CN1820021A

CN1820021A - 用于检测与严重的急性呼吸综合征(sars)相关的冠状病毒的肽及其混合物

Info

Publication number: CN1820021A
Application number: CNA2004800195752A
Authority: CN
Inventors: M·霍德; J·M·拉克鲁瓦
Original assignee: Adaltis Inc
Current assignee: Adaltis Inc
Priority date: 2003-05-09
Filing date: 2004-05-05
Publication date: 2006-08-16
Also published as: CA2428443A1

Abstract

本发明涉及用于检测人和动物的与严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS－CoV)感染的新肽及其混合物。因此，本发明提供SARS－CoV诊断方法和试剂盒。

Description

用于检测与严重的急性呼吸综合征(SARS)相关的冠状病毒的肽及其混合物

发明领域

本发明涉及有效用于检测人和动物的与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)感染的新肽及其混合物。

发明背景

SARS，一种未知病原学的非典型肺炎，在2003年2月末被世界卫生组织(World Health Organization)认可。在2003年4月，世界范围内的科学家证实了以前未被认识的冠状病毒(SARS-CoV)可能是SARS的起因(Drosten et al.，2003；Ksiazek et al，2003；Peiris et al，2003)。

迄今为止，已开发的对于SARS-CoV的血清学诊断测试极少(Drostenet al.，2003；Ksiazek et al，2003；Peiris et al，2003)。首选引入的是间接免疫荧光测定(IFA)(Drosten et al.，2003；Ksiazek et al，2003；Peiris et al，2003)，紧随其后的是ELISA(Ksiazek et al，2003；Peiris et al，2003)。所述IFAs都基于SARS-感染细胞的固定，随后的人抗-SARS抗体的结合和用荧光抗-人抗体对它们进行的标记。开始的ELISA基于使用全病毒裂解物(WVL)，即从组织培养物中富集的病毒的制备物。然而，如已在其它病毒中经历过的，全病毒裂解物纯度的缺乏通常导致测定中的更高背景水平，因为直接针对全病毒裂解物的污染物的抗体也将被捕获。这种纯度的缺乏减少了测定的敏感性并将检测不到许多显示低抗-SARS-CoV抗体水平的患者。因为相同的原因，这些全病毒裂解物分析的特异性也是不能接受得低。将具有高抗体水平的患者检测为SARS-阳性病例，所述抗体直接针对全病毒裂解物制备物的污染物。事实上，由于现存文献的首先应用，大量公开物已经报道了合成肽和重组蛋白质对于抗-SARS-CoV抗体的特异性检测的有效性(Ho et al.，2004；；Wang et al，2003；Wu et al.，2004)。

因此，存在对于开发诊断SARS-CoV感染的更敏感和更特异的测试的明确需要。

发明简述

本发明涉及用于开发SARS-CoV诊断方法和试剂盒的特异性SARS-CoV肽及其混合物。

更精确地，本发明的一个目标是提供一种分离的肽及其类似物，所述肽包括选自由SEQ ID NOS：1-4，6-16，18-22，24-33，35-41，43-62，64-73，75-77，79-81，83-100，102-105，107-113，115-118，120-127和129-140组成的组中的氨基酸序列。

本发明的另一个目标是提供具有式a--X--c--Z--b的分离的肽及其类似物，其中：X和Z具有的氨基酸序列与独立地选自由下列组成的组中的氨基酸序列具有85％同一性：SEQ ID NOS：1-4，6-16，18-22，24-33，35-41，43-62，64-73，75-77，79-81，83-100，102-105，107-113，115-118，120-127和129-140，并且其中：

a是有效促进肽的偶联或增加肽的免疫原性或抗原活性或促进与支持基质的附着的氨基端，1-8个氨基酸或取代物；

b是有效促进肽的偶联或增加肽的免疫原性或抗原活性或促进与支持基质的附着的羧基端，1-8个氨基酸或取代物；和

c是有效促进串联排列的两个肽的偶联或提高串联的肽的免疫原性或抗原活性或促进与支持基质的附着的一个或两个氨基酸或取代物的接头。

本发明的另一个目标涉及包括如上所述的至少两种肽或其类似物的混合物。

另一个目标涉及特异性结合于本发明的肽或其类似物的抗体或特异性结合于肽的抗体的混合物或特异性结合于如上所述的肽的混合物的抗体的混合物。

本发明的另一个目标是提供检测指示SARS-CoV的抗体的存在或缺乏的体外诊断方法，所述抗体结合于按照本发明的肽或其类似物以形成免疫复合物，所述方法包括如下步骤：

a)使按照本发明的肽或其类似物与生物样品接触一段时间并在足够形成免疫复合物的条件下；和

b)检测在a)中形成的免疫复合物的存在或缺乏。

本发明的另一个目标是提供一种用于检测指示SARS-CoV的抗体的存在或缺乏的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

-按照本发明的肽或其类似物；和

-检测肽-抗体免疫复合物的试剂；

其中所述肽或其类似物和试剂以足够进行所述检测的量存在。

本发明的另一个目标是提供检测指示SARS-CoV的肽或蛋白质的存在或缺乏的体外诊断方法，所述肽或蛋白质结合于按照本发明的抗体以形成免疫复合物，所述方法包括如下步骤：

a)使按照本发明的抗体与生物样品接触一段时间并在足够形成免疫复合物的条件下；和

b)检测在a)中形成的免疫复合物的存在或缺乏。

本发明的另一个目标是提供一种用于检测指示SARS-CoV的肽或蛋白质的存在或缺乏的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

-按照本发明的抗体；和

-检测肽-抗体免疫复合物的试剂；

其中所述抗体和试剂以足够进行所述检测的量存在。

本发明的肽及其混合物对于筛选SARS-CoV感染的血液和体液是有用的。例如，本文描述的肽及其混合物在用于检测针对SARS-CoV的抗体的广泛多种的特异性结合测定以及作为用于激发检测SARS-CoV抗原的抗体的免疫原是有用的。

附图简述

图1描述基于由BCCA基因组科学中心(BCCA Genome SciencesCenter)在2003年4月13日提供的序列(Protein ID NP_828858.1；422AA)的推定SARS-CoV的核壳体(N)蛋白质的Kyle-Doolittle分析(亲水性图)和Jameson-Wolf(抗原指数)和Emini(表面或然率)图谱。

图2显示本发明预期的肽的氨基酸序列，并将其鉴定为SEQ ID NOS：1-140。

发明详述

本发明提供对应于SARS-CoV的推定的刺突(S)，核壳体(N)和基质(M)基因产物的免疫显性区域的新肽及其类似物。本发明还提供这些肽和类似物的混合物和化学组合(串联排列)。如将在下面的描述中所解释的，这些肽、类似物、混合物和串联排列在关于SARS-CoV及由其造成的感染的广泛多种的诊断方法和试剂盒中是有用的。

本发明的肽优选地在对SARS-CoV蛋白质分析的基础上进行选择，如图1所示以预测亲水图(Kyle-Doolittle)，表面或然率图(Emini)和抗原指数(Jameson-Wolf)的3个公式进行所述分析。对于这三个参数显示阳性指数的氨基酸的区域具有作为免疫原并随后形成可用于检测抗-SARS-CoV抗体的线性表位的良好或然率。分析下列SARS-CoV蛋白质：S(刺突；NP_828851.1)，N(核壳体；NP_828858.1)，M(基质；NP_828855.1)，E(小包膜；NP_828854.1)，NSP1(非结构蛋白1；NP_828862.1)NSP2(NP_828863.1)，NSP3(NP_828864.1)，NSP4(NP_828865.1)，NSP5(NP_828866.1)，NSP6(NP_828867.1)，NSP7(NP_828868.1)，NSP9(NP_828869.1)，NSP10(NP_828870.1)，NSP11(NP_828871.1)，NSP12(NP_828872.1)和NSP13(NP_828873.2)。

如上面提出，选择在图2中显示的肽以进行另外的实验。Seq ID no：3的位置19，Seq ID no：6的位置133，Seq ID no：9的位置348，Seq ID no：10的位置419，Seq ID no：18的位置1064，Seq ID no：26的位置158，Seq IDno：38的位置119和128，Seq ID no：43的位置550，Seq ID no：57的位置2010，Seq ID no：59的位置2178，Seq ID no：61的位置2390和2391，SeqID no：65的位置113，Seq ID no：70的位置72，Seq ID no：75的位置142，Seq ID no：80的位置73，Seq ID no：84的位置79和91，Seq ID no：86的位置53和54，Seq ID no：91的位置281，Seq ID no：97的位置645和646，Seq ID no：102的位置72和84，Seq ID no：109的位置471，Seq ID no：111的位置556，Seq ID no：116的位置356，Seq ID no：117的位置382和387，Seq ID no：119的位置452，Seq ID no：120的位置484，Seq ID no：125的位置116，Seq ID no：131的位置333和Seq ID no：132的位置25的半胱氨酸残基由丝氨酸残基取代。关于Seq ID no：039，84，103和118，起始的半胱氨酸残基是保守的从而形成二硫键。

本发明的肽

按照第一个目标，本发明涉及分离的肽及其类似物，所述肽包括选自由下列组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID NOS：1-4，6-16，18-22，24-33，35-41，43-62，64-73，75-77，79-81，83-100，102-105，107-113，115-118，120-127和129-140。

按照另一个目标，本发明涉及串联排列的肽。确实，本发明涉及具有式a--X--c--Z-b的分离的肽及其类似物，其中：X和Z具有独立地选自由下列组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID NOS：1-4，6-16，18-22，24-33，35-41，43-62，64-73，75-77，79-81，83-100，102-105，107-113，115-118，120-127和129-140，并且其中：

按照本发明的另一个目标，本发明还意欲提供包括如上限定的至少两个肽或其类似物的混合物。

优选地，氨基酸序列选自由SEQ ID NOS：3，19，22，28，31，37，136，137，138，139和140及其类似物组成的氨基酸序列的组中。最优选地，氨基酸序列由SEQ ID NO：3，19，22，28，31，37，136，137，138，139或140或其类似物的任一组成。

用于本文时，“类似物”指与如上限定的肽的氨基酸序列的全长有至少85％的同一性的氨基酸序列。更具体地，术语“类似物”表示在肽链中，在其由天然存在的SARS-CoV氨基酸序列的区段(block)组成的部分中，在一个或多个位点的氨基酸插入、缺失、取代和修饰。

本发明的肽的天然氨基酸序列的优选修饰和取代是保守的那些(即，对肽的二级结构和亲水性质具有最小影响的那些)。这些包括取代诸如由Dayhoff在Atlas of Protein Sequence and Structure5，1978中和Argos在EMBO J，8，779-785，1989中所描述的那些。例如，属于下组之一的氨基酸代表保守性变化：丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，丝氨酸，苏氨酸；半胱氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸；赖氨酸，精氨酸，组氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸。

以相同的方式，一种易于氧化的氨基酸，甲硫氨酸(Met)可在本发明的肽中被正亮氨酸所取代。优选的取代还包括D-同分异构体对相应的L-氨基酸的取代。

除了当指SARS-CoV的基因产物的天然氨基酸序列时，用于本说明书(例如，在a和b及类似物的定义中)的术语“氨基酸”包括所有的天然氨基酸，以它们的D-构型存在的那些氨基酸，和已知的非天然、合成性和修饰的氨基酸，诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸和β-缬氨酸。

如上简短提出的，修饰本发明的肽从而使被选择的肽更有效用作免疫诊断试剂通常是有用并无疑在本发明的范围内。这些变化，例如包括：

--添加半胱氨酸残基到一个或两个末端从而用异双官能交联剂，诸如磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯促进肽偶联到合适的载体中。影响这些连接的优选的试剂是磺基琥珀酰亚胺基-磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯；

--将1-8个另外的氨基酸添加在肽的一个或两个末端从而促进肽的彼此连接，用于将其偶联到支持物或更大的肽或蛋白质或用于修饰肽的物理或化学特性。这些变化的实例是N-或C-末端的酪氨酸的添加，通过酯化反应作为接头的谷氨酸或天冬氨酸的添加和可通过席夫碱或酰胺形成被连接的赖氨酸的添加。如上所述，这些另外的氨基酸可包括任何天然氨基酸，以它们的D-构型存在的那些氨基酸和已知的非天然、合成性以及修饰的氨基酸；和

--通过，例如酰化或酰胺化对肽的一个或两个末端的衍生作用。这些修饰导致在肽上的净电荷的变化并还可促进肽对支持基质、载体或另外的肽的共价连接。有效促进肽的偶联或增加肽的免疫原性或抗原活性或促进附着于支持基质的取代物的实例是C₂-C₁₆酰基基团，聚乙二醇，磷脂，人血清白蛋白(HSA)和聚赖氨酸(PLL)。

如上所反映，应用串联排列的肽在本发明的范围内。这些肽可以是均聚物或共聚物。本发明的肽和串联排列的肽的物理混合物也在其范围内。

为了制备本发明的新肽，可以使用任何常规的肽制备方法。这些包括合成、重组DNA技术及其组合。按照本发明，优选固相合成。在该合成方法中，树脂支持物可以是常规用在本领域中进行固相制备肽的任何合适的树脂。优选地，其是对-苄氧基-醇聚苯乙烯或对-methylbenzyhydrylamine树脂。将第一被保护氨基酸与树脂支持物偶联后，通过常规应用在本领域的方法来去除氨基保护基。在去除氨基保护基后，使剩余的被保护氨基酸和如果必要，侧链被保护的氨基酸以所需的次序顺序地进行偶联以获得被选择的肽。或者，使用在与树脂支持的氨基酸序列偶联之前的溶液方法(solution methodology)可以偶联多个氨基酸基团。

合适的偶联试剂的选择按照已建立的技术。例如，合适的偶联试剂是单独地或优选地在1-羟基苯并三唑存在下的N，N′-二异丙基碳二亚胺或N，N′-二环已基碳二亚胺(DCC)或优选地，苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟-磷酸酯。另一个有用的偶联方法应用被保护的氨基酸的预形成的对称酐。

对于被引到延伸的多肽链上的每个氨基酸所应用的必需的α-氨基保护基优选9-芴基甲基氧基羰基(FMOC)，尽管可使用任何其它合适的保护基，只要其在偶联条件下不降解并在已经存在于延伸的肽链中的任何其它保护基存在时可容易地和选择性地去除。

选择侧链氨基酸的保护基的标准是：

(a)在合成的每个步骤，在选择用于去除α-氨基保护基的反应条件下，保护基对于各种试剂的稳定性；(b)保护基的关键性质的保持(即，在偶联条件下没有被分离)和(c)保护基在肽合成结束后并在没有另外影响肽结构的条件下容易地可去除性。

在合适的清除剂诸如茴香醚、苯硫基甲烷、乙基甲基硫醚、1，2-乙二硫醇和相关试剂存在时，以50％-60％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液于室温作用1-6小时将充分保护的树脂支持的肽优选地从对-苄氧基醇树脂上裂解下来。同时，将大多数酸不稳定的侧链保护基去除。典型地，通过HF处理将更多的酸抗性保护基去除。

使用的方法

本发明的肽作为按照本领域众所周知的方法检测和量化SARS-CoV相关抗体的诊断试剂是有用的。这些方法包括ELISA、蛋白质印迹法、荧光测定、化学发光测定、放射性免疫测定血细胞凝集、比浊测定法、免疫层析法(快速检验)，单斑点和多斑点测定方法。还可以使用诸如肽或蛋白质微阵列或使用基于压电现象的生物传感器标记、表面等离振子共振(SPR)或悬臂法的新方法。

使用本发明的肽或肽的混合物确定针对SARS-CoV的抗体的优选的便利和经典技术是酶联免疫吸附测定法(ELISA)。在该测定中，例如，本发明的肽或混合物吸附于，或共价偶联到微量滴定板的孔中。然后用待测定的血清或生物体液(fluid)处理所述孔。洗涤后，将用过氧化物酶标记的抗-人IgG或抗-人IgM或抗-人IgA加入孔中。用相应的底物，例如，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺来进行过氧化物酶的确定。

在不背离该说明性的测定的有用性的前提下，过氧化物酶可被另一种标记，例如放射性、荧光、化学发光或红外线发射标记所替代。

用本发明的肽和混合物确定在测试样品或血清中针对SARS-CoV的抗体的存在的另一种方法是按照所谓的“双-抗原-夹层法-测定”的酶免疫学测定。此方法基于如Immunological Methods，20，25-34，1978中所述Maiolini的工作。按照此方法，利用配体的偶联诸如生物素-抗生物素蛋白、His6-Ni-NTA、FITC-抗-FITC或其它，使待测定的血清或其它分析物与已经涂布本发明的肽的固相(捕获层)以及与已被过氧化物酶或其它信号标记的本发明的肽(检测层)接触。

可以一个或两个步骤来进行免疫反应。如果免疫反应以两个步骤来进行，那么洗涤步骤典型地在两次温育之间进行。免疫反应或反应后，也通常进行洗涤步骤。其后，例如，使用过氧化物酶的邻苯二胺确定过氧化物酶或其它信号。还可将包括那些已描述的其它的酶和色原用在本测定中。

应用在上述测定和测定方法中的合适的支持基质或固相包括，但不限于，有机和无机聚合物，例如淀粉酶、葡聚糖、天然或改性的纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖、磁铁矿、多孔玻璃粉末、聚乙烯双烯氟化物(kynar)和胶乳、测试容器(即玻璃或人工材料的测试试管、滴定板或比色杯)的内壁以及固体(即，玻璃和人工材料的棒条，具有末端增厚的棒条，具有末端裂片(lobes)或薄片(lamellae)的棒条)的表面。玻璃和人工材料的球体特别适合作为固相的载体。

本发明的肽及其混合物不仅在确定和量化针对SARS-CoV的抗体中是有用的。它们还在确定和量化SARS-CoV抗原本身中是有用的，因为游离、聚合或缀合于合适的载体的本发明的肽，在激发抗体，特别和优选地激发在免疫学上与SARS-CoV的抗原具有交叉反应性的单克隆抗体是有用的。例如，可通过用足够量的肽注射哺乳动物或禽类动物从而激发所需的免疫应答并从所述动物的血清中回收所述抗体来制备这些抗体。因此，本发明的另一个目标是提供特异性结合于按照本发明的肽或其类似物，或肽的混合物的抗体。

关于本发明的抗体，术语“特异性结合于”指以相对高的亲和性结合于一个或多个目标蛋白的表位，诸如本发明的肽，而基本不识别和结合除目标之外的分子的抗体。用于本文时，术语“相对高的亲和性”意为抗体和目标肽或蛋白质之间的结合亲和性为至少10⁶M^-1，优选地至少约10⁷M^{- 1}和甚至更优选地10⁸M^-1-10¹⁰M^-1。对这些亲和性的确定优选地在作为本领域技术人员公知常识的标准竞争性结合免疫测定条件下进行。

激发抗体的合适的宿主动物包括，例如，兔、马、山羊、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、绵羊和母鸡。优选地，使用本发明的肽和常规技术来制备产生所需单克隆抗体的杂交瘤。

例如，可使用众所周知的产生单克隆抗体的Kohler和Milstein技术。为了辨别针对相同抗原，但针对不同表位的单克隆抗体，可使用Stahli et al.的方法(J.of Immunological Methods，32，297-304，1980)。

使用上述抗体，可将公知的各种方法用在确定或量化SARS-CoV或其部分中。在一种这样的方法中，将已知量的待检验的血清样品或任何其它生物体液，本发明的放射性标记的肽或混合物和本发明的未标记的肽或混合物混和在一起，加入给定量的本发明的肽的抗体，优选单克隆抗体，并使所述混合物静止。然后，通过本领域已知方法诸如用硫酸铵、聚乙二醇、过量或结合于不溶支持物的二抗，或葡聚糖包被的炭进行处理从未结合的试剂中分离得到的抗体/抗原复合物。

然后，以结合或未结合的相来确定标记的肽的浓度并通过以本身已知的方式比较标记成分的水平和标准曲线来确定样品的SARS-CoV抗原含量。

另一种将这些抗体使用在测定中的合适方法是“双-抗体-夹层法-测定”。按照此测定，用两种不同的抗体，对待测样品进行处理，所述抗体例如，通过用本发明的肽或其混合物或组合免疫不同的动物，例如山羊和兔来激发(raise)。所述抗体之一被标记而另一个被涂布于固相上。优选的固相是塑料珠，并且优选的标记是辣根过氧化物酶。

典型地，在“双-抗体-夹层法-测定”中，将所述样品与固相抗体和标记的抗体一起温育。然而，还可能的是使样品首先与固相抗体接触，然后在任选地洗涤后使所述样品与标记的抗体接触。然而，优选地，将样品与固相和标记的抗体一起进行处理。免疫反应后，洗涤所述混合物并按照本领域已知的方法来测定标记。在过氧化酶被用作标记的情形中，可使用例如具有邻苯二胺或四甲基联苯胺的底物来进行测定。被标记的组分的量与存在于分析物或血清样品中的抗原的量成比例。

因此，在另一个目标中，本发明因而提供了检测指示SARS-CoV的抗体的存在或缺乏的体外诊断方法，所述抗体与按照本发明的肽或其类似物结合从而形成免疫复合物，所述方法包括如下步骤：

a)使按照本发明的肽或其类似物与生物样品接触一段时间并在足以形成免疫复合物的条件下；和

b)检测在a)中形成的免疫复合物的存在或缺乏。

本发明还在另一个目标中提供了检测指示SARS-CoV的肽或蛋白质的存在或缺乏的体外诊断方法，所述肽或蛋白质与按照本发明的抗体结合从而形成免疫复合物，所述方法包括如下步骤：

a)使按照本发明的抗体与生物样品接触一段时间并在足以形成免疫复合物的条件下；和

b)检测在a)中形成的免疫复合物的存在或缺乏。

“生物样品”包括从个体(动物或人)中获得的各种样品类型，并可将其用在本发明的诊断方法中。所述定义包括生物起源的血液和其它液体样品、固体组织样品诸如来自那里的活组织检查样品或组织培养物或细胞，及其后代。

所述定义还包括在获得后以任何方式诸如用试剂处理、溶解、或富集某些成分诸如蛋白质或多肽，进行处理的样品。术语“生物样品”包括临床样品，并还包括培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物体液和组织样品。

如上所述，还可在合适的检验试剂盒中进行测定和量化SARS-CoV抗原或针对该病毒的抗体的方法和测定，所述试剂盒的特征在于本发明的肽或混合物，或由那些肽和混合物激发的针对SARS-CoV的抗体。这些试剂盒典型地包括两个或更多进行诊断测定所必需的组分。组分可以是化合物、试剂、容器和/或装置。例如，在试剂盒中的一个容器可包含特异性结合于本发明的肽的单克隆抗体或其片段。这些抗体或片段可被提供连接于本领域技术人员已知的支持材料。一个或多个另外的容器可装入将在测定中使用的元素，诸如试剂或缓冲剂。

关于这一点，在另一个目标中，本发明提供检测指示SARS-CoV的抗体的存在或缺乏的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

-按照本发明的肽或其类似物和

-检测肽-抗体免疫复合物的试剂，

其中所述肽或其类似物以及试剂以足够进行所述检测的量存在。

在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括缺乏与所述肽免疫性结合的抗体的生物参比样品以及包括可特异性结合于所述肽或其类似物的抗体的比较样品，其中所述生物参比样品和比较样品以足够进行所述检测的量存在。

在另一个目标中，提供检测指示SARS-CoV的肽或蛋白质的存在或缺乏的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

-按照本发明的抗体和

-检测肽-抗体免疫复合物的试剂；

其中所述抗体和试剂以足够进行所述检测的量存在。

在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括缺乏与所述抗体免疫性结合的肽的生物参比样品以及包括可特异性结合于所述抗体的肽的比较样品，其中所述生物参比样品和比较样品以足够进行所述检测的量存在。

在下面提供本发明肽的合成和利用的优选的方案。

方案1

制备携带N-FMOC保护的氨基酸残基的树脂

将所需的在二氯甲烷(CH₂Cl₂)和二甲基甲酰胺(DMF)的混合物(4∶1)中的N-FMOC保护的氨基酸残基于0℃加入对-苄氧基醇树脂在CH₂Cl₂∶DMF(4∶1)的混悬液中。将所述混合物手动搅拌数秒，然后用N，N′-二环己基-碳二亚胺(DCC)进行处理，随后用催化量的4-(二甲基氨基)吡啶进行处理。将所述混合物于0℃再搅拌30分钟，然后于室温搅拌过夜。将过滤的树脂用CH₂Cl₂、DMF和异丙醇(每个洗涤3次)，最后用CH₂Cl₂连续洗涤。将树脂悬浮于CH₂Cl₂，并在冰浴中冷却，然后将重蒸馏的吡啶加入搅拌的混悬液中，随后加入苯甲酰氯。搅拌于0℃持续30分钟然后于室温持续60分钟。过滤后，在于高真空下被干燥到恒重之前，用CH₂Cl₂、DMF和异丙醇(每个洗涤3次)，最后用石油醚(两次)对树脂进行连续洗涤。按照Meienhofer et al.(Int.J.Peptide Protein Res.，13，35，1979)对取代进行的分光光度测定说明在树脂上的取代程度。

方案2

后来的氨基酸的偶联

将携带N-FMOC保护的第一氨基酸残基的树脂置于Biosearch 9600肽合成仪的反应容器中并如下处理：

1)用DMF洗涤(4次，每次20秒)

2)用30％的哌啶的DMF溶液预洗(3分钟)

3)用30％的哌啶的DMF溶液去保护(7分钟)

4)用DMF洗涤(8次，每次20秒)

5)检验游离氨基基团--Kaiser检验(必须是阳性的)

6)然后将肽树脂与都溶解于包含16当量的4-甲基吗啉的无水重蒸馏的DMF中的8当量的所需FMOC-保护的氨基酸和1-羟基苯并三唑和苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基-氨基)磷鎓六氟磷酸酯一起轻轻摇动1或2小时。

7)用DMF洗涤(6次，每次20秒)

步骤7后，取出等分试样进行水合茚三酮试验。如果所述试验是阴性的，从步骤1开始重复所述方案以偶联下一个氨基酸。如果所述试验是阳性或弱阳性，重复步骤6和7。

可将上述方案用于偶联本发明描述的肽的每个氨基酸。还可在整个合成中将用FMOC进行的N-保护与任何余下的氨基酸一起使用。

可通过使用上述偶联方案结合氚化的氨基酸来制备放射性标记的肽。

添加最后一个氨基酸后，通过返回上述方案的步骤1-7来去除N-末端残基的N-FMOC。用CH₂Cl₂洗涤所述的肽树脂并在真空中干燥从而得到粗的被保护的肽。

方案3

去保护并将肽从树脂上裂解下来

将被保护的肽-树脂悬浮于包含2.5％的乙二硫醇和2.5％茴香醚的55％的三氟乙酸(TFA)的CH₂Cl₂溶液。用N₂冲洗所述混合物并于室温搅拌1.5小时。过滤所述混合物并将所述树脂用CH₂Cl₂洗涤。于室温用20％的在CH₂Cl₂中的TFA再次处理所述树脂5分钟。过滤所述混合物并用20％的在CH₂Cl₂中的TFA洗涤所述树脂，然后用CH₂Cl₂洗涤它。低于35℃下，将合并的过滤物在真空下蒸发并用无水二甲醚洗涤残余物数次。将所述固体溶解在10％的乙酸水溶液中并将其冻干以得到粗产物。

通过在茴香醚和二甲硫存在时于0℃以HF处理1小时，将包含精氨酸和半胱氨酸残基的肽进一步去保护。用10％的乙酸水溶液抽提所述肽，用二甲醚洗涤并将其冻干以得到粗肽。

方案4

肽的纯化

通过在以梯度的移动相填充的C₁₈或C₄反相的Vydac柱(2.5×25mm)上的制备HPLC来纯化粗肽。在220nm处监测流出液，并随后用分析HPLC监测。将有关级分合并、蒸发并冻干。通过分析反相层析法和氨基酸分析来证实对合成肽的鉴定。

方案5

肽与牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)的缀合

将肽与先前用磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB)或磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)衍生化的BSA或KLH进行缀合。

将sulfo-SMPB或sulfo-SMCC(Pierce Chemicals)的水溶液加入在0.02M的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中的BSA或KLH溶液。将所述混合物于室温摇动45分钟并将活化的载体于4℃立即应用于用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱。

将对应于活化载体的第一个峰吸收值(280nm)的级分合并在一个圆底烧瓶中，并在所述圆底烧瓶中加入在0.05M的磷酸钠缓冲液(pH6.2)中的肽的溶液。用N₂彻底冲洗所述混合物并将其于室温过夜温育。使用³H标记的肽并通过缀合物的氨基酸分析来监测偶联效率。

方案6

通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测针对SARS-CoV的抗体

用包含肽或肽的混合物(5μg/ml)的100μl溶液(过滤的0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH9.4±0.2)来饱和微量滴定板的每个孔并留置过夜。优选地，发明人使用OsterBayVersafill分配系统来填充该孔。将每个孔腾空(优选地通过抽吸)并用洗涤缓冲液(NaCl，0.15M；NaH₂PO₄，0.060M；乙基汞硫代水杨酸钠，0.01％和Tween 20，0.05％；pH7.4(0.3mL/孔))洗涤两次。然后，将所述孔用0.35ml的洗涤缓冲液于37℃饱和1小时并用无Tween 20的相同缓冲液洗涤1次。于37℃再次干燥1小时后，将所述孔备用。用样品缓冲液(包含磷酸钠，6mM；NaCl，0.15M和BSA，2％，终pH等于7.2)来稀释待分析的血清样品。在添加稀释的血清样品(0.1ml)之前用洗涤缓冲液漂洗所述孔。这些在室温温育30分钟。然后，将所述孔腾空，用洗涤缓冲液迅速洗涤两次，然后洗涤1次，2分钟。将用1％w/v的在包含Tris，0.05M；NaCl，0.5M；Tween 20，0.05％；乙基汞硫代水杨酸钠，0.01％的溶液(pH7.2)中的牛血清白蛋白稀释的缀合溶液(过氧化物酶标记的亲和性纯化的针对人IgG的山羊抗体，在5ml 50％甘油中的0.5mg)加入每个孔中(0.1ml)并于室温温育30分钟。然后将所述孔腾空，用洗涤缓冲液洗涤5次。用100体积的包含0.1％v/v的30％H₂O₂的0.1M柠檬酸盐-乙酸盐缓冲液(pH5.6)来稀释底物溶液(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)(每ml的DMSO中8mg)并将其加入每个孔中(0.1ml/孔)。10分钟后，用0.1ml的2N H₂SO₄处理每个孔的内容物并在450nm读出光密度。所有的测定以两次重复进行。

实施例

随后的实施例是对本发明应用性的广泛范围的举例说明而不倾向于限制其范围。在不背离本发明精神和范围的前提下可对其作出修改和变化。尽管可将与本文描述的那些相似或相等的任何方法和材料用在检验本发明的实践中，还是描述了优选的方法和材料。

实施例1：本发明的肽检测抗-SARS-CoV抗体的效率

将对应于序列Seq ID nos：3，17，22，23，31，34，37，101，136和137的SARS-CoV肽进行化学合成，并按照方案6描述的方案用在微量滴定板EIA(酶免疫测定)中以检测抗-SARS CoV IgG抗体。

为了检验这些肽的敏感性，制备一组收集自SARS-阳性患者的55个血清样品。通过IFA(间接荧光测定)，所有这些样品的血清学状态被确认为SARS-阳性。为了检验这些肽的特异性，从收集自在2000年和2001年，SARS报道出现前的至少两年，被其它呼吸疾病侵袭的患者的血清库制备一组22个血清样品。

结果显示于表1中。对于每个肽，基于用22个SARS-阴性样品获得的结果的平均值加3标准偏差(平均值+3SD)来选择截止(cutoff)水平。将超过或低于截止值的任何值分别认为是阳性或阴性。10个肽显示良好特异性(95.5％或100％)因为用肽Seq ID nos：23，37和137没有获得假阳性结果，而用对应于Seq ID nos：3，17，22，31，34，101，和136的肽仅获得1个假阳性结果。就敏感性而言，对应于Seq ID nos：37，136和137的肽分别显示与SARS-阳性样品的显著反应性(分别为63.6％，50.9％和69.1％反应性)。Seq ID nos：3，22，31，和34的肽也显示分别与在55个中检测的4，5，5和3样品具有一定反应性。

此外，当将对应于Seq ID nos；37，136和137的肽的混合物用于试验时，获得了91.3％的敏感性和100％的特异性(见表2，混和37-136-137)。这些结果显示三个合成肽的组合提高了测定的检测效率，因为得到的敏感性比3个单独的肽更好而特异性仍是相同的(与肽Seq ID nos：37和136相对)或甚至比肽Seq ID no：137的更高。

实施例2：本发明的肽检测SARS-CoV蛋白质的效率

用Seq ID no：37或Seq ID no：136的肽(都与KLH偶联)免疫兔。3个月后，从这些兔中收集血清并接下来按照方案6描述的方案以用Seq ID nos：37，136和137的肽包被的微量培养板来对其进行检验。山羊抗-IgG-过氧化物酶缀合物的添加揭示特异性抗-肽抗体在所有被测试的抗血清中的存在，但是当用以肽Seq ID nos 136或137包被的微量培养板试验Seq ID no37的抗血清时和当用以肽Seq ID nos 37或137包被的微量培养板测定SeqID no 136的抗血清时，没有显著的反应。

在下一组实验中，将1微克(μg)的重组核壳体(N)蛋白质(氨基酸1-49；Biodesign International，Saco，Maine，USA)与兔抗血清一起加入微孔中。结果显示加入的SARS N蛋白质与被吸附的肽Seq ID no：136竞争抗体，因为如表2所示，当存在蛋白质时，信号减少。用另一个肽(Seq ID no：37)免疫的血清进行的对照实验没有显示信号的减少，说明这种减少是特异性的。

实施例3本发明的肽检测SARS-CoV抗原的效率

用在实施例2中描述的重组N蛋白质包被微量培养板(1μg/mL；100μL/孔)。接下来，将在实施例2中描述的抗血清加入所述板中并按照方案6中描述的方案检测与包被的抗原结合的IgG。获得的结果可见于表3。它们显示可将针对SARS-CoV N肽激发的抗血清用于检测SARS-CoV的N蛋白质。

参考文献

1.Drosten et al.，2003，Identification of a Novel Coronavirus in Patients withSevere Acute Respiratory Syndrome.N Engl J Med 348(20)：1967-1976

2.Ksiazek et al.，2003，A Novel Coronavirus Associated with Severe AcuteRespiratory Syndrome.N Engl J Med 348(20)：1953-1966

3.Peiris et al.，2003，Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratorysyndrome.Lancet 361(9366)：1319-25。

4.Ho et al.，2004，Antigenicity and receptor-binding ability of recombinantSARS corornavirus spike protein.Biochem Biophys Res Comm 313(4)：938-947。

5.Wang et al.，2003，Assessment of immunoreactiVe synthetic peptides fromthe structural proteins of severe acute respiratory syndrome coronavirus.ClinChem 49(12)：1989-1996。

6.Wu et al.，2004，Early detection of antibodies against various structuralproteins of the SARS-associated coronavirus in SARS patients.J Biomed Sc11：117-126。

表1 SARS-CoV肽的敏感性和特异性OD 450nm(-空白)

混和37-136-

样品ID	Seq017	Seq022	Seq037	Seq034	Seq023	Seq137	Seq003	Seq136	Seq101	Seq031	137
样品ID	Seq017	Seq022	Seq037	Seq034	Seq023	Seq137	Seq003	Seq136	Seq101	Seq031	137	SARS-Neg-01SARS-Neg-02SARS-Neg-03SARS-Neg-04SARS-Neg-05SARS-Neg-06SARS-Neg-07SARS-Neg-08SARS-Neg-09SARS-Neg-10SARS-Neg-11SARS-Neg-12SARS-Neg-13SARS-Neg-14SARS-Neg-15	.021.014.206.016.024.018.028.011.034.016.005.020.011.009.025	.055.030.053.077.035.045.046.014.117.051.017.067.029.043.036	.130.11-1.147.062.055.062.122.026.050.049.019.191.018.038.042	.074.040.055.076.044.033.033.015.047.034.019.055.019.033.457	.058.054.060.031.063.023.056.022.048.051.021.067.021.040.036	.057.065.052.020.042.044.172.039.096.029.032.150.035.055.123	.097.048.041.016.026.025.039.016.022.024.013.026.015.014.019	.107.038.035.016.027.025.038.021.017.026.020.042.016.011.020	.142.101.051.017.034.031.058.023.028.029.016.047.017.025.027	.064.030.025.011.022.026.032.015.017.017.008.038.009.209.012	.026.008.013.040.007.022.006.007.044.015.003.009

SARS-Neg-16SARS-Neg-17SARS-Neg-18SARS-Neg-19SARS-Neg-20SARS-Neg-21SARS-Neg-22SARS-Pos-01SARS-Pos-02SARS-Pos-03SARS-Pos-04SARS-Pos-05SARS-Pos-06SARS-Pos-07SARS-Pos-08SARS-Pos-09SARS-Pos-10SARS-Pos-11SARS-Pos-12SARS-Pos-13

.030.047.034.013.062.009.013.104.037.187.007.052.039.000.142.025.013.021.025.021

.082.082.051.049.182.022.059.072.086.068.014.064.045.029.030.296.034.011.063.081

.042.086.042.093.122.057.076.929.099.970.170.0561.0741.3241.047.355.079.062.667.088

.037.060.036.038.000.003.057.052.060.078.031.084.047.529.056.087.097.015.035.054

.021.047.016.056.040.007.017.004.041.006.001.012.001.001.009.042.000.001.001.008

.030.143.029.036.058.027.164.271.661.185.3471.053.315.204.3852.4501.480.318.088.266

.008.033.013.027.050.027.046.020.079.026.012.031.024.025.031.086.021.310.035.044

.016.035.014.033.045.030.046.022.072.030.292.032.030.515.033.063.043.012.729.245

.028.045.018.037.086.049.081.033.079.039.020.042.028.050.038.094.023.014.031.053

.007.028.012.019.073.021.038.022.080.024.010.024.028.020.025.041.016.005.021.019

.012.028.380.407.280.049.190.5812.144.920.379.354.108

SARS-Pos-14SARS-Pos-15SARS-Pos-16SARS-Pos-17SARS-Pos-18SARS-Pos-19SARS-Pos-20SARS-Pos-21SARS-Pos-22SARS-Pos-23SARS-Pos-24SARS-Pos-25SARS-Pos-26SARS-Pos-27SARS-Pos-28SARS-Pos-29SARS-Pos-30SARS-Pos-31SARS-Pos-32SARS-Pos-33

.010.012.040.007.035.015.006.017.010.012.014.001.001.001.035.001.004.010.001.003

.110.087.041.1551.040.033.051.079.052.057.252.016.099.017.033.032.219.051.033.034

.238.0662.453.808.2381.4121.289.1761.804.113.103.529.275.569.103.360.554.697.305.180

.697.032.035.031.083.048.028.057.052.101.066.025.551.028.220.049.058.048.120.032

.001.001.001.001.016.001.001.035.001.009.001.049.045.027.034.036.094.054.046.040

1.8571.381.9251.1031.660.889.689.6772.4881.211.144.039.207.0463.056.082.146.0652.5443.087

.064.029.026.0291.820.018.047.000.044.029.034.011.022.013.045.021.206.043.037.028

.099.100.038.073.102.042.030.0971.0271.998.028.527.062.436.335.705.416.118.032.080

.079.039.045.033.080.027.025.054.052.044.045.032.073.043.035.063.273.090.064.054

.035.022.082.014.078.025.018.034.027.021.341.011.032.077.021.338.103.047.027.021

1.9622.027.9231.167.888.3962.420.082.039.135

SARS-Pos-34SARS-Pos-35SARS-Pos-36SARS-Pos-37SARS-Pos-38SARS-Pos-39SARS-Pos-40SARS-Pos-41SARS-Pos-42SARS-Pos-43SARS-Pos-44SARS-Pos-45SARS-Pos-46SARS-Pos-47SARS-Pos-48SARS-Pos-49SARS-Pos-50SARS-Pos-51SARS-Pos-52SARS-Pos-53

.001.001.001.001.001.009.001.001.001.003.001.084.001.001.010.001.002.001.001.001

.065.021.012.010.005.134.021.209.026.016.033.048.028.013.038.023.009.050.014.005

.327.158.523.683.0401.055.372.129.1791.153.2031.523.274.040.530.646.462.2101.3061.245

.064.084.010.041.006.023.018.053.027.033.037.050.008.024.027.029.036.043.141.017

.001.072.041.029.027.036.036.001.037.055.043.066.033.034.037.055.021.054.034021

.373.062.358.786.7522.682.027.077.9281.451.200.920.598.614.350.433.912.335.312.125

.029.078.042.044.004.043.006.177.070.016.011.057.015.021.014.024.034.018.024.077

.041.232.086.059.039.250.519.123.009.148.566.189.006.047.110.060.225.526.023.214

.076.082.045.058.046.044.063.245.047.047.053.116.032.068.052.062.021.064.052.040

.033.047.164.034.020.019.016.107.017.184.022.042.009.050.019.024.098.290.020.075

.389.161

SARS-Pos-54SARS-Pos-55总SARS-NegSARS-Pos平均OD SARS-NegSARS-PosSD oD SARS-NegSARS-Pos截止值(平均Neg+3SD)总TN总FP总TP总FNSens＝Spec＝

.001.0012255.030.019.041.035.1552111541.8％95.5％

.0190132255.056.076.037.146.1672115509.1％95.5％

.0331.5352255.075.579.046.545.211220352063.6％100％

.029.0152255.058.080.091.131.3322113525.5％95.5％

.027.0162255.039.025.018.022.0932201541.8％100％

.027.1622255.068.778.049.825.216220381769.1％100％

.0160212255.029.075.019.245.0882114517.3％95.5％

.375.0242255.031.224.020.330.091211282750.9％95.5％

.048.0502255.045.058.032.044.1412112533.6％95.5％

.011.0132255.033.055.043.075.1612115509.1％95.5％

1423.017.712.013.739.05614021291.3％100.0％

表2

来自用下列Seq ID no：的肽免疫的兔的血清	加入血清的重组N蛋白(1-49)(μg)	获得的信号
来自用下列Seq ID no：的肽免疫的兔的血清	加入血清的重组N蛋白(1-49)(μg)	获得的信号
37	0	1.446
37	0	1.446	37	1	1.237
136	0	1.555	37	1	1.237
136	0	1.555	136	1	0.774

表3

来自用下列免疫的兔的血清	获得的信号
来自用下列免疫的兔的血清	获得的信号	无血清(空白)	0.022
Seq ID no：37	0.023	无血清(空白)	0.022
Seq ID no：37	0.023	Seq ID no：37	0.025
Seq ID no：136	1.573	Seq ID no：37	0.025
Seq ID no：136	1.573	Seq ID no：136	1.598

序列表

<110>亚特斯公司

<120>用于检测与严重的急性呼吸综合征(SARS)相关的冠状病毒的肽及其混合物

<130>010349-0004

<140>

<141>

<150>CA 2.441.677

<151>2003-09-23

<150>CA 2.428.443

<151>2003-05-09

<160>140

<170>PatentIn Vers.2.0

<210>1

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>1

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn

5 10 15

Ser Val Leu Leu Phe

20

<210>2

<211>27

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>2

Ser Leu Val Lys Pro Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

5 10 15

Leu Asn Ser Ser Glu Gly Val Pro Asp Leu Leu Val

20 25

<210>3

<211>27

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>3

Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Ser Thr Thr Phe Asp Asp

5 10 15

Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser

20 25

<210>4

<211>23

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>4

Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile

5 10 15

Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu

20

<210>5

<211>24

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>5

Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe

5 10 15

Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln

20

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>6

Phe Glu Leu Ser Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met

5 10 15

Gly Thr Gln Thr His

20

<210>7

<211>29

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>7

Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys

5 10 15

His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu

20 25

<210>8

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>8

Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn

5 10 15

Gly Thr Ile Thr Asp Ala

20

<210>9

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>9

Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys

5 10 15

Ile Ser Asn Ser Val Ala

20

<210>10

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>10

Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

5 10 15

Asp Phe Met Gly Ser Val

20

<210>11

<211>25

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>11

Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly

5 10 15

Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg

20 25

<210>12

<211>33

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>12

Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln

5 10 15

Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro

20 25 30

Lys Thr Ser

<210>13

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>13

Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys Ser Ile

5 10 15

Val Ala Tyr Thr Met Ser

20

<210>14

<211>28

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>14

Ser Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe

5 10 15

Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys

20 25

<210>15

<211>29

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>15

Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe

5 10 15

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys

20 25

<210>16

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>16

Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala

5 10 15

Asn Gln Phe Asn Lys Ala

20

<210>17

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>17

Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln

5 10 15

Ile Gln Glu Ser Leu

20

<210>18

<211>31

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>18

Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr

5 10 15

Ala Pro Ala Ile Ser His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu

20 25 30

Gly

<210>19

<211>33

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>19

Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu

5 10 15

Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His

20 25 30

Thr Ser Pro

<210>20

<211>23

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>20

Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn

5 10 15

Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu

20

<210>21

<211>30

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>21

Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr

5 10 15

Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile

20 25 30

<210>22

<211>30

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>22

Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr

5 10 15

Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile

20 25 30

<210>23

<211>18

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>23

Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile

5 10 15

Ile Lys Leu

<210>24

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>24

Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu

5 10 15

Thr Asn Ile Leu Leu

20

<210>25

<211>14

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>25

Ile Val Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly

5 10

<210>26

<211>18

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>26

Gly His Ser Leu Gly Arg Ser Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu

5 10 15

Ile Thr Val

<210>27

<211>22

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>27

Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp

5 10 15

His Ala Gly Ser Asn Asp Asn

20

<210>28

<21l>34

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>28

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg

5 10 15

Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn

20 25 30

Gly Gly Arg Asn

<210>29

<211>31

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>29

Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn

5 10 15

Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly

20 25 30

Leu

<210>30

<211>31

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>30

Ile Asn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg

5 10 15

Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu

20 25 30

Leu

<210>31

<211>28

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>31

Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr

5 10 15

Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu

20 25

<210>32

<211>28

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>32

Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn

5 10 15

Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg

20 25

<210>33

<211>38

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>33

Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser

5 10 15

Ala Ala 3lu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr

20 25 30

Lys Gln Tyr Asn Val Thr Gln Ala

35

<210>34

<211>19

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>34

Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn

5 10 15

Val Thr Gln Ala

<210>35

<211>27

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>35

Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

5 10 15

Gln Asp Ieu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His

20 25

<210>36

<211>13

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>36

Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val

5 10

<210>37

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>37

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro

5 10 15

Gln Arg Gln Lys Lys Gln

20

<210>38

<211>31

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>38

Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Ala Glu Ser Glu Glu Glu Glu Ile

5 10 15

Asp Glu Thr Ser Glu His Glu Tyr Gly Thr Glu Asp Asp Tyr Gln

20 25 30

Gly

<210>39

<211>31

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>39

Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Ala Glu Cys Glu Glu Glu Glu Ile

5 10 15

Asp Glu Thr Cys Glu His Glu Tyr Gly Thr Glu Asp Asp Tyr Gln

20 25 30

Gly

<210>40

<211>33

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>40

Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Trp Leu Asp Asp Thr Thr Glu

5 10 15

Gln Ser Glu Ile Glu Pro Glu Pro Glu Pro Thr Pro Glu Glu Pro

20 25 30

Val Asn Gln

<210>41

<211>16

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>41

Asn Gly Ala Met Gln Lys Glu Ser Asp Asp Tyr Ile Lys Leu Asn

5 10 15

Gly

<210>42

<211>23

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>42

Ala Pro Lys Gln Glu Glu Pro Pro Asn Thr Glu Asp Ser Lys Thr

5 10 15

Glu Glu Lys Ser Val Val Gln Lys

20

<210>43

<211>25

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>43

Glu Glu Thr Arg Lys Leu Met Pro Ile Ser Met Asp Val Arg Ala

5 10 15

Ile Met Ala Thr Ile Gln Arg Lys Tyr Lys

20 25

<210>44

<211>32

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>44

Ser Ser Lys Thr Ser Glu Glu His Phe Val Glu Thr Val Ser Leu

5 10 15

Ala Gly Ser Tyr Arg Asp Trp Ser Tyr Ser Gly Gln Arg Thr Glu

20 25 30

Leu Gly

<210>45

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>45

Thr Lys Lys Trp Lys Phe Pro Gln Val Gly Gly Leu Thr Ser Ile

5 10 15

Lys Trp Ala Asp Asn Asn

20

<210>46

<211>23

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>46

Glu Ile Glu Pro Lys Leu Asp Gly Tyr Tyr Lys Lys Asp Asn Ala

5 10 15

Tyr Tyr Thr Glu Gln Pro Ile Asp

20

<210>47

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>47

Glu Ser Gln Gln Pro Thr Ser Glu Glu Val Val Glu Asn Pro Thr

5 10 15

Ile Gln Lys Glu Val

20

<210>48

<211>18

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>48

Glu Asn Thr Ser Ile Thr Ile Lys Lys Pro Asn Glu Leu Ser Leu

5 10 15

Ala Leu Gly

<210>49

<211>12

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>49

Ala Lys Arg Leu Ala Gln Arg Val Phe Asn Asn Tyr

5 10

<210>50

<211>29

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>50

Thr Phe Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ile Arg Ala Ser Leu Pro

5 10 15

Thr Thr Ile Ala Lys Asn Ser Val Lys Ser Val Ala Lys Leu

20 25

<210>51

<211>11

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>51

Asn Tyr Val Lys Ser Pro Lys Phe Ser Lys Leu

5 10

<210>52

<211>10

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>52

Tyr Lys Arg Asn Arg Ala Thr Arg Val Glu

5 10

<210>53

<211>28

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>53

Arg Asp Leu Ser Leu Gln Phe Lys Arg Pro Ile Asn Pro Thr Asp

5 10 15

Gln Ser Ser Tyr Ile Val Asp Ser Val Ala Val Lys Asn

20 25

<210>54

<211>17

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>54

Leu Tyr Phe Asp Lys Ala Gly Gln Lys Thr Tyr Glu Arg His Pro

5 10 15

Leu Ser

<210>55

<211>15

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>55

Val Asn Leu Asp Asn Leu Arg Ala Asn Asn Thr Lys Gly Ser Leu

5 10 15

<210>56

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>56

Leu Ser Glu Gln Leu Arg Lys Gln Ile Arg Ser Ala Ala Lys Lys

5 10 15

Asn Asn Ile Pro Phe Arg

20

<210>57

<211>14

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>57

Arg Gly Gly Ser Tyr Lys Asn Asp Lys Ser Ser Pro Val Val

5 10

<210>58

<211>16

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>58

Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Glu Leu Arg Pro Asp Thr Arg Tyr Val

5 10 15

Leu

<210>59

<211>18

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>59

Leu Asn Asn Glu His Tyr Arg Ala Leu Ser Gly Val Phe Ser Gly

5 10 15

Val Asp Ala

<210>60

<211>10

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>60

Phe Phe Asn Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Val

5 10

<210>61

<211>42

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>61

Asp Thr Thr Ser Tyr Arg Glu Ala Ala Ser Ser His Leu Ala Lys

5 10 15

Ala Leu Asn Asp Phe Ser Asn Ser Gly Ala Asp Val Leu Tyr Gln

20 25 30

Pro Pro Gln Thr Ser Ile Thr Ser Ala Val Leu Gln

35 40

<210>62

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>62

Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His

5 10 15

Ser Phe Leu Val Gln Ala

20

<210>63

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>63

Lys Val Asp Thr Ser Asn Pro Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val

5 10 15

Arg Ile Gln Pro Gly Gln

20

<210>64

<211>21

<212>PRT

<211>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>64

Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu Pro Leu Thr Gln Asp

5 10 15

His Val Asp Ile Leu Gly

20

<210>65

<211>14

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>65

Ala Asp Thr Ser Leu Ser Gly Tyr Arg Leu Lys Asp Ser Val

5 10

<210>66

<211>11

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>66

Arg Thr Val Tyr Asp Asp Ala Ala Arg Arg Val

5 10

<210>67

<211>18

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>67

Asp Tyr Leu Val Ser Thr Gln Glu Phe Arg Tyr Met Asn Ser Gln

5 10 15

Gly Leu Leu

<210>68

<211>14

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>68

Gln Gln Leu Arg Val Glu Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln

5 10

<210>69

<211>9

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>69

Lys Asp Thr Thr Glu Ala Phe Glu Lys

5

<210>70

<211>17

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>70

Asp Ile Asn Arg Leu Ser Glu Glu Met Leu Asp Asn Arg Ala Thr

5 10 15

Leu Gln

<210>71

<211>26

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>71

Tyr Ala Thr Ala Gln Glu Ala Tyr Glu Gln Ala Val Ala Asn Gly

5 10 15

Asp Ser Glu Val Val Leu Lys Lys Leu Lys Lys

20 25

<210>72

<211>17

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>72

Ala Lys Ser Glu Phe Asp Arg Asp Ala Ala Met Gln Arg Lys Leu

5 10 15

Glu Lys

<210>73

<211>16

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>73

Tyr Lys Gln Ala Arg Ser Glu Asp Lys Arg Ala Lys Val Thr Ser

5 10 15

Ala

<210>74

<211>19

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>74

Leu Arg Lys Leu Asp Asn Asp Ala Leu Asn Asn Ile Ile Asn Asn

5 10 15

Ala Arg Asp Gly

<210>75

<211>17

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>75

Asp Tyr Gly Thr Tyr Lys Asn Thr Ser Asp Gly Asn Thr Phe Thr

5 10 15

Tyr Ala

<210>76

<211>26

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>76

Glu Ile Gln Gln Val Val Asp Ala Asp Ser Lys Ile Val Gln Leu

5 10 15

Ser Glu Ile Asn Met Asp Asn Ser Pro Asn Leu

20 25

<210>77

<211>11

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>77

Asn Asn Glu Leu Ser Pro Val Ala Leu Arg Gln

5 10

<210>79

<211>17

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>78

Asp Asp Asn Ala Leu Ala Tyr Tyr Asn Asn Ser Lys Gly Gly Arg

5 10 15

Phe Val

<210>79

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>79

Leu Ser Asp His Gln Asp Leu Lys Trp Ala Arg Phe Pro Lys Ser

5 10 15

Asp Gly Thr Gly Thr

20

<210>80

<211>24

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>80

Tyr Thr Glu Leu Glu Pro Pro Ser Arg Phe Val Thr Asp Thr Pro

5 10 15

Lys Gly Pro Lys Val Lys Tyr Leu Tyr

20

<210>81

<211>23

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>81

Ala Phe Ala Val Asp Pro Ala Lys Ala Tyr Lys Asp Tyr Leu Ala

5 10 15

Ser Gly Gly Gln Pro Ile Thr Asn

20

<210>82

<211>17

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>82

Thr Val Thr Pro Glu Ala Asn Met Asp Gln Glu Ser Phe Gly Gly

5 10 15

Ala Ser

<210>83

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>83

Arg Ser His Ile Asp His Pro Asn Pro Lys Gly Phe Ser Asp Leu

5 10 15

Lys Gly Lys Tyr Val

20

<210>84

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>84

Arg Cys His Ile Asp His Pro Asn Pro Lys Gly Phe Cys Asp Leu

5 10 15

Lys Gly Lys Tyr Val

20

<210>85

<211>9

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>85

Asp Gln Leu Arg Glu Pro Leu Met Gln

5

<210>86

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>86

Lys Thr Asn Ser Ser Arg Phe Gln Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn

5 10 15

Leu Leu Asp Ser Tyr

20

<210>87

<211>22

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>87

Val Val Lys Arg His Thr Met Ser Asn Tyr Gln His Glu Glu Thr

5 10 15

Ile Tyr Asn Leu Val Lys Asp

20

<210>88

<211>13

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>88

Val Pro His Ile Ser Arg Gln Arg Leu Thr Lys Tyr Thr

5 10

<210>89

<21>)25

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>89

Asp Asp Asp Tyr Phe Asn Lys Lys Asp Trp Tyr Asp Phe Val Glu

5 10 15

Asn Pro Asp Ile Leu Arg Val Tyr Ala Asn

20 25

<210>90

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>90

Thr Leu Asp Asn Gln Asp Leu Asn Gly Asn Trp Tyr Asp Phe Gly

5 10 15

Asp Phe Val Gln Val

20

<210>91

<211>26

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>91

Lys Tyr Asp Phe Thr Glu Glu Arg Leu Ser Leu Phe Asp Arg Tyr

5 10 15

Phe Lys Tyr Trp Asp Gln Thr Tyr His Pro Asn

20 25

<210>92

<211>25

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>92

Asn Asn Val Ala Phe Gln Thr Val Lys Pro Gly Asn Phe Asn Lys

5 10 15

Asp Phe Tyr Asp Phe Ala Val Ser Lys Gly

20 25

<210>93

<211>18

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>93

Asp Gly Asn Ala Ala Ile Ser Asp Tyr Asp Tyr Tyr Arg Tyr Asn

5 10 15

Leu Pro Thr

<210>94

<211>27

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>94

Tyr Tyr Asp Ser Met Ser Tyr Glu Asp Gln Asp Ala Leu Phe Ala

5 10 15

Tyr Thr Lys Arg Asn Val Ile Pro Thr Ile Thr Gln

20 25

<210>95

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>95

Asn Leu Lys Tyr Ala Ile Ser Ala Lys Asn Arg Ala Arg Thr Val

5 10 15

Ala Gly Val Ser Ile

20

<210>96

<211>17

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>96

Thr Asn Arg Gln Phe His Gln Lys Leu Leu Lys Ser Ile Ala Ala

5 10 15

Thr Arg

<210>97

<211>22

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>97

Val Leu Ala Arg Lys His Asn Thr Ser Ser Asn Leu Ser His Arg

5 10 15

Phe Tyr Arg Leu Ala Asn Glu

20

<210>98

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>98

Leu Tyr Arg Asn Arg Asp Val Asp His Glu Phe Val Asp Glu Phe

5 10 15

Tyr Ala Tyr Leu Arg Lys

20

<210>99

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>99

Lys Gln Gly Asp Asp Tyr Val Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Pro Ser

5 10 15

Arg Ile Leu Gly Ala Gly

20

<210>100

<211>26

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>100

Asp Ala Tyr Pro Leu Thr Lys His Pro Asn Gln Glu Tyr Ala Asp

5 10 15

Val Phe His Leu Tyr Leu Gln Tyr Ile Arg Lys

20 25

<210>101

<211>17

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>101

Leu Thr Asn Asp Asn Thr Ser Arg Tyr Trp Glu Pro Glu Phe Tyr

5 10 15

Glu Ala

<210>102

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>102

Tyr Ser Lys Ser His Lys Pro Pro Ile Ser Phe Pro Leu Ser Ala

5 10 15

Asn Gly Gln Val Phe Gly

20

<210>103

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>103

Tyr Cys Lys Ser His Lys Pro Pro Ile Ser Phe Pro Leu Cys Ala

5 10 15

Asn Gly Gln Val Phe Gly

20

<210>104

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>104

Lys Leu Phe Ala Ala Glu Thr Leu Lys Ala Thr Glu Glu Thr Phe

5 10 15

Lys Leu Ser Tyr Gly

20

<210>105

<211>21

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>105

Ile Ala Thr Val Arg Glu Val Leu Ser Asp Arg Glu Leu His Leu

5 10 15

Ser Trp Glu Val Gly Lys

20

<210>106

<211>32

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>106

Lys Pro Arg Pro Pro Leu Asn Arg Asn Tyr Val Phe Thr Gly Tyr

5 10 15

Arg Val Thr Lys Asn Ser Lys Val Gln Ile Gly Glu Tyr Thr Phe

20 25 30

Glu Lys

<210>107

<211>18

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>107

Gly Glu Tyr Thr Phe Glu Lys Gly Asp Tyr Gly Asp Ala Val Val

5 10 15

Tyr Arg Gly

<210>108

<211>25

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>108

Leu Asn Ile Ser Asp Glu Phe Ser Ser Asn Val Ala Asn Tyr Gln

5 10 15

Lys Val Gly Met Gln Lys Tyr Ser Thr Leu

20 25

<210>109

<211>22

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>109

Asp Asn Lys Leu Lys Ala His Lys Asp Lys Ser Ala Gln Ser Phe

5 10 15

Lys Met Phe Tyr Lys Gly Val

20

<210>110

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>110

Thr Arg Asn Pro Ala Trp Arg Lys Ala Val Phe Ile Ser Pro Tyr

5 10 15

Asn Ser Gln Asn Ala

20

<210>111

<211>30

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>111

Gln Thr Val Asp Ser Ser Gln Gly Ser Glu Tyr Asp Tyr Val Ile

5 10 15

Phe Thr Gln Thr Thr Glu Thr Ala His Ser Ser Asn Val Asn Arg

20 25 30

<210>112

<211>25

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>112

Ser Asp Arg Asp Leu Tyr Asp Lys Leu Gln Phe Thr Ser Leu Glu

5 10 15

Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Gln

20 25

<210>113

<211>16

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>113

Asp Ile Pro Gly Ile Pro Lys Asp Met Thr Tyr Arg Arg Leu Ile

5 10 15

Ser

<210>114

<211>23

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>114

Gly Tyr Val Asp Thr Glu Asn Asn Thr Glu Phe Thr Arg Val Asn

5 10 15

Ala Lys Pro Pro Pro Gly Asp Gln

20

<210>115

<211>10

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>115

Gly Asn Leu Gln Ser Asn His Asp Gln His

5 10

<210>116

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>116

Tyr Asp Ala Gln Pro Ser Ser Asp Lys Ala Tyr Lys Ile Glu Glu

5 10 15

Leu Phe Tyr Ser Tyr

20

<210>117

<211>24

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>117

Asp Lys Phe Thr Asp Gly Val Ser Leu Phe Trp Asn Ser Asn Val

5 10 15

Asp Arg Tyr Pro Ala Asn Ala Ile Val

20

<210>118

<211>24

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>118

Asp Lys Phe Thr Asp Gly Val Cys Leu Phe TrP Asn Cys Asn Val

5 10 15

Asp Arg Tyr Pro Ala Asn Ala Ile Val

20

<210>119

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>119

Tyr Tyr Ser Asp Ser Pro Ser Glu Ser His Gly Lys Gln Val Val

5 10 15

Ser Asp Ile Asp Tyr

20

<210>120

<211>22

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>120

Asn Leu Gly Gly Ala Val Ser Arg His His Ala Asn Glu Tyr Arg

5 10 15

Gln Tyr Leu Asp Ala Tyr Asn

20

<210>121

<211>13

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>121

Ile Tyr Lys Gln Phe Asp Thr Tyr Asn Leu Trp Asn Thr

5 10

<210>122

<211>14

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>122

Asp Val Glu Ile Phe Glu Asn Lys Thr Thr Leu Pro Val Asn

5 10

<210>123

<211>19

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>123

Glu Leu Trp Ala Lys Arg Asn Ile Lys Pro Val Pro Glu Ile Lys

5 10 15

Leu Asn Asn Leu

<210>124

<211>20

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>124

Asn Thr Val Ile Trp Asp Tyr Lys Arg Glu Ala Pro Ala His Val

5 10 15

Ser Thr Ile Gly Val

20

<210>125

<211>16

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>125

Thr Asp Ile Ala Lys Lys Pro Thr Glu Ser Ala Ser Ser Ser Leu

5 10 15

Thr

<210>126

<211>44

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>126

Val Leu Phe Asp Gly Arg Val Glu Gly Gln Val Asp Leu Phe Arg

5 10 15

Asn Ala Arg Asn Gly Val Leu Ile Thr Glu Gly Ser Val Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Pro Ser Lys Gly Pro Ala Gln Ala Ser Val Asn Gly

35 40

<210>127

<211>19

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>127

Thr Leu Ile Gly Glu Ser Val Lys Thr Gln Phe Asn Tyr Phe Lys

5 10 15

Lys Val Asp Gly

<210>128

<211>22

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>128

Glu Thr Tyr Phe Thr Gln Ser Arg Asp Leu Glu Asp Phe Lys Pro

5 10 15

Arg Ser Gln Met Glu Thr Asp

20

<210>129

<211>13

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>129

Asp Glu Phe Ile Gln Arg Tyr Lys Leu Glu Gly Tyr Ala

5 10

<210>130

<211>35

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>130

Ala Lys Arg Ser Gln Asp Ser Pro Leu Lys Leu Glu Asp Phe Ile

5 10 15

Pro Met Asp Ser Thr Val Lys Asn Tyr Phe Ile Thr Asp Ala Gln

20 25 30

Thr Gly Ser Ser Lys

35

<210>131

<211>16

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>131

Leu Trp Ser Lys Asp Gly His Val Glu Thr Phe Tyr Pro Lys Leu

5 10 15

Gln

<210>132

<211>24

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>132

Asn Leu Tyr Lys Met Gln Arg Met Leu Leu Glu Lys Ser Asp Leu

5 10 15

Gln Asn Tyr Gly Glu Asn Ala Val Ile

20

<210>133

<211>22

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>133

Tyr Asp Pro Arg Thr Lys His Val Thr Lys Glu Asn Asp Ser Lys

5 10 15

Glu Gly Phe Phe Thr Tyr Leu

20

<210>134

<211>35

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>134

Asn Tyr Leu Gly Lys Pro Lys Glu Gln Ile Asp Gly Tyr Thr Met

5 10 15

His Ala Asn Tyr Ile Phe Trp Arg Asn Thr Asn Pro Ile Gln Leu

20 25 30

Ser Ser Tyr Ser Leu

35

<210>135

<211>30

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>135

Ser Leu Lys Glu Asn Gln Ile Asn Asp Met Ile Tyr Ser Leu Leu

5 10 15

Glu Lys Gly Arg Leu Ile Ile Arg Glu Asn Asn Arg Val Val Val

20 25 30

<210>136

<211>32

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>136

Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu

5 10 15

Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His

20 25 30

Thr Ser

<210>137

<211>33

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>137

Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg ser Ala Pro Arg Ile

5 10 15

Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Arg Asn

<210>138

<211>41

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>138

Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys

5 10 15

Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys

20 25 30

Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp

35 40

<210>139

<211>41

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>139

Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile

5 10 15

Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg

35 40

<210>140

<211>41

<212>PRT

<213>与严重的急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)

<400>140

Ser Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro

5 10 15

Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr

20 25 30

Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu

35 40

权利要求书

(按照条约第19条的修改)

1.一种分离的肽，所述肽包括选自SEQ ID NOS：3-22，28-37和136-140的氨基酸序列，及其类似物。

2.一种具有式a--X--c--Z--b的分离的肽，其中：X和Z具有独立地选自SEQ ID NOS：3-22，28-37和136-140的氨基酸序列，及其类似物，并且其中：

3.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NOS：3，19，22，28，31，37，136，137，138，139和140，及其类似物。

4.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：3或其类似物组成。

5.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：19或其类似物组成。

6.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：22或其类似物组成。

7.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：28或其类似物组成。

8.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：31或其类似物组成。

9.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：37

Claims

1.一种分离的肽，所述肽包括选自SEQ ID NOS：1-4，6-16，18-22，24-33，35-41，43-62，64-73，75-77，79-81，83-100，102-105，107-113，115-118，120-127和129-140的氨基酸序列，及其类似物。2.一种具有式a--X--c--Z--b的分离的肽，其中：

X和Z具有独立地选自SEQ ID NOS：1-4，6-16，18-22，24-33，35-41，43-62，64-73，75-77，79-81，83-100，102-105，107-113，115-118，120-127和129-140的氨基酸序列，及其类似物，并且其中：

9.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：37或其类似物组成。

10.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：136或其类似物组成。

11.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：137或其类似物组成。

12.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：138或其类似物组成。

13.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：139或其类似物组成。

14.按照权利要求1或2的分离的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：140或其类似物组成。

15.一种混合物，其包括至少两种如权利要求1-14任一项限定的肽或其类似物。

16.一种抗体，其特异性结合于如权利要求1-14任一项所限定的肽或其类似物或如权利要求15所限定的混合物。

17.权利要求16的抗体，其特征在于所述抗体由单克隆抗体或多克隆抗体组成。

18.一种混合物，其包括至少两种在权利要求16或17中限定的抗体。

19.一种检测指示SARS-CoV的抗体的存在或缺乏的体外诊断方法，所述抗体结合于按照权利要求1-14任一项的肽或其类似物从而形成免疫复合物，所述方法包括如下步骤：

a)使按照权利要求1-14任一项的肽或其类似物与生物样品接触一段时间并在足够形成免疫复合物的条件下；和

b)检测在a)中形成的免疫复合物的存在或缺乏。

20.一种检测指示SARS-CoV的抗体的存在或缺乏的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

-按照权利要求1-14任一项的肽或其类似物和

-检测肽-抗体免疫复合物的试剂；

其中所述肽或其类似物、试剂、生物参比样品和比较样品以足够进行所述检测的量存在。

21.权利要求19的试剂盒，其还包括：-检测肽-抗体免疫复合物的试剂和/或缺乏与所述肽或其类似物免疫结合的抗体的生物参比样品，其中所述生物参比样品和比较样品以足够进行所述检测的量存在。

22.一种检测指示SARS-CoV的肽或蛋白质存在或缺乏的体外诊断方法，所述肽或蛋白质与按照权利要求16或17的抗体结合以形成免疫复合物，所述方法包括如下步骤：

a)使按照权利要求16或17的抗体与生物样品接触一段时间并在足够形成免疫复合物的条件下；和

b)检测在a)中形成的免疫复合物的存在或缺乏。

23.一种检测指示SARS-CoV的肽或蛋白质的存在或缺乏的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

-按照权利要求16或17的抗体和

-检测肽-抗体免疫复合物的试剂；其中所述抗体、试剂、生物参比样品和比较样品以足够进行所述检测的量存在。

24.权利要求23的试剂盒，其还包括缺乏与所述抗体免疫性结合的肽的生物参比样品和/或包括可与所述抗体特异性结合的肽的比较样品，其中所述生物参比样品和比较样品以足够进行所述检测的量存在。