CN1789239A - 同位素15n标记l－天冬酰胺的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及同位素15N标记L－天冬酰胺的制备方法，该发明利用有机合成的方法，将含有同位素标记氮15(15N)的无机原料和15N标记L－天冬氨酸，合成得到含有双标记氮15(15N)的的L－天冬酰胺。上述方法避免了常规化学合成15N－DL－天冬酰胺，再经拆分得到双标记15N－L－天冬酰胺，使得15N－无机原料和15N标记L－天冬氨酸的利用率大幅提高。最终15N－无机原料的利用率在80％以上， 15N标记L－天冬氨酸的利用率在70％以上；提纯得到的产品纯度在99％以上，丰度在99％以上。此方法同样也适用于α－15N标记、β－15N标记L－天冬酰胺的合成。
Description
技术领域
本发明涉及一种同位素15N标记L-天冬酰胺的制备方法，具体涉及利用有机合成的方法，制备α-、β-和α-、β-双15N标记L-天冬酰胺。
背景技术
氮-15(简称15N，下同)是氮元素的稳定同位素，可以用作示踪剂，广泛应用于生物化学、医学、药物学、农业科学等领域，尤其对生命科学研究有极为重大的意义。特别是在蛋白质的人工合成方面，氮-15氨基酸起着独特的示踪作用，其应用越来越广泛，市场前景良好。
由于此类产品产量小，对纯度和丰度要求高。目前主要是通过化学合成法或生物发酵法生产。化学合成法设备要求简单，生产的氨基酸是DL型氨基酸，丰度高，但不具有光学活性，需要再经化学或酶法拆分得到L型氨基酸。D型氨基酸大多被废弃，导致氮-15原料利用率降低，增加了生产成本。生物发酵法具有反应步骤少，产品光学纯度高的优点。但需要较大的设备投入，对菌种的要求高，后提取步骤较多。
L-天冬酰胺是构成蛋白质的主要成分之一，其酶法生产较为困难。目前国内外报导的方法均为化学合成法。具有代表性的有：CN.Pat.No95112751.9，U.S.Pat.No.3979449，EP.Pat.No.0376230等，主要以L-天冬氨酸同甲醇用盐酸或干燥的HCl气体为催化剂，生成中间体L-天冬氨酸-β-甲酯盐酸盐，该中间体在过量有机溶剂如乙醚等条件下沉淀析出，分离出该中间体后再氨解得到L-天冬酰胺。该方法消耗大量氨水，是目前常用的生成方法。但目前尚未看到由化学合成法生成同位素15N标记L-天冬酰胺的方法。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺简单、原料利用率高的同位素15N标记L-天冬酰胺的合成方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：同位素15N标记L-天冬酰胺的合成方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：
(1).选择性酯化反应：将原料L-天冬氨酸分散在醇类溶剂中，低温-10℃～20℃下逐渐加入无机或有机酸，并在此温度下反应1～5小时，用过量乙醚重结晶得到L-天冬氨酸-β-酯盐固体，L-天冬氨酸、醇、酸的用量比为1∶5～40∶0.1～1；
(2).选择性裂解反应：制备L-天冬氨酸-β-酯盐后所余下的母液，经减压脱除乙醚后，补加适量酸，在30～70℃下继续反应5～20小时，至薄层层析显示无L-天冬氨酸存在，加碱中和后，减压蒸干母液，用过量甲醇提取L-天冬氨酸酯，主要为α-或β-L-天冬氨酸酯以及L-天冬氨酸二酯的混合物，再经L-天冬氨酸铜盐络合物水解得到L-天冬氨酸-β-酯盐；
(3).过度酯化后再选择性裂解：将原料L-天冬氨酸分散在醇类溶剂中，低温-10℃～20℃下逐渐加入无机或有机酸，然后在30～70℃下继续反应5～20小时，至薄层层析显示仅有L-天冬氨酸二酯盐，再经L-天冬氨酸铜盐络合物水解得到L-天冬氨酸-β-酯盐；
(4).脱盐反应：将前面得到的L-天冬氨酸-β-酯盐固体分散到在无水乙醇中，在50℃～90℃下，逐滴滴加环氧丙烷，反应4～10小时，过滤得到L-天冬氨酸-β-甲酯固体，L-天冬氨酸-β-甲酯盐酸盐、无水乙醇、环氧丙烷的用量比为1∶5～30∶1～5；
(5).氨解反应：将L-天冬氨酸-β-酯溶于无水醇类溶剂中，加入15N标记或非标记无机氮源，在0℃～60℃条件下氨解10～60小时，蒸去溶剂和回收过量NH3，洗涤、烘干后得到α-15N标记或β-15N标记或α、β双15N标记的L-天冬酰胺产品。
所述的醇类溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或正丁醇中的一种或几种。
所述的无机或有机酸选自盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氯化亚砜、三氯氧磷、对甲苯磺酸中的一种或几种。
所述的原料L-天冬氨酸包括非标记或15N标记的L-天冬氨酸。
本发明提供了一套15N标记L-天冬酰胺的制备方法。在原有的有机合成L-天冬酰胺技术的基础上，结合15N原料昂贵的特点，对了工艺条件进行改变，使之具有良好的经济性和使用价值。该方法适用于合成α-、β-和α、β双15N标记L-天冬酰胺。本方法过程简单，15N原料利用率高，得到的L-天冬酰胺产品纯度在99％以上，丰度在99％以上。
具体实施方式
实施例1
同位素15N标记L-天冬酰胺的合成方法，该方法包括以下工艺步骤：
(1)酯化反应
将26.6g (0.2mol)L-天冬氨酸悬浮分散在200ml无水甲醇中，冰水浴冷却至0～5℃逐滴滴入20ml POCl3，滴加完毕后反应1.5小时。反应完毕，将反应液倾倒于500ml无水乙醚中，搅拌重结晶得到大量白色固体，过滤后用无水乙醚再洗涤两遍，过滤烘干后得到L-天冬氨酸-β-甲酯盐酸盐26.5g(0.145mol，单程收率72.5％)。熔点187.7～188.4℃，[α]20 D＝+16.7o(c＝13NHCl)。
(2)脱盐反应
将26.5gL-天冬氨酸-β-甲酯盐酸盐悬浮在200ml无水乙醇中，水浴加热至60℃，逐滴滴入20ml环氧丙烷，继续加热升温，回流5小时。冷却后过滤，用无水乙醚洗涤两遍，过滤烘干。得到L-天冬氨酸-β-甲酯17.4g(收率81.5％)，熔点189.8～190.2℃，[α]20 D＝+21.9o(c＝13N HCl)。
(3)氨解反应
取7.35g15NH4Cl(0.14mol)和40g NaOH反应，生成的15NH3通入50ml溶有2.95gL-天冬氨酸-β-甲酯(0.02mol)的甲醇中，密闭氨解，60℃下静置64小时，蒸去溶剂和及回收过量的15NH3。残余固体用20ml蒸馏水加热溶解，再加入50ml乙醇重结晶，得到白色固体，过滤后，用甲醇和乙醚各洗涤一遍，过滤，真空烘干得到β-15N标记L-天冬酰胺产品2.53g(转化率84.1％)，15NH3利用率高于80％。[α]20 D＝+28.3o(c＝1 3N HCl)。过程中过量的15NH3用稀硫酸吸收。
实施例2
同位素15N标记L-天冬酰胺的合成方法，该方法包括以下工艺步骤：
(1)酯化反应
将13.3g15N标记L-天冬氨酸(0.1mol)悬浮分散在100ml无水甲醇中，操作同实施例一，得到α-15N标记L-天冬氨酸-β-甲酯盐酸盐13.1g(0.0717mol，单程收率71.7％)，熔点187.5～188.1℃，[α]20 D＝+16.7o(c＝13N HCl)。
反应母液经减压脱除乙醚后，补加适量酸，在30～70℃下继续反应5～20小时，至薄层层析显示无L-天冬氨酸存在。加碱中和后，减压蒸干母液，用过量甲醇提取L-天冬氨酸酯盐，主要为α-或β-L-天冬氨酸酯盐以及L-天冬氨酸二酯盐的混合物。再经L-天冬氨酸铜盐络合物水解，浓缩至干得到α-15N标记L-天冬氨酸-β-甲酯盐酸盐2.74g(0.015mol)，熔点185.5～186.4℃，[α]20 D＝+16.9o(c＝1 3N HCl)，两步合并，酯化总收率86.7％。
(2)脱盐反应
操作同实施例一，得到α-15N标记L-天冬氨酸-β-甲酯9.9g(收率77.6％)。熔点189.9～190.4℃，[α]20 D＝+22.0o(c＝1 3N HCl)。
(3)氨解反应
取20gNH4Cl和110g NaOH反应，其余操作同实施例一，得到α-15N标记L-天冬酰胺产品8.2g，乙醇重结晶母液浓缩蒸干后再通入过量氨气氨解，还可得到α-15N标记L-天冬酰胺产品1.1g。原料15N标记L-天冬氨酸总收率62％，[α]20 D＝+28.4o(c＝1 3N HCl)。
实施例3
同位素15N标记L-天冬酰胺的合成方法，该方法包括以下工艺步骤：
(1)酯化反应
操作同实施例二，从13.3g15N标记L-天冬氨酸(0.1mol)得到15.8g α-15N标记L-天冬氨酸-β-甲酯盐酸盐(0.0867mol)。熔点186.7～187.3℃，[α]20 D＝+16.5o(c＝1 3N HCl)。
(2)脱盐反应
操作同实施例一，得到α-15N标记L-天冬氨酸-β-甲酯9.9g，熔点190.1～191.4℃，[α]20 D＝+22.2o(c＝1 3N HCl)。
(3)氨解反应
操作同实施例一，得到双15N标记L-天冬酰胺产品8.28g(0.055mol)。[α]20 D＝+28.5o(c＝1 3N HCl)。
Claims (4)
1.同位素15N标记L-天冬酰胺的合成方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：
(1).选择性酯化反应：将原料L-天冬氨酸分散在醇类溶剂中，低温-10℃～20℃下逐渐加入无机或有机酸，并在此温度下反应1～5小时，用过量乙醚重结晶得到L-天冬氨酸-β-酯盐固体，L-天冬氨酸、醇、酸的用量比为1∶5～40∶0.1～1；
(2).选择性裂解反应：制备L-天冬氨酸-β-酯盐后所余下的母液，经减压脱除乙醚后，补加适量酸，在30～70℃下继续反应5～20小时，至薄层层析显示无L-天冬氨酸存在，加碱中和后，减压蒸干母液，用过量甲醇提取L-天冬氨酸酯，主要为α-或β-L-天冬氨酸酯以及L-天冬氨酸二酯的混合物，再经L-天冬氨酸铜盐络合物水解得到L-天冬氨酸-β-酯盐；
(3).过度酯化后再选择性裂解：将原料L-天冬氨酸分散在醇类溶剂中，低温-10℃～20℃下逐渐加入无机或有机酸，然后在30～70℃下继续反应5～20小时，至薄层层析显示仅有L-天冬氨酸二酯盐，再经L-天冬氨酸铜盐络合物水解得到L-天冬氨酸-β-酯盐；
(4).脱盐反应：将前面得到的L-天冬氨酸-β-酯盐固体分散到在无水乙醇中，在50℃～90℃下，逐滴滴加环氧丙烷，反应4～10小时，过滤得到L-天冬氨酸-β-甲酯固体，L-天冬氨酸-β-甲酯盐酸盐、无水乙醇、环氧丙烷的用量比为1∶5～30∶1～5；
(5).氨解反应：将L-天冬氨酸-β-酯溶于无水醇类溶剂中，加入15N标记或非标记无机氮源，在0℃～60℃条件下氨解10～60小时，蒸去溶剂和回收过量NH3，洗涤、烘干后得到α-15N标记或β-15N标记或α、β双15N标记的L-天冬酰胺产品。
2.根据权利要求1所述的同位素15N标记L-天冬酰胺的合成方法，其特征在于，所述的醇类溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或正丁醇中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的同位素15N标记L-天冬酰胺的合成方法，其特征在于，所述的无机或有机酸选自盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氯化亚砜、三氯氧磷、对甲苯磺酸中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的同位素15N标记L-天冬酰胺的合成方法，其特征在于，所述的原料L-天冬氨酸包括非标记或15N标记的L-天冬氨酸。
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