优选实施方案中，所述标记蛋白是TNFR。
在一个实施方案中，本发明考虑了包含融合蛋白的蛋白复合物，其中所述融合蛋白包含一个便于纯化、分离或检测所述融合蛋白的的域。所述融合域可以选自例如多聚组氨酸、FLAG、谷氨酸-谷氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白和免疫球蛋白重链恒定区。一个优选的融合域是FLAG。在某些实施方案中，所述复合物包含TNF-α融合蛋白。在某些实施方案中，所述复合物包含TNFR融合蛋白。在某些实施方案中，所述复合物包含TNF-α融合蛋白和TNFR融合蛋白。
如上所述，在某些实施方案中，本发明的蛋白复合物包含复合物中任何多肽组分的至少一种片段。在某些实施方案中，所述复合物包含TNF-α多肽片段、全长TNFR多肽和选自以下的全长多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在某些实施方案中，所述复合物包含TNF-α多肽片段、TNFR多肽片段和选自以下的全长多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在某些实施方案中，所述复合物包含全长TNF-α多肽、TNFR多肽片段和选自以下多肽的片段：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在某些实施方案中，所述复合物包含全长TNF-α多肽、全长TNFR多肽和选自以下多肽的片段：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在某些实施方案中，所述复合物包含TNF-α多肽片段、全长TNFR多肽和选自以下多肽的片段：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在某些实施方案中，所述复合物包含TNF-α多肽片段、TNFR多肽片段和选自以下多肽的片段：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
在优选实施方案中，任何上述多肽的片段是功能性片段，例如其保留了结合复合物中至少一种其它多肽的能力。TNFR1的功能性片段的一个实例是包含TNFR1的胞内死亡域(DD)的片段，即TNFR1C端的约80个氨基酸。功能性片段的另一个实例是包含NAK的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化域(S_TKc)的片段，即NAK N端的约235个氨基酸。在某些实施方案中，复合物中的片段包含一个选自以下的RasGAP3域：1)蛋白激酶C保守区2域(C2)，即N端约100个氨基酸；2)RasGAP域，即中心区内约320个氨基酸；3)血小板-白细胞C激酶底物同源域(PH)，即C端约100个氨基酸；4)BTK域，即C端约35个氨基酸。
在某些实施方案中，本发明的复合物是水溶性形式(“可溶性复合物”)。例如，可溶性复合物包含TNFR的可溶性胞质部分和至少一种选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。这些蛋白复合物任选还包含至少一种选自TRADD、TRAF2和TRAP2的多肽或已知与TNFR形成复合物的蛋白，诸如TRAF1、RIP、RAIDD或FADD。在某些实施方案中，所述复合物是水不溶性形式，或者是膜结合形式。例如，具有跨膜域(例如全长TNFR)的蛋白的复合物通常会是水不溶性的。水不溶性复合物可以制备成例如包含脂质、去垢剂和/或其它成分的脂质胶束、去垢剂胶束或混合胶束。不溶性复合物也可以制备成来自细胞的膜部分。膜部分可以是粗制膜部分，其中膜部分简单地通过离心或过滤等方法从细胞的可溶性部分中分离出来。可以通过针对复合物中一种或多种蛋白中存在的亲和标记物的亲和纯化方法，进一步纯化膜部分。在复合物存在于脂质双层中的情况下，该脂质双层可以是例如囊泡双层(任选翻转，即以正常细胞外的面向里朝着囊泡内部)或平面双层。在其中复合物包含TNFR的实施方案中，所述TNFR最好是TNFR1或其变异体(例如可溶性胞质部分、DD域等)。
在某些实施方案中，本发明也提供产生功能性蛋白复合物的其它方法。在一个优选实施方案中，所述方法包括(i)用编码选自以下多肽的多核苷酸转染细胞：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；(ii)使所述细胞与TNF-α多肽接触；(iii)从而形成蛋白复合物。
IV.
蛋白复合物的多肽
在某些方面，本发明的复合物包含选自以下的多肽以及本文描述的额外成分及其变异体多肽：TNF-α、TNFR、NAK、RasGAP3、TRCP1、TRCP2、TRADD、TRAF2和TRAP2。在某些实施方案中，变异体多肽的氨基酸序列与SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中任一个所示的氨基酸序列有至少75％相同。在其它实施方案中，变异体多肽的氨基酸序列与SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中任一个所示的氨基酸序列有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。所述复合物的优选多肽为天然人NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2序列(SEQ ID No：13、15、17和19)。
在某些方面，蛋白复合物包含可作为SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中任一个所示的多肽的激动剂或拮抗剂的变异体多肽。这些多肽的变异体可能具过度活性或组成型活性，或者可以阻止蛋白复合物的TNF-α依赖性形成。例如，缺乏一个或多个域的截短形式可以具有显性失活作用。
在某些方面，蛋白复合物包含从SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中任一个所示的全长多肽获得的变异体多肽。可以通过筛选SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20中任一个所示的核酸(编码这些多肽)的相应片段重组产生的多肽，来得到这些多肽的分离的肽基部分。另外，片段可用本领域已知的常规Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学法等技术进行化学合成。例如，任何一个题述蛋白可任意分成不含片段重叠的理想长度的片段，或者优选分成理想长度的重叠片段。可以产生(重组或化学合成)所述片段，并对其进行测试，以鉴定出或者可用作TNFR蛋白复合物形成的激动剂或者可用作TNFR蛋白复合物形成的拮抗剂的那些肽基片段。
在某些方面，蛋白复合物包括含一个或多个融合域的变异体多肽。这些融合域的熟知实例包括例如多聚组氨酸、谷氨酸-谷氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白和免疫球蛋白重链恒定区(Fc)，即麦芽糖结合蛋白(MBP)，这些在通过亲和层析分离融合多肽时特别有用。为了亲和纯化的目的，使用亲和层析的有关基质，例如谷胱甘肽、淀粉酶以及镍或铜缀合的树脂。许多这样的基质以“试剂盒”形式供应，诸如Pharmacia GST纯化系统和与(HIS6)融合伴侣(fusion partner)一起使用的QIAexpressTM系统(Qiagen)。
本领域众所周知的另一融合域是绿色荧光蛋白(GFP)。该融合伴侣作为荧光“标记”，使得本发明融合多肽通过荧光显微镜法或流式细胞术鉴定出来。该GFP标记用于评价本发明融合多肽的亚细胞定位或者评价蛋白复合物的至少两种多肽的共同定位，其中一个多肽与GFP融合。该GFP标记也用于通过流式细胞计数法如荧光激活细胞分选法(FACS)来分离表达本发明融合多肽的细胞。
融合域也包括“附加表位”，它是可得到特异性抗体的短肽序列。容易得到特异性单克隆抗体的熟知附加表位包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标记物。
在某些情况下，所述融合域具蛋白酶切割位点，诸如对于因子Xa或凝血酶，使得相关蛋白酶可以部分消化本发明的融合多肽，并因此从中释放出重组多肽。然后，通过后续层析分离法，所释放的多肽可以从融合伴侣中分离出来。
在某些实施方案中，所述复合物的重组蛋白可由本领域技术人员用下述文献中介绍的标准方案很方便地制备，该文献包括Sambrook等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，1989)；Current Protocols In Molecular Biology，Ausubel等编著；和Current Protocols in Protein Science，Coligan等编著。
在某些实施方案中，复合物中多肽的变异体可以通过在天然多肽序列中进行一个或多个保守取代来产生。例如，合理的预测是，仅仅用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，丝氨酸取代苏氨酸，或者结构相关氨基酸之间的相似取代(即保守突变)，将不会对所得分子的生物活性产生重大影响。保守取代是发生于其侧链相关的氨基酸家族之内的取代。遗传编码的氨基酸可分为四个家族：(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性氨基酸＝赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性氨基酸＝丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不带电荷极性氨基酸＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有时也被共同地分为芳族氨基酸。以同样的方式，全部氨基酸可分类为(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性氨基酸＝赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)脂肪族氨基酸＝甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，任选丝氨酸和苏氨酸可被分为脂肪族-羟基组；(4)芳族氨基酸＝苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸；(5)酰胺氨基酸＝天冬酰胺，谷氨酰胺；和(6)含硫氨基酸＝半胱氨酸和甲硫氨酸(参见例如Biochemistry，第2版，L.Stryer编著，W.H.Freeman and Co.，1981)。多肽氨基酸序列的改变是否产生功能性同系物，可容易地用评定变异体多肽以野生型蛋白类似方式在细胞内产生反应的能力来确定。例如，可以对SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中任一个所示的多肽变异体形式进行评价，例如，其结合蛋白复合物中另一多肽的能力进行评价。发生不止一个取代的多肽可以用相同的方式容易地进行测试。
在某一实施方案中，本发明还考虑了产生系列题述多肽组合突变体以及截短突变体的方法，并且本发明尤其可用于鉴定在本发明蛋白复合物形成中起作用的潜在变异体序列(例如同系物)。筛选这样的组合文库的目的是产生例如或者可用作激动剂或拮抗剂或者同时具有新活性的同系物。可以产生相对于天然存在的多肽具有选择性效力的组合来源的同系物。这些蛋白，当由重组DNA构建体表达时，可用于本文描述的试验方案中。以同样的方式，SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中任一个所示的题述多肽的同系物，可用本发明组合方法产生，用作拮抗剂，因为它们能够干扰相应野生型蛋白在本发明蛋白复合物中起作用的能力。
其它诱变形式也可用来产生组合文库。例如题述蛋白同系物(激动剂形式和拮抗剂形式)可用下述筛选方法从文库中产生和分离：例如丙氨酸扫描诱变等(Ruf等，(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang等，(1994)J.Biol.Chem.269：3095-3099；Balint等，(1993)Gene 137：109-118；Grodberg等，(1993)Eur.J.Biochem.218：597-601；Nagashima等，(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman等，(1991)Biochemistry 30：10832-10838；和Cunningham等，(1989)Science 244：1081-1085)、接头扫描诱变(Gustin等，(1993)Virology 193：653-660；Brown等，(1992)Mol.Cell Biol.12：2644-2652；McKnight等，(1982)Science 232：316)；饱和诱变(Meyers等，(1986)Science 232：613)；PCR诱变(Leung等，(1989)Method Cell Mol.Biol.1：11-19)；或随机诱变，包括化学诱变等(Miller等，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY；和Greener等，(1994)Strategiesin Mol.Biol.7：32-34)。接头扫描诱变，特别在组合设置中是鉴定题述蛋白截短(生物活性)形式的具吸引力的方法。
许多用于筛选通过点突变和截短制备的组合文库的基因产物以及用于筛选具有某种性质的基因产物的cDNA文库的技术，是本领域已知的。这些技术通常适用于快速筛选通过题述蛋白同系物的组合诱变产生的基因文库。最广泛应用的筛选大基因文库的技术，通常包括将该基因文库克隆到复制型表达载体中，用所产生的载体文库转化合适的细胞，然后在所需活性的检测便于相对容易地分离出编码其产物可被检测的基因的载体的条件下，表达该组合基因。
在某一实施方案中，本发明也提供用于减少产生变异体的多肽，所述变异体是肽或非肽化合物等模拟物，并且可以模拟真蛋白与其它细胞组分(cellular partner)的结合。如上所述的这些诱变技术在对参与蛋白-蛋白相互作用、涉及例如本发明蛋白复合物的组装的多肽的决定簇作图方面也特别有用。为了说明，可以测定多肽(例如NAK)关键残基，该残基涉及相互作用蛋白(例如TNFR或TNF-α)的分子识别，并可将其用于产生结合TNFR、并通过抑制NAK结合来抑制蛋白复合物的组装或信号转导活性的来源于NAK多肽的肽模拟物。通过应用如扫描诱变对涉及与另一多肽结合的多肽氨基酸残基作图，可以产生模拟参与结合的那些残基的肽模拟物化合物。例如，用以下化合物可以产生这类残基的未水解肽类似物：苯并二氮杂类(例如参见Freidinger等，Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall编著，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)、氮杂(例如参见Huffman等，Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall编著，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)、取代γ内酰胺环(Garvey等，Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall编著，ESCOMPublisher：Leiden，Netherlands，1988)、酮亚甲基假肽(Ewenson等，(1986)J.Med.Chem.29：295；和Ewenson等，Peptides：Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce ChemicalCo.Rockland，IL，1985)、b-转角二肽核心(Nagai等，(1985)TetrahedronLett.26：647；和Sato等，(1986)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1：1231)和b-氨基乙醇(Gordon等，(1985)Biochem Biophys Res.Commun.126：419；和Dann等，(1986)Biochem Biophys Res.Commun.134：71)。
V.
核酸
在某些方面，本发明的复合物包含选自以下的核酸编码多肽以及本文描述的额外组分：TNF-α、TNFR、NAK、RasGAP3、TRCP1、TRCP2、TRADD、TRAF2、TRAP2。核酸可进一步理解为包括SEQ IDNo：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的变异体在内的核酸。变异体核苷酸序列包括差别是一个或多个核苷酸取代、添加或缺失的序列，诸如等位基因变异体；因此，包括例如由于遗传密码简并性而不同于所述编码序列的核苷酸序列的编码序列。在某些实施方案中，变异体核苷酸将也包括在高严格性条件下与SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20中任一个所示的编码序列的核苷酸序列杂交的序列。本领域普通技术人员将会很容易地理解，促进DNA杂交的合适严格性条件可以变动。例如，可以在6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)于45℃进行杂交，接着用2.0xSSC于50℃洗涤。例如，洗涤阶段盐浓度可选自低严格性的约2.0xSSC于50℃到高严格性的约0.2xSSC于50℃。此外，洗涤阶段的温度可从低严格性条件在室温(约22℃)升高至高严格性条件于约65℃。温度和盐可以同时改变，或者温度或盐浓度保持恒定，而另一个改变。在一个实施方案中，本发明提供可在6xSSC于室温的低严格性条件下杂交后用2xSSC于室温洗涤的核酸。
由于遗传密码简并性而不同于SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的分离的核酸也属于本发明范畴。例如，多数氨基酸由不止一个三联体密码指定。指定同一氨基酸的密码子即同义密码子(例如CAU和CAC是组氨酸的同义密码子)，可导致不会影响蛋白质氨基酸序列的“沉默”突变。然而，预期在哺乳动物细胞中将会存在确实会导致题述蛋白的氨基酸序列发生变化的DNA序列多态性。本领域技术人员将会认识到，在已知物种的许多个体中由于天然等位基因变异而可能存在编码特定蛋白的核酸的一个或多个核苷酸(高达约核酸的3-5％)发生这些变异。任何和所有这样的核苷酸变异及产生的氨基酸多态性全都在本发明的范围之内。
VI.
宿主细胞
在一个实施方案中，本发明提供包含编码本发明蛋白复合物的任意三种多肽或其变异体的至少三种核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，第一核酸包含编码TNF-α多肽的重组核酸，其中第二核酸包含编码TNFR多肽的重组核酸，并且其中第三核酸包含编码选自以下多肽的重组核酸：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在一个实施方案中，第二核酸编码TNFR1多肽。在另一个实施方案中，第二核酸编码TNFR2多肽。在一个实施方案中，第三核酸编码NAK多肽。在另一个实施方案中，第三核酸编码RasGAP3多肽。在另一个实施方案中，第三核酸编码TRCP1多肽。在另一个实施方案中，第三核酸编码TRCP2多肽。
在某些方面，本发明提供包含编码本发明蛋白复合物的任意两种多肽或其变异体的至少两种核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，第一核酸包含编码TNFR多肽的重组核酸，其中第二核酸包含编码选自以下多肽的重组核酸：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。在一个实施方案中，第一核酸编码TNFR1多肽。在另一个实施方案中，第一核酸编码TNFR2多肽。在一个实施方案中，第二核酸编码NAK多肽。在另一个实施方案中，第二核酸编码RasGAP3多肽。在另一个实施方案中，第二核酸编码TRCP1多肽。在另一个实施方案中，第二核酸编码TRCP2多肽。
在进一步方面，本发明提供包含编码TRCP1、TRCP2或其变异体的重组核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可用于如纯化、制备或研究蛋白或蛋白复合物。任选宿主细胞可用于如诸如下述方法在试验方案中测试化合物。
在某些实施方案中，本发明复合物多肽的重组表达可以独立进行，再形成复合物。在另一个实施方案中，本发明复合物多肽的重组表达可在同一细胞中进行，再形成复合物。
合适的重组表达宿主细胞包括细菌(诸如大肠杆菌、梭菌(Clostridium sp.，)、假单胞菌(Pseudomonas sp.))、酵母、植物细胞、昆虫细胞(例如Sf9)以及哺乳动物细胞诸如成纤维细胞、淋巴细胞、U937细胞(或其它前单核细胞系)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。
为使宿主细胞表达，可以将重组核酸在表达构建体中与一个或多个调节序列有效连接。调节核苷酸序列通常适合表达所用的宿主细胞。对于不同的宿主细胞，许多类型的合适表达载体和合适调节序列是本领域已知的。通常，所述一个或多个调节核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列以及增强子序列或活化子序列(activator sequence)。本发明考虑了本领域已知的组成型启动子或诱导型启动子。所述启动子可以是天然存在的，也可以是组合不止一个启动子元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞内的附加体(诸如质粒)上，也可以插入到染色体中。在一个优选实施方案中，所述表达载体包含使得可以选择转化宿主细胞的选择标记基因。选择标记基因是本领域众所周知的，并且将随所用的宿主细胞而变化。
所述表达载体也可以包括融合域(通常由表达载体提供)，致使本发明的重组多肽与所述融合域一起以融合多肽的形式表达。所述融合域的主要优点在于其可帮助鉴定和/或纯化所述融合多肽，并且也可提高蛋白质表达水平和总收率。
VII.
抗体及其应用
本发明的另一方面涉及分离的抗体，所述抗体与选自以下的多肽的表位特异性免疫反应：TNF-α、TNFR、NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，TRADD、TRAF2和TRAP2；或者与已知与TNF-α形成复合物的蛋白诸如TRAF1、RIP、RAIDD或FADD特异性免疫反应，其中所述抗体破坏本发明复合物的形成。通过使用源自NAK多肽(例如基于cDNA序列)的免疫原，可用标准方案来制备抗蛋白/抗多肽抗血清或单克隆抗体(参见例如Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane编著(Cold Spring Harbor Press：1988))。
在一个实施方案中，本发明的抗体破坏TNF-α和NAK之间相互作用的形成。在另一个实施方案中，本发明的抗体破坏TNF-α和RasGAP3之间相互作用的形成。在另一个实施方案中，本发明的抗体破坏TNF-α和TRCP1之间相互作用的形成。在另一个实施方案中，本发明的抗体破坏TNF-α和TRCP2之间相互作用的形成。
在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗体是Fab片段。在一个实施方案中，本发明抗体带有可检测标记。
哺乳动物，诸如小鼠、仓鼠或兔可用所述多肽(例如NAK多肽或可引起抗体应答的抗原片段或上述融合蛋白)的免疫原形式进行免疫。赋予蛋白或多肽免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域其它众所周知的技术。多肽的免疫原性部分可在佐剂存在下给予。免疫过程可用检测血浆或血清的抗体效价来监测。标准ELISA或其它免疫测定可以与作为抗原的免疫原一起用来评定抗体水平。在一个优选实施方案中，题述抗体对SEQ ID NO：14、16、18和20中任一个所示的多肽的抗原决定簇具有免疫特异性。
本发明考虑了对死亡域(DD)具有特异性的抗体，优选该DD域是TNFR多肽的一部分。在一个更具体的实施方案中，该DD域是TNFR1的C端长约80个氨基酸的区，如SEQ ID NO：3中所示。
用题述多肽的抗原制剂免疫动物后，可以获得抗血清，如有需要，可以从血清中分离出多克隆抗体。为了生产单克隆抗体，可以从免疫动物中收获抗体生产细胞(淋巴细胞)，并通过标准体细胞融合方法，将其与无限增殖细胞诸如骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞。这些技术是本领域众所周知的，并且包括例如杂交瘤技术(最早由Kohler和Milstein开发，(1975)Nature，256：495-497)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等，(1983)Immunology Today，4：72)以及产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1985)Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.第77-96页)。可以用免疫化学法筛选产生与本发明多肽发生特异性反应的抗体的杂交瘤细胞，然后从含有所述杂交瘤细胞的培养物中分离出单克隆抗体。在一个实施方案中，抗NAK抗体与由具有SEQ ID NO：14的核酸编码的蛋白特异性反应。
本文所用的术语抗体意指包括其也与题述多肽之一特异性反应的片段。采用常规技术，获得抗体片段，并且可以以与完整抗体的相同方式，根据用途对所述片段进行筛选。例如，可以用胃蛋白酶处理抗体，获得F(ab)2片段。可以对产生的F(ab)2片段进行处理，使二硫键还原，从而产生Fab片段。
本发明的抗体意指还包括对题述多肽之一具有亲和力的双特异性分子、单链分子、嵌合分子和人源化分子，该亲和力是由抗体的至少一个CDR区所赋予的。在优选实施方案中，该抗体还包含与其连接并可以被检测的标记(例如所述标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。
VIII.
药物筛选试验
在某些实施方案中，本发明提供用于鉴定抑制或增强本发明蛋白复合物稳定性的试验化合物的试验。在一个方面，该试验检测了抑制或增强本发明蛋白复合物中一种多肽与另一种多肽之间相互作用的试验化合物。
在某些实施方案中，该试验检测了调节所述蛋白复合物信号转导活性的试验化合物，所述活性例如结合其它细胞组分，激活酶诸如胱冬蛋白酶、脂肪酶、激酶和磷酸酯酶，激活NF-κB转录活性等。
各种各样的试验方式全都够用，并且根据本文的公开内容，本文没有具体描述的试验方式仍可以被本领域普通技术人员所理解。试验方式近似于蛋白复合物形成等条件，如酶活性，并且可以许多不同的形式产生，并且包括基于无细胞系统如纯化蛋白或细胞裂解物的试验，以及使用完整细胞的基于细胞的试验。简单结合试验可用于检测抑制或增强复合物中一种多肽与另一种多肽之间相互作用或者所述复合物与底物的结合的化合物。待测化合物可用例如细菌、酵母或其它生物生产(例如天然产物)，化学合成(例如小分子，包括肽模拟物)，或者重组方式生产。
在许多实施方案中，将细胞与候选化合物一起孵育后进行操作，然后检测本发明蛋白复合物的活性。在某些实施方案中，蛋白复合物活性的生物测定可以包括细胞凋亡试验(例如胱冬蛋白酶和TUNEL试验)和NF-κB活性试验(例如NF-κB萤光素酶或GFP报道基因试验)。
示例性的细胞凋亡试验(例如胱冬蛋白酶和TUNEL试验)可以按照Chaisson等，(2002)J.Clin.Invest.110：193-202中描述的方法进行。将细胞与候选化合物一起孵育，或者不做处理。然后将细胞裂解物与胱冬蛋白酶-3荧光底物DEVD-AMC(Alexis Corp.，San Diego，California，USA)一起孵育1小时。采用荧光读板器(Packard instrumentCo.，Meriden，Connecticut，USA)，在激发波长为360nm，发射波长为460nm，定量测定荧光。对于TUNEL试验，采用POD原位细胞死亡检测试剂盒(POD In Situ Cell Death Detection kit)(Roche DiagnosticsInc.)，按照生产商的说明，检测凋亡的细胞核。对于每个玻片，统计30个视野(x400)内的阳性细胞核。
示例性的NF-κB萤光素酶或GFP报道基因试验可以按照Shona等，(2002)Febs Letters.515：119-126中描述的方法进行。简而言之，用NF-κB-萤光素酶报道基因转染细胞。然后，将转染细胞与候选化合物一起孵育。随后，测定用或者不用所述化合物处理的细胞的NF-κB-刺激的萤光素酶活性。或者，可以用NF-κB-GFP报道基因(Stratagene)转染细胞。然后将转染细胞与候选化合物一起孵育。随后，用荧光/可见光显微镜装置或者用FACS分析，测定GFP表达，从而监测NF-κB-刺激的基因活性。
在某些实施方案中，本发明提供重建蛋白制剂，所述制剂包括所述复合物的多肽和所述复合物的一种或多种相互作用多肽。本发明试验包括体外标记的蛋白-蛋白结合试验、蛋白结合免疫测定等。纯化蛋白也可用于测定用来对分子间作用建模的三维晶体结构。
在所述试验的某些实施方案中，复合物的组分多肽对选择来支持试验的细胞可以是内源性的。或者，部分或全部组分多肽也可是外源的。例如，可以通过重组技术(例如通过使用表达载体)，以及通过显微注射融合蛋白本身或者编码融合蛋白的mRNA，将融合蛋白导入细胞中。
在所述试验的进一步的实施方案中，可以利用支持题述试验的细胞培养技术，在完整细胞中产生复合物。例如，如下所述，可以在真核细胞培养系统(包括哺乳动物和酵母细胞)中，构建复合物。在完整细胞中建立题述试验的优点包括检测在更加接近化合物治疗应用所需的环境中起作用的化合物的能力，包括化合物进入细胞的能力。此外，本项试验的某些体内实施方案，例如下文给出的实施例，适合于对候选化合物的高通量分析。
在本项试验的某些体外实施方案中，重建复合物包含至少半纯化蛋白的重建混合物。所谓半纯化，是指先前已从其它细胞蛋白中分离的重建混合物中所使用的蛋白。例如，与细胞裂解物相反，相对于所述混合物中的所有其它蛋白，所述混合物中参与复合物形成的蛋白的纯度至少为50％，更优选纯度为90-95％。在题述方法的某些实施方案中，通过将高纯度蛋白进行混合，获得重建蛋白混合物，致使所得重建混合物基本不含其它可能干扰或者改变复合物组装和/或分解测定能力的蛋白(例如细胞源性蛋白)。
在某些实施方案中，在存在或不存在候选化合物的情况下，试验可以在任何适于盛装所述反应物的容器内完成。实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。
在某些实施方案中，可以建立根据试验化合物干扰本发明复合物的组装、稳定性或功能的能力检测试验化合物的药物筛选试验。在一个示例性的结合试验中，使目标化合物与包含以下组分的混合物接触：TNF-α多肽、TNFR多肽和至少一种选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。对复合物的检测和定量为测定化合物抑制(或增强)两种组分多肽之间相互作用的功效提供了方法。根据用不同浓度的试验化合物所获得的数据，绘制剂量反应曲线，可以对化合物的功效进行评价。此外，也可以进行对照试验，以提供供比较用的基线。在对照试验中，在不存在试验化合物的情况下，对复合物的形成进行定量。
在某些实施方案中，复合物中任意两种多肽间缔合作用或者复合物多肽与底物多肽间缔合作用，可以通过多种技术来检测，其中许多方法上文已充分描述。例如，复合物形成中的调节可用下述方法来定量：例如可检测标记的蛋白(例如放射性标记、荧光标记或酶标记)、免疫测定或层析检测。诸如那些得自Biacore International AB(Uppsala，Sweden)的表面胞质团共振系统也可用来检测蛋白-蛋白相互作用。
在某些实施方案中，可以将复合物中的一种多肽固定化，以促进与某一多肽未复合的形式中分离出复合物，以及适应试验的自动化。在一个说明性实施方案中，提供添加一个使该蛋白与不溶性基质结合的域的融合蛋白。例如，GST-NAK融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板上，然后与潜在相互作用蛋白结合(例如35S-标记的TNFR多肽)，并将试验化合物在有利于复合物形成的条件下进行保温。保温后，洗涤所述珠，去除任何未结合的相互作用蛋白，然后直接测定基质珠结合的放射性标记(例如将珠置于闪烁体中)；或者解离复合物后测定上清液中的放射性标记，例如使用微量滴定板时。或者，在洗去未结合蛋白后，可以使复合物与基质解离，用SDS-PAGE凝胶分离，采用标准电泳技术，根据凝胶，对基质结合部分中存在的相互作用多肽水平进行定量。
在一个进一步的实施方案中，与复合物结合的化合物可用固定化复合物鉴定。在一个说明性实施方案中，可以提供添加一个使该蛋白与不溶性基质结合的域的复合物的融合蛋白。例如，包含GST-TNF-α融合蛋白组分的复合物可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(SigmaChemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板上，然后与潜在标记结合的化合物结合，并在有利于结合的条件下保温。保温后，洗涤所述珠，去除未结合的化合物，然后直接测定基质珠结合的标记，或者解离结合的化合物后测定上清液中的标记。
在另一个实施方案中，双杂合试验(也称为相互作用阱试验)可用于检测复合物中任意两种多肽的相互作用(另见美国专利第5,283,317号；Zervos等，(1993)Cell 72：223-232；Madura等，(1993)J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel等，(1993)Biotechniques 14：920-924；和Iwabuchi等，(1993)Oncogene 8：1693-1696)，以及用于随后检测抑制或增强蛋白彼此结合的试验化合物。本试验包括提供宿主细胞，例如酵母细胞(优选)、哺乳动物细胞或细菌细胞类型。所述宿主细胞包含报道基因，所述基因携带用于饵蛋白的转录激活因子DNA结合域的结合位点，使得当该报道基因转录激活时该基因表达可检测的基因产物。提供能够在宿主细胞中表达并编码“饵”融合蛋白的第一嵌合基因。也提供能够在宿主细胞中表达并编码“鱼”融合蛋白的第二嵌合基因。在一个实施方案中，将第一嵌合基因和第二嵌合基因均以质粒形式导入宿主细胞中。然而，优选所述第一嵌合基因存在于宿主细胞的染色体中，而所述第二嵌合基因作为质粒的一部分形式导入宿主细胞中。
优选第一杂合蛋白的DNA结合域与第二杂合蛋白的转录激活域均来源于具有独立的DNA结合域和转录激活域的转录激活因子。例如，已知这些独立的DNA结合域和转录激活域存在于酵母GAL4蛋白以及酵母GCN4蛋白和ADR1蛋白中。许多涉及转录的其它蛋白也具有独立的使得它们对本发明有用的结合域和转录激活域，并且包括如LexA蛋白和VP16蛋白。人们知道，其它(相当多)转录-无效的DNA结合域可用于题述构建体中；诸如ACEl、lcI、乳糖阻抑蛋白、jun或fos的域。另一个实施方案中，DNA结合域和转录激活域可来自不同的蛋白。LexA DNA结合域的应用有某些优点。例如，在酵母中，LexA部分不具有激活功能，并且已知对酵母基因的转录没有影响。另外，LexA的应用使得可以在试验的灵敏度范围内控制相互作用的水平(参见例如the Brent等，PCT公布号WO94/10300)。
在某些实施方案中，本发明提供用于鉴定抑制或增强所述复合物稳定性的试验化合物的双杂合试验。为了说明，将包含TNFR多肽的第一融合蛋白(即“饵”蛋白)和包含选自以下多肽的第二融合蛋白(即“鱼”蛋白)导入宿主细胞中：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。将细胞置于饵和鱼融合蛋白以足以激活报道基因的量表达的条件下。复合物中这两种融合多肽的相互作用导致报道基因表达产生的可检测信号。因此，在存在和不存在试验化合物的情况下，可以通过检测每种情况下报道基因的表达水平，来评价这两种融合蛋白之间的相互作用水平。各种报道构建体可以按照本发明的方法使用，并且包括例如产生选自诸如以下可检测信号的报道基因：酶信号、荧光信号、磷光信号和药物抗性。
在许多测试化合物和天然提取物文库的药物筛选程序中，高通量试验可望用来在规定的时间内使待测化合物数目最大化。在无细胞系统中进行的本发明试验，诸如用纯化或半纯化蛋白或细胞裂解物建立的试验往往优选作为“初级”筛选，这是由于其产生可允许快速开发并相对容易地检测由试验化合物介导的分子靶的改变。此外，该试验化合物的细胞毒性作用和/或生物利用度在体外系统中常常可以忽略不计，该试验转而主要针对药物对分子靶的作用，在与其它蛋白结合亲和性的改变或分子靶的酶学性质改变中可以得到证实。
在某些实施方案中，蛋白复合物活性可以包括但不限于蛋白复合物的形成，其可以通过共免疫沉淀蛋白的免疫沉淀和分析或者通过共纯化蛋白的亲和纯化和分析来评价。基于荧光共振能量转移(FRET)的试验也可用于测定复合物的形成。具合适发射光谱和激发光谱、彼此紧密接近的荧光分子可以显示FRET。要选择那些一个分子(供体分子)的发射光谱与另一个分子(受体分子)的激发光谱重叠的荧光分子。供体分子被供体激发光谱范围内适当强度的光所激发。该供体然后发射吸收能量像荧光。其产生的荧光能量被受体分子猝灭。当来自供体的荧光信号强度衰减、其激发状态寿命的减少和/或受体荧光特有的较长波长(低能)再发射发生时，证明了FRET效应。当荧光蛋白在物理上分离时，FRET效应减少或消失(美国专利第5,981,200号)。
例如，氰基荧光蛋白受约425-450纳米波长光激发并发射450-500纳米范围的光。黄色荧光蛋白在约500-525纳米波长光激发并发射525-500纳米范围的光。如果这两种蛋白置于溶液中，氰基荧光蛋白和黄色荧光蛋白分别可见。但是，如果这两种蛋白在外力作用下相互紧密靠近，其荧光性质将被FRET改变。CFP发射的带蓝色的光将被YFP吸收并发射出黄光。这意味着当蛋白被波长450纳米的光激发时，氰基发射的光急剧减少，而正常情况下不受此波长光激发的黄光急剧增加。通常可以通过测定对供体激发光范围的光刺激引起的发射光谱，并计算供体发射光与受体发射光间的比率，来监测FRET。当该供体：受体发射比率高时，FRET没有发生，并且两种荧光蛋白没有紧密靠近。当该供体∶受体发射比率低时，FRET发生，并且两种荧光蛋白紧密靠近。用这种方式，可以测定第一多肽和第二多肽之间的相互作用。
FRET的发生率也可引发供体荧光部分的荧光寿命减少。荧光寿命的这种变化可以用所谓荧光寿命成像技术(FLIM)来测定(Verveer等，(2000)Science 290：1567-1570；Squire等，(1999)J.Microsc.193：36；Verveer等，(2000)Biophys.J.78：2127)。开发出用于分析FLIM的全局分析技术。这些算法利用以下的知识：供体荧光部分以仅有的数目有限的状态存在，每个状态都具有不同的荧光寿命。每个状态的定量图基于点对点(pixel-by-pixel)产生。
为了进行基于FRET的试验，复合物多肽(例如TNFR)和相互作用目标蛋白(例如NAK)都进行荧光标记。鉴于本发明说明书，合适的荧光标记是本领域众所周知的。实例在下面提供，但未作具体讨论的合适荧光标记也可被本领域技术人员使用。荧光标记可以通过表达荧光蛋白如分离自水母、珊瑚及其它腔肠动物的荧光蛋白与多肽的融合蛋白来完成。示例性的荧光蛋白包括水母(Aequoria victoria)绿色荧光蛋白(GFP)的许多变异体。变异体或明或暗或有不同的激发和/或发射光谱。某些变异体出现很大变化，它们不再显绿色，而显蓝色、蓝绿色、黄色或红色(分别称为BFP、CFP、YFP和RFP)。荧光蛋白可以通过多种共价键和非共价键(包括如肽键)(例如以融合蛋白形式表达)、化学交联和生物素-链霉抗生物素偶联与多肽稳定连接。例如荧光蛋白，参见美国专利5,625,048；5,777,079；6,066,476；6,124,128；Prasher等(1992)Gene，111：229-233；Heim等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：12501-04；Ward等(1982)Photochem.Photobiol.，35：803-808；Levine等(1982)Comp.Biochem.Physiol.，72B：77-85；Tersikh等(2000)Science 290：1585-88。
基于FRET的试验可用于基于细胞的试验和无细胞试验。基于FRET的试验适合于高通量筛选方法，包括荧光激活细胞分选术和微量滴定阵列荧光扫描试验。
一般而言，在筛选试验是结合试验(是否蛋白-蛋白结合，化合物-蛋白结合等)的情况下，一个或多个分子可与标记结合，其中所述标记可直接或间接提供可检测信号。各种标记包括放射性同位素、荧光、化学发光、酶、特异性结合分子、颗粒例如磁性颗粒等。特异性结合分子包括对偶，诸如生物素和链霉抗生物素、地高辛和抗地高辛等。对特异性结合成员来说，互补成员通常按已知方法用可供检测的分子来标记。
在筛选试验中可以包括各种其它试剂。这些试剂包括像盐、中性蛋白如白蛋白、去垢剂等，它们都可用来促进蛋白-蛋白理想结合和/或减少非特异性或背景相互作用。可用提高试验效率的试剂，诸如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物化合物等。按任何顺序加入各组分的混合物，以便提供必要的结合。孵育可在任何合适温度下进行，通常在4℃到40℃之间。孵育周期以最佳活性为标准选择，但也要考虑最优化促进快速高通量筛选。
在某些实施方案中，本发明提供不依赖复合物的试验，其针对复合物中的一种多肽，诸如TRCP1或TRCP2。这样的试验包括对作为炎症或细胞凋亡候选调节剂的试验化合物的鉴定。
在一个示例性实施方案中，结合TRCP1或TRCP2的化合物可用固定化TRCP1多肽或TRCP2多肽来鉴定。在一个说明性实施方案中，可以提供TRCP1或TRCP2融合蛋白，其添加了一个可使该蛋白与不溶性基质结合的域。例如TRCP1或TRCP2与GST的融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板上，然后与潜在的标记化合物结合，并在有利于结合的条件下保温。保温后，洗涤所述珠，去除未结合的化合物，然后直接测定基质珠结合的放射性标记，解离复合物后测定上清液中的放射性标记。
在某些实施方案中，标记可以直接或间接提供可检测信号。各种标记包括放射性同位素、荧光、化学发光、酶、特异性结合分子、颗粒例如磁性颗粒等。特异性结合分子包括对偶，诸如生物素和链霉抗生物素、地高辛和抗地高辛等。对特异性结合成员来说，互补成员通常按已知方法用可供检测的分子来标记。在某些实施方案中，所述方法包括在体内形成混合物。在某些实施方案中，所述方法包括通过在体外形成混合物的基于细胞的试验。在某些实施方案中，所述方法包括使表达TRCP1多肽或TRCP2多肽或其变异体的细胞与试验化合物接触。
在某些实施方案中，试验基于无细胞系统如纯化蛋白或细胞裂解物以及使用完整细胞的基于细胞的试验。简单结合试验可用于检测与TRCP1多肽或TRCP2多肽相互作用的化合物。待测化合物可用如细菌、酵母或其它生物生产(例如天然产物)，化学合成(例如小分子，包括多肽类似物)，或重组方式生产。
任选自此试验鉴定的化合物可用来治疗TNF-α相关疾病。
IX.
治疗方法
在某些实施方案中，本发明涉及用该蛋白复合物治疗TNF-α相关疾病的方法。所述方法具体地讲是针对哺乳动物的治疗方法，更具体地讲是针对人类的治疗方法。
在某些方面，治疗TNF-α相关疾病的方法包括给予有效量的可抑制TNF-α或TNFR与选自以下多肽之间相互作用的化合物：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
所述方法优选包括给予本文定义的小分子、抗体或多肽。
在某些方面，治疗TNF-α相关疾病(包括炎性组分或细胞凋亡组分)的方法包括给予有效量的调节TRCP1的治疗性组合物。
在某些方面，治疗TNF-α相关疾病(包括炎性组分或细胞凋亡组分)的方法包括给予有效量的调节TRCP2的治疗性组合物。
基因治疗也适用于利用核酸编码复合物多肽的方面，优选核酸编码NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2多肽。
本文所用的术语“TNF-α相关疾病”是指任何由TNF-α(优选通过TNFR)介导的疾病。可以用这种方法治疗的示例性TNF-α相关疾病包括具有炎性组分或细胞凋亡组分的疾病。已知TNF-α涉及细胞凋亡、细胞增殖、分化、炎症、肿瘤发生、病毒复制、病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、免疫疾病、自身免疫病变、移植物抗宿主病变。TNF-α相关疾病的几个实例包括癌症、类风湿性关节炎、Chron疾病、哮喘、败血症性休克、过敏性肠疾病、出血热和恶病质、常见于癌症病人的组织消耗性疾病(参见例如MacEwan DJ.，(2002)Cellular Signaling，14：477-492)。
实施例
本发明现已进行了概述，通过参考以下实施例更容易理解，包括该实施例仅为了说明本发明的某些方面和实施方案，不应解释为对本发明的限制。
实施例1：
本实施例描述了用蛋白质组学方法对TNF-α受体复合物中蛋白进行鉴定，如图1所示。
骨髓单核细胞性白血病细胞(U937细胞)与或不与FLAG-标记的TNF-α一起孵育。然后裂解细胞，并用与琼脂糖珠缀合的抗FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。该免疫沉淀复合物经过洗涤，接着用FLAG肽洗脱。为提高洗脱蛋白收率，琼脂糖珠进一步用8M尿素洗脱。该洗脱蛋白用4-12％SDS-PAGE凝胶分离并用银染色法显色。蛋白条带在经TNF-α处理过的细胞相比未经处理过的显示提高的水平，并从凝胶中切下该条带。该凝胶切片然后用胰蛋白酶消化，所产生的胰蛋白酶肽用反相毛细管柱分离，并直接洗脱入FinniganLcQ离子捕捉质谱中。肽在离子捕捉中进行进一步片段化，并收集谱。谱序列通过用SEQUEST软件搜索数据库得到。通过所述方法在TNF-α受体复合物中鉴定出几种蛋白，例如TNF-α、TNF-α受体、TRADD、TRAF2、TRAP2、NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。尽管TNF-α受体与TRADD、TRAF2或TRAP2等蛋白结合是已知的，但是TNF-α受体与NAK、RasGAP3、TRCP1或TRCP2的结合之前没有描述。TNF-α受体复合物中TRADD的存在可用抗TRADD抗体通过蛋白质印迹法来进一步证实。
实施例2：
本实施例描述了以时间-依赖性方式配体诱导的TNFR1与NAK、TRAF2或TRADD的结合，如图22所示。
骨髓单核细胞性白血病细胞(U937细胞)与FLAG-标记的TNF-α一起孵育2分钟、5分钟、10分钟、20分钟或30分钟，或者不做处理。然后细胞用0.5％Triton裂解，并用与琼脂糖珠缀合的抗FLAG抗体(M2)对细胞裂解物进行免疫沉淀。该免疫沉淀复合物经过洗涤，用蛋白样品缓冲液洗脱，然后用4-12％SDS-PAGE凝胶分离。TNF-α受体复合物中NAK的存在可以通过蛋白质印迹来检测。同样，细胞裂解物与抗TNFR1抗体进行免疫沉淀。TNF-α受体与NAK、TRAF2或TRADD的缔合然后用抗NAK、TRAF2或TRADD的抗体通过蛋白质印迹来检测。
引用
本文提及的所有出版物和专利都通过引用全部结合到本文中，其程度与每个独立出版物或专利具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。如果发生冲突，本申请、包括本文中的任何定义将会作调整。
等同实施方案
尽管已经讨论了本发明的的具体实施方案，但是以上说明书是说明性而非限制性的。根据本说明书和所附权利要求书，对本发明的许多修改对于本领域技术人员而言将会是显而易见的。本发明的全部范围应该由所附权利要求、等同实施方案的全部范围、本发明说明书以及所述修改来决定。
Claims (57)
1.一种分离、纯化或重组的蛋白复合物，所述复合物包含：
(i)肿瘤坏死因子α(TNF-α)多肽或其功能性变异体；
(ii)TNF-α受体(TNFR)多肽或其功能性变异体；和
(iii)至少一种选自以下的多肽及其功能性变异体：NF-κB活化激酶(NAK)、RasGAP3、TRCP1、TRCP2。
2.权利要求1的复合物，其中所述TNFR多肽是TNFR1多肽或TNFR2多肽。
3.权利要求1的复合物，所述复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽和NAK多肽。
4.权利要求1的复合物，所述复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽和RasGAP3多肽。
5.权利要求1的复合物，所述复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽和TRCP1多肽。
6.权利要求1的复合物，所述复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽和TRCP2多肽。
7.权利要求1的复合物，所述复合物包含TNF-α多肽、NAK多肽和TNFR1多肽。
8.权利要求1-7中任一项的复合物，所述复合物还包含至少一种选自以下的多肽及其功能性变异体：TRADD、TRAF2、TRAP2。
9.权利要求8的复合物，所述复合物包含TNF-α多肽、NAK多肽、TNFR1多肽、TRAF2多肽和TRADD多肽。
10.权利要求8的复合物，所述复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽、NAK多肽、RasGAP3多肽、TRCP1多肽、TRCP2多肽、TRADD多肽、TRAF2多肽和TRAP2多肽。
11.权利要求1的复合物，其中所述TNF-α是融合蛋白。
12.权利要求1的复合物，其中所述TNFR是融合蛋白。
13.权利要求11或12的复合物，其中所述融合蛋白包含便于纯化、分离或检测所述融合蛋白的域。
14.权利要求11或12的复合物，其中所述融合蛋白包含一个选自以下的域：亲和标记物、放射性核苷酸、酶和荧光团。
15.权利要求13的复合物，其中所述域选自多聚组氨酸、FLAG、谷氨酸-谷氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白和免疫球蛋白重链恒定区。
16.权利要求13的复合物，其中所述域是FLAG。
17.一种分离、纯化或重组的蛋白复合物，所述复合物包含：
(i)TNF-α受体(TNFR)多肽或其功能性变异体；和
(ii)至少一种选自以下的多肽及其功能性变异体：NF-κB活化激酶(NAK)、RasGAP3、TRCP1、TRCP2。
18.权利要求17的复合物，所述复合物包含TNFR多肽和NAK多肽。
19.权利要求17的复合物，所述复合物包含TNFR多肽和RasGAP3多肽。
20.权利要求17的复合物，所述复合物包含TNFR多肽和TRCP1多肽。
21.权利要求17的复合物，所述复合物包含TNFR多肽和TRCP2多肽。
22.权利要求17的复合物，其中所述TNFR多肽是TNFR1多肽或TNFR2多肽。
23.权利要求17-22中任一项的复合物，所述复合物还包含至少一种选自以下的多肽：TNF-α、TRADD、TRAF2和TRAP2。
24.权利要求23的复合物，所述复合物包含TNF-α多肽、TNFR多肽、NAK多肽、RasGAP3多肽、TRCP1多肽、TRCP2多肽、TRADD多肽、TRAF2多肽和TRAP2多肽。
25.权利要求17的复合物，其中所述TNFR多肽是融合蛋白。
26.权利要求25的复合物，其中所述融合蛋白包含便于纯化、分离或检测所述融合蛋白的域。
27.权利要求25的复合物，其中所述融合蛋白包含一个选自以下的域：亲和标记物、放射性核苷酸、酶和荧光团。
28.权利要求26的复合物，其中所述域选自多聚组氨酸、FLAG、谷氨酸-谷氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白和免疫球蛋白重链恒定区。
29.权利要求1和17中任一项的蛋白复合物，其中所述复合物中至少一种蛋白是标记的。
30.权利要求29的蛋白复合物，其中所述标记是可检测标记。
31.权利要求29的蛋白复合物，其中所述标记选自多聚组氨酸、FLAG、谷氨酸-谷氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白和免疫球蛋白重链恒定区。
32.一种包含两种或三种多肽的分离的蛋白复合物，所述蛋白复合物选自：
(i) TNF-α多肽片段、TNFR多肽和选自以下多肽的复合物：
NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
(ii) TNF-α多肽片段、TNFR多肽片段和选自以下多肽的复合物：
NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
(iii) TNF-α多肽、TNFR多肽和选自以下多肽的片段的复合物：
NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
(iv) TNF-α多肽、TNFR多肽片段和选自以下多肽的片段的复合
物：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
(v) TNF-α多肽片段、TNFR多肽和选自以下多肽的片段的复合
物：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
(vi) TNF-α多肽片段、TNFR多肽片段和选自以下多肽的片段的
复合物：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
(vii) TNFR多肽片段和选自以下多肽的复合物：NAK、RasGAP3、
TRCP1和TRCP2；
(viii) TNFR多肽和选自以下多肽的片段的复合物：NAK、
RasGAp3、TRCp1和TRCp2；和
(ix) TNFR多肽片段和选自以下多肽的片段的复合物：NAK、
RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
33.一种包含第一核酸、第二核酸和第三核酸的宿主细胞，其中第一核酸包含编码TNF-α多肽的重组核酸，其中第二核酸包含编码TNFR多肽的重组核酸，并且其中第三核酸包含编码选自以下多肽的重组核酸：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
34.权利要求33的宿主细胞，其中第一核酸包含编码TNF-α多肽的重组核酸，其中第二核酸包含编码TNFR1多肽的重组核酸，并且其中第三核酸包含编码NAK多肽的重组核酸。
35.一种包含第一核酸和第二核酸的宿主细胞，其中第一核酸包含编码TNFR的重组核酸，并且其中第二核酸包含编码选自以下多肽的重组核酸：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
36.权利要求35的宿主细胞，其中第一核酸包含编码TNFR1多肽的重组核酸，并且其中第二核酸包含编码NAK多肽的重组核酸。
37.一种用于鉴定抑制或增强复合物稳定性的试验化合物的试验，所述试验包括：
(a)形成反应混合物，所述混合物包括：
(i)TNF-α多肽；
(ii)TNFR多肽；
(iii)至少一种选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；和
(iv)试验化合物；和
(b)检测复合物中TNF-α或TNFR的存在；
其中在所述试验化合物存在下所述复合物中TNF-α或TNFR的存在情况，相对于在不存在所述试验化合物的情况下所述复合物中TNF-α或TNFR的存在情况，这两者存在情况之间的变化说明所述试验化合物增强或抑制所述复合物的稳定性。
38.一种用于鉴定抑制或增强复合物稳定性的试验化合物的试验，所述试验包括：
(a)形成反应混合物，所述混合物包含：
(i)TNF-α多肽；
(ii)TNFR多肽；
(iii)至少一种选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；和
(iv)试验化合物；和
(b)检测TNFR和选自以下多肽之间的结合情况：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
其中在所述试验化合物存在下TNFR和选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，相对于在不存在所述试验化合物的情况下TNFR和选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，这两者结合之间的变化说明所述试验化合物增强或抑制所述复合物的稳定性。
39.一种用于鉴定抑制或增强复合物稳定性的试验化合物的试验，所述试验包括：
(a)形成反应混合物，所述混合物包含：
(i)TNFR多肽；
(ii)至少一种选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；和
(iii)试验化合物；和
(b)检测TNFR和选自以下多肽之间的结合情况：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
其中在所述试验化合物存在下TNFR和选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，相对于在不存在所述试验化合物的情况下TNFR和选自以下多肽之间的结合：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，这两者结合之间的变化说明所述试验化合物增强或抑制所述复合物的稳定性。
40.一种用于鉴定调节复合物活性的试验化合物的方法，所述方法包括：
(a)形成蛋白复合物，所述复合物包含：
(i)TNF-α多肽；
(ii)TNFR多肽；
(iii)选自以下的多肽：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；和
(b)使所述蛋白复合物与试验化合物接触，和
(c)检测所述试验化合物对一种或多种选自以下活性的影响：(i)所述蛋白复合物水平的变化，(ii)所述蛋白复合物中TNF-α或TNFR多肽水平的变化，(iii)所述复合物中信号转导酶活性的变化，或(iv)TNF-α或TNFR多肽与选自以下多肽之间相互作用的变化：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
41.一种用于鉴定抑制或增强复合物稳定性的化合物的筛选试验，所述试验包括：
(i)提供双杂合试验系统，所述双杂合试验系统包括第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中所述第一融合蛋白包含TNFR多肽部分，所述第二融合蛋白包含选自以下多肽的部分：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，条件是所述双杂合试验对TNFR多肽与选自以下多肽之间的相互作用敏感：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
(ii)在存在和不存在试验化合物的情况下，测定所述融合蛋白之间的相互作用水平；并
(iii)比较所述融合蛋白的相互作用水平；
其中相互作用水平降低说明化合物将抑制TNFR多肽和选自以下多肽之间的相互作用：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
42.一种分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段与选自以下多肽的表位特异性免疫反应：TNF-α、TNFR、NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，其中所述抗体破坏TNF-α与选自以下多肽之间相互作用的形成：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
43.一种分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段与选自以下多肽的表位特异性免疫反应：TNF-α、TNFR、NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，其中所述抗体破坏TNFR与选自以下多肽之间相互作用的形成：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
44.一种调节细胞内蛋白复合物的方法，所述复合物包含至少一种第一蛋白和一种第二蛋白，其中所述第一蛋白是TNFR，并且其中所述第二蛋白选自NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2，所述方法包括给予所述细胞能够调节所述蛋白复合物的化合物。
45.权利要求44的方法，其中蛋白复合物还包含TNF-α。
46.一种产生功能性复合物的方法，所述方法包括：
(i)用编码选自以下多肽的多核苷酸转染细胞：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2；
(ii)使所述细胞与TNF-α多肽接触；
(iii)从而形成复合物。
47.权利要求46的方法，其中所述复合物还包含TNFR多肽。
48.一种治疗TNF-α相关疾病的方法，所述方法包括给予有效量的抑制TNF-α或TNFR与选自以下多肽的相互作用的化合物：NAK、RasGAP3、TRCP1和TRCP2。
49.权利要求48的方法，其中所述化合物选自小分子、抗体和肽。
50.一种鉴定作为炎症或细胞凋亡候选调节剂的试验化合物的方法，所述方法包括：
(i)形成包含TRCP1多肽或其变异体多肽和试验化合物的混合物；和
(ii)测定TRCP1多肽或其变异体与所述试验化合物之间的相互作用；
其中与TRCP1多肽或其功能性变异体相互作用的试验化合物是炎症或细胞凋亡的候选调节剂。
51.权利要求50的方法，其中(i)包括在体外形成所述混合物。
52.权利要求50的方法，其中(i)包括使表达TRCP1多肽或其变异体的细胞与所述试验化合物接触。
53.一种鉴定作为炎症或细胞凋亡候选调节剂的试验化合物的方法，所述方法包括：
(i)形成包含TRCP2多肽或其变异体多肽和试验化合物的混合物；和
(ii)测定TRCP2多肽或其变异体与所述试验化合物之间的相互作用；
其中与TRCP2多肽或其功能性变异体相互作用的试验化合物是炎症或细胞凋亡的候选调节剂。
54.权利要求53的方法，其中(i)包括在体外形成所述混合物。
55.权利要求53的方法，其中(i)包括使表达TRCP2多肽或其变异体的细胞与所述试验化合物接触。
56.一种治疗包括炎性组分或细胞凋亡组分的TNF-α相关疾病的方法，所述方法包括给予有效量的调节TRCP1的治疗性组合物。
57.一种治疗包括炎性组分或细胞凋亡组分的TNF-α相关疾病的方法，所述方法包括给予有效量的调节TRCP2的治疗性组合物。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| WO2012152211A1 (zh) * | 2011-05-07 | 2012-11-15 | Jiang Shisong | 与凋亡或坏死相关的TNFα短肽及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| US5837514A (en) * | 1997-03-07 | 1998-11-17 | Tularik Inc. | IκB kinases |
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Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102803500A (zh) * | 2009-06-05 | 2012-11-28 | 13治疗有限公司 | 免疫调节肽和使用方法 |
| CN102803500B (zh) * | 2009-06-05 | 2014-11-19 | 13治疗有限公司 | 免疫调节肽和使用方法 |
| US9150616B2 (en) | 2009-06-05 | 2015-10-06 | 13Therapeutics, Inc. | Immunoregulatory peptides and methods of use |
| US9150617B2 (en) | 2009-06-05 | 2015-10-06 | 13Therapeutics, Inc. | Immunoregulatory peptides and methods of use |
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| WO2012152211A1 (zh) * | 2011-05-07 | 2012-11-15 | Jiang Shisong | 与凋亡或坏死相关的TNFα短肽及其应用 |
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