CN1813070A - 核酸测序方法 - Google Patents

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Abstract

本发明记载了通过用与核酸分子暴露碱基形成Watson－Crick碱基配对的重元素取代的核苷酸碱基来碱基特异性标记核酸分子的暴露碱基，然后再用电子显微术例如透射电子显微术(TEM)或其它一些可分辨重元素取代的核苷酸碱基的方法，来对所标记的单链核酸分子成像，而确定至少一部分单链核酸分子序列的方法。分析成像以确定至少一部分核酸分子的碱基序列。

Description

  核酸测序方法
发明背景
核酸分子测序有多种方法。过去，最普通的方法是基于化学(Maxam和Gilbert测序)或酶(Sanger双脱氧测序和以外切核酸酶为基础的测序)反应，所述化学或酶反应产生特异性的截短核酸分子，随后将该分子通过电泳技术分离以确定它们的相对长度。最近，开发出了有潜力的较高通量技术，包括热测序法(pyrosequencing)和基于杂交的测序法。也有人提议将扫描隧道显微镜用于直接观测核酸分子的序列。
发明概述
本发明特征在于确定单链核酸分子至少一部分的序列的方法，所述方法使用与核酸分子的暴露碱基形成Watson-Crick型碱基对的重元素取代的核苷酸例如核苷酸碱基，而使核酸分子的暴露碱基进行碱基特异性标记，然后用电子显微镜例如透射电子显微镜(TEM)或可区分重元素取代核苷酸碱基的一些其它方法图像来使标记的单链核酸分子成像。分析图像，以确定至少一部分核酸分子的碱基序列。
要产生核酸分子的一部分的合适成像，将单链核酸分子置于支持薄膜(film)上，优选处于延展状态，以使碱基间隔大于0.5nm(或至少0.6或0.7nm)。接着，该延展分子暴露于一个或多个可用合适显像技术，例如TEM，区分的碱基特异性标记。碱基特异性标记是四种不同的修饰核苷酸，例如核苷酸碱基(腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))，它们中的每个都包括一个不同的含重元素的基团。这些修饰的核苷酸或核酸碱基按照一般Watson-Crick碱基配对规则(A-T或A-U和G-C)，与延展的单链核酸分子中的暴露碱基形成碱基配对。此外，非A，G，C，和T或U的核苷酸碱基(例如，互换的或修饰的核苷酸碱基)也可以使用，只要它们能选择性与单链核酸分子中的核苷酸碱基配对。在一些具体实施方式中，碱基特异性标记通常是嘌呤或嘧啶碱基，例如核苷酸碱基。在其它具体实施方式中，可以使用核苷(碱基和核糖)或核苷酸(碱基，核糖，和一个或多个磷酸)。
用于成像的TEM可以任选装备一个倾斜(tilt)成像系统。相差TEM和复杂TEM都可以基于电子散射强度，例如通过定量电子散射，用于标记核酸分子成像和区分重元素标记的碱基。电子显微镜成像可以用软件来分析，以区分含有重元素基团内的重元素或重元素组。当重元素或重元素组可以用这些软件区分时，显微镜测得的电子散射强度就可以用作定量测量重元素或重元素组的基础，碱基就可鉴别。
用于在含有重元素的基团内修饰核苷酸碱基的重元素，优选电子散射强度足够被电子显微镜检测的那些元素。例如原子数大于20，优选原子数等于或大于25的那些元素，如金属和卤素，适于用作本发明方法中的重元素。标记也可以包括其中一些或所有原子的原子数小于20或25、但是在整体上该标记能被电子显微镜检测的一组原子。为了能区分不同修饰的核苷酸碱基，每个碱基必须包括在原子数上能与每个其它的修饰的核苷酸碱基的含有重元素的基团原子数差别达15左右的含有重元素的基团。因此，要获得四种可区分的含有重元素的基团(四种核苷酸碱基每个一种)，理想的是使用原子数大于例如25的和原子数差别在大约15的四种不同重元素的组合。这样组合的实例包括：78Pt，63Eu，46Pd，和27Co；92U，76Os，46Pd，和26Fe；80Hg，64Gd，48Cd，和30Zn；以及89Ac，74W，42Mo，和25Mn。给定的含有重元素的基团可以包括两个或更多(2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更多)重元素原子，例如原子数大于25的原子，并且在单个基团内两个或更多个元素可以是相同或不同的。例如，特定的核苷酸碱基可以用含有两个溴原子和一个钴原子的基团标记。在含有重元素的基团包括多个重元素原子时，给定基团中重元素的总原子数量优选与每个其它的碱基特异性标记中原子的总数量差别在大约15。在某些具体实施方式中，标记可以包括两个(2，3，4，5，6，8，9，10，15，20或更多)原子数不大于25的原子。
将标记核酸分子成像，分析图像以确定碱基特异性标记的顺序从而确定至少部分分子的碱基序列。为了利于分析图像，优选将至少部分核酸分子伸展，例如核糖-磷酸骨架没有发生自身交叉。这可以通过将核酸分子以延展状态置于支持薄膜上然后将延展的核酸分子固定在薄膜支持物上获得，或者可以通过在核酸分子固定在支持物上时伸展核酸分子获得。在核酸分子没有充分伸展时，例如在分子中包括至少一个由核酸骨架自身交叉所形成的环时，用，例如优选的倾斜成像系统时将获得不同倾斜角的多个图像。以此方式将可能收集深度信息。然后使用成像处理技术跟踪骨架，这样来确定核酸分子的碱基顺序。核酸分子优选在置于支持物薄膜上并延伸后标记。
在一实施例中，重元素取代的A用钯标记(原子数46)，重元素取代的C用铕标记(原子数63)，重元素取代的G用铂标记(原子数78)，以及重元素取代的U用钴标记(原子数27)。将这四种重元素标记的碱基与在支持物表面上的单链核酸分子(DNA或RNA)接触。重元素取代的碱基与单链核酸分子中的T(或U)，G，C，和A选择性形成碱基对。除去未碱基配对的重元素标记碱基，例如将其洗去。所剩下的标记核苷酸中的重元素作为报告子，可用TEM辨别。这样，如果在TEM图像上给定位置分辨出是铂原子，那么这表示Pt标记的G出现在该位置上，单链DNA的相应碱基是C。通过分辨其它三种碱基各自金属原子的电子散射，可以类似地确定其它三种碱基。当然，可以用其它的标记，例如，A用三个钯原子标记，C用三个铕原子标记，G用三个铂原子标记，以及U用三个钴原子标记。
本发明特征在于确定核酸分子中多个碱基的序列的方法，包括：(a)提供载有包含多个碱基的单链核酸分子的支持物表面，其中该多个碱基中的每一个用四种不同碱基特异性标记中的一种进行了标记；(b)用电子显微镜检测那些已碱基特异性标记的碱基；以及(c)分析所检测的碱基特异性标记的碱基，以确定核酸分子序列。
在各种具体实施方式中：每个碱基特异性标记包括至少一个原子数大于25的原子；每个碱基特异性标记包括两个或多个相同或不同、每个的原子数大于25的原子；每个碱基用四种碱基特异性标记之一进行标记，其中所述四种碱基特异性标记中的每个都包括原子数大于25的不同元素，而且每个原子数大于25的元素相比于每个其它的原子数大于25的元素其原子数差别至少15；每个碱基特异性标记包括一个或两个或更多原子数大于25的原子，而且每个碱基特异性标记中这样原子的整个原子数相比于每个其它碱基特异性标记的整个原子数差别至少15；所述元素选自下列元素构成的组：Pt，Eu，Pd，Co，U，Os，Fe，Hg，Gd，Cd，Zn，Ac，W，Mo，Cl，Br，I，At和Mn；以及四种碱基特异性标记由下列组成：(i)包括取代的腺嘌呤的标记，(ii)包括取代的尿嘧啶或取代的胸腺嘧啶的标记，(iii)包括取代胞嘧啶的标记，和(iv)包括取代的鸟嘌呤的标记。所述碱基在参与Watson-Crick碱基配对的位点上不被取代。在某些具体实施方式中，存在在碱基中参与Watson-Crick碱基配对的位点上通常可发现的基团。
在某些具体实施方式中，所用四种元素是：(i)Pt，Eu，Pd，和Co；(ii)U，Os，Pd和Fe；(iii)Hg，Gd，Cd和Zn；or(iv)Ac，W，Mo和Mn。
在各种具体实施方式中：取代的腺嘌呤的N7或N9用基团取代，所述基团包括原子数大于25的元素的至少一个原子；取代的鸟嘌呤的N7或N9用基团取代，所述基团包括原子数大于25的至少一个元素的至少一个原子；取代的胞嘧啶的N1用基团取代，所述基团包括原子数大于25的至少一个元素的至少一个原子；取代的尿嘧啶的N1用基团取代，所述基团包括原子数大于25的至少一个元素的至少一个原子；取代的胸腺嘧啶的N1用基团取代，所述基团包括原子数大于25的至少一个元素的至少一个原子；取代的腺嘌呤，其取代增加了与尿嘧啶或胸腺嘧啶Watson-Crick碱基配对的特异性；取代的胸腺嘧啶或取代的尿嘧啶，其取代增加了与腺嘌呤Watson-Crick型碱基配对的特异性；取代的胞嘧啶，其取代增加了与鸟嘌呤Watson-Crick型碱基配对的特异性；取代的鸟嘌呤，其取代增加了与胞嘧啶Watson-Crick型碱基配对的特异性；取代的腺嘌呤，其为在C2或C8，或C2和C8位置上取代；取代的胸腺嘧啶或取代的尿嘧啶，其在C5或C6，或C5和C6位置上取代；取代的胞嘧啶或取代的尿嘧啶，其在C5或C6，或C5和C6位置上取代；取代的鸟嘌呤，其在C2位置上取代；以及修饰是取代或未取代的烷基或卤素。
在各种具体实施方式中：核酸分子的3’核苷酸或5’核苷酸被共价连接在支持物表面的特定区；支持物表面的特定区用金包被；支持物表面载有多个单链核酸分子，其中每个核酸分子的3’核苷酸或5’核苷酸共价连接在支持物表面的特定区；多个核酸分子形成规则阵列；多个单链核酸分子中的每一个共价连接在支持物表面的不同特定区。
在某些具体实施方式中：每个碱基特异性标记包括至少两个(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，等等)原子数大于25的原子；一个或更多个碱基特异性标记包括至少两个原子数小于25的原子；原子数小于25的两个或更多个原子，其整个原子数大于25；每个碱基特异性标记包括选自下列的组的基团：B10I9COOH，C2B10I10，C2B10Br10，C2B10Cl10，C2B10F10。
在某些具体实施方式中：电子显微术是透射电子显微术；透射电子显微术包括使用Zernike相板(phase plate)位于物镜之后的透射电子显微镜；以及包括使用复杂电子显微镜的电子显微术。
本发明特征也在于确定核酸分子中多个碱基的序列的方法，包括：(a)提供载有包括多个碱基的单链核酸分子的支持物表面；(b)在没有氢键供体和受体，从而允许四种不同碱基特异性标记与多个碱基非共价结合的有机溶剂存在的情况下，将该单链核酸分子与四种不同碱基特异性标记进行接触；(c)用电子显微术检测碱基特异性标记的碱基；以及(d)分析所检测的碱基特异性标记的碱基，以确定核酸分子序列。
本发明特征也在于：取代的腺嘌呤，其中C2或C8位置用C1-C5烷基基团或卤素取代，并且N7或N9位置用包括原子数大于25的原子、或整体原子数大于25的原子组的基团取代；取代的鸟嘌呤，其中C8位置用C1-C5烷基基团或卤素取代，并且N7或N9位置用包括原子数大于25的原子、或整体原子数大于25的原子组的基团取代；取代的尿嘧啶，其中C5或C6位置用C1-C5烷基基团或卤素取代，并且N1位置用包括原子数大于25的原子、或整体原子数大于25的原子组的基团取代；以及取代的胞嘧啶，其中C5或C6位置用C1-C5烷基基团或卤素取代，并且N1位置用包括原子数大于25的原子、或整体原子数大于25的原子组的基团取代。
在各种具体实施方式中，原子数大于25的元素选自由下列组成的组：Pt，Eu，Pd，Co，U，Os，Fe，Hg，Gd，Cd，Zn，Ac，W，Mo，CI，Br，I，At和Mn。
附图简述
图1是根据本发明一个实施方式，对核酸分子的一部分测序的示意图。
图2是载有延展的核酸分子的阵列的支持物的示意图。
详细说明
图1是根据本发明一个实施方式的对核酸分子一部分测序的示意图。获得DNA分子10。分子变性，以获得单链20。将该单链转化成延展形式30，其被置于薄膜支持物40上，或者将该单链先固定在薄膜支持物上，之后再延展。支持物上的延展的分子暴露于重元素标记的核苷酸碱基50(A°，T°，G°，C°)，该标记的核苷酸碱基可与延展分子中的暴露的碱基60选择性碱基配对。TEM被用于使所获碱基特异性标记的分子成像，重元素标记的核苷酸碱基根据出现在重元素标记的核苷酸碱基中的重元素原子数，显示出不同强度的一系列点70。分析成像80，以确定点的强度，而确定核酸分子中碱基的顺序。
携带延展的核酸分子的支持物的制备
将要分析的核酸分子置于适合电子显微术成像的样品支持物上(即，EM或TEM栅格)。应该选择支持物，以避免与背景发射(shot)噪音相关的背景噪音问题及由支持物产生的雾(fog)。背景发射噪音可以通过增加电子束剂量而降低，而雾则可以通过使用薄支持物来减少。样品支持物优选可以牢固承载单链核酸分子的薄膜(thin film)，其足够强韧可以耐受强电子束辐射，且由不显著分散EM或TEM所使用的电子束的轻元素制成。
碳薄膜和铝薄膜可用于固定用于EM或TEM成像的核酸分子。然而，这些膜能产生强烈的背景雾。另外，这些膜往往会降低以碱基对键合的标记重元素的对比度。由脂质或变性天然蛋白(例如，白蛋白和酪蛋白)或合成人工蛋白(例如，聚赖氨酸)制成的有机支持物膜通常更有用。一旦支持物膜制备好，就将其转移至TEM栅格。
结合及延展以一端附在表面上的核酸分子，有多种合适的方法。例如，将盖玻片置于包含附着的DNA分子的液滴上。当液滴干燥时，弯液面降低，拉伸了与弯液面垂直的核酸分子(Bensimon et al.1995 Phys.Rev.Lett.74：4754)。此外，可以使用Langmuir-Blodgett膜法。这里，携带核酸分子的表面慢慢从缓冲液中退出，然后慢慢从缓冲液中拉出来(Michalet et al.1997Science 277：1518)。其它有用的延展方法包括：电子伸展(2002Ultramicroscopy 91：139)和旋转伸展(Yokota et al.1999 Anal.Chem.71：4418)。
未修饰的核酸分子可以以一端结合至多种表面。例如，将pH5.5MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)缓冲液中的核酸分子置于用含乙烯末端基团的硅烷包被的表面时，分子的一个或两个末端会自发与表面结合。通常，末端结合(相对于内部结合)在狭窄pH范围内(在例如聚苯乙烯、聚四氟乙烯树脂、和石墨的疏水表面大约0.2单位)发生，疏水表面上的最佳pH通常接近pH5.5(Allemand et al.1997 Biophysical Journal 73：2064)。
含有巯基基团的核酸分子可以以一端与金结合。例如，该方法在美国专利No.5,472,881中有记载(也参见Rongchao et al.2002 Nucl.Acids.Res.30：1558，以及1993 FEBS Lett.336：452)。以烷巯基或二硫化物为末端的核酸分子可以直接吸附于金。核酸分子可以在任何一端衍生使得5’端和3’端都可能固定。可以简单地将悬浮在缓冲液中的巯基化核酸分子暴露于金表面可能来达到特异性结合。该技术可以与电子伸展技术结合以获得一端固定在金锚点(anchor)上的延展的核酸分子(Namasivayam et al.2002 Anal.Chem.74：3378)。
碱基修饰以提高有机溶剂的溶解性和碱基配对的特异性
用附着于含有重元素的基团的标准核苷酸碱基或其衍生物进行碱基特异性标记。要增加碱基配对形成的特异性，可将核苷酸碱基或其衍生物暴露于在有机溶剂中的单链核酸分子。这是因为水性溶剂可竞争氢键结合位点，并干扰碱基配对形成。
在有机溶剂中溶解性增加的核苷酸碱基衍生物或以较高特异性形成碱基配对的核苷酸碱基衍生物可以用在本发明的方法中。四种核苷酸碱基描绘如下以便于理解碱基修饰。式I是腺嘌呤(A)。式II是尿嘧啶(U)。式III是鸟嘌呤(G)。式IV是胞嘧啶。胸腺嘧啶与尿嘧啶相同，除了在C5位置上是甲基而不是H。
由于碱基配对发生在有机溶剂中，修饰的碱基在有机溶剂中必须可溶。A在2-和8-位、G在8-位、以及U、C在5-和6-位的修饰都可以增加在有机溶剂中的溶解性。卤化和烷基化对提高配对结合选择性以及增加在有机溶剂中的溶解性都有作用。在碱基配对结合不受阻碍的位置用疏水烷基基团修饰预期可以增加有机溶剂的溶解性。修饰基团的实例包括乙基，丙基，和环己基。卤素和烷基基团有助于提高溶解入有机溶剂的能力以及改善配对结合形成的选择性。有机溶剂中溶解性的增加，也可以通过在A或G的7-位或9-位的氮原子以及U或C的1-位氮原子导入烷基等来实现。另外，用于标记的重元素复合物或其它基团取决于设计可以提高有机溶剂中的溶解性。要实现在有机溶剂中的较高溶解性，可将碱基用选自由下列组成的组的至少一个取代基部分取代：烷基基团，环己基基团，卤素基团，苯基，以及苯基。以腺嘌呤(A)为例，取代基位于2-和/或8-位。以鸟嘌呤(G)为例，取代基位于8-位。以尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)为例，取代基位于5-和/或6-位。当单个碱基有两个取代基时，它们在种类上可以相同、相似或不同。
式V描绘U-A Watson-Crick型碱基配对。式VI描绘C-G Watson-Crick型碱基配对。
Figure A20048001785500131
修饰的碱基可以用于增加碱基配对的特异性，例如相对正确G-C配对，它可以减少G-G，G-A，或G-U碱基配对形成。修饰也可以减少非Watson-Crick碱基配对的发生，即它可以减少Hoogstein碱基配对形成。要增加特异性，可将A，U，G，和C用卤素(例如Cl，Br，和I)、甲基、乙基、烷基(例如环己基)、氨基、或类似物修饰。修饰位点可以是A的2-和8-位点，G的8-位点，U和C的5-和6-位点。例如，A和G在8-位的卤化、A在2-位的氨基化、U和C在5-位的卤化可增强配对结合，增强选择性。
A在2-位和8-位，G在8-位，以及U(T)和C在2-和5-位的取代包括：卤素，取代或非取代的C1-C12烷基，取代或非取代的C3-C10环烷基，取代或非取代的C2-C12烯基，取代或非取代的C5-C12环烯基，取代或非取代的C2-C12炔基，氨基，以及-NH(C1-C6烷基)。
本文所用的术语“卤”或“卤素”是指氟，氯，溴，碘任一基团。
术语“烷基”是指含有所示碳原子数的直链或支链碳氢链。例如，C1-C12烷基表示基团其中可以含有1-12个(含1个及12个)碳原子。术语“卤烷”是指其中一个或多个氢原子被卤素取代的烷基，包括其中所有氢原子被卤素取代的烷基部分(例如全氟烷)。
用在本文中的术语“环烯”包括部分非饱和、非芳香族的环、二环、三环或多环的有5-12个碳原子优选5-8个碳原子的烃基，其中可取代的任何环原子可被取代基取代。环烷基部分的实例包括但不限于环己烯，环己二烯，或降冰片烯。
术语“取代基”是指在烷基，环烷基，烯基，炔基，杂环烷基，杂环烯基，环烯基，芳基，或杂芳基任一原子上的取代基团。合适的取代基包括但不限于，烷基，烯基，炔基，烷氧基，酰氧基，卤素，羟基，氰基，硝基，氨基，SO3H，硫酸基，磷酸基，全氟烷基，全氟烷氧基，亚甲二氧基，亚乙二氧基，羧基，氧代，硫代，亚氨(烷基，芳基，芳烷基)，S(O)n烷基(其中n是0-2)，S(O)n芳基(其中n是0-2)，S(O)n杂芳基(其中n是0-2)，S(O)n杂环烷基(其中n是0-2)，胺(单-，二-，烷基，环烷基，芳烷基，杂芳烷基，及其组合)，酯(烷基，芳烷基，杂芳烷基)，酰胺(单-，二-，烷基，芳烷基，杂芳烷基，及其组合)，磺胺化合物(单-，二-，烷基，杂烷基，杂芳烷基，及其组合)，未取代的芳基，未取代的杂芳基，未取代的杂环烷基，以及未取代的环烷基。在某方面，基团取代基可以独立地是前述取代基的任一单个取代基，也可以是它们的任意组合。
有用的修饰碱基包括：8-溴嘌呤，2，6-二氨嘌呤，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，以及5-烷基尿嘧啶。为增强碱基配对形成的选择性，将甲基导入尿嘧啶的5-位，就形成了胸腺嘧啶。相应地，根据本发明胸腺嘧啶衍生物也包含在尿嘧啶衍生物中。
碱基配对条件
将重元素或其它标记碱基与单链核酸分子在有机溶剂存在的情况下接触，有机溶剂优选缺少氢键供体和受体的有机溶剂。介电常数相对较高且缺少氢键供体或受体的离子液体极性溶剂可迅速溶解重元素标记的碱基且不会干扰碱基特异结合。因此，离子液体，例如由阳离子(咪唑鎓，吡咯鎓，吡啶鎓，磷鎓)和阴离子(硼酸盐，硫酸盐，磺酸盐，酰胺，亚胺，卤化物)组合制成的有机盐是有用的溶剂。
介电常数在10以下的有机溶剂也是有用的。这样的溶剂包括：氯仿，庚烷，环已烷，四氯化碳，乙腈，苯胺，乙胺，甲酚，醋酸，三氯乙酸，二甲醚，二乙醚，甲苯，甲苯胺，苄胺，苯酚，癸醇，苯，喹啉，吗啉，二甲胺，氯苯，二氯甲烷，二氯乙烯，四氢呋喃，三氯乙烯，二氯苯，氟苯，溴苯，戊醇，硅氧烷，以及甘油酯。将一种或多种重元素标记的碱基溶解在包括至少一种有机溶剂的溶剂或溶剂混合物中，然后施于附着在支持物胶片上的核酸分子。非极性或低极性的有机溶剂有助于特异的碱基配对。然而，极性溶剂，例如氯仿，甲苯，苯胺，以及戊醇，对溶解碱基特异性标记有用。通常，可以使用任意合适的相对的非氢键键合溶剂。在给定情况下，优选的溶剂或溶剂混合物取决于给定标记反应中的特定碱基特异性标记。
重元素标记
每个碱基或碱基衍生物优选用耐有机溶剂且耐由电子轰击引起的质量损失的重元素复合物标记。对A和G(或A和G衍生物)来说，重元素复合物优选在N7或N9键合，例如共价键合。对U(或T)和C(或U或T和C的衍生物)来说，重元素复合物优选在N1键合，例如共价键合。当然，在A或G的N7和N9位而不是N7或N9位连接含有重元素的基团，这也是可能的。在这种情况下，可以增加重元素原子数量。由此，增强了TEM图像分辨率和对比度而提高了对碱基的区分。合成带有重元素标记的核苷酸的方法是本领域已知的(参见例如，Moudrianakis and Beer，1965 Proc.Natl.Acad.Sci.USA53：564；Beer et al.1978/1979 Chemica Scripta 14：263；and Commerford 1993Biochemistry 10：1993)。
合适的重元素复合物包括胺复合物，苯复合物，金属茂复合物，烯烃复合物，以及许多其它复合物。当重元素复合物与碱基键合时，重元素复合物可以通过金属元素与碱基中的氮直接配位而获得。此外，重元素复合物可以通过所称的接头或衔接子，例如聚亚甲基链或聚氧化烯链，与碱基中的氮键合。
重元素复合物优选包括金属或卤素，所述金属或卤素的电子散射强度足够由例如TEM的技术检测。因此，重元素复合物优选包括原子数大于25，优选大于30的至少一个金属或卤素原子。合适的金属和卤素原子包括：Pt，Eu，Pd，Co，U，Os，Fe，Hg，Gd，Cd，Zn，Ac，W，Mo，Cl，Br，I和Mn。由于四种不同标记的碱基中每个被电子显微术或类似方法区分这一点很重要，所以用在四种不同标记的碱基中的每一个中的重原子优选原子数差别至少10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25或更多。原子数足够差别的重原子的任何组合，都可以用作四种不同标记的碱基。合适的组合包括：Pt，Eu，Pd和Co；U，Os，Pd和Fe；Hg，Gd，Cd和Zn；以及Ac，W，Mo和Mn。任何原子都可以用于与任何碱基的组合，只要四种原子原子数有足够差别。
用于本发明的重元素复合物并不限于其中每个分子包括一个原子数大于25的原子的重元素复合物。包括多个原子数大于25的原子的复合物也可以使用。这些复合物的使用优选元素或原子之间可区分及信号与背景之间可区分。包括多原子的这样的复合物的一个例子是其中一个分子包含两个重原子的双取代重元素复合物。另一个例子是包含三个重原子的三取代复合物。再一个例子是包括四个重原子的铁-硫簇(cluster)金属复合物。包括在一个复合物中的原子可以是相似或不相似的重元素。
为了基于整个原子数区分碱基，可以使用重卤素原子，例如碘和溴部分取代的碱基。例如，下列标记可以容易检测到：B10I9COOH，C2B10I10，C2B10Br10，C2B10Cl10，C2B10F10。
应该注意到，如果高频率碱基与较轻元素组合或者低频率碱基与较重元素组合，可以减少相互干扰。这样组合的例子包括：腺嘌呤-Pd，鸟嘌呤-Pt，胞嘧啶-Eu，尿嘧啶-Co以及腺嘌呤-Zn，鸟嘌呤-Hg，胞嘧啶-Gd，尿嘧啶-Cd。
结构式VII示意了与单链核酸分子中T碱基配对的Pd标记的A。
Figure A20048001785500161
结构式VIII示意了与单链核酸分子中G碱基配对的Eu标记的C。
结构式IX示意了与单链核酸分子中C碱基配对的Pt标记的G。
Figure A20048001785500172
结构式X示意了与单链核酸分子中A碱基配对的Co标记的U。
重元素簇可用作碱基特异性标记。使用重元素簇可增加成像对比度由此增加碱基分辨灵敏度和可靠性。由于重元素簇相当大而可使用低分辨率的成像方法。例如，低电压(例如，100kV)相差电子显微镜可以提供足够的分辨率。合适的重元素簇包括自然存在的铁-硫簇及其金属取代物。例如，在立方体(cubic)铁-硫簇(立方烷)中金属和硫原子在立方体的八个顶角交替配位而形成了具有四个重原子的簇。
某些重元素簇在水中不稳定。然而，它们可以与蛋白复合存在，例如，它们可以与铁氧化还原蛋白和氢化酶复合存在。重元素簇在有机溶剂中通常稳定。因此，用某些重元素簇标记的碱基，如果只接触有机溶剂则是稳定的。重元素簇可以直接或通过接头或衔接子与碱基连接。重元素簇的使用给产生碱基特异性标记提供了多种选择，因为任两个标记之间相关原子数差别是基于每个簇中重元素的整个原子数。例如，含有两个Fe原子(原子数26)和两个Mo原子(原子数42)的簇的相关整个原子数是136(2×26+2×42)。
结构式XI示意了半胱氨酸复合的重金属簇。
在未取代C与N9位取代G之间G-C碱基配对的稳定性，可以通过在G的C8或C2位氨基基团用电子吸引基团，例如NO2，O(氧代)，F(特别是在COH(甲酰基)取代而提高。
成像
有足够对比度和分辨率以执行原子数大于25左右的重元素的一个原子的定量元素分析的电子显微镜可以用于对标记的核酸分子成像。该系统应该能定量检测原子数差别在35或更少，优选30，25，20，15或更少的两个元素。
商业上可购得的TEM及TEM增强版可用于对标记的核酸分子成像。相差TEM在本发明方法中特别有用。相差TEM可通过多种方式进行。例如，将物镜散焦，允许出射波(exit wave)中的仅仅一部分空间频率成分在图像中表达(Scherzer(1949)J.Appl.Phys.20：20)。在该方法中，由此导致的低空间频率成分(例如，图像排列(image alignment)，低频率物体信息(obiectinformation)，和粒子搜寻(particle finding))损失可以通过摄取一系列散焦图像及数字重建物相(numerical reconstructing the obiect phase)来补偿(Kirkland 1984 Ultramicroscopy 15：151 and Coene et al.1992 Phys.Rev.Lett.69：3743)。此外，能量过滤可用于去除对图像的非弹性影响(inelasticcontribution)，由此对低频率成分取得更高的对比度和更好的信噪比(Schroder et al.1990J.Struct.Biol.105：28)。
最近，相差TEM可使用位于物镜后焦板(back-focal plane)的Zernike相盘(phase plate)进行。相盘是中心有孔的薄材薄膜。未散射的电子从孔通过，而散射的电子从薄的薄膜通过，使相延迟。合适的相盘可通过将碳真空气化在新切割的云母上而获得。将薄膜浮在水中，转移至钼物镜光圈。相盘中心开口可用离子束生产。对-π/2相移来说，31nm厚的碳薄膜可用于300kV的加速电压，24nm厚的碳薄膜可用于100kV的加速电压(参见Danevand Nagayama 2001Ultramicroscopy 88：243-252和日本专利申请No.2000-085493)。要获得可在重元素间进行区分的高分辨率(0.2-0.3nm)，TEM优选有低球面像差和色差的，从而实现高分辨率极限。可插入相盘、并能区分单个原子元素的具有高分辨率和高对比度的TEM优选使用大于300kV的电压。在区分每个由3-5个原子组成的元素簇的情况下，可使用较低电压，例如100kV的TEM。
将相差TEM和标准TEM组合的复合(complex)电子显微镜可用于实现0.2-0.3nm分辨率(Japanese Patent Publication No.11-258057)。例如，由真实数字成份信号和虚拟(imaginary)数字成份信号组成的复合电子显微镜成像，可以通过探测样本的真实数字成份TEM成像和由仅将穿过样本的电子波相移π/2而产生的虚拟数字TEM成像，以及将真实数字成份TEM成像和虚拟数字成份TEM成像复合求和而获得。
不依赖上述方法，对比度改进的TEM可使用低温样本台(stage)而获得。该台的使用可允许增加电子剂量而增加信噪比。
成像分析
TEM产生的成像作为数字信息，被能通过信号强度鉴别重元素或其基团的计算机记录和处理。用于成像分析的记录媒介应选择适宜TEM所产生的放大成像的媒体。
假设一个碱基在TEM图像中占据0.7nm×0.7nm的面积，而且为了在碱基间精确分辨，需要将所占据面积的10倍的容许量给予TEM图像，以及假设单个图像中俘获了105个碱基，那么一帧图像的实际面积是0.7×0.7×105nm2，或者大约0.5μm2。如果每个像素设置为分辨率的一半(例如，0.15nm)，那么需要像素的数量是(0.7×103nm/0.15nm)2或大约为2×107。因此，数字记录媒体，例如CCDs和成像板(IPs)可用于成像捕捉。然而，每像素的大小优选基本上等于高分辨率照相胶片大约5μm的像素大小。
本分析系统的特征在于，该系统能分析单链核酸分子序列，即使其骨架没有完全伸展。例如，即使其骨架弯曲或有部分相互接触，或者如果其骨架自身相交形成交叉，核酸分子序列仍可被确定。如果在靠近交叉点的链部分之间的碱基间隔相当大，那么碱基可基于沿着骨架观测到的点的原子数依赖的强度来区分。由此可确定序列。
如果骨架交叉产生的交叉使骨架不能被容易地追踪，那么需要收集两帧或多帧交叉区的成像。对每帧图像，将样品以不同角度倾斜，例如大约30°。以这种方式获得深度信息，并从中获得其中重叠已经被除去了的成像。
阵列
核酸测序法适合极高通量的分析。如上所述，这是因为该方法不依赖特定核酸分子的克隆。的确，在1mm2网格中通过排列，例如成行的平行的延展的单链核酸分子而产生整个基因组阵列是可能的。每行包含，例如3000个核酸分子，每个核酸分子大约10,000个碱基长(或大约7μ长)。假设在行之间、和在单行的分子之间有合适的间隔，那么在1mm2网格中可容纳大约这样的100个行。因此，这样的网格可以包含整个基因组或3×109个碱基(100行3000分子/行×10,000碱基/分子)。这样排列使每天分析相当于一个基因组的序列成为可能(假设分析3×105碱基/成像×10,000成像/天))。
阵列可通过将硫化核酸分子吸附在金点阵列上而产生。例如，直径小于1nm(例如，2，5，10，50，100nm)的金点可以作为矩形点阵(lattice)以10，20，50，100，200，300，400或500nm间隔或任何其它期望间隔规则排列在碳薄膜上。
可重复使用的可编址的(addressable)阵列可通过将许多短、特异性寡核苷酸中的每个连接至表面的特异位置，例如连接至在该点的阵列中的特异金点来构建。每个寡核苷酸与特异单链序列杂交，这样就在已知位置产生核酸分子阵列。
各种参考文献引用在本文中而且这些文献以其全部内容合并在本文中用作参考。
本发明记载了多种具体实施方式。然而，可以理解在不背离本发明精神和范围的情况下，可以有多种改变。相应地，其它具体实施方式也包含在下列权利要求的范围之内。

Claims (44)

1.确定核酸分子中多个碱基的序列的方法，包括：
(a)提供载有单链核酸分子的支持物表面，所述单链核酸分子包含多个用四种不同的碱基特异性标记中的一种进行了标记的碱基；
(b)用电子显微术检测已碱基特异性标记了的碱基；以及
(c)分析所检测的碱基特异性标记了的碱基，以确定核酸分子的序列。
2.权利要求1的方法，其中每个碱基特异性标记包括至少一个原子数大于25的原子。
3.权利要求1的方法，其中每个碱基用四种碱基特异性标记中的一种进行标记，这四种碱基特异性标记中的每个包括不同的原子数大于25的元素，而且每个原子数大于25的元素与其它原子数大于25的元素在原子数上差别至少15个原子数。
4.权利要求1的方法，其中每个碱基用四种碱基特异性标记中的一种进行标记，其中四种碱基特异性标记中的每个都包括至少两个原子数大于25的原子。
5.权利要求1的方法，其中碱基特异性标记中的每个都包括取代的核苷酸碱基。
6.权利要求5的方法，其中所述取代使Watson-Crick碱基配对的特异性增加。
7.权利要求5的方法，其中所述取代包括含有整体原子数大于25的基团。
8.权利要求5的方法，其中所述取代包括含有原子数大于25的原子的基团。
9.权利要求2的方法，其中所述原子选自：Pt，Eu，Pd，Co，U，Os，Fe，Hg，Gd，Cd，Zn，Ac，W，Mo，或Mn。
10.权利要求1的方法，其中所述四种碱基特异性标记由下列组成：
(i)包含取代的腺嘌呤的标记；
(ii)包含取代的尿嘧啶或取代的胸腺嘧啶的标记；
(iii)包含取代的胞嘧啶的标记；以及
(iv)包含取代的鸟嘌呤的标记。
11.权利要求3的方法，其中所述四种元素是：(i)Pt，Eu，Pd，和Co；(ii)U，Os，Pd和Fe；(iii)Hg，Gd，Cd和Zn；或(iv)Ac，W，Mo和Mn。
12.权利要求10的方法，其中取代的腺嘌呤的N7或N9位用包含原子数大于25的原子的基团取代。
13.权利要求10的方法，其中取代的鸟嘌呤的N7或N9位用包含原子数大于25的原子的基团取代。
14.权利要求10的方法，其中取代的胞嘧啶的N1位用包含原子数大于25的原子的基团取代。
15.权利要求10的方法，其中取代的尿嘧啶的N1位用包含原子数大于25的原子的基团取代。
16.权利要求10的方法，其中取代的胸腺嘧啶的N1位用包含原子数大于25的原子的基团取代。
17.权利要求10的方法，其中取代的腺嘌呤具有取代，所述取代增加与尿嘧啶或胸腺嘧啶Watson-Crick型碱基配对的特异性。
18.权利要求10的方法，其中取代的胸腺嘧啶或取代的尿嘧啶具有取代，所述取代增加与腺嘌呤Watson-Crick型碱基配对的特异性。
19.权利要求10的方法，其中取代的胞嘧啶具有取代，所述取代增加与鸟嘌呤Watson-Crick型碱基配对的特异性。
20.权利要求10的方法，其中取代的鸟嘌呤具有取代，所述取代增加与胞嘧啶Watson-Crick型碱基配对的特异性。
21.权利要求17的方法，其中取代的腺嘌呤在C2或C8、或者C2和C8被取代。
22.权利要求18的方法，其中取代的胸腺嘧啶或取代的尿嘧啶在C5或C6、或者C5和C6被取代。
23.权利要求19的方法，其中取代的胞嘧啶或取代的尿嘧啶在C5或C6、或者C5和C6被取代。
24.权利要求20的方法，其中取代的鸟嘌呤在C2被取代。
25.权利要求21-24任意一项的方法，其中所述修饰是取代或未取代的烷基或卤素。
26.权利要求1的方法，其中核酸分子的3’核苷酸或5’核苷酸共价连接至支持物表面的特定区域。
27.权利要求26的方法，其中支持物表面的特定区域用金包被。
28.权利要求1的方法，其中支持物表面载有多个单链核酸分子，其中每个核酸分子的3’核苷酸或5’核苷酸共价连接至支持物表面的特定区域。
29.权利要求28的方法，其中多个单链核酸分子中的每个共价连接至支持物表面的不同特定区域。
30.权利要求2的方法，其中每个碱基特异性标记包括至少两个原子数大于25的原子。
31.权利要求30的方法，其中每个碱基特异性标记包括选自下列的基团：B10I9COOH，C2B10I10，C2B10Br10，C2B10Cl10，或C2B10F10。
32.权利要求1的方法，其中电子显微术是透射电子显微术。
33.权利要求22的方法，其中透射电子显微术包括使用透射电子显微镜，所述透射电子显微镜带有位于物镜之后的Zernike相板。
34.权利要求1的方法，其中电子显微术包括使用复合电子显微镜。
35.权利要求29的方法，其中多个核酸分子形成规则阵列。
36.确定核酸分子中多个碱基的序列的方法，包括：
(a)提供载有单链核酸分子的支持物表面，所述单链核酸分子包括多个碱基；
(b)在有机溶剂存在的情况下，将该单链核酸分子与四种不同碱基特异性标记进行接触，所述有机溶剂无氢键供体及受体，以允许四种不同碱基特异性标记与多个碱基非共价结合；
(c)用电子显微术检测碱基特异性标记的碱基；以及
(d)分析所检测的碱基特异性标记的碱基，以确定核酸分子的序列。
37.取代的腺嘌呤，其中C2或C8位用C1-C5烷基或卤素取代以及N7或N9位用包括原子数大于25的元素的基团取代。
38.取代的鸟嘌呤，其中C8位用C1-C5烷基或卤素取代以及N7或N9位用包括原子数大于25的元素的基团取代。
39.取代的尿嘧啶，其中C5或C6位用C1-C5烷基或卤素取代以及N1位用包括原子数大于25的元素的基团取代。
40.取代的胞嘧啶，其中C5或C6位用C1-C5烷基或卤素取代以及N1位用包括原子数大于25的元素的基团取代。
41.权利要求37的取代的腺嘌呤，其中原子数大于25的元素选自：Pt，Eu，Pd，Co，U，Os，Fe，Hg，Gd，Cd，Zn，Ac，W，Mo，或Mn。
42.权利要求38的取代的鸟嘌呤，其中原子数大于25的元素选自：Pt，Eu，Pd，Co，U，Os，Fe，Hg，Gd，Cd，Zn，Ac，W，Mo，或Mn。
43.权利要求39的取代的尿嘧啶，其中原子数大于25的元素选自：Pt，Eu，Pd，Co，U，Os，Fe，Hg，Gd，Cd，Zn，Ac，W，Mo，或Mn。
44.权利要求40的取代的胞嘧啶，其中原子数大于25的元素选自：Pt，Eu，Pd，Co，U，Os，Fe，Hg，Gd，Cd，Zn，Ac，W，Mo，或Mn。
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