CN1796398B - 以胺类界面活性剂萃取核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是有关于一种萃取生物检体中核酸的方法，是将生物检体与一含有胺类界面活性剂的试剂进行接触，使生物检体中核酸与胺类界面活性剂形成一错合物，其中胺类界面活性剂是具备如式(I)的通式：R1R2R3N(O)x，式(I)；其中，R1与R2分别为氢，含1-6个碳的烷基，含6-12个碳的芳香烃基或是含6-12个碳的烃基芳香烃基；R3为含1-20个碳的烷基、含6-26个碳的芳香烃基或是含6-26个碳的烃基芳香烃基；且x为0或1；胺类界面活性剂存在于试剂中的含量不限，较佳为0.001％至20％的浓度百分比。
Description
技术领域
本发明是关于一种自样品中分离生物材料的方法，尤指一种自生物样品中分离核酸的方法。
背景技术
由于核酸是携带有一个体的遗传信息，因此核酸在分子生物学中扮演著重要的角色。近来的研究显示，一病患的遗传缺失或疾病已可经由临床诊断方式，来监别出病患本身带有的异常或特殊的核酸序列，因此可以在疾病发生前，经由诊断出不正常的核酸，或是以必要的补救方式预防疾病的发生；而为了达到有效诊断出不正常或是特殊序列的核酸，自个体中分离核酸与保持遗传信息的完整成为相关应用的首要研究目标。
为了避免蛋白质或是其他胞器的干扰影响，目前皆以有机溶剂-酚及氯仿，将蛋白质变性后，再进行核酸的分离与纯化。然而，以酚及氯仿自生物样品中分离核酸的方法，需要仔细的操作与训练优良的操作人员，以自核酸中去除不需要的物质(例：蛋白质)。另一方面，酚与氯仿不仅在操作上具有危险性，更会对环境造成污染；此外，由于酚与氯仿无法直接浓缩核酸，因此，需要额外使用其他化学物品以浓缩核酸；同时，由于酚极易氧化，因此不利于储存与使用。基于上述缺点，酚与氯仿并非用于分离核酸的最适化学物质，亦不适合用于高效能(high throughput)的临床检验技术，也不易和自动化样品处理仪器搭配而达到自动化的目的。
许多的研究均已指出，分离核酸的方法在不需要酚与氯仿的使用下也可以达成。Qiagen公司在中国台湾专利案号WO03084976中揭示一种利用氨(ammonia)或胺(ammonium)分离核酸的方法，在此方法中，利用了一固体界面做为吸附核酸的固定物质；此外，在分离的第一阶段中，利用了一钳合盐类(chaotropic agent)试剂，首先解开双股DNA，而在氨类或是一级胺类的存在下，可增强已解离的核酸与固体界面的结合效率。此外，pH8.5到9.5的含氨或是一级胺反应液，可增加样品中核酸与固体界面的接触附著效率。
另一方面，Gjerde等人在美国专利号US 6,265,168中揭示一种自一DNA序列片段的混合物中，移除一已知序列长度的DNA片段的方法；首先将含一目标DNA片段的DNA片段混合物置于一第一溶液中，此第一溶液内含有一相反离子与一可结合DNA的起始溶液，接着将第一溶液加入含有非极性、无孔洞表面介质的分离管柱中；再利用一第二溶液，将吸附于介质表面的目标DNA片段冲提出。在此所使用的相反离子(counterion)为一级胺、二级胺、低级的三级胺与四级烷基胺盐。此方法的重点是利用管柱中非极性、无孔洞的表面，纯化出目标DNA；且所形成的相反离子-DNA错合物可轻易的吸附于管柱内介质表面；然而，本案技术重点是自己纯化的大量DNA中分离出目标DNA的方法；由于此技术将可能导致管柱的阻塞，因此并不适用于从全血液样品中直接纯化出核酸。
在加拿大专利CA 2299119中可以发现更多的相关讨论，该案包括在核酸萃取进行时，一种稳定生物检体中核酸的方法；在此叙述的方法中，使用至少含有两个四级胺或是磷基结构的阳离子聚合物，以进行核酸的沉淀与保护。然而，阳离子聚合物将与核酸形成一强键结的复合物，将增加自阳离子聚合物中纯化出核酸的困难度。
而在美国专利案号US2004014703中揭示一自生物性物质中分离与/或稳定核酸的试剂；此案的方法与目的为提供一可于组织、血液、血浆或是血清中稳定RNA的试剂；此试剂包含一用以稳定核酸的阳离子化合物，如四级胺；此技术同样面临难以分离具有强键结的核酸复合物的困境。
在上述前案中，虽然提及利用胺类进行核酸纯化的技术，然而该技术必须结合管柱，才能从一群已纯化过的核酸中萃取出标的核酸；而且如以全血液等生物检体样品直接进行核酸的纯化，将由于样品中大分子的存在而导致管柱的阻塞，因此并不适用于生物检体中核酸的萃取；从上述前案的揭示中发现，目前尚未有使用一级胺、二级胺、或三级胺，直接从生物检体中进行核酸分离的方法被揭示。
发明内容
本发明的主要目的是在提供一种利用含有胺类界面活性剂的试剂，自生物性样品中直接分离出核酸的方法。
本发明是一种萃取生物检体中核酸的方法，是将该生物检体与一含有胺类界面活性剂的试剂进行接触，使该生物检体中核酸与该胺类界面活性剂形成一错合物；以及
萃取出该错合物；
其中该胺类界面活性剂是具备如式(I)的通式：
R1R2R3N(O)x，式(I)；
其中，R1与R2分别为氢，含1-6个碳的烷基，含6-12个碳的芳香烃基或是含6-12个碳的烃基芳香烃基；R3为含1-20个碳的烷基、含6-26个碳的芳香烃基或是含6-26个碳的烃基芳香烃基；且x为0或1。
本发明所提的萃取用试剂其型态不限，可以是以一液状型态使用，也可以一固态方式与生物检体相接触，而为使检体中核酸与试剂的成分充分混合，本发明最佳实施方式是以液态方式呈现；此外，本发明中胺类界面活性剂的种类可以是任何常见的胺类界面活性剂，较佳的是，本发明胺类界面活性剂可选择自一包含十二烷胺(dodecylamine)，N-甲基十二烷胺(N-methyldodecylamine)，N，N-二甲基十二烷胺(N，N-dimethyldodecylamine)，氧化氮N，N-二甲基十二烷胺(N，N-dimethyldodecylamine N oxide)与4-十四烷胺(4-tetradecylaniline)的群组。
本发明中胺类界面活性剂的重量百分比无限制，较佳的是，当本发明试剂为固态，则其中的胺类界面活性剂重量百分比小于90％，较佳为10％到90％；当本发明萃取用试剂与胺类界面活性剂为一液态试剂时，其中的胺类界面活性剂浓度范围较佳为0.001％到20％。
本发明方法可以在不含非离子界面活性剂或酸性盐类中达到萃取核酸的目的，然而，在特定的胺类界面活性剂中配合非离子界面活性剂、酸性盐类或两者的混合物，可以使核酸萃取的效果更佳；为此，含胺类界面活性剂的萃取用试剂可选择性地更包括至少一非离子性界面活性剂；此非离子性界面活性剂可以为液态或固态界面活性剂；当其为液态时，其浓度范围为0.01％到20％；当此非离子性界面活性剂为一固态时，其存在于萃取用试剂中的重量百分比范围为0.01％到40％。本发明所述的非离子性界面活性剂可以为任何一种现有的非离子性界面活性剂，较佳的是聚氧乙烯类界面活性剂，如Tween 20或是Triton X-100，其中最佳的是Tween 20。
本发明含胺类界面活性剂的萃取用试剂可更包括至少一种酸性盐类；此酸性盐类可以是一酸缓冲液或是一固态酸剂，例如为一酸性缓冲液，其浓度较佳是低于1M；最佳浓度是0.01到0.5M；本发明中适用的酸性盐类可以为任何一种常用的酸；较佳的酸性盐类可选自包括顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、草酸的群组。
本发明所述的萃取用试剂较佳是以一液态水溶液方式进行生物检体中核酸的萃取，其水溶液的pH值不限定，较佳的是，pH值范围在1到10之间。
适用于本发明方法的含核酸生物检体可为不含细胞的检体、血浆、体液如全血、血清、细胞、白血球细胞、血液黄层、痰液、尿液、精液、粪便、样本抹片、抽吸物、或任何一种组织样本，如部分组织或器官的活检组织、或食物样本中所含的游离态或结合态的核酸或含核酸的细胞，如单细胞或多细胞有机物(如昆虫等)、或是植物或植物的一部分组织、细菌、病毒、酵母菌与其他种类真菌，或真核细胞，原核细胞等等。
本发明方法中提到的“核酸”，所代表的意义为广义的核酸，包括了各种长度或构型的核糖核酸(ribonucleic acids，RNA)、去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acids，DNA)，如双股，单股，环状，直链状，支链状，或是结合上述型态的任何一种可能的次单元，如寡核酸单体，质体，病毒或细菌的DNA或RNA，来自动物、植物或其他真核细胞的基因体或非基因体的DNA或RNA，修饰前后的mRNA、tRNA、异核RNA(heterogeneousnuclear RNA，hnRNA)、rRNA、cDNA或任何一种常见的核酸；较佳的是，本发明方法中适用的核酸为DNA或RNA。
附图说明
为进一步说明本发明的技术内容，以下结合实施例及附图详细说明如后，其中：
图1是一全血样本经十二烷胺纯化后的核酸电泳结果。
图2是一全血样本经N，N-二甲基十二烷胺纯化后的核酸电泳结果。
图3是一全血样本经氧化氮N，N-二甲基十二烷胺纯化后的核酸电泳结果。
图4是一全血样本经4-十四烷基苯胺纯化后的基因组DNA电泳结果。
具体实施方式
实施例一、自全血样品中纯化全细胞RNA
使用三种不同的萃取方法，将全细胞RNA自新鲜全血中分离出来，以萃取结果作为比较依据。第一种，使用红血球细胞溶解缓冲液(RocheDiagnostics GmbH)与根据使用手册中所建议的含酚试剂(Trizol Reagent，Life Technologies)分离出RNA，步骤是根据使用者手册进行。第二种，利用PAXgene Blood RNA Validation Kit(QIAGEN GmbH)进行核酸的纯化，步骤亦根据使用者手册进行；第三种，使用含胺类界面活性剂的萃取用试剂，纯化出全血中全细胞的RNA，步骤如下。
首先，制备一溶解缓冲液，其中成分包含1％(W/V)十二烷胺，50mM的顺丁烯二酸与3％(W/V)的Tween 20；将新鲜人类全血(333μl)与1ml制备好的溶解缓冲液进行混合，并以每分钟11转的速度混合20分钟以确保混合液均质性。接着以5000xg离心混合液10分钟，并去除上清液；接着将沉淀物以两次333μl的二次蒸馏水清洗；再将含沉淀物的溶液以5000xg离心10分钟并完整去除上清液。
加入147μl RLT缓冲液(QIAGEN GmbH)于样品中并充分混合。接着加入200μl的1，3-溴氯丙烷并悬浮震荡10秒；样品以10000xg离心5分钟，并将上清液转置入一新的离心管中，加入90μl的100％酒精并以微量吸取器吸放的方式混合三次，再将溶液转置于一RNeasy mini管柱内(QIAGEN GmbH)。
样品以13000xg离心30秒并舍弃过滤液，加入350μl缓冲液RW1于管柱中，以每分钟13000转的速度离心30秒，再舍弃过滤液；取10μl的DNase I原液(QIAGEN GmbH)加入70μl的RDD缓冲液中；将DNase I混合液直接加入RNeasy？mini管柱中，并置于20-30℃反应15分钟，再加入350μl缓冲液RW1于管柱中，并以每分钟13000转离心30秒，并将舍弃过滤液。
加入500μl的缓冲液RPE(QIAGEN GmbH)于管柱中，接着样品以每分钟13000转离心30秒并舍弃过滤液。另外加入500μl的缓冲液RPE于RNeasy管柱中。管柱以每分钟13000转离心30秒，舍弃过滤液。空管柱以每分钟13000转离心1分钟，再将管柱转置于另一干净的1.5毫升管子中。加入40μl不含RNase的二次水于管柱中，以每分钟13000转离心1分钟，另外再以等量的40μl不含RNase的二次水加入管柱中，以每分钟13000转离心1分钟，将80μl所冲提出的溶液置于一新的1.5毫升管中。
实施例二、全血中纯化基因组DNA
使用三种不同的萃取方法，自新鲜全血中分离基因组DNA。在第一种萃取方法中，使用红血球细胞溶解缓冲液(Roche Diagnostics GmbH)与根据使用手册中所建议的含酚试剂(Trizol Reagent，Life Technologies)分离出DNA，步骤是根据使用者手册进行。第二种，使用QIAamp DNA BloodKit(QIAGEN GmbH)，并根据使用手册指示进行萃取。第三种，使用含胺类界面活性剂的萃取用试剂，纯化出全血中基因组DNA，步骤如下。
新鲜人类全血(333μl)与1ml含1％(W/V)十二烷胺，3％(W/V)的Tween20与50mM顺丁烯二酸的溶液混合。以5000xg离心10分钟，将一级胺界面活性剂与DNA的错合物分离出，以利后续DNA的萃取；以200μl的AL缓冲液(QIAGEN GmbH)与20μl的蛋白质酶K混合液溶解离心后的沉淀物。在55℃反应10分钟后，样品与200μl乙醇混合，并转置于包含一硅质过滤膜的离心管柱中；样品混合液在离心时将透过过滤膜；再以500μl AW1缓冲液(QIAGEN GmbH)冲洗硅质过滤膜，并以500μl AW2缓冲液(QIAGENGmbH)再冲洗一次；最后以200μl无菌水冲提出基因组DNA。
实施例三、核酸定量与定性
以分光光度计测量波长260mm与280mm吸收光谱测定分离核酸的浓度。参照表1，比较三种不同分离方法所分离出核酸的浓度与品质。三种方法为A.本发明的一级胺萃取试剂，B.PAXgene Blood RNA ValidationKit或QIAamp DNA Blood Kit，与C.利用结合溶解红血球与Trizol试剂的传统方法。
表一
根据表一的数据，在分离RNA的三种方法中，以本发明含一级胺的萃取试剂进行萃取可得最高的RNA浓度，且品质也达到理想的测定范围(1.9到2.1)。同样的，表一结果也显示本发明含一级胺界面活性剂的试剂，同时对于DNA的萃取有相同的效果。以洋菜胶电泳进一步测试最终样品，结果如同图1表示，D1为利用红血球溶解与Trizol试剂的一般方法分离出DNA的结果；D2为利用QIAamp DNA Blood Kit套组纯化的结果；D3为以本发明一级胺界面活性剂分离出DNA的结果。R1表示以红血球溶解与Trizol试剂的一般方法分离RNA的结果，R2为利用PAXgene Blood RNAValidation Kit套组纯化的结果；R3是以本发明所提的一级胺界面活性剂分离RNA的结果。洋菜胶中每一样品条带中核酸浓度约为100ng DNA或是200ng RNA。结果显示以实施例一方式所分离出的核酸，D3与R3，比其他两种分离方式更具效率。且结果也显示使用本发明一级胺界面活性剂，在萃取DNA中可得到良好的品质。而以本发明方法所萃取出RNA的量(R3)，与其他两种方式萃取出的量相同，但是从R3可清楚看出，以本发明一级胺界面活性剂分离出的RNA，是没有掺杂基因组DNA的纯RNA。
实施例四、以二级胺界面活性剂纯化全细胞核醣核酸
制备18种界面活性剂溶液，分别包含1％、2％、3％不同浓度的N-甲基十二烷胺，与25、50、75、100、125或150mM不同浓度的酒石酸；取新鲜人类全血(333μl)与1ml界面活性剂溶液混合，并将样品混合物于室温中以每分钟11转的速度混合20分钟。
将样品混合物以5000xg离心10分钟；以倒出或吸出方式移除上清液；加入666μl二次水，并且以剧烈震荡方式回溶离心后的沉淀物；再以5000xg离心10分钟；移除并舍弃上清液。
加入50μl不含RNase的二次水回溶离心沉淀物，以微量吸取器来回吸放的方式，直到完全溶解沉淀物；接着加入100μl RLT液(Qiagen，RNeasy mini kit)与40μl蛋白酶K，并且以微量吸取器以吸放方式混合均匀；将溶液置于震荡培养器或水浴槽中，在55℃下反应10分钟；取200μl的1，3-溴氯丙烷加入反应液中，并剧烈震荡以充分混合。样品再以10000xg离心5分钟；接着将上清液移至另一新的1.5ml离心管中。
加入90μl的100％乙醇于样品中并以剧烈震荡充分混合；以低速短暂离心(低于两秒)的方式移除在管盖上的液体。
将样品溶液移入RNeasy mini管柱中，并以每分钟13000转离心30秒；加入350μl的RW1液，以每分钟13000转离心1分钟，舍弃离心后的过滤液；取10μl的DNase I原液加入70μl的RDD缓冲液中；将80μl的DNase I混合液直接加于离心管柱过滤膜上，并且将含样品的离心管柱静置于室温中反应15分钟；接着以350μl的RW1液冲洗硅质过滤膜，并以每分钟13000转离心30秒，舍弃离心后的过滤液；接着以500μl的RPE液加到过滤膜上，并以每分钟13000转离心30秒，舍弃离心后的过滤液。
取另外500μl的RPE液加到过滤膜上，并以每分钟13000转离心30秒，舍弃离心后的过滤液；再以13000转离心管柱2分钟。将管柱转换至另一全新的1.5毫升冲提管，最后同实施例一，以两次40μl的不含RNase的二次水将过滤膜上的RNA样品冲提出来。
以上述不同萃取方式所取得的RNA沉淀物大小(％)的比较于表2A中。
表2A
沉淀物大小为沉淀物体积除以全血体积；较高的沉淀物比值代表沉淀物较不纯或是有其他污染物存在于其中。
表2B数据表示经由上述纯化RNA步骤，RNA的取得量(ug/ml blood)的比较。
表2B
表2A与表2B的资料显示，以2％到3％的N-十二烷胺甲基，搭配75到150mM的酒石酸的组合，最能移除RNA中不纯物与杂质，且有最高的RNA产率。
实施例五、以三级胺界面活性剂纯化全细胞RNA
制备10种界面活性剂溶液，分别包含1％或3％不同浓度的N，N-二甲基十二烷胺，与50、75、100、125或150mM不同浓度的酒石酸。取新鲜人类全血(333μl)与1ml不同配方的界面活性剂溶液混合，于室温中以每分钟11转速度混合20分钟；溶液以5000xg离心10分钟；上清液以倒出或吸出方式移除；加入666μl二次水，并且以剧烈震荡方式回溶离心后的沉淀物；再以5000xg离心10分钟；移除并舍弃上清液。
接着加入167μl RLT液(Qiagen，RNeasy mini kit)回溶离心沉淀物，直到沉淀物完全回溶；加入200μl的1，3-溴氯丙烷，并以剧烈震荡充分混合；再将样品以10000xg离心5分钟；接着将上清液移至另一新的1.5ml离心管中。
加入90μl的100％乙醇于样品中。并以剧烈震荡充分混合；以低速短暂离心(低于两秒)的方式移除在管盖上的液体。
样品溶液加入于RNeasy mini管柱，并以每分钟13000转离心30秒；再加入350μl的RW1液并以每分钟13000转离心1分钟；舍弃离心后的过滤液。
加入10μl的DNase I原液与70μl的RDD缓冲液混合。将总共80μl的DNase I混合液直接置于离心管柱过滤膜上，并且静置于室温反应15分钟。接着以350μl的RW1液冲洗硅质过滤膜，并以每分钟13000转离心30秒；舍弃离心后的过滤液。接着以500μl的RPE液加入过滤膜，并以每分钟13000转离心30秒，舍弃离心后的过滤液。
取另外500μl的RPE液加入过滤膜，并以每分钟13000转离心30秒，同样舍弃过滤液，以13000转离心管柱2分钟。
将管柱置于另一全新的1.5毫升冲提管，最后以两次40μl不含RNase的二次水将过滤膜上的RNA样品冲提出来。
以上述方式所取得的RNA沉淀物大小(％)比较于表3A中。
表3A
表3B数据表示经由上述纯化RNA步骤，RNA的取得量(ug/ml blood)的比较。
表3B
表3A与表3B的资料显示，3％的N-N-二甲基十二烷胺配与75mM的酒石酸配方，最能移除RNA中不纯物与杂质，并有最高的回收率。
分离效率可经由电泳方式观察其结果，如图2，其中1到5行是使用1％N-N-二甲基十二烷胺，6到10行为3％N-N-二甲基十二烷胺。1与6行，2与7行，3与8行，4与9行，5与10行分别为搭配50mM，75mM，100mM，125mM与150mM酒石酸的配方。
实施例六、以三级氧化胺界面活性剂纯化全细胞RNA
制备16种界面活性剂溶液，分别包含1％浓度的氧化氮N，N-二甲基十二烷胺，与25、50、75、100、125或150mM不同浓度的顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、草酸；自全血中分离RNA的步骤同上述的实施例的说明。
表4显示在RNA萃取量(ug/ml blood)
表4
| RNA萃取量 | 25mM | 50mM | 75mM | 100mM |
| 顺丁烯二酸 | 4.32 | 3.12 | 3.84 | 2.40 |
| 柠檬酸 | 3.84 | 3.12 | 4.56 | 3.36 |
| 酒石酸 | 2.64 | 4.08 | 3.60 | 3.84 |
| 草酸 | 5.28 | 4.56 | 3.36 | 3.60 |
自图3的电泳结果可以看出纯化的效率，其中A部分为顺丁烯二酸的结果；B部分为柠檬酸；C部分为酒石酸；D部分为草酸。第一行为浓度25mM；第二行为浓度50mM；第三行为浓度75mM；第四行为浓度100mM。根据表4与图3的结果显示，以1％氧化氮N，N-二甲基十二烷胺与柠檬酸、酒石酸或草酸混合使用，可以得到良好的品质与可接受的RNA萃取量。
实施例七、以4-十四烷基苯胺自全血中纯化基因组DNA
制备3种界面活性剂溶液，分别包含1％浓度的4-十四烷基苯胺并配与3％、4％与5％不同浓度的Tween 20；取新鲜人类全血(333μl)与1ml不同配方的界面活性剂溶液混合；混合液以5000xg离心10分钟，以沉淀DNA与一级胺界面活性剂错合物；加入333μl RLT液(Qiagen，RNeasy mini kit)回溶离心沉淀物；加入200μl的1，3-溴氯丙烷，剧烈震荡以充分混合；再以10000xg离心5分钟。
将上清液转置于另一新的1.5毫升小管内，并混合160μl乙醇后，置入于含有一硅质过滤膜的离心管柱内进行离心，接着以700μl的RW1(QIAGEN GmbH)液冲洗硅质过滤膜一次；再以两次500μl的RPE液(QIAGEN GmbH)冲洗过滤膜，最后以80μl的无菌水冲提DNA分子。
自图4的电泳图结果可以看出纯化分离的效率，其中3行各代表不同浓度的Tween 20：行1代表浓度3％，行2代表4％浓度，行3代表5％浓度。根据结果，利用4-十四烷基苯胺分离DNA样品可以得到良好的品质与可接受的萃取量。除此之外，也可以萃取得完整的基因组DNA。
上述实施例仅是为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专利范围所述为准，而非仅限于上述实施例。
Claims (14)
1.一种萃取生物检体中核酸的方法，是将该生物检体与一含有胺类界面活性剂的试剂进行接触，使该生物检体中核酸与该胺类界面活性剂形成一错合物；以及
进行萃取；
其中该试剂中还包括羧酸、无机酸或其混合物，其浓度范围为0.01M至1M，且该胺类界面活性剂是具备如式(I)的通式：
R1R2R3N(O)x，式(I)；
其中，R1与R2分别为氢，含1-6个碳的烷基，含6-12个碳的芳香烃基或是含6-12个碳的烃基芳香烃基；R3为含1-20个碳的烷基、含6-26个碳的芳香烃基或是含6-26个碳的烃基芳香烃基；且x为0或1。
2.如权利要求1所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该x为1，R1与R2分别为含1-6个碳的烷基，且R3为含1-20个碳的烷基。
3.如权利要求1所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该x为0。
4.如权利要求1所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该胺类界面活性剂是选自由下列物质所组成的群组：十二烷胺，N-甲基十二烷胺，N，N-二甲基十二烷胺，氧化氮N，N-二甲基十二烷胺以及4-十四烷胺。
5.如权利要求1所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该试剂中所含的该胺类界面活性剂为0.001％至20％的浓度百分比。
6.如权利要求1所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该试剂中还包括至少一种非离子界面活性剂。
7.如权利要求6所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该非离子界面活性剂为聚氧化乙烯类界面活性剂。
8.如权利要求6所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该非离子界面活性剂为0.01％至20％的浓度百分比。
9.如权利要求6所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该非离子界面活性剂为Tween20或Triton X-100。
10.如权利要求1所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该羧酸、无机酸选自由下列物质所组成的群组：顺丁烯二酸，酒石酸，柠檬酸以及草酸。
11.如权利要求1所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该试剂为一液态水溶液。
12.如权利要求11所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该液态水溶液的pH值范围在1-10之间。
13.如权利要求1所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该试剂是一固态基质。
14.如权利要求1所述的萃取生物检体中核酸的方法，其特征在于，其中该生物检体是选自由下列物质所组成的群组：全血液，血浆，血清，尿液，组织与细胞。
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| A.V.Heydenreich, ET AL..Preparation and purification of.......International Journal of Pharmaceutics254 1.2003,254(1),83-87, 特别是第84页表1. |
| A.V.Heydenreich, ET AL..Preparation and purification of.......International Journal of Pharmaceutics254 1.2003,254(1),83-87, 特别是第84页表1. * |
| LAWRENCE LEVINE, ET AL..The Relationship of.......Biochemistry (Moscow, Russian Federation)2.1963,2168-175, 特别是第168页摘要及第171页表II. * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1796398A (zh) | 2006-07-05 |
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