JP5491395B2 - イノシトールピロリン酸はエキソサイトーシス能を決定する - Google Patents
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Description
(相互参照)
本願は、2007年8月31日に出願された米国仮特許出願出願番号第60/969,443号の優先権を主張し、該出願全体を援用する。
ることができる(7)。細胞応答の種類は、見たところかかる分子によって制御されるが(4,8)、かかる分子を作るキナーゼの細胞内分布の差により促進され得る(9)。イノシトールピロリン酸の濃度は、重要な細胞事象の最中に動的に制御され、その細胞機能に対する重要を強調している。例えば、InsP7レベルは細胞周期の進行中に変化する(10)。また、InsP7はサイクリン/CDK複合体を調節するが(11)、InsP8は細胞ストレスに応じて急増する(8)。しかしながら、最近の研究によって、InsP6の酵素の補因子としての役割等も類推により分かってきており、非刺激条件下でさえInsP7が重要な制御分子である可能性がある。
イナミン媒介性エンドサイトーシス(76)を活性化することが示されているが、これらはインシュリン分泌のすべてのキープロセスであるため特に興味深い。
でのイノシトールピロリン酸の関与の示唆(4)、インシュリンエキソサイトーシスのプロセスに対するかかる輸送事象の重要性、およびInsP7の直近の前駆物質であるInsP6がβ細胞で高濃度であること(73)に鑑みると、イノシトールピロリン酸はβ細胞において重要な役割を果たしていると本願発明者らは仮定する。本願発明者らは本願において、インシュリンエキソサイトーシスの調節におけるInsP7の新規な役割について実証する。
(a)膵β細胞を、1または複数の試験化合物と接触させること、および
(b)IP6K1キナーゼの発現レベルおよびInsP7のレベルのうちの少なくとも一方を決定すること、からなり、
前記IP6K1キナーゼの発現の増加およびInsP7の増加のうちの少なくとも一方が、該試験化合物がII型糖尿病を治療するのに適していることを示す方法を提供する。
る。
な遺伝子治療および送達方法は例えば本願に援用するWO90/11092またはM. I. Phillips (Ed.): Gene Therapy Methods. Methods in Enzymology, Vol. 346, Academic Press, placeCitySan Diego 2002に記載されているように当該技術分野で周知である。したがって、例えば、患者由来の細胞を、導入される分子に対応する核酸と作用的に結合されたプロモータを含む核酸構築物でエキソビボにより組み換え、次に、かかる組換え細胞を治療される患者に与えてもよい。かかる方法は当該技術分野では周知である。例えば、本願に援用するBelidegrun, A., et al., J. Natl. Cancer Inst. 85: 207-216 (1993); Ferrantini, M. et al., Cancer Research 53: 1107-1112 (1993); Ferrantini, M. et al., J. Immunology 153: 4604-4615 (1994); Kaido, T., et al., Int. J. Cancer 60: 221-229 (1995); Ogura, H., et al., Cancer Research 50: 5102-5106 (1990); Santodonato, L., et al., Human Gene Therapy 7:1-10 (1996); Santodonato, L., et al., Gene Th erapy 4:1246-1255 (1997); および Zhang, J.-F. et al., Cancer Gene Therapy 3: 31-38 (1996))を参照されたい。組換えられる細胞は、例えば膵β細胞であってよい。
されない任意の適切な技術により投与することができる。そのような領域は、結合されたポリペプチドの細胞膜を横切る直接移動を行うよう、他のポリペプチドに結合可能である(例えばCell 55: 1179-1188, 1988; Cell 55: 1189-1193, 1988; Proc Natl Acad Sci U
S A 9V. 664- 668, 1994; Science 285: 1569-1572, 1999; J Biol Chem 276: 3254-3261 , 2001 ; and Cancer Res 61 : 474-477, 2001参照)。
(a)膵β細胞を、1または複数の試験化合物と接触させること、および
(b)IP6K1キナーゼの発現レベルおよびInsP7のレベルのうちの少なくとも
一方を決定すること、からなり、
前記IP6K1キナーゼの発現の増加およびInsP7の増加のうちの少なくとも一方が、該試験化合物がII型糖尿病を治療するのに適していることを示す方法を提供する。
らびにそれらの文献に引用されている文献に見出すことができる。インスリン分泌細胞株は米国培養寄託機関(「ATCC」)(メリーランド州ロックヴィル所在)から利用可能である。膵β細胞が使用されるさらなる実施形態では、それらは膵島に95%を超えるβ細胞を含むob/obマウスから得られる。
2.(時間依存的効果の分析のため)異なる時点で前記1または複数の試験化合物と接触させる以外は、同じ方法で処理される同じ宿主細胞、および
3.(濃度依存的効果の分析のため)異なる濃度で前記1または複数の試験化合物と接触させる以外は、同じ方法で処理される同じ宿主細胞。
天然または非天然のアミノ酸を含んでもよい。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、標準的な脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコルによる標準Boc(Nαアミノ保護Nα−t−ブチルオキシカルボニル)アミノ酸樹脂であるか、または標準のベースが不安定なNα−アミノ保護9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)アミノ酸であってよい。FmocおよびBoc Nα−保護アミノ酸のいずれもSigma社、Cambridge Research Biochemical社、または当業者によく知られている他の化学会社から得ることができる。さらにポリペプチドは、当業者に周知の他のNα保護基を用いても合成することができる。固相ペプチド合成は、当業者に周知の方法により遂行され、例えば自動合成装置の使用により与えられる。
により製造可能である。
膵β細胞でのIP6K1キナーゼの発現を増加および/またはInsP7を増加させるとして識別された試験化合物は、任意のさらなる手法を用いて、II型糖尿病を治療するための候補化合物として使用されるか否かをさらに評価してもよい。かかる手法とは、限定ではないが、試験化合物を膵β細胞と接触させて試験化合物により誘発されるインスリン放出を測定したり、および/または試験化合物により誘発される膵β細胞キャパシタンスを測定したりすることを含み、インスリン放出および/またはキャパシティ(これは以下に説明するようにインシュリンエキソサイトーシスの指標である)を増大させる化合物は、対照と比較して、II型糖尿病の治療のための候補化合物として特に価値を有し得る。さらなる実施形態では、以下に記述されるようにキャパシタンスの測定が行なわれ、最初の脱分極でエキソサイトーシス反応を誘発する試験化合物はII型糖尿病の治療のための良い候補化合物と考えられる。
材料および方法
試薬および構築物。
重要なInsP3KA中のリジンが識別されていた(28)。マウスIP6K1、ヒトIP6K2およびヒトIP6K3では、このリジンがそれぞれ226、222および217位置で生じている。IP6K1については、本願発明者らが、以下のオリゴヌクレオチドを使用してリジン226をアラニンへ変化させた:K26A、5’−GTGTGCTGGACTTGGCCATGGGTACCCG−3’(配列番号4)およびその相補配列。IP6K2については、本願発明者らが、以下のオリゴヌクレオチドを使用してリジン222をアラニンへ変化させた:K222A、5’−GTCCTTGACCTCGCGATGGGCACACGA−3’(配列番号5)およびその相補配列。IP6K3については、本願発明者らが、以下のオリゴヌクレオチドを使用してリジン217をアラニンへ変化させた:K217A、5’−CCCTGTGTCCTGGATCTGGCCATGGGGACCCGGCAGCAC−3’(配列番号6)およびその相補配列。構築物を、その効能を確立するためにINS−1E細胞で試験した。IP6K1〜3およびそれぞれの触媒不活性型をINS−1E細胞へトランスフェクトした(プロトコルは以下)。すべての構築物は、ウェスタンブロッティングで判断されるように同様のレベルで発現されていた。さらに、IP6K1〜3野生型では細胞InsP7レベルが6倍まで増大したが、それらの触媒不活型(K/A)では増大しなかった。
全体RNAをRNeasy(登録商標)Micro Kit(Qiagen社、カリフォルニア州バレンシア)を使用して細胞から抽出した。RNAを1時間、37℃でDNaseIにより消化し(Fermentas社、ドイツセントレオンロット)、次にRNeasy(登録商標)Micro Kit(Qiagen社)で再精製した。Applied Biosystem社のMultiScribe(商標)Reverse Transcriptaseキットを使用して、製造業者の取扱説明書に従って1μgの精製したRNAを逆転写した。逆転写酵素反応から得られた3.94μlの生じたcDNAsを10、06μl滅菌水に希釈し、各サンプルの1.25μ1アリコートを三連で各異なる定量PCR反応ごとに試験した。伝令RNAの相対発現を、定量的RT−PCR(TaqMan Gene Expression Assaysの生成物をABI PRISM(商標) 7700 Sequence Detection Systemに適用、Applied Biosystems社、カリフォルニア州フォスターシティ)により測定した。分析には、以下のTaqMan(商標)アッセイ(Applied Biosystems)を使用した:IP6K1に対して:イノシトールヘキサリン酸キナーゼ1、IP6K2に対して:イノシトールヘキサリン酸キナーゼ2、およびIP6K3に対して:イノシトールヘキサリン酸キナーゼ3。18SリボソームRNAに対するプライマーおよびプローブ(TaqMan(商標)Ribosomal RNA Control Reagents,Applied Biosystems)を内在性対照として使用した。
HIT T15細胞およびマウス膵島を、以前に記載されたように(29)RPMI−1640培地に維持した。特定のRPMI−1640培地にそれぞれ存在するインスリン分泌HIT T15細胞およびマウス膵島に対して、[3H]ミオイノシトール(GEヘルスケア、Amersham Biosciences社、スウェーデン、ウプサラ)10または50μCi/mlで、以前に記載されたように(29)標識化を行った。細胞を72時間で標識したが、48−168時間の標識化ではInsP6対InsP7の比が変化しなかった。実験のため、膵島または細胞を洗浄してKrebs緩衝液に移し、基本グルコース条件(細胞株は0.1mMおよび膵島は3mM)下で30分インキュベートした。ポリリン酸イノシトールを以前に記載されたように(29)HPLCで抽出および分離した。他に記載されたように(30)INS−1E細胞を培養した。マウス膵島を雌NMRIマウス(Bomholtgaard社、デンマーク、ライ)または正常血糖性ob/obマウスから、以前に記載されたように(31,32)分離した。細胞を10%(v/v)の熱不活性化ウシ胎児血清、100IU/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補給したRPMI 1640培地(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド)でインキュベートした。単一マウスの膵島細胞を、pIRES2−EGFP(mock)またはpIRES2−EGFPと対照構築物との組み合わせを2μg/mlで上記RPMI 1640細胞培養培地にプレーティングした後日、製造業者の取扱説明書に従ってリポフェクトアミン(商標)2000(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド)を用いて付着させてトランスフェクトした。リポフェクトアミン(商標)をDNAに対して4:1の比で使用した。細胞をトランスフェクションの48時間後に使用した。GFP蛍光に基づくと、マウス膵島細胞中のトランスフェクション効率は8+/−1%に及んだ(n=124細胞;4つの異なる細胞調製物およびトランスフェクション)。SiRNAをリポフェクトアミン(商標)2000および最適MEM(商標)培地を使用して、MIN6m9細胞および初代膵島細胞にトランスフェクトした。翌日培地をMIN6m9細胞または初代膵島細胞のいずれかの通常の培地に変更し、細胞をさらに4日間培養した。
キャパシタンス測定のために、EGFPを発現している細胞を選択した。穿孔パッチまたはパッチクランプ技術の標準全細胞構成と、EPC9パッチクランプアンプ(Heka
Elektronik社、ドイツ、ランブレヒト/プファルツ)とを使用して、エキソサイトーシスを細胞キャパシタンスの変化としてモニタした。穿孔パッチ構成のピペット溶液は、(単位mMで)76 Cs2SO4、10 NaCI、10 KCl、1 MgCl2、5HEPES(CsOHを使用してpH7.35)および0.24mg/mlアンホテリシンBから構成された。穿孔には数分間が必要であり、Gseries(一連のコンダクタンス)が安定し、>35nSである場合に電圧クランプは満足であると考えられた。標準的な全細胞記録のために使用されるピペット溶液は、(単位mMで)125 Csグルタミン酸塩、10 CsCl、10 NaCl、1 MgCl2、5HEPES、0.05 EGTA、0.01 GTP、および3 MgATP(CsOHを使用してpH7.15)を含んでいた。InsP7アイソフォームを、本文書に示した最終濃度になるようにピペット充填溶液に溶解させ、使用まで凍結した。細胞外培地は、(単位mMで)118 NaCI、20 テトラエチルアンモニウム−Cl、5.6 KCl、1.2 MgCl2、2.6 CaCl2、5HEPES(NaOHを用いてpH7.40)および3 グルコースから構成した。刺激プロトコルは、1Hzで適用される一連の4回の500ミリ秒の脱分極から成り、−70mVから0mVまでに及んだ。キャパシタンス測定は33°Cで行ない、記録チャンバを1.5ml/分の速度で潅流した。
単一L型Ca2+チャンネル活性の測定
細胞付着パッチの記録を、以前に記載されたように(32)対照MIN6m9細胞およびIP6K1−siRNAを受けたMIN6m9細胞に対して行なった。簡単に説明すると、一般に電極抵抗は2−4MΩとした。細胞付着シングルチャネル記録を、電荷担体としてBa2+を用いて行い:(単位はmM)110 BaCl2、10 TEA−Cl、5
HEPES−Ba(OH)2およびpH7.4、また、(単位はmM)125 KCl、30 KOH、10 EGTA、2 CaCl2、1 MgCl2、5 HEPES−KOHおよびpH7.15を含む脱分極用外部記録溶液を使用して、細胞内電位を約0mVとする。記録はAxopatch(商標)200アンプ(Axon Instrument社、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ)で作成した。保持電位の−70mVから膜電位の0mVに細胞を脱分極させるために、周波数0.5Hzで電圧パルス(200ミリ秒)を加える。生じた電流を1kHzでフィルタし、5kHzでデジタル化し、ソフトウェアプログラムpCLAMP(商標)6(Axon Instrument社、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ)で分析した。
ヒト成長ホルモン(hGH)放出分析
pCMV5−hGHと、空ベクターpcDNA3または対象プラスミドとによるトランスフェクション後、INS−1E細胞を48−マルチウェルプレート(1つのウェル当たりの2×105細胞)に播き、48時間培養した。インキュベーションと分泌実験は以前
に記載されたように(33)、上述と同じ細胞外培地を使用し、3mMグルコースを補給して行なった。
結果を、示した数の実験に対する平均値±平均値の標準誤差(S.E.M.)として示す。統計学的有意差を、対象に対する複数の比較の場合にはDunnett試験で、複数のグループ間の多数の比較が要求される場合にはTukey試験を使用して評価した。
[3H]ミオイノシトール標識プロトコルを使用して、本願発明者らは、インシュリン分泌細胞および膵島をイノシトールピロリン酸種の存在の有無について調べた。InsP7は、InsP6キナーゼを用いて生成された正規InsP7標準との同時溶出により同定された(データは図示しない)。InsP8はほとんど検知されなかった。図1Aは、
インシュリン分泌または初代β細胞に対する細胞InsP6レベルの割合として発現されたInsP7レベルを示す。正常マウスの膵島(60%がβ細胞)では、InsP7の相対レベルはInsPβレベルの約5%である。対照的に、約90%を超えるβ細胞を有するob/obマウスの膵島のInsP7の割合は約8%である。これは、InsP7レベルの上昇がβ細胞に限定されることを示唆している。100%のβ細胞へ初代マウスデータを正規化する(図1B)と、β細胞はInsP6濃度の約9%でInsP7レベルを維持していることをすること示唆している。インシュリン分泌細胞株のうち、HIT−T15細胞だけが同様のレベルのInsP7(10%のInsP6)を有している。成長している培養細胞のみに高い信頼で適用できる平衡標識技術(13)を用いて、発明者らはHIT−T15細胞におけるInsP7の基本濃度が5.8+/−0.14μM(±SEM、n=3)であると推測できたが、これは他の哺乳動物細胞または酵母で推算した範囲(1〜5μM)(4)の上限の濃度を反映している。InsP7は他の哺乳動物細胞(4)と共通してβ細胞でも細胞InsP6プールと迅速に交換する状態にあり(データは図示しない)、β細胞におけるInsP6の細胞濃度も高いため(13)、高レベルのInsP7がβ細胞に存在するのは驚くべきことではない。
におけるIP6K1および2の発現は低かった。したがって、高InsP7レベルは排他的な核プールを反映せず、細胞の至る所で一貫して高く、よってこれがインシュリン分泌に影響を及ぼし得る可能性がある。
InsP7の他の理論的異性体も評価した(図3E)。エキソサイトーシスに対する5−InsP7の影響を測定するために、本願発明者らは、標準の全細胞実験に一連の脱分極を適用し、ここではβ細胞を3μM InsP7を含む溶液で透析した。全細胞構成の確立に続いて、細胞に2分間の平衡期間を与えた。その後、エキソサイトーシスを引き起こすために−70mVから0mVまで4回の500msの脱分極を適用した。一連の6つの実験で、細胞キャパシタンスの増加の合計は、それぞれ3μM InsP7のピペット充填溶液の存在下では231+/−12fF(P<0.01)となり、対照条件下では77+/−11fFとなった(図3A)。IP6K1−3を過剰発現している細胞の場合、5−InsP7の存在下で最初の脱分極によって引き起こされるキャパシタンス増加が、続く3回の脱分極に答えたエキソサイトーシスに対する影響はほとんどない状態で、強く刺激された(図3B)。5−InsP7がエキソサイトーシスを刺激する能力は、全細胞のCa2+電流の変化(図3C)とは関係していなかった。エキソサイトーシスに対する5−InsP7の刺激作用は濃度依存的であった(図3D)。0.1μM以下のInsP7ではエキソサイトーシス刺激が観察されなかった。より高い濃度では、5−InsP7は90〜410%エキソサイトーシスを刺激した。ヒル(Hill)方程式への平均データ点の近似により、1.02μMの半最大刺激作用および1.5の同時作用因数が算出された。エキソサイトーシスの最大刺激は10μM以上のInsP7の濃度で観察され、380%を超える刺激を生じた(図4D)。したがって、5−InsP7は用量依存的に、InsP7濃度(1−10μM)という生理学的範囲内のエキソサイトーシスを増強した。InsP7の他の異性体も10μMでエキソサイトーシスを刺激することができたが、CH−PP(シクロヘキサンに基づく単純なピロリン酸塩)は効果がなかった(図4E)。エキソサイトーシスに対するInsP7の効果を調べるために使用される条件下では、InsP6の正味の効果はエンドサイトーシスではなくエキソサイトーシスを促進することであった(図5参照)。これは、エキソサイトーシスに対するInsP6の効果が、エンドサイトーシスが阻害された条件下でのみ識別できるからである(15)。これはInsP7には当てはまらない。さらに、エキソサイトーシスに対するInsP6の効果は、エンドサイトーシスが阻害される場合、RRPからの分泌を選択的に促進しない(データは図示しない)。本願発明者らのデータは、InsP7およびInsP6がエキソサイトーシスに別個の効果を有することを示している。これらの実験およびキナーゼの過剰発現に関する実験は、リン酸化ピロリン酸、つまりInsP8の役割を排除しないが、このピロリン酸はβ細胞では低濃度であるかまたは検出されないため(しかしながら)、生理学的役割を果たすことはあり得ない。
参考文献
Claims (10)
- II型糖尿病の治療用の化合物を識別する方法であって、
(a)膵β細胞を、1または複数の試験化合物と接触させること、および
(b)前記膵β細胞における、イノシトールヘキサリン酸キナーゼ1(IP6K1)の発現レベルおよび5−ジホスホイノシトールペンタキスリン酸(InsP7)のレベルのうちの少なくとも一方を決定すること、からなり、
対照に対する、前記IP6K1の発現レベルの増加および前記InsP7のレベルの増加のうちの少なくとも一方が、該試験化合物がII型糖尿病を治療するのに適していることを示す方法。 - 前記接触させることが、基本グルコース条件下で起こる請求項1に記載の方法。
- 前記膵β細胞は、膵組織、膵臓の単離されたランゲルハンス膵島、単離された膵β膵島細胞、およびインスリン分泌細胞株から選択される請求項1に記載の方法。
- 前記膵β細胞は、膵臓の単離されたランゲルハンス膵島である請求項1に記載の方法。
- 膵β細胞で前記試験化合物により誘発されるインスリン放出を測定すること、および該測定値を対照と比較することをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記試験化合物により誘発される膵β細胞キャパシタンスを測定すること、および該測定値を対照と比較することをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記決定することは、膵β細胞におけるイノシトールヘキサリン酸キナーゼ1(IP6K1)の発現レベルを決定することからなる請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記決定することは、膵β細胞における5−ジホスホイノシトールペンタキスリン酸(InsP7)のレベルを決定することからなる請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 患者におけるII型糖尿病を治療するための医薬組成物であって、
有効量のイノシトールヘキサリン酸キナーゼ1(IP6K1)の発現を増加させることが可能な治療薬
を含み、該治療薬が、前記IP6K1を含む遺伝子治療ベクター、もしくは前記IP6K1である、医薬組成物。 - 患者におけるII型糖尿病を治療するための医薬組成物であって、
有効量の5−ジホスホイノシトールペンタキスリン酸(InsP7)の生産を増加させることが可能な治療薬
を含み、該治療薬が、イノシトールヘキサリン酸キナーゼ1(IP6K1)を含む遺伝子治療ベクター、前記IP6K1、または前記InsP7である、医薬組成物。
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