CN1808119A - 一种净化α－玉米赤霉醇的方法及其专用免疫亲和色谱柱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种净化α－玉米赤霉醇的方法及其专用免疫亲和色谱柱。该色谱柱的填料是净化α－玉米赤霉醇的免疫亲和吸附剂，该免疫亲和吸附剂是由固相载体和与其偶联的α－玉米赤霉醇单克隆抗体组成；所述α－玉米赤霉醇单克隆抗体是以α－玉米赤霉醇与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；本发明的提纯方法结合色谱法高效检测α－玉米赤霉醇的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
Description
技术领域
本发明涉及一种净化α-玉米赤霉醇的方法及其专用免疫亲和吸附色谱柱。
背景技术
随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性及灵敏度提出了更高的要求。将免疫亲和色谱(IAC，immunoaffinity chromatography)应用于残留分析，其高度选择性和高亲和性无疑使净化过程简化。与GC，HPLC联用可使免疫学技术和理化技术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，弥补了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。
α-玉米赤霉醇(α-Zearalanol，ZER)属于雷羧酸内酯类非甾体同化激素，曾作为生长促进剂应用于反刍动物，具有促进蛋白质合成作用。α-玉米赤霉醇具有弱雌激素作用，它在动物组织中的残留会影响人类健康，轻者引起人体性机能紊乱，重者影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，这类物质可能致癌。同时，α-玉米赤霉醇排出动物体外后，还可经饮水和食物造成二次污染和环境污染，我国已禁止其用于所有食品动物，在所有食用组织不得检出。
目前检测α-玉米赤霉醇的方法主要有薄层色谱法(TLC)、气-质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液-质联机(LC-MS)和酶联免疫法(ELISA)等。这些方法的前处理利用液-液分配，常规的SPE柱净化和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种净化α-玉米赤霉醇的方法及其专用免疫亲和吸附剂。
本发明所提供的净化α-玉米赤霉醇的免疫亲和吸附剂是由固相载体和与其偶联的α-玉米赤霉醇单克隆抗体组成；所述α-玉米赤霉醇单克隆抗体是以α-玉米赤霉醇半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述α-玉米赤霉醇半抗原是将α-玉米赤霉醇与琥珀酸酐反应得到ZER-7-半琥珀酸酯，即为α-玉米赤霉醇半抗原。
所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用载体蛋白。
α-玉米赤霉醇是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本发明将α-玉米赤霉醇与琥珀酸酐反应，形成半抗原，这样突出了α-玉米赤霉醇半抗原决定簇的特征结构，然后再采用混合酸酐法将α-玉米赤霉醇半抗原与蛋白质载体偶联成免疫原，α-玉米赤霉醇半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利，α-玉米赤霉醇与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为8∶1和10∶1。
所述固相载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶等，优选为Sepharose 4B。
所述α-玉米赤霉醇鼠单克隆抗体优选为α-玉米赤霉醇鼠单克隆抗体。
所述α-玉米赤霉醇鼠单克隆抗体优选为α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体。
所述α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604已于2006年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
所述免疫亲和吸附剂可装载入柱中制成免疫亲和色谱柱，该免疫亲和色谱柱也属于本发明的保护范围。
含有上述免疫亲和吸附剂或免疫亲和色谱柱的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒中还包括洗脱液，所述洗脱液可为甲醇。
所述试剂盒中还包括洗涤液、保存液；
所述洗涤液为pH7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述0.01mol/L磷酸盐缓冲液比例为1L中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g；
所述保存液为1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
该免疫亲和吸附剂基于免疫反应和色谱反应，适合从生物样品(如肌肉、肝、肺、肾、血浆)中提纯α-玉米赤霉醇，便于残留分析。在该免疫亲和吸附剂中，抗体和溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率是96.7±1.5％，动态柱容量为2500-3000ng，在使用了15次后柱容量为总柱容量的46％左右，保存期为1年。
本发明所提供的提纯α-玉米赤霉醇的方法，包括以下步骤：
1)样品的前处理：
将动物组织样品以5g的量加入5mL甲醇，涡动混匀，3500g离心10分钟，收集上清液，置于-20℃1小时，过0.25μM微孔滤膜得到样品溶液。
2)将步骤1)得到的样品溶液过免疫亲和色谱柱，然后用洗涤液洗涤，再用上述洗脱液洗脱，得到纯化的α-玉米赤霉醇溶液。
本发明的免疫亲和吸附剂具有高选择性，使样品前处理过程大大简化，尤其适用于肌肉、肝和血浆中微量ZER的前处理，分析质量得到改善。免疫亲和吸附剂的高选择性使得α-玉米赤霉醇分析方法的检测限将主要取决于取样量，这是单纯理化手段难以达到的；本发明的免疫亲和吸附剂对待测组分有很强的保留和浓缩能力，只要加样量不超过柱容量，在实测样品条件下免疫亲和吸附剂对组分的保留能力几乎不受样品体积或组分浓度的影响。本发明的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本发明的方法水相操作，操作简单，净化效果好，免疫亲和色谱柱能重复使用，能节省大量的有机溶剂，降低分析成本和环境污染。本发明的提纯方法结合色谱法高效检测α-玉米赤霉醇的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
附图说明
图1为添加α-玉米赤霉醇的牛肌肉样品净化效果气质色谱图
图2为α-玉米赤霉醇单克隆抗体免疫原的制备流程图
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、提纯α-玉米赤霉醇的免疫色谱柱的制备
1、α-玉米赤霉醇鼠单克隆抗体的制备
半抗原的合成：将α-玉米赤霉醇与琥珀酸酐反应得到ZER-7-半琥珀酸酯，即为α-玉米赤霉醇半抗原。具体步骤如下所述：
1)取α-玉米赤霉醇520mg，琥珀酸酐480mg，溶于20ml吡啶中，在氮气环境下加热回流4小时。
2)步骤1)的反应产物减压蒸发，将残留物溶于乙酸乙酯中，然后用0.5mol/L硫酸洗涤3次，弃去水相，得到有机相。
3)步骤2)得到的有机相用饱和碳酸钠溶液萃取3次，保留水相，再用乙酸乙酯洗涤3次。
4)水相用4mol/L的HCl调pH至4.0，得到ZER-7-半琥珀酸酯沉淀，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，ZER-7-半琥珀酸酯即存在于有机相中。有机相用蒸馏水洗涤2次，用无水硫酸钠干燥，氮气吹干。残留固体溶于最小体积的氯仿中，加入石油醚，得到ZER-7-半琥珀酸酯沉淀即为α-玉米赤霉醇半抗原。
半抗原合成的反应式为：
免疫原的制备：采用混合酸酐法，将α-玉米赤霉醇半抗原与蛋白质载体牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联，制成BSA-ZER或OVA-ZER偶联物，即免疫原。
具体步骤如下所述(免疫原制备流程图如图2所示)：
1)取ZER-7-半琥珀酸酯300mg，三正丁胺132mg，溶于20ml二噁烷中，溶液冷却至10℃，边搅拌边加入氯甲酸异丁酯100mg，溶液冷却至4℃，搅拌45min。
2)4℃条件下，取BSA 650mg，加入2.5ml 1mol/L氢氧化钠，加入130ml二噁烷与水按1∶1比例配制的混合液，最终得到BSA溶液，将步骤1)中得到的反应液体加入该BSA溶液中，4℃搅拌1小时后加入1ml 1mol/L氢氧化钠，4℃搅拌4小时，蒸馏水透析12小时。
3)用1mol/L盐酸将步骤2)得到的溶液调pH至2.0，即产生Z7BSA沉淀，将沉淀置于100ml蒸馏水中，用1M氢氧化钠调pH至11.0，沉淀溶解。加入丙酮(4℃，300ml)，用1M盐酸调pH至2.0，Z7BSA再次沉淀出来，收集，再重复丙酮沉淀过程3次。
4)将步骤3)得到的Z7BSA沉淀溶于300ml蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠调pH至11.0。2000g离心10min，弃沉淀，上清液对蒸馏水4℃透析48h，每6～8小时换一次透析液。透析后，加入0.01％硫柳汞，小瓶分装，-20℃保存。
动物免疫：采用BALA/C小鼠作为免疫动物、以上述α-玉米赤霉醇半抗原与蛋白质载体的偶联物BSA-ZER偶联物为免疫原，免疫剂量为100μg/只(0.1ml)，加等体积的完全弗氏佐剂乳化，进行首次免疫。两周后，取同样量免疫抗原加不完全弗氏佐剂，乳化，进行第二次免疫。间隔两周，进行第三次免疫，方法同第二次免疫。再隔两周，进行第四次免疫，方法同第二次免疫。融合前3天再对BALB/C小鼠加强免疫一次，腹腔注射100μg抗原，不加佐剂。融合前摘眼球放血，获得阳性血清，然后将小鼠拉颈脱臼处死，取脾脏。
细胞融合：脾细胞按5∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。
杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株-α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604。α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604已于2006年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
单克隆杂交瘤细胞的保存：在液氮-20℃下保存，使用时37℃水浴快速解冻。
单克隆抗体大量生长及提纯：采用体内诱生法，将BALB/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.16045×105-106个/只，7-10天后采集腹水。
2、单克隆抗体的纯化：
采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化单克隆抗体。其具体步骤如下：
取上述方法腹腔注射α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCCNo.1604得到的腹水5mL，加入0.06mol/L、pH4.0的NaAc-HAc缓冲液10mL，搅拌均匀，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。在室温下边搅拌边加入165μL辛酸，搅拌30min。在4℃6000g离心30min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。然后在4℃条件下，边搅拌边加入15mL饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终质量百分含量为50％，搅拌30min后，在4℃6000g离心30min，弃上清液，将沉淀悬浮于5.5mL0.01M pH7.2的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)中。将沉淀悬浮液边搅拌边加入4.5mL饱和硫酸铵溶液，此操作在4℃条件下完成。此时硫酸铵终浓度为45％，搅拌30min后，4℃6000g离心30min，弃上清液，将沉淀悬浮于1mL 0.01M pH7.2PBS中。将沉淀悬浮液装入透析袋中，用0.01M pH7.2PBS透析，4～6小时换液-次，换液2～3次。测定单克隆抗体溶液在280nm和260nm处的OD值，结果表明得到纯化的α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体。
3、免疫色谱柱(IAC)的制备
基质的准备：取溴化氰活化的Sepharose 4B干冻粉，在盛有1.0mmol 1-1HCl的G3漏斗中膨胀。
抗体IgG的准备：用0.1mol/L的NaHCO3溶液将纯化的α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体稀释，调溶液的pH值为8.4。
偶联反应：将膨胀的溶胶用0.1mol/L的NaHCO3溶液平衡后，转入上述用0.1mol/L的NaHCO3溶液将纯化的α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCCNo.1604分泌的单克隆抗体溶液中，混合，4℃下缓慢搅拌20-24hr。40mLPBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠29.3g)洗去未偶联抗体并测其偶联率，偶联率的检测结果表明，α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体与溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率是97.0±1.5％。
活化位点的封闭：将上述偶联后的凝胶转入盛有0.1mol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，混合，4℃下缓慢搅拌2hr，以封闭未偶联的活化位点。
洗涤：凝胶用5倍体积的0.1mol/L、pH4.0醋酸盐缓冲液和0.1mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液交替冲洗3次。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)平衡后，抽干的凝胶转入0.01mol/L、pH7.4的含0.1％NaN3磷酸盐缓冲液(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，NaN3 1g)中，4℃下存放备用。
装柱：将偶联有α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体的免疫吸附剂转入到含G3滤板的层析柱里，制成偶联有α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱(IAC柱)。
5、IAC柱容量的确定
将步骤4制备的偶联有α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCCNo.1604分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱，用10ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)洗柱，轻轻上下晃动IAC柱，赶走柱里的气泡，再以10ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)平衡。将含有100ng·ml-1α-玉米赤霉醇的PBS-甲醇溶液(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，200mL甲醇)连续加到IAC柱，自然重力下流出。当柱达到饱和后(流出液中α-玉米赤霉醇和加样液浓度相同)，用10ml PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)、15ml水洗涤IAC柱，再用4ml 30％(体积百分含量)的甲醇水溶液洗涤，除去干扰杂质。最后用4ml甲醇将α-玉米赤霉醇洗脱，自然重力下流出，收集，吹干，加入0.05ml的双-三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)试剂，涡动，60℃衍生化15min，进行GC/MS测定。计算出动态柱容量和绝对柱容量。动态柱容量(dynamic column capacity)是指每毫升免疫吸附剂(或柱床体积)对待测物的最大吸收值。绝对柱容量(specific column capacity)是指每毫克固定抗体对待测物的最大结合容量。结果表明偶联有α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱的动态柱容量和绝对柱容量分别为2810ng/mL，401ng/mg。
实施例2、偶联有鼠单克隆抗体的免疫色谱柱的试剂盒的制备及其对α-玉米赤霉醇的净化效果
1、净化α-玉米赤霉醇的试剂盒的制备
主要由盒体，免疫色谱柱(IAC柱)，标准α-玉米赤霉醇试剂、洗涤液，洗脱液，保存液，海绵托架所组成，海绵托架上设有孔和凹槽。海绵托架的凹槽内有装有标准α-玉米赤霉醇试剂、洗涤液，洗脱液，保存液的试剂瓶，海绵托架7的孔内装有IAC柱。其中免疫色谱柱为实施例1制备的偶联有α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱。
洗涤液为磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4)，配制方法为：1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g。
洗脱液为色谱级的甲醇。
保存液为1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，NaN3 0.2g，pH7.4。
将含有偶联有α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱的试剂盒分别放在4℃，有效期为12个月。
2、α-玉米赤霉醇的净化效果实验
IAC提取原理是，将特异性抗体α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体和惰性基质偶联，制备免疫吸附剂，装柱。当含α-玉米赤霉醇的混合物流过IAC柱时，固定抗体选择性地结合α-玉米赤霉醇，其它不被识别的样品杂质则不受阻碍地流出IAC柱，经洗涤后，将抗原-抗体复合物解离洗脱，α-玉米赤霉醇得到净化或分离。IAC柱经再生处理后可重复使用。
检测样品的处理：取牛肌肉样品(取自未接触过α-玉米赤霉醇的牛)各5g于50ml塑料离心管中，每个样本按2.5μg/kg浓度的α-玉米赤霉醇标准品进行添加，再加入5mL甲醇，涡动1min，3500g 10min，将上清液转入另一个干净的离心管中，重复提取，合并上清液。放入-20℃冰柜1hr，过0.25μM微孔滤膜。取过膜溶液5mL与20mL上述试剂盒中的洗涤液混匀，备用。
将偶联有α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱平衡到室温，用10ml上述试剂盒中的洗涤液冲洗，然后将上述的样品溶液过柱，用15ml水洗涤，然后再加入4ml 30％(体积百分含量)的甲醇水溶液洗涤，目的是为了除去非特异性吸附的杂质。用4ml洗脱液洗脱，在50℃N2气流下吹干，然后加入50μl衍生化试剂BSTFA，涡动，60℃衍生化15分钟，然后进行GC/MS分析，测定α-玉米赤霉醇的含量，标准品为α-玉米赤霉醇标准品。IAC柱用20ml的保存液平衡保存在4℃冰箱里备用。测定结果表明，用IAC进行样品净化，不干扰药物色谱峰，能够完全分离，说明制备的IAC非特异性吸附极小。其中偶联有α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱对于添加2.5μg/kg浓度的α-玉米赤霉醇牛肌肉样品中的净化效果如图1所示，图1中1为α-玉米赤霉醇峰，A为添加2.5μg/kg浓度的α-玉米赤霉醇的牛肌肉样品，B为2.0μg/kg浓度的α-玉米赤霉醇标准品。
Claims (10)
1.一种净化α-玉米赤霉醇的免疫亲和吸附剂，是由固相载体和与其偶联的α-玉米赤霉醇单克隆抗体组成；所述α-玉米赤霉醇单克隆抗体是以α-玉米赤霉醇半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述α-玉米赤霉醇半抗原是将α-玉米赤霉醇与琥珀酸酐反应得到的ZER-7-半琥珀酸酯，即为α-玉米赤霉醇半抗原。
2、根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述固相载体为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶，优选为Sepharose 4B；所述α-玉米赤霉醇单克隆抗体为α-玉米赤霉醇鼠单克隆抗体。
3、根据权利要求2所述的吸附剂，其特征在于：所述α-玉米赤霉醇鼠单克隆抗体为α-玉米赤霉醇的单克隆杂交瘤细胞株A-1-2CGMCC No.1604分泌的单克隆抗体。
4、根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5、装载有权利要求1-4中任一所述的免疫亲和吸附剂的免疫亲和色谱柱。
6、含有权利要求1-4中任一所述的免疫亲和吸附剂的试剂盒或含有权利要求5所述的免疫亲和色谱柱的试剂盒。
7、根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括洗脱液，所述洗脱液为甲醇。
8、根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括洗涤液、保存液；所述洗涤液为pH7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述0.01mol/L磷酸盐缓冲液为1L中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g的溶液；所述保存液为1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
9、一种提纯α-玉米赤霉醇的方法，包括以下步骤：
1)样品的前处理：
将动物组织样品以5g的量加入5mL甲醇，涡动混匀，3500g离心10分钟，收集上清液，置于-20℃ 1hr，过0.25μM微孔滤膜得到样品溶液；
2)将步骤1)得到的样品溶液过权利要求5所述的免疫亲和色谱柱，然后用权利要求8所述的洗涤液洗涤，再用权利要求7所述的洗脱液洗脱，得到纯化的α-玉米赤霉醇溶液。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述动物组织样品包括肌肉、肝、肺、肾和血浆。
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