CN1800229A - 以空壳病毒为模板制备单分散高分子纳米球 - Google Patents

Abstract

一种以空壳病毒为模板制备单分散高分子纳米球的方法。解决现有技术难以制备在尺寸和形状上完全一致的纳米材料的问题。本发明以二十面体的植物空壳豇豆退绿斑驳病毒为模板，将单体2－丙烯酸氨基－2－甲基－1－丙烷磺酸和交联剂N，N’－亚甲基双丙烯酰胺充满空壳病毒的内部空腔。在病毒的空间限制下进行聚合反应，制备出交联型聚2－丙烯酸氨基－2－甲基－1－丙烷磺酸高分子化合物。在与空壳病毒脱离后，产物在尺度上具有单分散性，并与病毒内腔直径相当，且在形状上与病毒的球形空腔互补。该方法可为利用不同的病毒分子设计指定大小和形状的纳米高分子颗粒提供了一条途径。

Description

以空壳病毒为模板制备单分散高分子纳米球

【技术领域】：本发明属于生物材料和纳米高分子合成技术交叉应用领域，特别是以天然的微生物体为“容器”来制造聚合物纳米材料。它可以获得传统纳米材料制备方法所难以得到的单分散产物，并可望产生大量规整粒子组装起来所形成的协同效应。

【背景技术】：纳米材料的制备多采用溶胶-凝胶法、复合醇盐法、微乳液法、气相沉积法、等离子法、原位聚合法、分子离子插层法等。所有这些方法都因为微环境的涨落，而不能使材料在大小尺寸和外部形状上完全保持一致。纳米粒在粒径上呈现一个分布，其平均粒径虽处在纳米范围内，而最大与最小粒径却可能有较大的差别，产物实际上是各种尺度粒子的混合物。此外，上述方法制备的纳米材料基本上是球形，或者因微环境的干扰而产生不规则的类球体。现有的聚合物微球制备方法大多能提供微米级的颗粒。虽然，人们已经能够制成纳米级的聚合物微球，但一般难以控制粒径的均一程度。制备不同数量级的超细颗粒通常需要不同的操作手段，或者需要极其精确和苛刻的反应条件才能完成。

在自然界，存在着一些具有规则的微型结构的物质。例如，C₆₀的类似足球的笼形结构，碳纳米管的管状结构，环糊精和杯芳烃的杯子结构，冠醚和环肽的环状结构等。但是，它们每一种化合物均只有一种固定的尺寸和形状，而且有些因尺寸太小而不能作为聚合物合成的模板，还有些因没有适宜的孔道而难以捕捉和封装有机分子。

病毒，作为一种天然的半生命体微生物，其大小在10～300nm之间，恰处于纳米级的范围内。病毒粒由中心的核酸(RNA或DNA)和蛋白质外壳所构成。如果除去内部的核酸，不同的病毒大大小小的蛋白质“笼子”可广泛提供尺寸各异的纳米反应容器。研究者可以通过选择不同的病毒粒来制备指定大小的纳米粒子。此外，同种病毒具有完全相同的尺度和形状，这意味着以同种空壳病毒粒为模板，合成出大小和外形完全相同的纳米材料。

如，Meldrum等人发现储铁蛋白可用于空间约束的矿化反应(见Meldrum，F.C.Heywood，B.R.&Mann，S.Science，1992，257：522.)。Douglas和Young用病毒粒对无机矿物质钨酸盐和钒酸盐进行了封装和矿化，并将聚茴香脑磺酸引入空壳病毒中，从而阻碍了病毒粒的矿化(见Douglas，T.&Young，M.Nature，1998，393：152)。但这两种方法仅仅是将现成的物质装入病毒空腔中，而没有发生化学变化。

【发明内容】：本发明目的是解决现有技术不能使制备的纳米材料在大小尺寸和外部形状上完全保持一致的问题，提供一种以空壳病毒为模板制备单分散高分子纳米球的方法。该方法以结构熟知的植物空壳病毒为模板，在其空腔中进行高分子的合成，制备指定尺寸和形状、且粒度均一的聚合物纳米粒子。

本发明以空壳病毒为模板制备单分散高分子纳米球，该纳米球的组成为2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚物；共聚物具有交联结构；外部形状为球状；尺寸在纳米级范围内；其具体制备过程如下：

——病毒自组装和纯化：

在Tris-盐酸缓冲液中悬浮0.5～5.0mg/ml的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析10～20h，使空壳病毒颗粒组装起来；组装的混合物载入10～40％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38,000rpm下离心4～6h；梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份；

——单体的封装：

在5℃下，在10～20m1的Tris-盐酸缓冲液(0.05M)中，将25～50mg空壳豇豆退绿斑驳病毒分散在15～24mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、13～21mg的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和2～4mg的过硫酸钾-亚硫酸氢钠溶液中进行孵化3～5h；然后用邻苯二甲酸-盐酸缓冲液降低溶液的pH值，并用大量邻苯二甲酸-盐酸缓冲液洗涤；样品随后载入如前所述的10～40％蔗糖梯度，进行超速离心分离；收集280nm吸收峰的梯度馏分；

——聚合物的合成：

在N₂保护下，温度在5℃下，病毒内部的单体聚合与交联而固化；升温至60～80℃，使聚合物熟化；向体系中加入8～12mol/l的尿素；样品随后载入如前所述的10～40％蔗糖梯度，进行超速离心分馏，洗涤并浓缩产物，得到单分散高分子纳米球。

本发明的优点和积极效果：由于病毒尺度一般均在纳米级的范围内，将病毒内部的RNA或DNA去除，剩余的蛋白质外壳内就会留下一个空腔，这个空腔具有纳米级的体积和特定的形状，如果使某种单体在这一空腔内聚合，所形成的聚合物在尺度上与病毒空腔吻合，在形状上与空腔互补；无须精准的反应环境就可制备出与病毒相匹配的高分子纳米粒子。同时病毒是多种多样的，它们在尺寸和形状上具有很大的差别，采用本发明方法可以制备出不同尺寸和形状的高分子纳米粒子。本发明以二十面体对称的植物空壳病毒作为制备高分子纳米球的模板，在碱性环境中，衣壳表面有60个直径约为2nm的孔洞通向病毒内部；在酸性介质中，这些孔道则会闭合起来，可在病毒内部形成相对封闭的聚合体系。单体分子在病毒内部就会以共价键连接起来，形成一个完整的网状结构。这些衣壳可来源于去除核酸基因组的病毒，也可来源于基因工程所表达的衣壳蛋白质的组装体。采用本发明方法可以得到与空壳病毒空腔尺寸和形状相匹配，且粒度均一的聚合物纳米粒子。

【附图说明】：

图1是以空壳病毒为模板高分子纳米球的合成示意图；

图2是聚合物纳米球的透射电子显微镜图像。

【具体实施方式】：

实施例1

1.病毒自组装和纯化

在Tris-盐酸缓冲液(0.05M)中悬浮0.5mg/ml的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析15h，使空壳病毒颗粒组装起来。组装的混合物载入10％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38,000rpm下离心4h。梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份。

2.单体的封装

在5℃下，在10ml的Tris-盐酸缓冲液(0.05M)中，将25mg空壳豇豆退绿斑驳病毒分散在15mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、13mg的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和2mg的过硫酸钾-亚硫酸氢钠溶液中进行孵化3h。然后用邻苯二甲酸-盐酸缓冲液(0.05M)降低溶液的pH值，并用大量邻苯二甲酸-盐酸缓冲液洗涤。样品随后载入如前所述的10％蔗糖梯度，进行超速离心分离。收集280nm吸收峰的梯度馏分。

3.聚合物的合成

在N₂保护下，温度在5℃下，病毒内部的单体聚合与交联而固化。升温至60℃，使聚合物熟化。向体系中加入8mol/l的尿素。样品随后载入如前所述的10％蔗糖梯度，进行超速离心分馏。洗涤并浓缩，得到高分子纳米球产物。如图2所示，将单体染色，以100nm为单位的透射电镜观察病毒对聚合物的封装。

实施例2

1.病毒自组装和纯化：

在Tris-盐酸缓冲液中悬浮1.0mg/ml的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析10h，使空壳病毒颗粒组装起来；组装的混合物载入20％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38,000rpm下离心5h；梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份；

2.单体的封装：

在5℃下，在15ml的Tris-盐酸缓冲液(0.05M)中，将35mg空壳豇豆退绿斑驳病毒分散在20mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、18mg的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和3mg的过硫酸钾-亚硫酸氢钠溶液中进行孵化4h；然后用邻苯二甲酸-盐酸缓冲液降低溶液的pH值，并用大量邻苯二甲酸-盐酸缓冲液洗涤；样品随后载入如前所述的30％蔗糖梯度，进行超速离心分离；收集280nm吸收峰的梯度馏分；

3.聚合物的合成：

在N₂保护下，温度在5℃下，病毒内部的单体聚合与交联而固化；升温至70℃，使聚合物熟化；向体系中加入10mol/l的尿素；样品随后载入如前所述的20％蔗糖梯度，进行超速离心分馏，洗涤并浓缩产物，得到单分散高分子纳米球。

实施例3

1.病毒自组装和纯化：

在Tris-盐酸缓冲液中悬浮5.0mg/ml的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析20h，使空壳病毒颗粒组装起来；组装的混合物载入40％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38,000rpm下离心6h；梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份；

2.单体的封装：

在5℃下，在20ml的Tris-盐酸缓冲液(0.05M)中，将50mg空壳豇豆退绿斑驳病毒分散在24mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、21mg的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和4mg的过硫酸钾-亚硫酸氢钠溶液中进行孵化5h；然后用邻苯二甲酸-盐酸缓冲液降低溶液的pH值，并用大量邻苯二甲酸-盐酸缓冲液洗涤；样品随后载入如前所述的40％蔗糖梯度，进行超速离心分离；收集280nm吸收峰的梯度馏分；

3.聚合物的合成：

在N₂保护下，温度在5℃下，病毒内部的单体聚合与交联而固化；升温至80℃，使聚合物熟化；向体系中加入12mol/l的尿素；样品随后载入如前所述的40％蔗糖梯度，进行超速离心分馏，洗涤并浓缩产物，得到单分散高分子纳米球。

Claims (1)

1、一种以空壳病毒为模板制备单分散高分子纳米球的方法，其特征是该纳米球的组成为2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚物；共聚物具有交联结构；外部形状为球状；尺寸在纳米级范围内；其具体制备过程如下：

——病毒自组装和纯化：

在Tris-盐酸缓冲液中悬浮0.5～5.0mg/ml的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析10～20h，使空壳病毒颗粒组装起来；组装的混合物载入10～40％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38,000rpm下离心4～6h；梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份；

——单体的封装：

在5℃下，在10～20ml的Tris-盐酸缓冲液(0.05M)中，将25～50mg空壳豇豆退绿斑驳病毒分散在15～24mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、13～21mg的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和2～4mg的过硫酸钾-亚硫酸氢钠溶液中进行孵化3～5h；然后用邻苯二甲酸-盐酸缓冲液降低溶液的pH值，并用大量邻苯二甲酸-盐酸缓冲液洗涤；样品随后载入如前所述的10～40％蔗糖梯度，进行超速离心分离；收集280nm吸收峰的梯度馏分；

——聚合物的合成：

在N₂保护下，温度在5℃下，病毒内部的单体聚合与交联而固化；升温至60～80℃，使聚合物熟化；向体系中加入8～12mol/l的尿素；样品随后载入如前所述的10～40％蔗糖梯度，进行超速离心分馏，洗涤并浓缩产物，得到单分散高分子纳米球。

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