MXPA06000637A - Uso de un inhibidor de la pak para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de un inhibidor de la cinasa activada por p21 (PAK) para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones tal como osteoartritis o artritis reumatoide, o para el tratamiento de un dolor de las articulaciones, y al uso de la PAK como proteina diana para el descubrimiento de un inhibidor de la PAK como medicamento para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones.

Description

J USO DE UN INHIBIDOR DE LA PAK PARA EL TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD DE LAS ARTICULACIONES 5 DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere al uso de un inhibidor de la cinasa activada por p21 (PAK) para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones tal como osteoartritis o artritis reumatoide, o para el tratamiento de un dolor de las articulaciones, y al uso de la PAK como proteína diana para 10 el descubrimiento de un inhibidor de la PAK como medicamento para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones. La osteoartritis es la dolencia discapacitadora más común del hombre en el mundo occidental. Debido al envejecimiento de la población, tenemos que afrontar una población de pacientes en continuo crecimiento, 15 cuya calidad de vida está gravemente afectada. Además, la enfermedad conlleva una tremenda carga socio-económica, con altos costes directos e indirectos. Las modalidades actuales de tratamiento se concentran en el tratamiento del dolor asociado a la osteoartritis, pero aún carecemos completamente de alguna modalidad de tratamiento farmacológico capaz de 20 ralentizar, detener o incluso invertir el curso de la enfermedad. La osteoartritis puede ser considerada como el resultado clínico y patológico de un intervalo de trastornos que da como resultado un fallo estructural y funcional de las articulaciones sinoviales. La osteoartritis se *J produce cuando el equilibrio dinámico entre la rotura y la reparación de los tejidos de la articulación es desbordado. El fallo estructural del cartílago articular puede resultar de tensiones mecánicas anormales que lesionan el cartílago sano, así como de un fallo del cartílago dañado patológicamente que 5 se degenera bajo la influencia de tensiones mecánicas fisiológicas. Los cambios morfológicos observados en la osteoartritis incluyen la erosión del cartílago, así como un grado variable de inflamación sinovial. Estos cambios se atribuyen a una compleja red de factores bioquímicos, que incluyen enzimas proteolíticas, que conducen a una rotura de las macromoléculas del 10 cartílago. Las citoquinas tales como IL-1 y TNFa, que son producidas por sinoviocitos activados, por células mononucleares o por el propio cartílago articular, regulan en ascenso significativamente la expresión genética de las metaloproteinasas (MMP) y de las citoquinas, y merman las rutas de síntesis compensatorias. Por ejemplo, la activación del factor complejo de 15 transcripción de la AP1 por IL-1 y/o TNFa mediante la transmisión de señales vía rutas MAPK (proteincinasa activada por mitógenos) juega un importante papel para la regulación de la expresión de genes marcadores que son relevantes para la osteoartritis. Un factor bioquímico adicional implicado en el catabolismo del 20 cartílago y en la génesis de dolor inflamatorio es la PGE2 (prostaglandina E2). La PGE2, un eicosanoide sintetizado por cicloxigenasa (COX) -1 y -2, está implicada en la degradación de proteoglicanos mediada por IL-1, y la administración de PGE2 en ratas o ratones conscientes induce hiperalgesia.

V La expresión endógena de IL-1 ß conduce a la inducción de COX-2 en la articulación humana con osteoartritis. Por consiguiente, la osteoartritis se caracteriza por una degeneración lenta y progresiva del cartílago articular. La etiología exacta de 5 la osteoartritis no se conoce aún, pero se acepta generalmente que la degradación de los componentes de la matriz del cartílago es debida a una síntesis y activación incrementadas de proteinasas extracelulares, principalmente metaloproteinasas matriciales, y de citoquinas que amplifican los procesos degenerativos. Se requieren nuevos planteamientos para tratar 10 la osteoartritis, y el progreso en el entendimiento de la biología de los trastornos de los cartílagos ha llevado al uso de genes cuyos productos estimulan la reparación del cartílago o inhiben la rotura de la matriz cartilaginosa. Varios estudios ilustran, p.ej., la importancia potencial de modular la actividad de la IL-1 como medio para reducir la progresión de los 15 cambios estructurales en la osteoartritis. Por tanto, un objeto de la presente invención es encontrar nuevas vías terapéuticas para la evitación o la reducción de los efectos de los factores que dañan el cartílago. Sorprendentemente, la PAK, en particular la PAK1, ha sido 20 identificada como un mediador importante de la activación inducida por IL-1 de rutas de transmisión de señales que conducen a una regulación en ascenso de la expresión de genes marcadores que son relevantes para la osteoartritis. La PAK1 pertenece a un miembro de la familia V evolucionariamente conservada de las serin/treonincinasas, que son importantes para diversas funciones celulares, que incluyen morfogénesis celular, motilidad, supervivencia, mitosis, y angiogénesis. Las PAKs pertenecen a la familia más grande de proteincinasas Ste20. La Ste20p es 5 una proteína putativa cinasa cinasa cinasa cinasa activada por mitógeno (MAP4K) de levadura, implicada en la ruta de apareamiento de la S. cerevisiae. Sus homólogos en mamíferos, Drosophila, Caenorhabditis elegans y otros organismos componen un gran grupo emergente de proteincinasas que incluyen miembros en los seres humanos. Las cinasas del grupo Ste20 se 10 dividen adicionalmente en las familias de las cinasas activadas por p21 (PAK) y las cinasas del centro germinal (GCK). Se caracterizan por la presencia de un dominio de cinasa conservado y una región no catalítica de gran diversidad estructural que permite a las cinasas interactuar con diversas moléculas transmisoras de señales y proteínas regulatorias del citoesqueleto. 15 Varias publicaciones han descrito un papel para las PAKs en la regulación de la actividad de la MAPK en células de mamíferos (véase, p.ej., Dan, C. et al. (2002) Mol. Cell Biol., 22, 567-577). Las cascadas MAPK son cruciales en un amplio intervalo de eventos celulares, transmitiendo señales a partir de estímulos extracelulares tales como factores de crecimiento, 20 citoquinas y tensiones del entorno, para activar factores de transcripción, dando como resultado la regulación de la expresión genética (Johnson, G. L. y Lapadat, R. (2002) Science, 298, 1911-1912). La transmisión de señales es mediada por fosforilación secuencial lineal de un módulo de cinasa triple que consiste en MAP cinasa cinasa cinasa (MAP3K), MAP cinasa cinasa (MAP2K) y MAPK. El módulo de cinasa triple y su mecanismo de activación están muy conservados en la evolución eucariótica desde la levadura hasta los mamíferos. En las células de los mamíferos, las PAKs se identifican como diana efectora corriente abajo de Cdc42 y Rac1, y la unión de GTPasas a la Pak1 estimula su actividad cinasa vía autofosforilación. Las PAKs forman complejos específicamente con p21 activada (unida a GTP), inhibiendo la actividad de la p21 GTPasa y conduciendo a la autofosforilación y activación de la cinasa. Las cinasas de la familia PAK, conservadas desde las levaduras hasta los seres humanos, son activadas directamente por Cdc42 ó Rac1 mediante la interacción con un motivo N-terminal conservado (correspondiente a los residuos 71 a 137 en aPAK). La cinasa autofosforilada tiene una afinidad disminuida por Cdc42/Rac1, liberando la p21 para más actividades estimulatorias o la regulación en descenso por proteínas activadoras de la GTPasa (Manser, E. et al. (1994) Nature, 367, 40-46). Además de Rad y Cdc42, homólogos recientemente identificados de la familia Rho de GTPasas, tales como Wrch-1 y Chp, pueden activar también las PAKs e inducir la formación de filopodios y la disolución de fibras de tensión (Aronheim, A. et al. (1998) Curr. Biol. 8, 1125-1128). Los factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs) y las proteínas activadoras de GTPasa (GAPs), que regulan los estados de unión GTP-GDP de la familia Rho de GTPasas, son importantes determinantes de la transmisión de señales corriente abajo activada por cinasas PAK1 (Zhou, K. et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 16782-16786). La secuencia de ácidos nucleicos y ia secuencia de aminoácidos de la PAK1 se muestran en la SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de PAK1 requeridas para una unión fuerte con Cdc42 y Rae han sido estudiadas analizando propiedades de fragmentos truncados y mutantes dirigidos a sitios, así como determinando la estructura de resolución de un complejo de Cdc42 con el segmento homólogo de la WASP (Burbelo, P. D. et al. (1995) J. Biol. Chem., 270, 29071-29074; Rudolph, M. G. et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 18067-18076; Abdul-Manan, N. et al. (1999) Nature, 399, 379-383). Superpuesto, pero no coincidente con el PBD (dominio de unión con la p21) de la PAK1 , hay un segmento implicado en la autoinhibición (Zhao, Z. S. et al. (1998) Mol. Cell Biol, 18, 2153-2163; Lei, M. et al. (2000) Cell, 102, 387-397). Esta región autorregulatoria incluye el dominio del interruptor inhibitorio y el inhibitorio de las cinasas, que interfieren con la autoactivación de las cinasas (Lei, M. et al. (2000) Cell 102, 387-397). Las mutaciones dentro de la región autoregulatoria dan mutantes constitutivamente activos (Zhao, Z. S. et al. (1998), véase anteriormente; Lei, M. et al. (2000) véase anteriormente). La expresión del dominio autorregulatorio que incluye los aminoácidos 83-149 (PID para el dominio inhibitorio de las PAK) de la PAK1 en células de mamíferos impide la activación de efectores de corriente abajo mediante la PAK1. Así, la expresión conjunta de este inhibidor de la PAK con la GTPasa Cdc42G12V constitutivamente activa, un acitvador de la PAK1 , impidió p.ej. la formación de microfilamentos de actina periférica y la pérdida asociada de fibras de tensión inducidas normalmente por esta proteína p21 (Zhao, Z. S. et al. (1998), véase anteriormente. En unos informes recientes, la inhibición de la actividad de la PAK1 en células cancerosas de mama se asoció con una reducción en la actividad de la cinasa c-Jun N-terminal, la inhibición de la actividad de unión con el ADN del factor de transcripción AP-1 y la supresión de la transcripción in vivo conducida por el promotor del AP-1 , del que se sabe que está implicado en la invasión del cáncer de mama (Adam, L. et ai. (2000) J. Biol. Chem., 275, 12041-12050). Además, la Ngo, el agente etiológico de la gonorrea, induce la activación de citoquinas proinflamatorias mediante una cascada de cinasas de respuesta a la tensión celular que implica PAK, la cual dirige la señal desde la familia Rho de GTPasas pequeñas hasta la activación de la JNK y el AP-1 (Naumann, M. et al. (1998) J. Exp. Med., 188, 1277-1286). Sin embargo, no ha habido informes acerca de un papel potencial para las cinasas de la familia PAK en una enfermedad de las articulaciones tal como la osteoartritis. Un tema de la presente invención es, por tanto, el uso de un inhibidor de la PAK para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones, en particular una enfermedad degenerativa de las articulaciones tal como la osteoartritis y/o una enfermedad inflamatoria de las articulaciones tal como la artritis reumatoide. El inhibidor de la PAK también se puede usar para tratar el dolor de las articulaciones, en particular reduciendo el dolor de las ariticulaciones en enfermedades degenerativas de las articulaciones. Además, se puede usar un inhibidor de la PAK para la producción de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones y/o para el tratamiento del dolor de las articulaciones especificado anteriormente. Según la presente invención, el término "inhibidor" se refiere a un compuesto bioquímico o químico que inhibe preferiblemente o reduce la actividad de la serin/treonincinasa de la PAK o la expresión del gen de la PAK o la localización de la PAK en la célula, como se describe, p.ej., en Kiosses, W. B. et al. (2002) Circ. Research, April 5, 2002, 697-702. La actividad de la serin/treonincinasa puede ser medida según protocolos normalizados, p.ej., con el Ensayo de Serin Treonincinasa HitHunter™, de Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE.UU. La expresión del gen de la PAK puede ser medida por RT-PCT o por análisis Western blot, como se describe en los ejemplos de la presente invención. El término "PAK" se refiere a una familia de serin/treonincinasas activadas por p21 que incluye, sin limitación, PAK1, PAK2, PAK3 y/o PAK4. Estas proteínas sirven preferiblemente como dianas para las proteínas pequeñas de unión al GTP Cdc42 y Rae descritas anteriormente. En particular, el término "PAK" se refiere a PAK humana, especialmente PAK1 humana. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la PAK1 humana se muestran en la SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las PAK 2, 3 y 4 humanas se muestran en la SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente. Las secuencias genéticas que codifican estas PAKs humanas pueden ser derivadas fácilmente usando el código genético. Los números de acceso del banco de genes para las PAK 1 , 2, 3 y 4 humanas son NP_002567, Q13177, NP_002569 y NP_005875, respectivamente. Los homólogos no humanos pueden ser aislados por medio de las secuencias genéticas de las PAK 1 , 2, 3 ó 4 humanas con métodos conocidos por una persona experta en la técnica, p.ej., mediante amplificación por PCR o hibridación bajo condiciones severas (p.ej. 60 °C en tampón SSC 2,5 x seguido de varias etapas de lavado a 37 °C en un tampón de concentración más baja) con sondas adecuadas derivadas de, p.ej., las secuencias de PAK humana según métodos de laboratorio normalizados. Los ejemplos de tales inhibidores de la PAK son el dominio inhibidor de la PAK1 con la secuencia de aminoácidos HTIHVGFDAV TGEFTGMPEQ WARLLQTSNI TKSEQKKNPQ AVLDVLEFYN SKKTSNSQKY MSFTDKS (SEQ ID NO: 6), el péptido PAK1 con la secuencia de aminoácidos KPPAPPMRNT STM (SEQ ID NO: 7), el péptido de fusión Tat-PAK con la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRR RGKPPAPPMR NTSTM (SEQ ID NO: 8), proteínas de unión o péptidos de unión dirigidos contra la PAK, en particular contra el sitio activo de la PAK, ácidos nucleicos dirigidos contra el gen de la PAK o la propia PAK, una molécula química, preferiblemente una molécula pequeña, y/o un extracto de un producto natural. Según la presente invención, el término "molécula química" engloba compuestos orgánicos no poliméricos, lípidos, carbohidratos, péptidos, preferiblemente péptidos con de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 aminoácidos, en particular con de 10 a 25 aminoácidos y oligonucleótidos, preferiblemente con de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nucleótidos, en particular con de 15 a 25 nucleótidos. Son especialmente preferidas las moléculas químicas pequeñas, en particular compuestos orgánicos no poliméricos, bien sintetizados en un laboratorio o bien existentes en la naturaleza, con un peso molecular preferido de aproximadamente 200 g/mol a aproximadamente 1500 g/mol, en particular de 400 g/mol a 1000 g/mol. Alternativamente, el inhibidor de la presente invención puede estar en la forma de un extracto de un producto natural, bien en forma bruta o bien purificada. El extracto puede producirse según procedimientos normalizados, tales como extracción en agua y/o alcohol y/o un disolvente orgánico y/o cromatografía en columna y/o precipitación a partir de una fuente animal, vegetal o microbiana, como veneno de serpiente, hojas o caldos de fermentación microbiana. El término "proteína de unión" o "péptido de unión" se refiere a una clase de proteínas o péptidos que se unen e inhiben a la RAK, que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpos y proteínas andamio dirigidas contra la PAK, p.ej. anticalinas, que se dirigen contra la PAK. El procedimiento para preparar un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se efectúa de acuerdo con métodos que son bien conocidos por el experto en la materia, p.ej. inmunizando un mamífero, por ejemplo un conejo, con PAK, donde sea apropiado en presencia de, por ejemplo, adyuvante de Freund y/o geles de hidróxido de aluminio (véase, por ejemplo, Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349). Los anticuerpos policlonales que se forman en el animal como resultado de una reacción inmunológica pueden ser aislados de la sangre posteriormente usando métodos bien conocidos y, por ejemplo, ser purificados por medio de cromatografía en columna. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales, por ejemplo, de acuerdo con el método conocido de Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299). Según la presente invención, el término anticuerpo o fragmento de anticuerpo también se entiende que significa anticuerpos o partes de los mismos que se unen con antígenos, que han sido preparados de manera recombinante y, donde sea apropiado, modificados, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos multifuncionales, anticuerpos biespecíficos u oligoespecíficos, anticuerpos de hebra única y fragmentos F(ab) o F(ab)2 (véase, por ejemplo, la patente europea EP-B1-0 368 684, el documento US 4.816.567, el documento US 4.816.397, la solicitud de patente internacional WO 88/01649, la solicitud de patente internacional WO 93/06213 ó la solicitud de patente internacional WO 98/24884). Como alternativa a los anticuerpos clásicos también es posible, por ejemplo, usar proteínas andamio contra la PAK, p.ej. anticalinas, que 4 están basadas en lipocalína (Beste et al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903). Los sitios de unión con ligandos naturales de las lipocalinas, por ejemplo la proteína de unión con el retinol o la proteína de unión con la bilina, pueden ser alterados, por ejemplo por medio de un procedimiento de "diseño combinatorio de proteínas", de tal manera que se unan a haptenos seleccionados, aquí a la PAK (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50). Se sabe que otras proteínas andamio conocidas son alternativas a los anticuerpos para el reconocimiento molecular (Skerra (2000) J. Mol. Recognit, 13, 167-187). El término "ácidos nucleicos contra el gen de la PAK o la propia PAK" se refiere a ADN o ARN de doble hebra o de hebra única que, por ejemplo, inhiben la expresión del gen de la PAK o la actividad de la PAK, e incluye, sin limitación, ácidos nucleicos antisentido, aptámeros, siARNs (ARNs de interferencia pequeña) y ribozimas. Los ácidos nucleicos, p.ej. los ácidos nucleicos antisentido, pueden ser sintetizados químicamente, p.ej. de acuerdo con el método del fosfotriéster (véase, por ejemplo, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584). Los aptámeros son ácidos nucleicos que se unen con alta afinidad a un polipéptido, aquí la PAK. Los aptámeros pueden ser aislados por métodos de selección tales como SELEX (véase p.ej. Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug y Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; documento US 5.582.981) a partir de un acervo grande de moléculas de ARN de hebra única diferentes. Los aptámeros también se pueden sintetizar y seleccionar en la forma de su imagen especular, por ejemplo como el L-ribonucleótido (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Las formas que han sido aisladas de esta manera disfrutan de la ventaja de que no son degradadas por ribonucleasas que se encuentran en la naturaleza y, por tanto, poseen mayor estabilidad. Los ácidos nucleicos pueden ser degradados por endonucleasas o exonucleasas, en particular por DNasas y RNasas, que se pueden encontrar en la célula. Es, por tanto, ventajoso modificar los ácidos nucleicos con el fin de estabilizarlos frente a la degradación, asegurando de este modo que es mantenida una alta concentración del ácido nucleico en la célula durante un periodo de tiempo largo (Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; solicitud de patente internacional WO 95/11910; solicitud de patente internacional WO 98/37240; solicitud de patente internacional WO 97/29116). Típicamente, tal estabilización puede obtenerse introduciendo uno o más grupos fosfóricos intemucleotídicos o introduciendo uno o más internucleótidos no fosfóricos. Los internucleótidos modificados adecuados están recopilados en Uhlmann y Peyman (1990), véase anteriormente (véase también Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; solicitud de patente internacional WO 95/11910; solicitud de patente internacional WO 98/37240; solicitud de patente internacional WO 97/29116). Los radicales fosfato internucleotídicos modificados y/o los puentes no fosfóricos en un ácido nucleico que se pueden emplear en uno de los usos acordes con la invención contienen, por ejemplo, esteres de metilfosfonato, fosforotioato, fosforamidato, fosforoditioato y/o fosfato, mientras que los análogos intemucleotídicos no fosfóricos contienen, por ejemplo, puentes siloxano, puentes carbonato, esteres de carboximetilo, puentes de acetamidato y/o puentes de tioéter. También se tiene la intención de que esta modificación debe mejorar la durabilidad de una composición farmacéutica que puede emplearse en uno de los usos acordes con la invención. El uso de ácidos nucleicos antisentido adecuados se describe además, p.ej., en Zheng y Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen y Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18, 419-23, Stein (1992) Leukemia, 6, 697-74, o Yacyshyn, B. R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1142). La producción y uso de siARNs como herramientas para la interferencia con ARN en el proceso para regular en descenso o desactivar la expresión de genes, aquí la expresión del gen de la PAK, se describe p.ej. en Elbashir, S. M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188, o Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411 , 494. Las ribozimas también son herramientas adecuadas para inhibir la translación de ácidos nucleicos, aquí el gen de la RAK, porque son capaces de unirse y cortar de manera específica a los mARNs. Se describen p.ej. en Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202; Vaish et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnoi., 15, 921-2 o Couture y Stinchcomb (1996) Trends Genet., 12, 510-5. Así, los ácidos nucleicos descritos se pueden usar para inhibir o reducir la expresión de los genes de la PAK en las células, tanto in vivo como in vitro, y en consecuencia actuar como un inhibidor de la PAK en el sentido de la presente invención. Se prefiere un ADN o ARN de hebra única para el uso como oligonucleótido antisentido o ribozima, respectivamente. Para la producción del medicamento los inhibidores de la PAK de la presente invención se formulan usualmente con uno o más aditivos o sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como disolución de tampón fisiológico, p.ej. disolución de cloruro sódico, agua desmineralizada, estabilizantes, tales como inhibidores de la proteasa o de la nucleasa, preferiblemente aprotinina, ácido e-aminocaproico o pepstatina A o agentes secuestrantes tales como AEDT, formulaciones de geles, tales como vaselina blanca, parafina de baja viscosidad y/o cera amarilla, etc. dependiendo del tipo de administración. Son aditivos adicionales adecuados, por ejemplo, detergentes, tales como, por ejemplo, Tritón X-100 o desoxicolato sódico, pero también polioles, tales como, por ejemplo, polietilenglicol o glicerol, azúcares, tales como, por ejemplo, sacarosa o glucosa, compuestos de ion dipolar, tales como, por ejemplo, aminoácidos tales como glicina o en particular taurina o betaína y/o una proteína, tal como, por ejemplo, albúmina de suero bovino o humano. Se prefieren los detergentes, polioles y/o compuestos de ion dipolar. La solución de tampón fisiológico tiene preferiblemente un pH de aprox. 6,0-8,0, especialmente un pH de aprox. 6,8-7,8, en particular un pH de aprox. 7,4, y/o una osmolaridad de aprox. 200-400 miliosmol/litro, preferiblemente de aprox. 290-310 miliosmol/litro. El pH del medicamento se ajusta, en general, usando un tampón orgánico o inorgánico adecuado, tal como, por ejemplo, usando preferiblemente un tampón fosfato, un tampón tris (tris(hidroximetil)aminometano), un tampón HEPES (ácido[4-(2-hidroxietiI)pi-perazinojetanosulfónico) o un tampón MOPS (ácido 3-morfolino-1 -propanosulfónico). La elección del tampón respectivo depende, en general, de la molaridad deseada del tampón. El tampón fosfato es adecuado, por ejemplo, para disoluciones para inyección o infusión. El medicamento puede ser administrado de una manera convencional, p.ej. por medio de formas de dosificación oral, tales como, por ejemplo, comprimidos o cápsulas, por medio de las membranas mucosas, por ejemplo la nariz o la cavidad oral, en la forma de dispositorios implantados bajo la piel, por medio de inyecciones, infusiones o geles que contienen los medicamentos acordes con la invención. Es posible además administrar el medicamento por vía tópica y local con el fin de tratar la enfermedad de la articulación particular como se describe anteriormente, si fuera apropiado, en la forma de complejos de liposoma. Además, el tratamiento puede llevarse a cabo por medio de un sistema terapéutico transdérmico (TTS), que hace posible una liberación temporalmente controlada de los medicamentos. Se conocen TTS, por ejemplo, de las solicitudes de patente europea EP 0 944 398 A1 , EP 0916336 A1 , EP 0 889 723 A1 ó EP 0 852493 A1.

Las soluciones para inyección se usan, en general, si sólo van a ser administradas al cuerpo cantidades relativamente pequeñas de una disolución o suspensión, por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mi. Las soluciones para infusión se usan, en general, si va a ser administrada una cantidad más grande de una disolución o suspensión, por ejemplo uno o más litros. Dado que, en contraste con la solución para infusión, sólo se administran unos pocos mililitros en el caso de soluciones para inyección, las diferencias pequeñas del pH y de la presión osmótica de la sangre o el fluido tisular en la inyección no se hacen perceptibles o sólo se hacen perceptibles en un grado insignificante con respecto a la sensación de dolor. La dilución de la formulación acorde con la invención antes del uso no es, por tanto, necesaria en general. En el caso de la administración de cantidades relativamente grandes, sin embargo, la formulación acorde con la invención debe ser diluida un poco antes de la administración hasta tal punto que se obtenga una solución al menos aproximadamente isotónica. Un ejemplo de solución ¡sotónica es una disolución de cloruro sódico de 0,9% de concentración. En el caso de la infusión, la dilución puede ser llevada a cabo, por ejemplo, usando agua estéril, mientras que la administración puede ser llevada a cabo, por ejemplo, mediante un llamado bypass. Los ácidos nucleicos descritos anteriormente se pueden usar en forma desnuda, en la forma de vectores de transferencia de genes o complejados con liposomas o partículas de oro. Son ejemplos de vectores de transferencia de genes los vectores virales, por ejemplo vectores adenovirales o vectores retrovirales (Lindemann et al. (1997), Mol. Med., 3, 466-76; Springer et al. (1988) Mol. Cell., 2, 549-58). Los complejos con liposomas consiguen usualmente una eficacia muy alta de transfección, en particular de células de la piel (Alexander y Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4:2279-85). En la lipofección, se preparan vesículas pequeñas, unilamelares, compuestas de lípidos catiónicos, ultrasonicando la suspensión de liposomas. El ADN se une iónicamente sobre la superficie de los liposomas en una relación tal que permanece una carga neta positiva y todo el ADN plásmido está complejado por los liposomas. Además de las mezclas lípidas DOTMA (bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-tr¡metilamonio) y DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina) empleadas por Felgner, P. L. et al. (1987), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 7413 - 7414, ya se ha sintetizado y ensayado un gran número de formulaciones lipídicas en cuanto a su eficacia en transfectar diversas líneas celulares (Behr et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986; Gao y Huang (1991), Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203; Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 2550-2561). Son ejemplos de las formulaciones lipídicas el DOTAP, metilsulfato de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propiI]-N,N,N-trimetilamonio, o la DOGS (dioctadecilamidoglicilesper- mina). Las sustancias auxiliares que incrementan la transferencia de ácidos nucleicos en la célula pueden ser, por ejemplo, proteínas o péptidos que se unen a las moléculas de ADN o de péptido sintético-ADN que permiten que el ácido nucleico sea transportado al núcleo de la célula (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6:282; Branden et al. (1999) Nature Biotech., 17, 784).

Las sustancias auxiliares también incluyen moléculas que permiten que los ácidos nucleicos sean liberados en el citoplasma de la célula (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem., 8, 213) o, por ejemplo, liposomas (Uhlmann and Peyman (1990), véase anteriormente). Se puede obtener otra forma particularmente adecuada aplicando los ácidos nucleicos descritos anteriormente a partículas de oro y disparando estas partículas en tejidos o células usando lo que se denomina una "pistola de genes" (Wang et al. (1999) J. Invest. Dermatol. 112:775-81 , Tuting et al. (1998) J. Invest. Dermatol. 111 :183-8). Otro tema de la presente invención es el uso de PAK o del gen de la PAK como diana para el descubrimiento de un inhibidor de la PAK para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones, en particular una enfermedad degenerativa de las articulaciones tal como la osteoartritis o una enfermedad inflamatoria de las articulaciones tal como la artritis reumatoide, y/o para el tratamiento del dolor de las articulaciones, en particular reduciendo el dolor de las articulaciones en enfermedades degenerativas de las articulaciones. Preferiblemente, el inhibidor de la PAK se puede usar en forma de un medicamento como se describe anteriormente. Por consiguiente, la presente invención se refiere también a un método de cribado de un inhibidor de la PAK, en el que el método comprende las etapas de: (a) proporcionar PAK o el gen de la PAK, (b) proporcionar un compuesto de ensayo, y (c) medir o detectar la influencia del compuesto de ensayo en la PAK o el gen de la PAK. En general, la PAK o el gen de la PAK se proporciona p.ej. en un sistema de ensayo y se lleva al contacto directa o indirectamente con un compuesto de ensayo, en particular un compuesto de ensayo bioquímico o químico, p.ej. en la forma de una librería de compuestos químicos. Entonces, se mide o detecta la influencia del compuesto de ensayo en la PAK o el gen de la PAK. Después de eso, se pueden analizar y/o aislar inhibidores adecuados. Para el cribado de librerías de compuestos químicos, se prefiere el uso de ensayos de alto rendimiento que son conocidos por el experto en la materia o que están disponibles comercialmente. Según la presente invención, el término "librería de compuestos químicos" se refiere a una pluralidad de compuestos químicos que han sido ensamblados a partir de cualquiera de múltiples fuentes, que incluyen moléculas sintetizadas químicamente y productos naturales, o que han sido generados por técnicas de química combinatoria. En general, la influencia del compuesto de ensayo en la PAK o el gen de la PAK se mide o detecta en un ensayo heterogéneo u homogéneo. Como se usa en la presente memoria, un ensayo heterogéneo es un ensayo que ¡ncluye una o más etapas de lavado, mientras que en un ensayo homogéneo tales etapas de lavado no son necesarias. Los reactivos y compuestos son solamente mezclados y medidos.

Los ensayos funcionales adecuados pueden basarse en la expresión genética de la PAK, la activación directa de la PAK por GTPasas tales como Cdc42, Rac1 , Wrch-1 o Chp, o la formación de un complejo con p21 activada (unida a GTP). En presencia de un compuesto bioquímico o químico para ser ensayado como inhibidor de la PAK la expresión genética, la activación directa o la formación de un complejo con otras proteínas, p.ej. proteínas celulares como, p.ej., las especificadas anteriormente, pueden ser medidas por medios conocidos, de manera general, por un experto en la materia. En general, los sistemas de ensayo de cinasa disponibles comercialmente detectan cuantitativamente la cantidad de fosfato incorporada en un sustrato. Por ejemplo, la prevención de la formación de microfilamentos de actina periféricos y la pérdida asociada de fibras de tensión puede ser medida como se describe en Zhao, Z. S. et al. (1998), véase anteriormente. Son ensayos heterogéneos, por ejemplo, los ensayos ELISA, DELFIA, SPA y "flashplate". Los ensayos basados en ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) son ofrecidos por diversas compañías. Los ensayos emplean péptidos al azar que pueden ser fosforilados por una cinasa, tal como la PAK. Las muestras que contienen cinasa se diluyen usualmente en un tampón de reacción que contiene p.ej. ATP y cationes requeridos, y después se añaden a pocilios de placas. Las reacciones son detenidas simplemente retirando las mezclas. Después de eso, las placas se lavan. La reacción es iniciada p.ej. por la adición de un sustrato biotinilado a la cinasa. Después de la reacción, se añade un anticuerpo específico. Las muestras son transferidas usualmente a placas de proteína G adherida previamente y después de lavar se añade p.ej. estreptavidina-HRP. Después de eso, la estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) sin unir es retirada, la reacción de color con la peroxidasa es iniciada por la adición del sustrato de la peroxidasa y se mide la densidad óptica en un densitómetro adecuado. Los ensayos basados en DELFIA (inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos potenciada por disociación) son ensayos en fase sólida. El anticuerpo es marcado usualmente con europio u otro lantánido y la fluorescencia del europio es detectada después de haber retirado por lavado los anticuerpos marcados con europio sin unir. El SPA (ensayo de escintilación por proximidad) y el ensayo "flashplate" explotan usualmente las interacciones biotina/avidina para capturar sustratos radiomarcados. De manera general, la mezcla de reacción incluye la cinasa, un sustrato peptídico biotinilado y ?-[P33]ATP. Después de la reacción, los péptidos biotinilados son capturados por la estreptavidina. En la detección por SPA, la estreptavidina está unida a bolas que contienen un escintilante, mientras que en la detección "flashplate", la estreptavidina está unida al ¡nterior del pocilio de microplacas que contienen un escintilante. Una vez inmovilizado, el sustrato radiomarcado está lo bastante cerca del escintilante para estimular la emisión de luz. Son ensayos homogéneos alternativos, por ejemplo, TR-FRET, FP, ALPHA y ensayos genéticos. Los ensayos basados en TR-FRET (transferencia de energía fluorescente inducida por resonancia de tiempo resuelto) son ensayos que explotan usualmente la transferencia de energía fluorescente inducida por resonancia entre el europio y APC, una alfaficocianina modificada, u otros colorantes con espectros superpuestos tales como Cy3/Cy5 ó Cy5/Cy7 (Schobel, U. et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10, 1107-1114). Después de la excitación, p.ej. del europio con luz a 337 nm, la molécula fluoresce a 620 nm. Pero si este fluoróforo está lo bastante cerca del APC, el europio transferirá su energía de excitación a la APC, que fluoresce a 665 nm. El sustrato de la cinasa es usualmente un sustrato marcado con biotina. Después de la reacción con la cinasa, se añaden anticuerpos (P)-específicos marcados con europio, junto con estreptavidina-APC. Los péptidos fosforilados llevan el anticuerpo marcado con europio y la estreptavidina-APC a un contacto directo. La cercana proximidad de la APC al fluoróforo de europio causará una reducción de la fluorescencia del europio a beneficio de la fluorescencia de la APC (transferencia de energía fluorescente inducida por resonancia). Los ensayos basados en polarización por fluorescencia (FP) son ensayos que usan luz polarizada para excitar sustratos de péptidos fluorescentes en disolución. Estos péptidos fluorescentes están libres en disolución y se mueven rápidamente, causando que la luz polarizada se despolarice. Cuando el péptido sustrato se une a una molécula más grande, sin embargo, tal como la (P)-Tir, sus velocidades de movimiento disminuyen mucho, y la luz emitida permanece altamente polarizada. Para un ensayo de cinasa hay, de manera general, dos opciones: (a) Un trazador fosfopeptídico fluorescente está unido a un anticuerpo (P)-specífico. Los productos fosforilados competirán por el fosfopéptido fluorescente del anticuerpo dando como resultado un cambio de la polarización, de alta a baja. (b) Un péptido sustrato fosforilado se une al anticuerpo fosfoespecífico dando como resultado un cambio de la polarización, de baja a alta. Los ensayos basados en ALPHA (ensayo homogéneo luminiscente amplificado por proximidad), son ensayos que dependen de la transferencia de oxígeno singlete entre bolas dadoras y aceptoras llevadas a proximidad por un péptido fosforilado. Tras una excitación a 680 nm, los fotosensibilizadores en las bolas dadoras convierten el oxígeno ambiental en oxígeno en estado singlete, que se difunde hasta una distancia de 200 nm. Los grupos quimioluminiscentes en las bolas aceptoras transfieren energía a los aceptores fluorescentes de dentro de la bola, los cuales emiten luz entonces a aproximadamente 600 nm. Los ensayos basados en EFC (complementación de fragmentos enzimáticos) o los ensayos equivalentes se pueden usar, en particular, para un cribado de compuestos de alto rendimiento. El ensayo EFC se basa en una enzima ß-galactosidasa manipulada que consiste en dos fragmentos - el aceptor enzimático (EA) y el dador enzimático (ED). Cuando los fragmentos están separados, no hay actividad ß-galactosidasa, pero cuando los fragmentos están juntos se asocian (complementan) para formar la enzima activa. El ensayo EFC utiliza un conjugado ED-analito en el que el analito puede ser reconocido por una proteína de unión específica, tal como un anticuerpo o un receptor. En ausencia de la proteína de unión específica, el conjugado ED-analito es capaz de complementarse con el EA para formar ß-galactosidasa activa, produciendo una señal luminescente positiva. Si el conjugado ED-analito es unido por una proteína de unión específica, la complementación con el EA se impide, y no hay señal. Si se proporciona analito libre (en una muestra), competirá con el conjugado ED-analito por la unión a la proteína de unión específica. El analito libre liberará el conjugado ED-analito para la complementación con el EA, produciendo una señal dependiente de la cantidad de analito libre presente en la muestra. Un ejemplo de un ensayo genético es el ensayo del sistema de doble híbrido (Fields y Sternglanz (1994) Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas y Brent (1998) TIBTECH, 16, 355-363). En esta prueba, las células son transformadas con vectores de expresión que van a expresar proteínas de fusión que consisten en el polipéptido acorde con la invención y un dominio de unión con ADN de un factor de transcripción tal como GaI4 o LexA. Las células transformadas contienen adicionalmente un gen indicador cuyo promotor contiene sitios de unión para el correspondiente dominio de unión con ADN. Transformando con otro vector de expresión que va a expresar una segunda proteína de fusión que consiste en un polipéptido conocido o desconocido y un dominio de activación, por ejemplo de Gal4 ó VP16 del virus del herpes simple, la expresión del gen indicador puede ser aumentada mucho si la segunda proteína de fusión interactúa con el polipéptido. Por consiguiente, este sistema de ensayo se puede usar para el cribado de compuestos bioquímicos o químicos que inhiban una interacción entre la PAK y p.ej. GTPasas, tales como Cdc42, Rad , Wrch-1 o Chp, o p21 activada (unida a GTP) (véase p.ej. Vidal y Endoh (1999) Trends in Biotechnology, 17, 374-81). De esta manera, es posible identificar rápidamente nuevos compuestos activos, que se pueden usar para el tratamiento de enfermedades de las articulaciones. Alternativamente, en el caso de que el compuesto de ensayo sea una proteína o un péptido, la expresión conjunta de este compuesto de ensayo con una GTPasa, tal como Rac1 , Wrch-1, Chp o la Cdc42 constitutivamente activa, como activador de la PAK en presencia de PAK, se puede usar para medir o detectar la influencia del compuesto de ensayo sobre la PAK, como p.ej. se describe en Zhao, Z.S. et al. (1998), véase anteriormente. Otro ejemplo de un ensayo genético es un ensayo funcional en el que la actividad de la cinasa es convertida en una respuesta celular funcional tal como crecimiento, detención del crecimiento, diferenciación o apóptosis. Para este tipo de cribado, la levadura es un modelo de sistema particularmente adecuado. Por ejemplo, en un ensayo funcional de levadura con PAK 1, cuando se cultivan en medio que contiene glucosa, las células p.ej. de levadura con PAK 1 crecen como células normales de levadura. Cuando, sin embargo, son expuestas a galactosa, es inducida la expresión ¡ntracelular de PAK 1 , causando que las células de levadura mueran. Los compuestos que inhiben la actividad de la PAK 1 impiden la muerte de la célula en este caso. Otro ensayo se basa en polipéptidos unidos a una fase sólida, tales como PAK, GTPasas, tales como Cdc42, Rad, Wrch-1 ó Chp, ó p21 activada (unida a GRP) y la interferencia con los compuestos a ser ensayados. Así, un compuesto de ensayo, por ejemplo, que contiene un marcador detectable, por ejemplo, el compuesto puede ser marcado radiactivamente, marcado con fluorescencia o marcado con luminiscencia, como ya se explicó anteriormente. Además, los compuestos pueden ser acoplados a proteínas que permitan una detección indirecta, por ejemplo por medio de catálisis enzimática empleando un ensayo de peroxidasa que use un sustrato cromogénico o por medio de la unión con un anticuerpo detectable. Otra posibilidad es la de investigar los complejos proteínicos unidos a una fase sólida por medio de espectrometría de masas (SELDI (desorción/ionización mediante láser sobre superficie mejorada)). Los cambios en la conformación de p.ej. PAC o las otras proteínas descritas anteriormente, como resultado de la interacción con una sustancia de ensayo, pueden ser detectados, por ejemplo, por el cambio en la fluorescencia de un residuo endógeno de triptófano en el polipéptido. Los polipéptidos unidos a una fase sólida también pueden ser parte de una matriz. Se describen métodos para preparar tales matrices usando química de fase sólida y grupos protectores fotolábiles, por ejemplo, en el documento US 5.744.305. Estas matrices también pueden ser llevadas al contacto con un compuesto de ensayo o librerías de compuestos y ensayar su interacción, por ejemplo la unión o el cambio de conformación. En otra modalidad de la presente invención, el método se lleva a cabo usando células enteras. Usualmente las células que crecen en el fondo de placas multipocillos se fijan y permeabilizan, se bloquean y se incuban con p.ej. un anticuerpo (P)-específico primario contra el sustrato de interés. Entonces, p.ej., se utilizan anticuerpos secundarios marcados con europio o conjugados con HRP, junto con sustancias específicas quimioluminiscentes o colorimétricas, p.ej. como las descritas anteriormente, para generar la señal. En asociación con el uso de un microscopio, no sólo puede ser cuantificada la cantidad de anticuerpos (P)-específicos a nivel de una sola célula, sino también las translocaciones inducidas por fosforilación de un sustrato o los cambios morfológicos de las células. Ventajosamente, el método de la presente invención se lleva a cabo en un sistema de robótica, p.ej. que incluya la preparación robótica de cultivos en placas y un sistema robótico de transferencia de líquidos, p.ej. usando microfluídicos, es decir, de estructura en canales. En otra modalidad de la presente invención, el método se lleva a cabo en forma de un sistema de cribado de alto rendimiento. En tal sistema.ventajosamente el método de cribado está automatizado y miniaturizado, en particular usa pocilios miniaturizados y microfluídicos controlados por un robotizador. En otra modalidad, la presente invención se refiere también a un método para producir un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones, en particular una enfermedad degenerativa de las articulaciones tal como la osteoartritis o una an enfermedad inflamatoria de las articulaciones tal como artritis reumatoide, y/o para el tratamiento de un dolor de las articulaciones, en particular reduciendo el dolor de las articulaciones en enfermedades degenerativas de las articulaciones, en el que el método comprende las etapas de: (a) llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, (b) aislar un compuesto de ensayo medido o detectado, adecuado para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones y/o un dolor de las articulaciones, y (c) formular los compuestos de ensayo medidos o detectados con uno o más vehículos o sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, p.ej. como los descritos anteriormente. Las siguientes Figuras, Secuencias y Ejemplos explicarán la presente invención sin limitar el alcance de la invención.

Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-C muestran la Expresión de PAK1 en extractos de células HEK293 y en condrocitos primarios humanos.

Los extractos de células HEK293 humanas, así como los condrocitos primarios humanos que se originan en el cartílago de pacientes con osteoartritis, y el cartílago de control fueron separados por electroforesis en gel bidimensional. Las proteínas fueron transferidas a membranas de PVDF por Western blot y la PAK1 fue detectada por un anticuerpo específico. La Figura 2 muestra que la sobreexpresión del PAK1-ID reprimió la expresión inducida por IL-1ß de MMP13 en células SW1353 humanas. El dominio inhibitorio de la PAK1 fue subclonado en el vector pCEP4 y transfectado en células SW1353. Donde se indica, se usó IL-1 ß como estímulo en una concentración de 10 ng/ml durante 24 h. Se recogieron los sobrenadantes y la cantidad de proteína MMP13 se determinó por ELISA. Los valores se muestran en unidades arbitrarias y representan al menos 3 resultados independientes ±DE. La columna rayada representa los experimentos con el vector pCEP4 (vector nulo) y la columna negra representa los experimentos con el vector pCEP4_PAK1-ID. La Figura 3 muestra que la sobreexpresión del PAK1-ID reprimió la expresión inducida por IL-1ß de PGE2 en células SW1353 humanas. El dominio inhibitorio de la PAK1 fue subclonado en el vector pCEP4 y transfectado en células SW1353. Las células fueron estimuladas con una combinación de IL-1ß y TNFa, ambas en una concentración de 10 ng/ml durante 24h. Se recogieron los sobrenadantes y la cantidad de proteína MMP13 se determinó por ELISA. Los valores en unidades arbitrarias representan la media de dos experimentos. La columna puncionada representa los experimentos sin vector más IL1ß y TNFa. La columna rayada representa los experimentos con el vector pCEP4 (vector) más IL1ß y TNFa. La columna negra representa los experimentos con el vector pCEP4_PAK1-ID más ILIß y TNFa. La Figura 4 muestra que la sobreexpresión del PAK1-ID reprimió la expresión inducida por IL-1ß de IL-8 en células HEK293 humanas. El dominio inhibitorio de la PAK1 subclonado en el vector pCDNA3.1 fue transfectado transitoriamente en células HEK293. Las células fueron estimuladas con IL-1ß en una concentración de 10 ng/ml durante los periodos de tiempo indicados. Se recogieron los sobrenadantes y la cantidad de proteína IL-8 se determinó por ELISA. Los valores en unidades arbitrarias representan la media de dos experimentos. Los círculos representan los experimentos con el vector pCDNA3.1_PAK1-ID más IL-1ß y los cuadrados representan los experimentos con el vector pCDNA3.1 (vector nulo) más IL-1 ß.

Descripción de las Secuencias La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de la PAK1. La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la PAK1. La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la PAK2.

La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la PAK3. La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la PAK4. La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio inhibidor de la PAK1 (PAK1-ID). La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia inhibidora rica en prolina de la PAK1 según Kiosses, W. B. (2002), véase anteriormente. La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos de un péptido sintético que contiene la secuencia rica en prolina de la PAK1 fusionada a la secuencia polibásica de la proteína tat del HIV según Kiosses, W. B. (2002), véase anteriormente. La SEQ ID NO: 9 muestra un primer cebador de la PCR para el acceso a secuencias conservadas entre cADNs de la PAK1 humana y de ratón. La SEQ ID NO: 10 muestra un segundo cebador de la PCR para el acceso a secuencias conservadas entre cDNAs de la PAK1 humana y de ratón . La SEQ ID NO: 11 muestra un primer cebador de la PCR para la amplificación del PAK1-ID. La SEQ ID NO: 12 muestra un segundo cebador de la PCR para la amplificación del PAK1-ID.

Ejemplos 1. MÉTODOS 1.1 Transcripción inversa-Reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) El ARN total (1 µg) fue digerido primero con 1 unidad de DNasa I libre de RNasa para evitar la contaminación por ADN genómico. El ARN tratado con DNasa I fue entonces transcrito a la inversa en ADNc usando transcriptasa inversa de Thermoscript (Life Technologies, Inc.) cebada con oligo(dT)20 según el procedimiento suministrado por el fabricante. Se realizó la PCR usando 5'-TGGCTGGAGGCTCCTTGACA-3' (SEQ ID NO: 9) y 5'-GAGGGCTTGGCAATCTTCAGGA-3' (SEQ ID NO: 10) como cebadores (MWG Biotech AG, Alemania) para acceder a secuencias conservadas entre cADNs de la PAK1 humana y de ratón. Las condiciones de la PCR fueron 95°C/30 s, 60°C/30 s y 72°C/45 s para 25 ciclos usando 2,6 unidades de ADN polimerasa de PCR de alta fidelidad Expand (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) por 50 µl de reacción. 1.2 Diseño de construcciones de vectores El polipéptido que codifica los residuos 83 a 149 de la PAK1 identificados como el dominio autoinhibitorio de la PAK1 (Zhao, Z. S. et al. (1998), véase anteriormente) fue amplificado por PCR. Los cebadores usados para la amplificación fueron 5'ATCGCCACCATGTACCCTTATGATGTGCCAGATTATGCCCACACAATTC ATGTCGGTTTTG-3' (SEQ ID NO: 11) (la secuencia de Kozak está subrayada, la etiqueta de hemaglutinina (HA) está en negrita) y 5'-ATCTTATGACTTATCTGTAAAGCTCATG-3' (SEQ ID NO: 12) (MWG, Biotech AG, Alemania). Las condiciones de la PCR fueron 95°C/30 s, 60°C/30 s y 72°C/30 s para 25 ciclos usando 2,6 unidades de ADN polimerasa de PCR de alta fidelidad Expand (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) por 50 µl de reacción. El producto de la PCR fue subclonado en el vector pCR-TOPO2.1 (Invitrogen GmbH, Alemania). La PAK1 etiquetada con HA fue introducida en los sitios Hindlll y Xbal del pcDNA3.1 mamífero (Invitrogen GmbH, Alemania). El PAK1-ID fue insertado en el plásmido pCEP4 (Invitrogen GmbH, Alemania) mediante un sitio de restricción 5' Hindlll y un 3' Notl. Todos los plásmidos fueron verificados por secuenciación. 1.3 Cultivo celular Se cultivaron cultivos de condrosarcoma humano SW1353 en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero de ternero fetal (FCS) y penicilina/estreptomicina (37°C, 5% de CO2). Para las transfecciones, se cultivaron durante una noche 6 x 104 células/pocilio y al día siguiente se transfectaron con 2 µg de ADN y 10 µl de reactivo de transfección GenePORTER™ (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA, EE.UU.).

Después de 3 h, se añadió un volumen igual de medio que contenía 20% de FCS y se incubó durante una noche. En el caso de sobreexpresión con el vector pCEP4 (Invitrogen GmbH, Alemania), dos días después de la transfección se seleccionaron las células con 200 µg/ml de higromicina B (Invitrogen GmbH, Alemania). La eficacia de la transfección fue examinada con un FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc., Mountain View, CA, EE.UU.) y en un microscopio de fluorescencia invertida. Para la mayoría de los experimentos, se transfirieron 60000 células a cada pocilio de una placa de 6 pocilios de 35 mm. Antes de la estimulación, las células se lavaron con suero salino tamponado con fosfato (PBS) y se cultivaron durante 30 min en DMEM sin FCS. Para el experimento, se colocaron las células durante 24 h en 1ml de DMEM libre de suero, con o sin 10 ng/ml de IL-1ß humana (Roche Diagnostics GmbH Alemania) y con o sin 10 ng/ml de TNFa (Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Se mantuvieron células de riñon embrionario humano (HEK) 293 en medio Eagle modificado con Dulbecco suplementado con 10 % de suero de ternero fetal. Para los experimentos de transfección, se sembraron las células a 5 x 105 células por pocilio, en platos de 6 pocilios, 24 h antes de la transfección. Se incubaron las células durante 4 h en 1,0 mi de medio libre de suero que contenía 20 µl de lipofectAMINE® (Life Technologies, Inc., EE.UU.) y 5,0 µg de ADN total por pocilio (se usó como control el plásmido pcDNA3.1-PAK1 (83-149) o el vector vacío pcDNA.1). Las células se dejaron sin tratar o bien se estimularon con ¡nterleucina-1 ß (10 ng/ml; R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.) seguido de un periodo de recuperación (16 h) en un medio que contenía 10 % de suero bovino de ternera fetal. El sobrenadante del cultivo fue retirado y la expresión de la IL-8 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.), la PGE2 (SpiBiom Inc.), y la MMP-13 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.) fue seguida por ELISA según el procedimiento suministrado por el fabricante. 1.4 Análisis Western Blot y ELISA Para evaluar la expresión de los péptidos PAK183"149 etiquetados con HA, se lisaron las células en 100 µl de Tampón de Lisis (MOPS 20 mM, AEGT 2 mM, AEDT 5 mM, Nonidet P-40 0,5% suplementado por un cóctel de inhibidores de proteasas libre de AEDT Complete (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), y la concentración de proteínas se determinó usando el kit de ensayo BCA Protein (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL, EE.UU.). Las proteínas fueron separadas por gel NuPAGE 4-12% (Invitrogen GmbH, Alemania) antes de la transferencia a una membrana de PVDF (Millipore Corp., EE.UU.). Se prepararon extractos proteínicos de condrocitos humanos primarios del tejido de pacientes afectados de osteoartritis, así como de tejido normal, según técnicas normalizadas. La expresión de la PAK1 fue investigada por electroforesis en gel bidimensional e inmunoblotting usando 30 µg de proteínas. Para la electroforesis en gel 2D, el enfoque isoeléctrico (IEF) se realizó usando tiras IPG de gradiente lineal inmovilizado de pH 3-10, de 7 cm (Bio-Rad Laboratories, Inc., EE.UU.) en una celda para IEF de proteínas (Bio-Rad Laboratories, Inc., EE.UU.). La etapa final de enfoque fue a 4000 V durante 8 h. La segunda dimensión fue realizada en gel NuPAGE Novex 4-12% ZOOM (Invitrogen GmbH, Alemania) y las proteínas fueron transferidas sobre una membrana de PVDF (Millipore Corp., U.S.A.). Para el inmunoblotting, las proteínas PAK183"149 etiquetadas con HA y la PAK1 fueron detectadas usando anticuerpo policlonal anti-etiqueta HA (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) y anticuerpo policlonal anti-aPAK(N-20) (Santa Cruz), respectivamente. En resumen, las membranas fueron bloqueadas con TBS-T (NaCI 150 mM, Tris 20 mM, pH 7,6, Tween 2090,1% conteniendo 5% de leche seca libre de grasas, durante 1 h a temperatura ambiente; incubadas en TBS-T que contenía bien una dilución 1/500 de anticuerpo anti-etiqueta HA o una dilución 1/50 de anticuerpos anti-aPAK(N-20) durante 1 h a temperatura ambiente, y finalmente incubadas en TBS-T que contenía anticuerpo anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano picante, de dilución 1/10000 (Pierce) durante 1 h. Las membranas fueron procesadas usando electroquimioluminiscencia (ECL) según las instrucciones del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.). Para el análisis de los niveles de las proteínas MMP13, IL-8 y PGE2, los sobrenadantes de los cultivos celulares fueron determinados por ELISA para la MMP13 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.), la IL-8 (R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN, EE.UU.) y la PGE2 (SpiBio) como describe el proveedor. 2. RESULTADOS 2.1 Expresión de la PAK1 en líneas celulares de Condrosarcoma humano y en condrocitos primarios de ratón Usando RT-PCR, se analizó la expresión de la PAK1 en líneas celulares de condrocitos SW1353 humanos, así como en células primarias de ratón estimuladas o no estimuladas con ácido retinoico. Los resultados obtenidos en este experimento demuestran claramente que la PAK1 es expresada en la línea celular SW1353 de condrosarcoma humano, así como en condrocitos primarios de ratón. En una serie adicional de experimentos se usó RT-PCR para confirmar la expresión de PAK1 en la línea celular de condrocitos CH8 humanos. Los resultados mostrados a nivel de ARN han sido confirmados también a nivel de proteínas usando análisis Western blot con un anticuerpo específico para la PAK1 (Figura 1). Tomados en conjunto, los resultados a nivel de ARN y de proteínas confirman que la PAK1 es expresada en líneas celulares de condrocitos humanos y en condrocitos primarios de ratón. 2.2 Interferencia de la expresión del dominio inhibitorio de la PAK1 con la transmisión de señales mediante IL-1: La MMP13 (metaloproteinasa matricial 13) representa una importante proteína marcadora para la expresión inducida por IL-1 de proteínas que son relevantes para la osteoartritis. El dominio inhibitorio de la PAK1 (PAK1-ID) en la línea celular SW1353 de condrosarcoma humano fue sobreexpresado con el fin de estudiar el requirimiento de PAK1 para la transmisión de la señal que conduce, desde la IL-1, a la inducción de la expresión de la MMP13 (Figura 2). En células SW1353 transfectadas, así como no transfectadas, la exposición a IL-1ß condujo a un gran incremento en la expresión y liberación de MMP13 en el medio. Los resultados de este experimento demostraron claramente que la sobreexpresión del PAK1-ID inhibe la expresión inducida por IL-1ß de la MMP13 en la línea celular SW1353 de condrocitos humanos hasta un -55%. Además, se pudo observar un nivel basal de secreción de MMP13 en el medio en células SW1353 transfectadas así como no transfectadas. La expresión del PAK1-1D puede inhibir la expresión inducida por IL-1 ß de la MMP13 en estas células no estimuladas hasta >80%. Tomados en conjunto, los resultados confirman que se requiere la PAK1 para la expresión inducida por IL-1ß de la MMP13. Otro gen marcador importante es la prostaglandina PGE2. La regulación de la expresión de la PGE2 en células SW1353 fue analizada en presencia y ausencia, respectivamente, del PAK1-ID (Figura 3). AI igual que lo visto para la inhibición de la expresión de la MMP13, estos resultados confirmaron que la inhibición de la PAK1 mediante la sobreexpresión del PAK1-ID conduce a una significativa regulación en descenso de las rutas de transmisión de señales inducidas por IL-1ß. La expresión inducida por IL-1ß de la PGE2 fue inhibida hasta más que 50% en la línea celular SW1353. Además, la regulación de la PGE2 indica una involucración para la PAK1 en los procesos que están asociados con el dolor en la osteoartritis. Además de su efecto en células SW1353, los autores de la invención investigaron el efecto del PAK1-ID, es decir, la interferencia con la actividad de la PAK1 por su inhibidor biológico, también en la línea celular HEK293 de riñon embrtionario humano (Figura 4). El resultado de este experimento confirmó los descubrimientos obtenidos en los estudios en células SW1353. La PAK1 juega un papel esencial en la regulación de la cascada de transmisión de señales que son inducidas por la IL-1ß y que conducen, desde la activación de la IL-1 R, a la activación de factores de transcripción que regulan en ascenso la expresión de genes marcadores que son relevantes para la osteoartritis y el dolor, tales como MMP13, IL-8, y PGE2.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1.- El uso de un inhibidor de la cinasa activada por p21 (PAK) para la producción de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones.

2.- El uso según la reivindicación 1 , en el que la enfermedad de las articulaciones es una enfermedad degenerativa de las articulaciones o una enfermedad inflamatoria de las articulaciones.

3.- El uso según la reivindicación 2, en el que la enfermedad degenerativa de las articulaciones es osteoartritis.

4.- El uso según la reivindicación 2, en el que la enfermedad inflamatoria de las articulaciones es artritis reumatoide.

5.- El uso de un inhibidor de la cinasa activada por p21 (PAK) para la producción de un medicamento para el tratamiento de un dolor de las articulaciones.

6.- El uso según la reivindicación 5, en el que el dolor de las articulaciones está asociado a una enfermedad degenerativa de las articulaciones.

7.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la PAK es PAK 1, PAK 2, PAK 3 ó PAK 4, preferiblemente PAK 1 humana.

8.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el inhibidor de la PAK es el dominio inhibidor de la PAK1 con la secuencia de aminoácidos HTIHVGFDAV TGEFTGMPEQ WARLLQTSNI TKSEQKKNPQ AVLDVLEFYN SKKTSNSQKY MSFTDKS (SEQ ID NO: 6), el péptido de la PAK1 con la secuencia de aminoácidos KPPAPPMRNT STM (SEQ ID NO: 7), el péptido de fusión Tat-PAK con la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRR RGKPPAPPMR NTSTM (SEQ ID NO:8), una proteína de unión o un péptido de unión dirigido contra la PAK, un ácido nucleico dirigido contra el gen de la PAK o la PAK, una molécula química y/o un extracto de un producto natural.

9.- El uso según la reivindicación 8, en el que la proteína de unión o el péptido de unión es un anticuerpo, una parte de un anticuerpo que se une a antígenos o una proteína andamio contra la PAK, preferiblemente una anticalina.

10.- El uso según la reivindicación 9, en el que el ácido nucleico es un ácido nucleico antisentido, un aptámero, un siARN o una ribozima.

11.- El uso de PAK o del gen de la PAK como proteína diana para el descubrimiento de un inhibidor de la PAK como medicamento para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones o de un dolor de las articulaciones.

12.- El uso según la reivindicación 11 , en el que la PAK o el gen de la PAK se lleva al contacto directo o indirecto con un compuesto de ensayo, y se mide o detecta la influencia del compuesto de ensayo sobre la PAK o el gen de la PAK.

13.- Un método de cribado de un inhibidor de la PAK, en el que el método comprende las etapas de: (a) proporcionar PAK o el gen de la PAK, (b) proporcionar un compuesto de ensayo, y (c) medir o detectar la influencia del compuesto de ensayo en la PAK o el gen de la PAK.

14.- El método según la reivindicación 13, en el que el compuesto de ensayo se proporciona en la forma de una librería de compuestos químicos.

15.- El método según la reivindicación 13 ó 14, en el que la influencia del compuesto de ensayo sobre la PAK o el gen de la PAK se mide o detecta en un ensayo heterogéneo u homogéneo.

16.- El método según la reivindicación 15, en el que el ensayo heterogéneo es un ensayo ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), un ensayo DELFIA (inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos potenciada por disociación), un ensayo SPA (ensayo de escintilación por proximidad) o un ensayo "flashplate".

17.- El método según la reivindicación 15, en el que el ensayo homogéneo es un ensayo TR-FRET (transferencia de energía fluorescente inducida por resonancia de tiempo resuelto), un ensayo FP (polarización por fluorescencia), un ensayo ALPHA (ensayo homogéneo luminiscente amplificado por proximidad), un ensayo EFC (complementacióp de fragmentos enzimáticos) o un ensayo genético.

18.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el método se lleva a cabo en una matriz.

19.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el método se lleva a cabo usando células enteras.

20.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que el método se lleva a cabo en un sistema de robótica.

21.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en el que el método se lleva a cabo usando microfluídicos.

22.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en el que el método es un método de cribado de alto rendimiento de un inhibidor de la PAK.

23.- Un método para producir un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones y/o un dolor de las articulaciones, en el que el método comprende las etapas de: (a) llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 22, (b) aislar un compuesto de ensayo medido o detectado, adecuado para el tratamiento de una enfermedad de las articulaciones y/o un dolor de las articulaciones, y (c) formular los compuestos de ensayo medidos o detectados con uno o más vehículos o sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables.