CN1826130A

CN1826130A - Pak抑制物用于治疗关节疾病的用途

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Publication number: CN1826130A
Application number: CNA2004800207374A
Authority: CN
Inventors: S·巴拉德奥; E·巴特尼克; J·采奇; A·R·克拉特; E·莱伯尔; T·莱乌
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2004-07-15
Publication date: 2006-08-30
Anticipated expiration: 2024-07-15
Also published as: IL173145A; EP1648486A2; CN1826130B; ZA200510377B; NO20060808L; JP4843487B2; WO2005011721A2; IL173145A0; KR20060052832A; RU2360696C2; IL198727A; HK1096854A1; WO2005011721A3; KR101238755B1; KR101299936B1; IL204861A; KR20120034250A; JP2007537134A; EP1498133A1; CA2532742C

Abstract

本发明涉及p21激活性激酶(PAK)抑制物用于治疗关节疾病如骨关节炎或类风湿性关节炎或者用于治疗关节痛的用途，并涉及PAK作为靶蛋白在发现作为治疗关节疾病药物的PAK抑制物中的用途。

Description

PAK抑制物用于治疗关节疾病的用途

发明内容

在西方世界，骨关节炎是人们最常见的致残性疾病。由于人口的老龄化，我们必须面对不断增长的生活质量受到严重影响的患者群体。而且，伴随着高昂的直接和间接花费，这种疾病带来巨大的社会经济负担。当前的治疗方式集中在处理骨关节炎带来的疼痛，但是我们仍然完全缺乏任何能够延缓、终止或者甚至逆转病程的药学治疗方式。

骨关节炎可以看作是导致滑膜关节的结构和功能故障的一系列疾病的临床病理表现。当关节组织的破坏和修复间的动态平衡被破坏时，骨关节炎就发生了。关节软骨的结构故障可由损伤健康软骨的异常机械劳损引起，以及在生理机械劳损影响下，由病理损伤的软骨退化故障引起。在骨关节炎中观察到的形态学变化包括软骨侵蚀以及不同程度的滑液炎症。这些变化归因于复杂的生化因子网络，包括导致软骨大分子破坏的蛋白水解酶。由活化的滑膜细胞、单核细胞或关节软骨自身产生的细胞因子如IL-1和TNFα显著地提高了金属蛋白酶(MMP)和细胞因子的基因表达，同时钝化了代偿合成途径。例如，由IL-1和/或TNFα通过信号传递经由MAPK。(促分裂原活化蛋白激酶)途径导致的AP1-转录因子复合体的激活在调节与骨关节炎有关的标志基因的表达中发挥重要作用。

软骨分解代谢和炎性痛发生中涉及的另外一个生化因子是PGE2(前列腺素E2)。PGE2为由环加氧酶(COX)1和2合成的类花生酸，其参与IL-1介导的蛋白聚糖降解，并且对清醒的大鼠或小鼠施与PGE2会诱发痛觉过敏。IL-1β的内源性表达导致在人骨关节炎关节中诱导COX-2。

因此，骨关节炎的特征在于关节软骨的慢性进行性退化。骨关节炎确切的病因学仍然未知，但是通常认为软骨基质成分的降解归因于细胞外蛋白水解酶主要基质金属蛋白酶以及放大退化过程的细胞因子的合成和激活增加。治疗骨关节炎需要新方法，并且对软骨疾病生物学了解的进展已经导致使用这样的基因，所述基因的产物刺激软骨修复或抑制软骨基质破坏。一些研究表明例如调节IL-1活性作为一种减少骨关节炎中结构改变进程的方法具有潜在重要性。

因此，本发明的一个目的是发现避免或减少软骨损伤因子作用的新治疗方法。

令人惊讶地，已鉴定了PAK尤其是PAK1为IL-1诱导的信号传导途径活化中的一种重要介质，其导致骨关节炎相关的标志基因表达升高。

PAK1属于对多种细胞功能包括细胞形态发生、运动性、存活、有丝分裂和血管发生重要的进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶家族的一员。PAK属于Ste20蛋白激酶大家族。Ste20p是公认的参与酿酒酵母(S.cerevisiae)交配途径的酵母促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶(MAP4K)。它在哺乳动物、果蝇、秀丽隐杆线虫和其他有机体中的同系物包括人类中的成员形成了一个大的正在浮现的蛋白激酶族。Ste20p族激酶进一步分成p21激活性激酶(PAK)和生发中心激酶(GCK)家族。它们的特征是存在保守的激酶结构域以及存在使激酶能够与多种信号传导分子和细胞骨架调节蛋白相互作用的结构差异大的非催化区域。

一些出版物已经描述了PAK在哺乳动物细胞中调节MAPK活性的作用(参见如Dan，C.等人，(2002)Mol.Cell Biol.，22，567-577)。MAPK级联在从细胞外刺激如生长因子、细胞因子和环境应激到转录因子活化的信号传递、导致基因表达调节的大范围细胞事件中非常重要(Johnson，G.L.和Lapadat，R.，(2002)Science，298，1911-1912)。信号传导通过由MAP激酶激酶激酶(MAP3K)、MAP激酶激酶(MAP2K)和MAPK组成的三联激酶组件(triple-kinase module)的线性连续磷酸化介导。该三联激酶组件和其激活机制在从酵母到哺乳动物的真核进化中高度保守。

在哺乳动物细胞中PAKs被鉴定为Cdc42和Rac1的下游效应靶标，鸟苷三磷酸酶(GTPase)与Pak1的结合经由自身磷酸化作用刺激其激酶活性。PAKs特异地与活化的(结合GTP的)p21形成复合体，抑制p21鸟苷三磷酸酶活性并导致激酶自身磷酸化作用和激活。从酵母到人类保守的PAK家族激酶由Cdc42或Rac1通过与保守的N末端基序(对应aPAK中71到137位残基)相互作用直接激活。经自身磷酸化的激酶对Cdc42/Rac1的亲和力降低，释放p21用于进一步的刺激活动或被GTP酶活化蛋白下调(Manser，E.等人，(1994)Nature，367，40-46)。除Rac1和Cdc42之外，新鉴定的鸟苷三磷酸酶Rho家族的同系物如Wrch-1和Chp也能够活化PAKs并诱导线状伪足形成和应力纤维溶解(Aronheim，A.等人，(1998)Curr.Biol.，8，1125-1128)。调节鸟苷三磷酸酶Rho家族GTP-GDP结合状态的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)和GTP酶活化蛋白(GAPs)是通过PAK1激酶的下游信号转导活化的重要决定因素(Zhou，K.等人，(1998)J.Biol.Chem.，273，16782-16786)。

PAK1的核酸序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：1和2中显示。通过分析截短片段和定点突变体的特性以及通过确定Cdc42与WASP同源片段复合体的溶液结构而研究了与Cdc42和Rac紧密结合所需的PAK1序列(Burbelo，P.D.等人，(1995)J.Biol.Chem.，270，29071-29074；Rudolph，M.G.等人，(1998)J.Biol.Chem.，273，18067-18076；Abdul-Manan，N.等人，(1999)Nature，399，379-383)。自体抑制中涉及的片段与PAK1的PBD(p21结合结构域)重叠但不一致(Zhao，Z.S.等人，(1998)Mol.Cell Biol，18，2153-2163；Lei，M.等人，(2000)Cell，102，387-397)。该自体调节区域包括干扰激酶自体活化的抑制开关和激酶抑制结构域(Lei，M.等人，(2000)Cell 102，387-397)。自体调节区域中的突变产生组成型活化的突变体(Zhao，Z.S.等人，(1998)，同上；Lei，M.等人，(2000)同上)。在哺乳动物细胞中表达包括PAK183-149位氨基酸(PAK抑制结构域的PID)的自身调节结构域阻止了通过PAK1的下游效应物的活化。因此，该PAK抑制物与一种PAK1活化物即组成型活化的鸟苷三磷酸酶Cdc42^G12V的共表达阻止了例如外周肌动蛋白微端丝的形成和通常由该p21蛋白诱导的相关应力纤维的丧失(Zhao，Z.S.等人，(1998)，同上)。

在最近的报道中，在乳腺癌细胞中抑制PAK1活性与c-Jun N末端激酶活性的降低、转录因子AP-1DNA结合活性的抑制以及由已知参与乳腺癌侵入的AP-1启动子驱动的体内转录的抑制有关(Adam，L.等人，(2000)J.Biol.Chem.，275，12041-12050)。此外，淋病病原因子Ngo通过包括PAK的细胞应激反应激酶级联诱导促炎细胞因子的激活，其介导从小鸟苷三磷酸酶Rho家族到JNK和AP-1激活的信号(Naumann，M.等人，(1998)J.Exp.Med.，188，1277-1286)。然而，没有与PAK家族激酶在关节疾病如骨关节炎中潜在作用有关的报道。

因此，本发明的一个主题是PAK抑制物用于治疗关节疾病尤其是退化性关节疾病如骨关节炎和/或炎性关节疾病如类风湿性关节炎的用途。PAK抑制物也能用于治疗关节痛，尤其是在退化性关节疾病中通过减轻关节疼痛治疗关节痛。另外，如前所述PAK抑制物可用于产生治疗关节疾病和/或治疗关节痛的药物。

根据本发明，术语“抑制物”指优先抑制或降低PAK丝氨酸/苏氨酸激酶活性或PAK基因表达或PAK在细胞中定位的生物化学化合物或化合物，如同在Kiosses，W.B.等人，(2002)Circ.Research，2002年4月5日，697-702中描述的那样。根据标准的操作程序能检测丝氨酸/苏氨酸激酶活性，如用位于美国CA，Foster City的Applied Biosystems，Inc.的HitHunter^TM Serine/Threonine Kinase Assay。如本发明实施例中描述的那样通过RT-PCT或Western印迹分析能检测PAK基因的表达。

术语“PAK”指丝氨酸/苏氨酸p21激活性激酶家族，其包括但不限于PAK1、PAK2、PAK3和/或PAK4。如前所述这些蛋白质优选作为小GTP结合蛋白Cdc42和Rac的靶标。具体而言，术语“PAK”指人PAK，尤其是人PAK1。人PAK1的核酸序列和氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：1和2中。人PAK 2、3和4的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：3、4和5中。通过使用遗传密码能轻易地导出编码这些人PAKs的基因序列。人PAK 1、2、3和4的基因库登录号分别是NP 002567、Q13177、NP 002569和NP 005875。用本领域技术人员公知的方法借助人PAK1、2、3或4的基因序列能分离非人同系物，如根据标准实验室方法用衍生自例如人PAK序列的合适探针通过PCR扩增或在严谨条件下杂交(例如在2.5x SSC缓冲液中60℃，然后是37℃低缓冲液浓度中的几个洗涤步骤)。

此类PAK抑制物的实例是具有氨基酸序列HTIHVGFDAVTGEFTGMPEQ WARLLQTSNI TKSEQKKNPQ AVLDVLEFYNSKKTSNSQKY MSFTDKS(SEQ ID NO：6)的PAK1抑制物结构域、具有氨基酸序列KPPAPPMRNT STM(SEQ ID NO：7)的PAK1肽、具有氨基酸序列YGRKKRRQRR RGKPPAPPMR NTSTM(SEQ ID NO：8)的Tat-PAK融合肽、针对PAK尤其是针对PAK活性部位的结合蛋白或结合肽、针对PAK基因或PAK本身的核酸、化学分子优选地为小分子、和/或天然产物提取物。

根据本发明，术语“化学分子”包含非聚合有机化合物、脂类、碳水化合物、肽、优选具有约10到约80个氨基酸尤其是具有10到25个氨基酸的肽、以及寡核苷酸，优选具有约10到约90个核苷酸尤其是具有15到25个核苷酸的寡核苷酸。特别优选的是小化学分子，尤其是具有优选分子量约200g/mole到约1500g/mole尤其是400g/mole到1000g/mole的实验室中合成或自然界中发现的非聚合有机化合物。

可选择地，本发明的抑制物可以是粗制或纯化方式的天然产物提取物的形式。提取物可根据标准方法产生，如从动物、植物或微生物来源，象蛇毒、树叶或微生物发酵液通过水和/或醇和/或有机溶剂提取和/或柱层析和/或沉淀产生。

术语“结合蛋白”或“结合肽”指结合并抑制RAK的一组蛋白质或肽，其包括但不限于针对PAK的多克隆或单克隆抗体、抗体片段和蛋白质支架(protein scaffold)，如针对PAK的anticalins。

根据本领域技术人员众所周知的方法完成抗体或抗体片段的制备过程，如根据需要在弗氏佐剂和/或氢氧化铝凝胶存在下例如用PAK免疫哺乳动物例如兔子(参见，如Diamond，B.A.等人，(1981)The New EnglandJournal of Medicine：1344-1349)。作为免疫反应的结果而在动物中形成的多克隆抗体能接着用众所周知的方法从血液中分离，例如，借助柱层析纯化。单克隆抗体例如能根据公知的Winter&Milstein方法(Winter，G.&Milstein，C.(1991)Natur，349，293-299)制备。

根据本发明，术语抗体或抗体片段也被理解为经过重组制备和根据需要为经修饰的抗体或其抗原结合部分，如嵌合抗体、人源化抗体、多功能抗体、双特异或寡特异抗体、单链抗体和F(ab)或F(ab)₂片段(参见，如EP-B1-0368684、US 4,816,567、US 4,816,397、WO 88/01649、WO 93/06213或WO 98/24884)。

也可例如使用针对PAK的蛋白质支架作为经典抗体的替代物，如基于脂质运载蛋白(lipocalin)的anticalins(Beste等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，1898-1903)。脂质运载蛋白如视黄醇结合蛋白质或后胆色素结合蛋白质的天然配体结合位点可例如通过“组合蛋白质设计”的方法以与选择的半抗原这里指与PAK结合的方式改变(Skerra，2000，Biochim.Biophys.Acta，1482，337-50)。已知其他公知的蛋白质支架作为分子识别的抗体的替代物(Skerra(2000)J.Mol.Recognit.，13，167-187)。术语“针对PAK基因或PAK本身的核酸”指例如抑制PAK基因表达或PAK活性的双链或单链DNA或RNA，并且包括但不限于反义核酸、适体、siRNAs(小干扰RNAs)和核酶。

例如根据磷酸三酯法(参见，如Uhlmann，E.&Peyman，A.(1990)Chemical Reviews，90，543-584)能化学合成核酸如反义核酸。适体是以高亲和力与多肽此处指与PAK结合的核酸。用筛选方法如SELEX(参见如Jayasena(1999)Clin.Chem.，45，1628-50；Klug和Famulok(1994)M.Mol.Biol.Rep.，20，97-107；US 5,582,981)能从不同单链RNA分子的大库中分离适体。也可合成适体并选择其对映体形式，如作为L-核糖核苷酸(Nolte等人，(1996)Nat.Biotechnol.，14，1116-9；Klussmann等人，(1996)Nat.Biotechnol.，14，1112-5)。以这种方法分离的构型具有不被天然存在的核糖核酸酶降解的优点并因此具有更高的稳定性。

核酸可被核酸内切酶或核酸外切酶尤其可被在细胞中发现的DNA酶和RNA酶降解。因此，为稳定它们抵抗降解而修饰核酸是有利的，从而保证在细胞中长期保持高浓度的核酸(Beigelman等人，(1995)NucleicAcids Res.23：3989-94；WO 95/11910；WO 98/37240；WO 97/29116)。一般地，通过导入一个或多个核苷酸间磷基(internucleotide phosphorusgroups)或通过导入一个或多个无磷间核苷酸(non-phosphorusinternucleotides)能获得这种稳定作用。

在Uhlmann和Peyman(1990)，同上中(也参见Beigelman等人，(1995)Nucleic Acids Res.23：3989-94；WO 95/11910；WO 98/37240；WO 97/29116)，汇编了适当修饰的间核苷酸(internucleotides)。能用于本发明用途之一的核酸中的经修饰间核苷酸磷酸根和/或无磷桥包含例如膦酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或磷酸酯，而无磷间核苷酸类似物包含例如硅氧烷桥、碳酸盐桥、羧甲基酯、乙酰胺桥和/或硫醚桥。该修饰提高可用于本发明用途之一的药物组合物的耐久性也是本发明的目的。

合适反义核酸的用途在例如Zheng和Kemeny(1995)Clin.Exp.Immunol.，100，380-2；Nellen和Lichtenstein(1993)Trends Biochem.Sci.，18，419-23，Stein(1992)Leukemia，6，697-74或Yacyshyn，B.R.等人，(1998)Gastroenterology，114，1142中有更多描述。

例如在Elbashir，S.M.等人，(2001)Genes Dev.，15，188或Elbashir，S.M.等人，(2001)Nature，411，494中，描述了siRNA的制备和用作下调或关闭基因表达此处为PAK基因表达过程中RNA干扰的工具。

核酶也是抑制核酸此处为PAK基因翻译的适当工具，因为它们能特异结合并剪切mRNA。它们在例如Amarzguioui等人，(1998)Cell.Mol.Life Sci.，54，1175-202；Vaish等人，(1998)Nucleic Acids Res.，26，5237-42；Persidis(1997)Nat.Biotechnol.，15，921-2或Couture和Stinchcomb(1996)Trends Genet.，12，510-5中有描述。

因此，上述核酸在体内和体外都能用于抑制或降低PAK基因在细胞中的表达并因此在本发明中用作PAK抑制物。优选单链DNA或RNA分别用作反义寡核苷酸或核酶。对于产生药物，根据施用方式，本发明的PAK抑制物通常与一种或多种可药用添加剂或辅助物质如生理缓冲溶液如氯化钠溶液、去离子水、稳定剂如蛋白酶或核酸酶抑制剂优选抑酶肽、ε-氨基己酸或抑胃酶肽A或螯合剂如EDTA制剂，与如白凡士林、低粘度石蜡油和/或黄蜡等制剂为凝胶剂型。

合适的其它添加剂如去污剂如Triton X-100或脱氧胆酸钠、还有多元醇如聚乙二醇或甘油、糖如蔗糖或葡萄糖、两性离子化合物如氨基酸如甘氨酸或尤其是牛磺酸或甜菜碱和/或蛋白质如牛或人血清白蛋白。优选去污剂、多元醇和/或两性离子化合物。

生理缓冲溶液优选具有pH约6.0-8.0，特别是pH约6.8-7.8，尤其是pH约7.4，和/或具有摩尔渗透压浓度约200-400毫渗量/升，优选约290-310毫渗量/升。药物的pH一般用适当的有机或无机缓冲液调节，例如，优选使用磷酸盐缓冲液、tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟乙基)哌嗪]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉基-1-丙磺酸)。各种缓冲液的选择通常取决于希望得到的缓冲液摩尔浓度。如磷酸盐缓冲液适用于注射液和输注液。

药物能以常规方式施与，如通过口服剂型如片剂或胶囊剂、通过粘膜如鼻腔或口腔、以植入皮下的储库形式、通过含有本发明药物的注射剂、输注液或凝胶剂施用。如前所述为治疗特定的关节疾病还可局部施与药物，适当情况下可以脂质体复合体的形式施与。此外，能通过经皮治疗系统(TTS)进行治疗，它使药物释放的时间控制成为可能。TTS已知如来自EP 0944398A1、EP 0916336A1、EP 0889723A1或EP 0852493A1。

如果只有相对少量的溶液或混悬液如约1到约20ml欲施与身体，通常使用注射液。如果有大量的溶液或混悬液如1升或更多欲施与身体，通常用输注液施与。就痛觉而论，因为与输注液对比在注射液的情况下仅给药几个毫升，注射中血液或组织液的pH和渗透压的微小差异使它们本身不引人注意或仅使它们本身以不显著的程度引人注意。因此在使用前稀释本发明的制剂通常是不需要的。然而，在相对大量给药的情况下，本发明的制剂应当在给药前临时稀释到这样的程度即至少获得近似等渗的溶液。等渗溶液的实例是0.9％浓度的氯化钠溶液。在输注液的情况下，如用无菌水进行稀释同时如经由所谓的分流术进行施与。

上述核酸能以裸核酸形式、基因转移载体形式或与脂质体或金颗粒复合体的形式使用。

基因转移载体的实例是病毒载体，如腺病毒载体或逆转录病毒载体(Lindemann等人，(1997)，Mol.Med.，3，466-76；Springer等人，(1988)Mol.Cell.，2，549-58)。与脂质体的复合体通常达到很高的转染效率，尤其是皮肤细胞(Alexander和Akhurst，1995，Hum.Mol.Genet.4：2279-85)。在脂质转染法中，通过超声破碎脂质体混悬液制备由阳离子脂质组成的小的单层小囊泡。DNA以一定的比例离子结合在脂质体的表面，该比例是这样的即所有的质粒DNA被脂质体复合并保持阳性净电荷。除了Felgner，P.L.等人，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci USA，84，7413-7414使用的脂质混合物DOTMA(溴化1，2-二油基氧基丙基-3-三甲基铵)和DOPE(二油基磷脂酰乙醇胺)之外，至今已经合成了大量的脂质制剂并测试了它们转染多种细胞系的效率(Behr等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，6982-6986；Gao和Huang(1991)，Biochim.Biophys.Acta，1189，195-203；Felgner等人，(1994)J.Biol.Chem.，269，2550-2561)。脂质制剂的实例是DOTAP N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸酯或DOGS(双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺)。

增加核酸转移进入细胞的辅助物质可以是如与DNA结合的蛋白质或肽或使核酸能被转运进入细胞核的合成肽-DNA分子(Schwartz等人，(1999)Gene Therapy 6：282；Brandén等人，(1999)Nature Biotech.，17，784)。辅助物质还包括能使核酸释放到细胞胞浆中的分子(Planck等人，(1994)J.Biol.Chem.，269，12918；Kichler等人，(1997)Bioconj.Chem.，8，213)或如脂质体(Uhlmann和Peyman(1990)，同上)。

另外，通过将上述的核酸应用到金颗粒能获得特别适合的形式，并用所谓的“基因枪”将这些颗粒导入组织或细胞(Wang等人，(1999)J.Invest.Dermatol.112：775-81，Tuting等人，(1998)J.Invest.Dermatol.111：183-8)。

本发明的另一个主题是PAK或PAK基因作为靶标用于发现PAK抑制物的用途，其中所述的PAK抑制物用于治疗关节疾病尤其是退化性关节疾病如骨关节炎或炎性关节疾病如类风湿性关节炎，和/或用于治疗关节痛，尤其是在退化性关节疾病中通过减少关节疼痛治疗关节痛。优选地PAK抑制物能以如前所述的药物形式使用。

因此，本发明还提供筛选PAK抑制物的方法，其中该方法包括步骤：

(a)提供PAK或PAK基因，

(b)提供测试化合物，并

(c)测量或检测测试化合物对PAK或PAK基因的影响。

通常，如在检测系统中提供PAK或PAK基因并直接或间接地与测试化合物尤其是如化合物文库形式的生化的或化学的测试化合物接触。然后，测量或检测测试化合物对PAK或PAK基因的影响。然后，可分析和/或分离适当的抑制物。对于化合物文库的筛选，优选使用技术人员公知或商业上可获得的高通量测定法。

根据本发明，术语“化合物文库”指组合自任何多重来源的多数化合物，包括化学合成分子和天然产物，或已经通过组合化学技术产生的化合物。

通常，在多相或均相测定法中测量或检测测试化合物对PAK或PAK基因的影响。如此处所用的，多相测定法是包括一个或多个洗涤步骤的测定法，而在均相测定法中不需要这样的洗涤步骤。仅将试剂和化合物混合并检测。

适当的功能测定法可基于PAK的基因表达、由鸟苷三磷酸酶如Cdc42、Rac1、Wrch-1或Chp对PAK的直接活化或与活化的(结合GTP的)p21形成复合体。在被检测的生化的或化学的化合物作为PAK抑制物存在时，可通过技术人员通常公知的方法检测基因表达、直接活化或与其他蛋白质例如如前所述的细胞蛋白质形成复合体。通常，商业上可获得的激酶检测系统定量检测底物中掺入的磷酸根的量。

例如，如Zhao，Z.S.等人，(1998)，同上中描述的那样能检测阻止外周肌动蛋白微端丝的形成和相关应力纤维的丧失。

多相测定法为例如ELISA、DELFIA、SPA和快速平板测定法(flashplate assay)。

由多个公司提供基于ELISA(酶联免疫吸附测定)的测定法。该测定法使用能被激酶如PAK磷酸化的随机肽。含激酶的样品通常稀释到含例如ATP和必需阳离子的反应缓冲液中然后加到培养板孔中。仅通过移除混合物终止反应。然后，洗涤培养板。例如通过加入生物素化的底物到激酶中启动反应。反应后，加入特异性抗体。通常将样品转移到预封闭的蛋白质G培养板中并在洗涤后加入如链亲和素-HRP(辣根过氧化物酶)。然后，移除未结合的链亲和素-辣根过氧化物酶，通过加入过氧化物酶底物启动过氧化物酶颜色反应并在适当的光密度计中检测光密度。

基于DELFIA(解离增强的镧系荧光免疫检测)的测定法是固相测定法。通常用铕或另外的镧系元素标记抗体并在洗掉未结合的铕标记抗体后检测铕荧光。

SPA(闪烁邻近测定法(scintillation proximity assay))和快速平板测定法通常利用生物素/抗生物素蛋白相互作用捕获放射标记的底物。通常反应混合物包括激酶、生物素化的肽底物和γ-[P³³]ATP。反应以后，生物素化的肽被链亲和素捕获。在SPA检测中链亲和素结合在含有闪烁体的珠上，而在快速平板测定法中链亲和素结合在含有闪烁体的微量培养板加样孔内部。一旦被固定，放射标记的底物与闪烁体充分接近以激发光发射。

可选择的均相测定法为例如TR-FRET、FP、ALPHA和基因测定法。

基于TR-FRET(时间分辨的荧光共振能量转移)的测定法是通常利用铕和APC之间的荧光共振能量转移的测定法，其中APC是具有重叠光谱的经修饰别藻蓝蛋白或其他染料如Cy3/Cy5或Cy5/Cy7(Schobel，U.等人，(1999)Bioconjugate Chem.10，1107-1114)。如用337nm处的光激发铕后，该分子在620nm处发荧光。但是如果该荧光团与APC足够接近，铕将转移它的激发能量到APC，APC在665nm处发荧光。激酶底物通常是生物素标记的底物。激酶反应后，将铕标记的(P)特异性抗体与链亲和素APC一起加入。磷酸化的肽使铕标记的抗体和链亲和素APC近距离接触。APC与铕荧光团的近距离靠近将导致铕荧光的淬灭和获得APC荧光(FRET)。

基于荧光偏振(FP)的测定法是利用偏振光激发溶液中荧光底物肽的测定法。这些在溶液中游离和运动的荧光肽导致发射光变成去极化。然而，当底物肽与大分子如(P)-Tyr结合时，其运动速率将大幅降低，并且发射光将保持高度极化。对于激酶测定法通常有两种选择：

(a)荧光磷酸肽示踪剂与(P)特异性抗体结合。磷酸化产物会从抗体竞争荧光磷酸肽导致偏振从高变化到低。

(b)磷酸化底物肽与磷酸特异的(phosphospecific)抗体结合导致偏振从低变化到高。

基于ALPHA(放大的发光临近均相测定)的测定法是依赖通过磷酸化肽而接近的供体和受体珠之间的单线态氧转移的测定法。通过在680nm处激发，供体珠中的感光材料将周围的双原子气态氧转化为单线态氧，其弥散到200nm的距离。受体珠中的化学发光基团将能量转移到珠中的荧光受体，然后该荧光受体在约600nm处发射光。

基于EFC(酶片段互补)的测定法或等同的测定法尤其能用于化合物的高通量筛选。EFC测定法基于由两个片段一酶受体(EA)和酶供体(ED)组成的工程化β-半乳糖苷酶。当片段分离时没有β-半乳糖苷酶活性，但是当片段在一起时它们联合(互补)形成有活性的酶。EFC测定法利用ED-被分析物缀合物，其中被分析物可被特异结合蛋白质如抗体或受体识别。在缺乏特异结合蛋白质时，ED-被分析物缀合物能与EA互补形成活性β-半乳糖苷酶，产生阳性发光信号。如果ED-被分析物缀合物被特异结合蛋白质结合，其与EA之间的互补作用被阻止，并没有信号。如果(在样品中)提供游离被分析物，其将和ED-被分析物缀合物竞争结合特异结合蛋白质。游离的被分析物将释放ED-被分析物缀合物用于与EA互补，信号的产生取决于样品中存在的游离被分析物量。

基因测定法的实例是双杂交系统测定法(Fields和Sternglanz(1994)Trends in Genetics，10，286-292；Colas和Brent(1998)TIBTECH，16，355-363)。在该检测中，用表达融合蛋白的表达载体转化细胞，其中融合蛋白质由根据本发明的多肽和转录因子如Gal4或LexA的DNA结合结构域组成。转化细胞还包含其启动子含有相应DNA结合结构域结合位点的报告基因。通过用表达第二融合蛋白的另一表达载体转化，其中第二融合蛋白由已知或未知的多肽和如来自Gal4或单纯疱疹病毒VP16的活化结构域组成，如果第二融合蛋白与多肽相互作用则报告基因的表达能大幅提高。因此该检测系统能用于筛选抑制PAK和如鸟苷三磷酸酶如Cdc42、Rac1、Wrch-1或Chp、或活化的(结合GTP的)p21(参见如Vidal和Endoh(1999)Trends in Biotechnology，17，374-81)之间相互作用的生化的或化学的化合物。用这种方法，快速鉴定能用于治疗关节疾病的新的活性化合物是可能的。

可选择地，例如象在Zhao，Z.S.等人，(1998)，同上中描述的那样，当测试化合物是蛋白质或肽时，将该测试化合物与鸟苷三磷酸酶如Rac1、Wrch-1、Chp或组成型活化的Cdc42共表达，在PAK存在时作为PAK的活化剂能用于测量或检测测试化合物对PAK的影响。

基因测定法的另一实例是功能性测定法，其中激酶的活性被转化为功能性细胞反应如生长、生长抑制、分化或凋亡。对这种类型的筛选，酵母是尤其适合的模型系统。例如在PAK1酵母功能性测定法中，当在含葡萄糖的培养基上培养时，例如PAK1酵母细胞象正常酵母细胞一样生长。然而，当被暴露到半乳糖时，PAK1的细胞内表达被诱导导致酵母细胞死亡。在这种情况下抑制PAK1活性的化合物将阻止细胞死亡。

另一测定法是基于固相结合的多肽如PAK、鸟苷三磷酸酶如Cdc42、Rac1、Wrch-1或Chp、或活化的(结合GTP的)p21并检测与化合物的相互干扰。因此，如含可检测标记的测试化合物，例如如前所述化合物可被放射标记、荧光标记或发光标记。另外，化合物可偶联至允许间接检测的蛋白质上，如通过利用使用生色底物的过氧化物酶测定法的酶催化或通过结合可检测的抗体。另一可能性是通过质谱法(SELDI)检测固相结合蛋白质复合体。可检测与测试物相互作用导致的如PAC或如前所述的其他蛋白质的构象变化，例如通过多肽中内源性色氨酸残基的荧光变化。

固相结合的多肽还可是阵列的一部分。如在US 5,744,305中公开了利用固相化学和光敏保护基团(photolabile protecting groups)制备这类阵列的方法。这些阵列还可与测试化合物或化合物文库接触并检测相互作用，如结合或构象改变。

在本发明的另一实施方案中，用完整的细胞实施该方法。通常固定和透化处理生长在多孔培养板底部的细胞，封闭并与例如抗目标底物的(P)特异性初级抗体孵育。然后，使用例如如前所述的与特异化学发光或比色物质结合的铕标记或辣根过氧化物酶(HRP)结合的第二抗体产生信号。与显微镜联合使用不仅能在单细胞水平上定量(P)特异性抗体的量，而且能定量磷酸化诱导的底物易位或细胞形态变化。

在机器人系统中实施本发明的方法是有利的如包括机器人铺板和机器人流体转移系统如用微流体技术(microfluidics)即通道结构的微流体技术。

在本发明的另一实施方案中，以高通量筛选系统的形式实施该方法。在这样的系统中筛选方法有利地是自动化和小型化的，尤其是它使用由机器人控制的小型化的加样孔和微流体技术。

在另一实施方案中本发明还提供了产生药物的方法，其中所述的药物用于治疗关节疾病尤其是退化性关节疾病如骨关节炎或炎性关节疾病如类风湿性关节炎，和/或用于治疗关节痛，尤其是在退化性关节疾病中通过减轻关节疼痛治疗关节痛，其中该方法包括步骤：

(a)实施根据权利要求13到19中任意一项所述的方法，

(b)分离适用于治疗关节疾病和/或关节痛的经测量或检测过的测试化合物，并

(c)将经测量过或检测过的测试化合物与例如如前所述的一种或多种可药用载体或辅助物质制剂。

下述附图、序列和实施例将解释本发明但不限制本发明的范围。

附图简述

图1A-C显示PAK1在HEK293细胞和人原代软骨细胞提取物中的表达。

用二维凝胶电泳分离人HEK293细胞及来自骨关节炎患者软骨和对照软骨的人原代软骨细胞的提取物。用Western印迹法将蛋白质转移到PVDF膜并通过特异性抗体检测PAK1。

图2显示PAK1-ID的过量表达抑制IL-1β诱导的MMP13在人SW1353细胞中的表达。

将PAK1抑制结构域亚克隆到pCEP4载体并转染入SW1353细胞中。这里标明，将浓度10ng/ml的IL-1β用作刺激物进行24小时。收集上清并用ELISA测定MMP13蛋白质含量。数值以任意单位显示并以至少3次独立结果±SD表示。格子花柱代表载体pCEP4(空载体)的实验且黑柱代表载体pCEP4_PAK1-ID的实验。

图3显示PAK1-ID的过量表达抑制IL-1β诱导的PGE2在人SW1353细胞中的表达。

将PAK1抑制结构域亚克隆入pCEP4载体并转染入SW1353细胞中。将细胞用浓度均为10ng/ml的IL-1β和TNFα联合刺激24小时。收集上清并用ELISA测定MMP13蛋白质含量。任意单位的数值代表两次实验的平均值。有刻点的柱代表无载体加IL1β和TNFα的实验。格子花柱代表载体pCEP4(空载体)加IL1β和TNFα的实验。黑柱代表载体pCEP4_PAK1-ID加IL1β和TNFα的实验。

图4显示PAK1-ID的过量表达抑制IL-1β诱导的IL-8在人HEK293细胞中的表达。

将亚克隆到pCDNA3.1载体的PAK1抑制结构域瞬时转染到HEK293细胞中。按标明的时间期间用浓度10ng/ml的IL-1β刺激细胞。收集上清并用ELISA测定IL-8蛋白质含量。任意单位的数值代表两次实验的平均值。圆形代表载体pCDNA3.1_PAK1-ID加IL1β的实验及正方形代表载体pCDNA3.1(空载体)加IL1β的实验。

序列说明

SEQ ID NO：1显示PAK1的核酸序列。

SEQ ID NO：2显示PAK1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3显示PAK2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4显示PAK3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5显示PAK4的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6显示PAK1抑制物结构域(PAK1-ID)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7显示根据Kiosses，W.B.(2002)，见上文，富含脯氨酸的PAK1抑制物序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8显示根据Kiosses，W.B.(2002)，见上文，含与来自HIV tat蛋白多元序列(polybasic sequence)融合的PAK1脯氨酸富含序列的合成肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9显示以人和小鼠PAK1 cDNA之间的保守序列为靶标的第一PCR引物。

SEQ ID NO：10显示以人和小鼠PAK1 cDNA之间的保守序列为靶标的第二PCR引物。

SEQ ID NO：11显示用于扩增PAK1-ID的第一PCR引物。

SEQ ID NO：12显示用于扩增PAK1-ID的第二PCR引物。

实施例

1.方法

1.1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

首先用1单位无RNA酶的DNA酶I消化总RNA(1μg)以避免被基因组DNA污染。然后根据制造商提供的方法用oligo(dT)20引发的Thermoscript逆转录酶(Life Technologies，Inc.)将DNA酶I处理过的RNA逆转录为cDNA。用以人和鼠PAK1 cDNA之间的保守序列为靶标的5′-TGGCTGGAGGCTCCTTGACA-3′(SEQ ID NO：9)和5′-GAGGGCTTGGCAATCTTCAGGA-3′(SEQ ID NO：10)为引物(德国，MWG Biotech AG)进行PCR。PCR条件是每50μl反应用2.6单位ExpandHigh Fidelity PCR DNA聚合酶(德国，Roche Diagnostics GmbH)95℃/30秒，60℃/30秒和72℃/45秒进行25个循环。

1.2载体构建体的设计

通过PCR扩增编码被鉴定为PAK1自体抑制结构域的PAK1残基83到149的多肽(Zhao，Z.S.等人，(1998)，同上)。用于扩增的引物是

5′ATCGCCACCATGTACCCTTATGATGTGCCAGATTATGCCCACACAATTCATGTCGGTTTTG-3′(SEQ ID NO：11)

(下划线是Kozak序列，粗体是血细胞凝集素(HA)标签)和

5′-ATCTTATGACTTATCTGTAAAGCTCATG-3′(SEQ ID NO：12)(德国，MWG，Biotech AG)。PCR条件是每50μl反应用2.6单位ExpandHigh Fidelity PCR DNA聚合酶(德国，Roche Diagnostics GmbH)95℃/30秒，60℃/30秒和72℃/30秒进行25个循环。将PCR产物亚克隆到pCR-TOPO2.1载体(德国，Invitrogen GmbH)。将带HA标签的PAK1导入哺乳动物的pcDNA3.1(德国，Invitrogen GmbH)的HindIII和XbaI位点。将PAK1-ID经由5′HindIII和3′NotI限制性位点插入pCEP4质粒(德国，Invitrogen GmbH)。通过序列测定验证所有的质粒。

1.3细胞培养

人SW1353软骨肉瘤的培养是生长在含10％胎牛血清(FCS)和青霉素/链霉素(37℃，5％CO2)的Dulbecco′s改良的Eagles′s培养基(DMEM)中。为了转染，过夜培养6×104/培养孔并在第二天用2μg DNA和10μlGenePORTER^TM Transfection Reagent(位于美国CA，San Diego的GeneTherapy Systems，Inc)转染。3小时后，加入等体积的含20％FCS的培养基并孵育过夜。在用pCEP4载体(德国，Invitrogen GmbH)过量表达的情况下。转染两天后用200μg/ml的潮霉素B(德国，Invitrogen GmbH)选择细胞。用荧光激活细胞分选扫描器(FACScan)(位于美国CA，Mountain View的Becton Dickinson Immunocytometry Systems，Inc.)并在倒置荧光显微镜下检查转染效率。对于大多数实验，将60000个细胞转移到35mm 6孔培养板的每一孔。刺激之前用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞并在无FCS的DMEM中培养30分钟。对于实验，将细胞在含或不含10ng/ml人IL-1β(德国Roche Diagnostics GmbH)及含或不含10ng/mlTNFα(德国，Roche Diagnostics GmbH)的1ml无血清DMEM中放置24小时。

在用10％胎牛血清补充的Dulbecco′s改良的Eagles′s培养基中培养人胚肾(HEK)293。对于转染实验，转染前24小时将细胞以5×10⁵细胞每培养孔接种到6孔培养皿中。将细胞在每培养孔含20μl lipofectAMINE^(美国Life Technologies，Inc.)和5.0μg 总DNA(用pcDNA3.1-PAK1(83-149)质粒或作为对照的pcDNA.1空载体)的1.0ml无血清培养基中孵育4小时。细胞不被处理或用白细胞介素1β(10ng/ml；位于美国MN，Minneapolis的R&D Systems，Inc.)刺激随后是在含10％胎牛血清的培养基中的恢复期(16小时)。移出培养上清并根据制造商提供的方法用ELISA监测IL-8(位于美国MN，Minneapolis的R&D Systems，Inc.)、PGE2(SpiBiom Inc.)、和MMP-13(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.)的表达。

1.4 Western印迹分析和ELISA

为评估带HA标签的PAK^183-149肽的表达，将细胞在100μl Lysis Buffer中(添加完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(德国Roche DiagnosticsGmbH)的20mM MOPS、2mM EGTA、5mM EDTA、0.5％NonidetP-40)，并用BCA蛋白质检测试剂盒(位于美国IL，Rockford的PierceBiotechnology，Inc.)确定蛋白质浓度。转移到PVDF膜(美国，MilliporeCorp.)之前用4-12％NuPAGE凝胶(德国，Invitrogen GmbH)分离蛋白质。

根据标准操作制备来自骨关节炎侵袭患者组织和来自正常组织的人原代软骨细胞蛋白质提取物。用二维凝胶电泳研究PAK1的表达并用30μg的蛋白质进行免疫印迹。对于二维凝胶电泳，在蛋白质IEF Cell(美国，Bio-Rad Laboratories，Inc.)上用长7-cm固定化的pH 3-10梯度的IPG条(美国，Bio-Rad Laboratories，Inc.)进行等电聚焦。最后的聚焦步骤为在4000V进行8小时。在NuPAGE Novex 4-12％ZOOM Gel(德国，Invitrogen GmbH)上进行第二维并将蛋白质转移到PVDF膜(美国，Millipore Corp)上。

对于免疫印迹，分别用HA标签多克隆抗体(位于美国CA，Palo Alto的BD Biosciences Clontech)和αPAK(N-20)多克隆抗体(Santa Cruz)检测带HA标签的PAK^183-149和PAK1蛋白质。简言之，将膜用TBS-T(含5％脱脂无水奶的150mM NaCl、20mM Tris，pH 7.6、0.1％Tween 209)于室温封闭1小时，在含1/500稀释的HA标签抗体或1/50稀释的αPAK(N-20)抗体的TBS-T中室温孵育1小时，并最后在含1/10000辣根过氧化物酶结合的抗兔抗体(Pierce)的TBS-T中孵育1小时。根据制造商的技术说明书(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.)将膜用ECL处理。

为分析MMP13、IL-8和PGE2的蛋白质水平，根据供应商的描述通过ELISA测定细胞培养上清中的MMP13(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.)、IL-8(位于美国MN，Minneapolis的R&D Systems，Inc.)和PGE2(SpiBio)。

2.结果

2.1PAK1在人软骨肉瘤细胞系和小鼠原代软骨细胞中的表达

用RT-PCR分析PAK1在人SW1353软骨细胞系及在用或不用维甲酸刺激的小鼠原代细胞中的表达。

该实验获得的结果清楚地表明PAK1在人SW1353软骨肉瘤细胞系及在小鼠原代软骨细胞中表达。在另一组实验中用RT-PCR证实PAK1在人CH8软骨细胞系中的表达。

在RNA水平上显示的结果还通过使用PAK1特异性抗体的Western印迹分析的蛋白质水平证实(图1)。

总而言之，在RNA和蛋白质水平上的结果证实PAK1在人和小鼠软骨细胞系和原代软骨细胞中表达。

2.2PAK1抑制结构域的表达对IL-1信号传导的干扰：

MMP13(基质金属蛋白酶13)代表与骨关节炎有关的IL-1诱导的蛋白质表达的重要标记蛋白质。为研究从IL-1到诱导MMP13表达的信号转导对PAK1的需要，将PAK1抑制结构域(PAK1-ID)在人软骨肉瘤细胞系SW1353中过量表达(图2)。

在转染和未转染的SW1353细胞中，暴露于IL-1β导致表达和释放到培养基中的MMP13大幅升高。该实验的结果清楚地表明PAK1-ID的过量表达抑制～55％的IL-1β诱导的MMP13在人SW1353软骨肉瘤细胞系中的表达。另外，在转染和未转染的SW1353细胞中能观察到分泌到培养基中的MMP13的基础水平。PAK1-ID的表达能在这些未刺激的细胞中抑制＞80％的IL-1β诱导的MMP13表达。总而言之，结果证实IL-1β诱导的MMP13表达需要PAK1。

另一重要的标记基因是前列腺素PGE2。分别在PAK1-ID存在和缺失的情况下分析了SW1353细胞中PGE2表达的调节(图3)。

象看到的对MMP13表达的抑制那样，这些结果证实通过PAK1-ID的过量表达抑制PAK1导致IL-1β诱导的信号传导途径的显著下调。在SW1353细胞系中IL-1β诱导的PGE2表达被抑制超过50％。另外，PGE2的调节表明PAK1参与和骨关节炎中疼痛有关的过程。

除它在SW1353细胞中的效果以外，我们研究了PAK1-ID的效果，即还在人胚肾HEK293细胞系中研究了它的生物抑制物对PAK1活性的干扰(图4)。

该实验的结果证实了在SW1353细胞研究中获得的发现。PAK1在信号传导级联调节中发挥重要作用，其中所述的信号传导级联由IL-1β诱导并从IL-1R的活化引导向下到转录因子的活化，上调与骨关节炎和疼痛有关的标记基因如MMP13、IL-8、和PGE2的表达。

序列表

<110>塞诺菲-安万特德国有限公司

<120>PAK抑制物用于治疗关节疾病的用途

<130>DEAV2003/0055

<160>12

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>1638

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

atgtcaaata acggcctaga cattcaagac aaacccccag cccctccgat gagaaatacc 60

agcactatga ttggagccgg cagcaaagat gctggaaccc taaaccatgg ttctaaacct 120

ctgcctccaa acccagagga gaagaaaaag aaggaccgat tttaccgatc cattttacct 180

ggagataaaa caaataaaaa gaaagagaaa gagcggccag agatttctct cccttcagat 240

tttgaacaca caattcatgt cggttttgat gctgtcacag gggagtttac cggaatgcca 300

gagcagtggg cccgcttgct tcagacatca aatatcacta agtcggagca gaagaaaaac 360

ccgcaggctg ttctggatgt gttggagttt tacaactcga agaagacatc caacagccag 420

aaatacatga gctttacaga taagtcagct gaggattaca attcttctaa tgccttgaat 480

gtgaaggctg tgtctgagac tcctgcagtg ccaccagttt cagaagatga ggatgatgat 540

gatgatgatg ctaccccacc accagtgatt gctccacgcc cagagcacac aaaatctgta 600

tacacacggt ctgtgattga accacttcct gtcactccaa ctcgggacgt ggctacatct 660

cccatttcac ctactgaaaa taacaccact ccaccagatg ctttgaccct taatactgag 720

aagcagaaga agaagcctaa aatgtctgat gaggagatct tggagaaatt acgaagcata 780

gtgagtgtgg gcgatcctaa gaagaaatat acacggtttg agaagattgg acaaggtgct 840

tcaggcaccg tgtacacagc aatggatgtg gccacaggac aggaggtggc cattaagcag 900

atgaatcttc agcagcagcc caagaaagag ctgattatta atgagatcct ggtcatgagg 960

gaaaacaaga acccaaacat tgtgaattac ttggacagtt acctcgtggg agatgagctg 1020

tgggttgtta tggaatactt ggctggaggc tccttgacag atgtggtgac agaaacttgc 1080

atggatgaag gccaaattgc agctgtgtgc cgtgagtgtc tgcaggctct ggagtctttg 1140

cattcgaacc aggtcattca cagagacatc aagagtgaca atattctgtt gggaatggat 1200

ggctctgtca agctaactga ctttggattc tgtgcacaga taaccccaga gcagagcaaa 1260

cggagcacca tggtaggaac cccatactgg atggcaccag aggttgtgac acgaaaggcc 1320

tatgggccca aggttgacat ctggtccctg ggcatcatgg ccatcgaaat gattgaaggg 1380

gagcctccat acctcaatga aaaccctctg agagccttgt acctcattgc caccaatggg 1440

accccagaac ttcagaaccc agagaagctg tcagctatct tccgggactt tctgaaccgc 1500

tgtctcgaga tggatgtgga gaagagaggt tcagctaaag agctgctaca gcatcaattc 1560

ctgaagattg ccaagcccct ctccagcctc actccactga ttgctgcagc taaggaggca 1620

acaaagaaca atcactaa 1638

<210>2

<211>545

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ser Asn Asn Gly Leu Asp Ile Gln Asp Lys Pro Pro Ala Pro Pro

1 5 10 15

Met Arg Asn Thr Ser Thr Met Ile Gly Ala Gly Ser Lys Asp Ala Gly

20 25 30

Thr Leu Asn His Gly Ser Lys Pro Leu Pro Pro Asn Pro Glu Glu Lys

35 40 45

Lys Lys Lys Asp Arg Phe Tyr Arg Ser Ile Leu Pro Gly Asp Lys Thr

50 55 60

Asn Lys Lys Lys Glu Lys Glu Arg Pro Glu Ile Ser Leu Pro Ser Asp

65 70 75 80

Phe Glu His Thr Ile His Val Gly Phe Asp Ala Val Thr Gly Glu Phe

85 90 95

Thr Gly Met Pro Glu Gln Trp Ala Arg Leu Leu Gln Thr Ser Asn Ile

100 105 110

Thr Lys Ser Glu Gln Lys Lys Asn Pro Gln Ala Val Leu Asp Val Leu

115 120 125

Glu Phe Tyr Asn Ser Lys Lys Thr Ser Asn Ser Gln Lys Tyr Met Ser

130 135 140

Phe Thr Asp Lys Ser Ala Glu Asp Tyr Asn Ser Ser Asn Ala Leu Asn

145 150 155 160

Val Lys Ala Val Ser Glu Thr Pro Ala Val Pro Pro Val Ser Glu Asp

165 170 175

Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ala Thr Pro Pro Pro Val Ile Ala Pro

180 185 190

Arg Pro Glu Hi s Thr Lys Ser Val Tyr Thr Arg Ser Val Ile Glu Pro

195 200 205

Leu Pro Val Thr Pro Thr Arg Asp Val Ala Thr Ser Pro Ile Ser Pro

210 215 220

Thr Glu Asn Asn Thr Thr Pro Pro Asp Ala Leu Thr Leu Asn Thr Glu

225 230 235 240

Lys Gln Lys Lys Lys Pro Lys Met Ser Asp Glu Glu Ile Leu Glu Lys

245 250 255

Leu Arg Ser Ile Val Ser Val Gly Asp Pro Lys Lys Lys Tyr Thr Arg

260 265 270

Phe Glu Lys Ile Gly Gln Gly Ala Ser Gly Thr Val Tyr Thr Ala Met

275 280 285

Asp Val Ala Thr Gly Gln Glu Val Ala Ile Lys Gln Met Asn Leu Gln

290 295 300

Gln Gln Pro Lys Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Ile Leu Val Met Arg

305 310 315 320

Glu Asn Lys Asn Pro Asn Ile Val Asn Tyr Leu Asp Ser Tyr Leu Val

325 330 335

Gly Asp Glu Leu Trp Val Val Met Glu Tyr Leu Ala Gly Gly Ser Leu

340 345 350

Thr Asp Val Val Thr Glu Thr Cys Met Asp Glu Gly Gln Ile Ala Ala

355 360 365

Val Cys Arg Glu Cys Leu Gln Ala Leu Glu Ser Leu His Ser Asn Gln

370 375 380

Val Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Asp Asn Ile Leu Leu Gly Met Asp

385 390 395 400

Gly Ser Val Lys Leu Thr Asp Phe Gly Phe Cys Ala Gln Ile Thr Pro

405 410 415

Glu Gln Ser Lys Arg Ser Thr Met Val Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala

420 425 430

Pro Glu Val Val Thr Arg Lys Ala Tyr Gly Pro Lys Val Asp Ile Trp

435 440 445

Ser Leu Gly Ile Met Ala Ile Glu Met Ile Glu Gly Glu Pro Pro Tyr

450 455 460

Leu Asn Glu Asn Pro Leu Arg Ala Leu Tyr Leu Ile Ala Thr Asn Gly

465 470 475 480

Thr Pro Glu Leu Gln Asn Pro Glu Lys Leu Ser Ala Ile Phe Arg Asp

485 490 495

Phe Leu Asn Arg Cys Leu Glu Met Asp Val Glu Lys Arg Gly Ser Ala

500 505 510

Lys Glu Leu Leu Gln His Gln Phe Leu Lys Ile Ala Lys Pro Leu Ser

515 520 525

Ser Leu Thr Pro Leu Ile Ala Ala Ala Lys Glu Ala Thr Lys Asn Asn

530 535 540

His

545

<210>3

<211>524

<212>PRT

<213>人

<400>3

Met Ser Asp Asn Gly Glu Leu Glu Asp Lys Pro Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Arg Met Ser Ser Thr Ile Phe Ser Thr Gly Gly Lys Asp Pro Leu Ser

20 25 30

Ala Asn His Ser Leu Lys Pro Leu Pro Ser Val Pro Glu Glu Lys Lys

35 40 45

Pro Arg His Lys Ile Ile Ser Ile Phe Ser Gly Thr Glu Lys Gly Ser

50 55 60

Lys Lys Lys Glu Lys Glu Arg Pro Glu Ile Ser Pro Pro Ser Asp Phe

65 70 75 80

Glu His Thr Ile His Val Gly Phe Asp Ala Val Thr Gly Glu Phe Thr

85 90 95

Gly Met Pro Glu Gln Trp Ala Arg Leu Leu Gln Thr Ser Asn Ile Thr

100 105 110

Lys Leu Glu Gln Lys Lys Asn Pro Gln Ala Val Leu Asp Val Leu Lys

115 120 125

Phe Tyr Asp Ser Asn Thr Val Lys Gln Lys Tyr Leu Ser Phe Thr Pro

130 135 140

Pro Glu Lys Asp Gly Leu Pro Ser Gly Thr Pro Ala Leu Asn Ala Lys

145 150 155 160

Gly Thr Glu Ala Pro Ala Val Val Thr Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu

165 170 175

Glu Thr Ala Pro Pro Val Ile Ala Pro Arg Pro Asp His Thr Lys Ser

180 185 190

Ile Tyr Thr Arg Ser Val Ile Asp Pro Val Pro Ala Pro Val Gly Asp

195 200 205

Ser His Val Asp Gly Ala Ala Lys Ser Leu Asp Lys Gln Lys Lys Lys

210 215 220

Pro Lys Met Thr Asp Glu Glu Ile Met Glu Lys Leu Arg Thr Ile Val

225 230 235 240

Ser Ile Gly Asp Pro Lys Lys Lys Tyr Thr Arg Tyr Glu Lys Ile Gly

245 250 255

Gln Gly Ala Ser Gly Thr Val Phe Thr Ala Thr Asp Val Ala Leu Gly

260 265 270

Gln Glu Val Ala Ile Lys Gln Ile Asn Leu Gln Lys Gln Pro Lys Lys

275 280 285

Glu Leu Ile Ile Asn Glu Ile Leu Val Met Lys Glu Leu Lys Asn Pro

290 295 300

Asn Ile Val Asn Phe Leu Asp Ser Tyr Leu Val Gly Asp Glu Leu Phe

305 310 315 320

Val Val Met Glu Tyr Leu Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asp Val Val Thr

325 330 335

Glu Thr Cys Met Asp G1u Ala G1n Ile A1a Ala Val Cys Arg Glu Cys

340 345 350

Leu Gln Ala Leu Glu Phe Leu His Ala Asn Gln Val Ile His Arg Asp

355 360 365

Ile Lys Ser Asp Asn Val Leu Leu Gly Met Glu Gly Ser Val Lys Leu

370 375 380

Thr Asp Phe Gly Phe Cys Ala Gln Ile Thr Pro Glu Gln Ser Lys Arg

385 390 395 400

Ser Thr Met Val Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu Val Val Thr

405 410 415

Arg Lys Ala Tyr Gly Pro Lys Val Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile Met

420 425 430

Ala Ile Glu Met Val Glu Gly Glu Pro Pro Tyr Leu Asn Glu Asn Pro

435 440 445

Leu Arg Ala Leu Tyr Leu Ile Ala Thr Asn Gly Thr Pro Glu Leu Gln

450 455 460

Asn Pro Glu Lys Leu Ser Pro Ile Phe Arg Asp Phe Leu Asn Arg Cys

465 470 475 480

Leu Glu Met Asp Val Glu Lys Arg Gly Ser Ala Lys Glu Leu Leu Gln

485 490 495

His Pro Phe Leu Lys Leu Ala Lys Pro Leu Ser Ser Leu Thr Pro Leu

500 505 510

Ile Met Ala Ala Lys Glu Ala Met Lys Ser Asn Arg

515 520

<210>4

<211>544

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Ser Asp Gly Leu Asp Asn Glu Glu Lys Pro Pro Ala Pro Pro Leu

1 5 10 15

Arg Met Asn Ser Asn Asn Arg Asp Ser Ser Ala Leu Asn His Ser Ser

20 25 30

Lys Pro Leu Pro Met Ala Pro Glu Glu Lys Asn Lys Lys Ala Arg Leu

35 40 45

Arg Ser Ile Phe Pro Gly Gly Gly Asp Lys Thr Asn Lys Lys Lys Glu

50 55 60

Lys Glu Arg Pro Glu Ile Ser Leu Pro Ser Asp Phe Glu His Thr Ile

65 70 75 80

His Val Gly Phe Asp Ala Val Thr Gly Glu Phe Thr Gly Ile Pro Glu

85 90 95

Gln Trp Ala Arg Leu Leu Gln Thr Ser Asn Ile Thr Lys Leu Glu Gln

100 105 110

Lys Lys Asn Pro Gln Ala Val Leu Asp Val Leu Lys Phe Tyr Asp Ser

115 120 125

Lys Glu Thr Val Asn Asn Gln Lys Tyr Met Ser Phe Thr Ser Gly Asp

130 135 140

Lys Ser Ala His Gly Tyr Ile Ala Ala His Pro Ser Ser Thr Lys Thr

145 150 155 160

Ala Ser Glu Pro Pro Leu Ala Pro Pro Val Ser Glu Glu Glu Asp Glu

165 170 175

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asn Glu Pro Pro Pro Val Ile Ala

180 185 190

Pro Arg Pro Glu His Thr Lys Ser Ile Tyr Thr Arg Ser Val Val Glu

195 200 205

Ser Ile Ala Ser Pro Ala Val Pro Asn Lys Glu Val Thr Pro Pro Ser

210 215 220

Ala Glu Asn Ala Asn Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Asn Thr Asp Arg Gln

225 230 235 240

Arg Lys Lys Ser Lys Met Thr Asp Glu Glu Ile Leu Glu Lys Leu Arg

245 250 255

Ser Ile Val Ser Val Gly Asp Pro Lys Lys Lys Tyr Thr Arg Phe Glu

260 265 270

Lys Ile Gly Gln Gly Ala Ser Gly Thr Val Tyr Thr Ala Leu Asp Ile

275 280 285

Ala Thr Gly Gln Glu Val Ala Ile Lys Gln Met Asn Leu Gln Gln Gln

290 295 300

Pro Lys Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Ile Leu Val Met Arg Glu Asn

305 310 315 320

Lys Asn Pro Asn Ile Val Asn Tyr Leu Asp Ser Tyr Leu Val Gly Asp

325 330 335

Glu Leu Trp Val Val Met Glu Tyr Leu Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asp

340 345 350

Val Val Thr Glu Thr Cys Met Asp Glu Gly Gln Ile Ala Ala Val Cys

355 360 365

Arg Glu Cys Leu Gln Ala Leu Asp Phe Leu His Ser Asn Gln Val Ile

370 375 380

His Arg Asp Ile Lys Ser Asp Asn Ile Leu Leu Gly Met Asp Gly Ser

385 390 395 400

Val Lys Leu Thr Asp Phe Gly Phe Cys Ala Gln Ile Thr Pro Glu Gln

405 410 415

Ser Lys Arg Ser Thr Met Val Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu

420 425 430

Val Val Thr Arg Lys Ala Tyr Gly Pro Lys Val Asp Ile Trp Ser Leu

435 440 445

Gly Ile Met Ala Ile Glu Met Val Glu Gly Glu Pro Pro Tyr Leu Asn

450 455 460

Glu Asn Pro Leu Arg Ala Leu Tyr Leu Ile Ala Thr Asn Gly Thr Pro

465 470 475 480

Glu Leu Gln Asn Pro Glu Arg Leu Ser Ala Val Phe Arg Asp Phe Leu

485 490 495

Asn Arg Cys Leu Glu Met Asp Val Asp Arg Arg Gly Ser Ala Lys Glu

500 505 510

Leu Leu Gln His Pro Phe Leu Lys Leu Ala Lys Pro Leu Ser Ser Leu

515 520 525

Thr Pro Leu Ile Ile Ala Ala Lys Glu Ala Ile Lys Asn Ser Ser Arg

530 535 540

<210>5

<211>591

<212>PRT

<213>人

<400>5

Met Phe Gly Lys Arg Lys Lys Arg Val Glu Ile Ser Ala Pro Ser Asn

1 5 10 15

Phe Glu His Arg Val His Thr Gly Phe Asp Gln His Glu Gln Lys Phe

20 25 30

Thr Gly Leu Pro Arg Gln Trp Gln Ser Leu Ile Glu Glu Ser Ala Arg

35 40 45

Arg Pro Lys Pro Leu Val Asp Pro Ala Cys Ile Thr Ser Ile Gln Pro

50 55 60

Gly Ala Pro Lys Thr Ile Val Arg Gly Ser Lys Gly Ala Lys Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Thr Leu Leu Leu Asp Glu Phe Glu Asn Met Ser Val Thr Arg

85 90 95

Ser Asn Ser Leu Arg Arg Asp Ser Pro Pro Pro Pro Ala Arg Ala Arg

100 105 110

Gln Glu Asn Gly Met Pro Glu Glu Pro Ala Thr Thr Ala Arg Gly Gly

115 120 125

Pro Gly Lys Ala Gly Ser Arg Gly Arg Phe Ala Gly His Ser Glu Ala

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Asp Arg Arg Arg Ala Gly Pro Glu Lys Arg Pro

145 150 155 160

Lys Ser Ser Arg Glu Gly Ser Gly Gly Pro Gln Glu Ser Ser Arg Asp

165 170 175

Lys Arg Pro Leu Ser Gly Pro Asp Val Gly Thr Pro Gln Pro Ala Gly

180 185 190

Leu Ala Ser Gly Ala Lys Leu Ala Ala Gly Arg Pro Phe Asn Thr Tyr

195 200 205

Pro Arg Ala Asp Thr Asp His Pro Ser Arg Gly Ala Gln Gly Glu Pro

210 215 220

His Asp Val Ala Pro Asn Gly Pro Ser Ala Gly Gly Leu Ala Ile Pro

225 230 235 240

Gln Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Pro Pro Thr Arg Ala Arg Gly Ala

245 250 255

Pro Ser Pro Gly Val Leu Gly Pro His Ala Ser Glu Pro Gln Leu Ala

260 265 270

Pro Pro Ala Cys Thr Pro Ala Ala Pro Ala Val Pro Gly Pro Pro Gly

275 280 285

Pro Arg Ser Pro Gln Arg Glu Pro Gln Arg Val Ser His Glu Gln Phe

290 295 300

Arg Ala Ala Leu Gln Leu Val Val Asp Pro Gly Asp Pro Arg Ser Tyr

305 310 315 320

Leu Asp Asn Phe Ile Lys Ile Gly Glu Gly Ser Thr Gly Ile Val Cys

325 330 335

Ile Ala Thr Val Arg Ser Ser Gly Lys Leu Val Ala Val Lys Lys Met

340 345 350

Asp Leu Arg Lys Gln Gln Arg Arg Glu Leu Leu Phe Asn Glu Val Val

355 360 365

Ile Met Arg Asp Tyr Gln His Glu Asn Val Val Glu Met Tyr Asn Ser

370 375 380

Tyr Leu Val Gly Asp Glu Leu Trp Val Val Met Glu Phe Leu Glu Gly

385 390 395 400

Gly Ala Leu Thr Asp Ile Val Thr His Thr Arg Met Asn Glu Glu Gln

405 410 415

Ile Ala Ala Val Cys Leu Ala Val Leu Gln Ala Leu Ser Val Leu His

420 425 430

Ala Gln Gly Val Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Asp Ser Ile Leu Leu

435 440 445

Thr His Asp Gly Arg Val Lys Leu Ser Asp Phe Gly Phe Cys Ala Gln

450 455 460

Val Ser Lys Glu Val Pro Arg Arg Lys Ser Leu Val Gly Thr Pro Tyr

465 470 475 480

Trp Met Ala Pro Glu Leu Ile Ser Arg Leu Pro Tyr Gly Pro Glu Val

485 490 495

Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile Met Val Ile Glu Met Val Asp Gly Glu

500 505 510

Pro Pro Tyr Phe Asn Glu Pro Pro Leu Lys Ala Met Lys Met Ile Arg

515 520 525

Asp Asn Leu Pro Pro Arg Leu Lys Asn Leu His Lys Val Ser Pro Ser

530 535 540

Leu Lys Gly Phe Leu Asp Arg Leu Leu Val Arg Asp Pro Ala Gln Arg

545 550 555 560

Ala Thr Ala Ala Glu Leu Leu Lys His Pro Phe Leu Ala Lys Ala Gly

565 570 575

Pro Pro Ala Ser Ile Val Pro Leu Met Arg Gln Asn Arg Thr Arg

580 585 590

<210>6

<211>67

<212>PRT

<213>人

<400>6

His Thr Ile His Val Gly Phe Asp Ala Val Thr Gly Glu Phe Thr Gly

1 5 10 15

Met Pro Glu Gln Trp Ala Arg Leu Leu Gln Thr Ser Asn Ile Thr Lys

20 25 30

Ser Glu Gln Lys Lys Asn Pro Gln Ala Val Leu Asp Val Leu Glu Phe

35 40 45

Tyr Asn Ser Lys Lys Thr Ser Asn Ser Gln Lys Tyr Met Ser Phe Thr

50 55 60

Asp Lys Ser

65

<210>7

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>7

Lys Pro Pro Ala Pro Pro Met Arg Asn Thr Ser Thr Met

1 5 10

<210>8

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>含与来自HIV tat蛋白多元序列融合的PAK1脯氨酸富含序列的合成肽的氨基酸序列

<400>8

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Lys Pro Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Met Arg Asn Thr Ser Thr Met

20 25

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>以人和小鼠PAK1 cDNA之间的保守序列为靶标的第一PCR引物

<400>9

tggctggagg ctccttgaca 20

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>以人和小鼠PAK1 cDNA之间的保守序列为靶标的第二PCR引物

<400>10

gagggcttgg caatcttcag ga 22

<210>11

<211>61

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增PAK1-ID的第一PCR引物

<400>11

atcgccacca tgtaccctta tgatgtgcca gattatgccc acacaattca tgtcggtttt 60

g 61

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增PAK1-ID的第二PCR引物

<400>12

atcttatgac ttatctgtaa agctcatg 28

Claims

1.p21激活性激酶(PAK)抑制物的用途，用于产生治疗关节疾病的药物。

2.根据权利要求1的用途，其中关节疾病是退化性关节疾病或炎性关节疾病。

3.根据权利要求2的用途，其中退化性关节疾病是骨关节炎。

4.根据权利要求2的用途，其中炎性关节疾病是类风湿性关节炎。

5.p21激活性激酶(PAK)抑制物的用途，用于产生治疗关节痛的药物。

6.根据权利要求5的用途，其中关节痛与退化性关节疾病相关。

7.根据权利要求1至6中任意一项所述的用途，其中PAK是PAK1、PAK2、PAK3或PAK4，优选地是人PAK1。

8.根据权利要求1至7中任意一项所述的用途，其中PAK抑制物是具有氨基酸序列HTIHVGFDAV TGEFTGMPEQ WARLLQTSNITKSEQKKNPQ AVLDVLEFYN SKKTSNSQKY MSFTDKS(SEQ IDNO：6)的PAK1抑制物结构域、具有氨基酸序列KPPAPPMRNT STM(SEQ ID NO：7)的PAK1肽、具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRGKPPAPPMR NTSTM(SEQ ID NO：8)的Tat-PAK融合肽、针对PAK的结合蛋白或结合肽、针对PAK基因或PAK的核酸、化学分子和/或天然产物提取物。

9.根据权利要求8的用途，其中结合蛋白或结合肽是针对PAK的抗体、抗体的抗原结合部分或蛋白质支架，优选地是anticalin。

10.根据权利要求9的用途，其中核酸是反义核酸、适体、siRNA或核酶。

11.作为靶蛋白质的PAK或PAK基因的用途，用于发现作为治疗关节疾病或关节痛的药物的PAK抑制物。

12.根据权利要求12的用途，其中将PAK或PAK基因直接或间接与测试化合物接触并测量或检测测试化合物对PAK或PAK基因的影响。

13.筛选PAK抑制物的方法，其中该方法包括步骤：

(a)提供PAK或PAK基因，

(b)提供测试化合物，并

(c)测量或检测测试化合物对PAK或PAK基因的影响。

14.根据权利要求13的方法，其中测试化合物以化合物文库的形式提供。

15.根据权利要求13或14的方法，其中在多相或均相测定法中测量或检测测试化合物对PAK或PAK基因的影响。

16.根据权利要求15的方法，其中多相测定法是ELISA(酶联免疫吸附测定法)、DELFIA(解离增强的镧系荧光免疫测定法)、SPA(闪烁邻近测定法)或快速平板测定法。

17.根据权利要求15的方法，其中均相测定法是TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)测定法、FP(荧光偏振)测定法、ALPHA(放大的发光临近均相测定法)、EFC(酶片段互补)测定法或基因测定法。

18.根据权利要求13到17中任意一项所述的方法，其中所述方法是在阵列上实施的。

19.根据权利要求13到15中任意一项所述的方法，其中所述方法是用完整的细胞实施的。

20.根据权利要求13到19中任意一项所述的方法，其中所述方法是在机器人系统中实施的。

21.根据权利要求13到20中任意一项所述的方法，其中所述方法是用微流体技术实施的。

22.根据权利要求13到21中任意一项所述的方法，其中所述方法为高通量筛选PAK抑制物的方法。

23.产生治疗关节疾病和/或关节痛的药物的方法，其中该方法包括步骤：

(a)实施根据权利要求13到22中任意一项所述的方法，

(b)分离适用于治疗关节疾病和/或关节痛的经测量或检测过的测试化合物，以及

(c)将经测量或检测过的测试化合物与一种或多种可药用载体或辅助物质制剂。