CN1786159A - 一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法，是将真菌在合成液体培养基中发酵预培养获得菌种种液，与已用蒸汽灭菌的草类生物质原料混合均匀，并放入发酵罐内发酵，发酵过程中，进行间歇式的排气－通氧循环换气操作，发酵后，取出物料，挤出酶液；装置包括发酵罐、真空泵、氧气瓶、蒸汽发生器、控制系统，发酵罐是恒温罐，其上部与真空泵连接，下部与氧气瓶、蒸汽发生器分别连接，控制系统与发酵罐、真空泵、氧气瓶分别连接。本发明采用间歇式的排气－通氧循环换气操作，提高了气体交换效率和微生物产酶的能力，解决了菌种污染的问题；设备简单，可自动控制操作，提高了发酵器单位容积的发酵原料装载量，实现真菌发酵产漆酶的高产高效。
Description
技术领域
本发明涉及真菌发酵技术领域，具体是指一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法及其装置。
背景技术
许多生物酶是通过微生物经固体发酵产生，真菌及所有好氧的微生物在生长以及代谢产酶的过程都需要通入氧气。微生物在代谢过程中会产生二氧化碳，由于二氧化碳较空气和氧气的比重大，因此产生的二氧化碳在发酵原料周围的浓度较高，虽然通入氧气或增加氧压可以增加氧气与微生物的接触，但是仍不能充分穿透发酵使用的固体原料，特别是对于大型的固体发酵装置。目前采用的固体发酵装置中，通常安装有机械搅拌装置，以增强物料与鼓入氧气或空气的混和，或者增加许多的小隔板制作成多个小的浅层发酵器组。这种固体发酵设备的缺点在于：(1)机械搅拌对微生物生长不利，(2)容易产生菌种污染，(3)减少了发酵器的实际使用容积。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点和不足，提供一种高产高效，可大大提高酶活的真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法。
本发明的目的还在于提供实现上述方法的一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置。
本发明的目的通过下述技术方案实现：本真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法，其步骤是：
(1)将真菌在合成培养基液体中发酵预培养8～10天获得菌种种液，即用于扩大接种的菌丝液；
(2)把草类生物质原料放入发酵罐内，通过蒸汽发生器产生蒸汽并通入发酵罐内，蒸汽压力为1.0kg/cm2，时间为40min，使发酵罐内部以及草类生物质原料灭菌；
(3)从发酵罐内取出已灭菌的草类生物质原料，按每5千克草类生物质原料(绝干)接入700～1000毫升菌种种液的比例，将菌种种液与已灭菌的草类生物质原料混合均匀；
(4)将转接了菌种种液的草类生物质原料放入发酵罐内发酵，发酵罐内在25～40℃下保持恒温，发酵过程中，进行间歇式的排气-通氧循环换气操作，通过真空泵抽出发酵罐内气体，抽气2～10分钟，负压压力为0～-0.02Mpa，每次抽气后再通过氧气瓶充入氧气，通氧15～20分钟，氧气压力达到0.01～0.1Mpa，并保持2～6小时；
(5)发酵20～28天后，取出草类生物质原料，挤出酶液，即可得到漆酶。
为了更好得实现本发明，所述真菌是白腐菌中的革耳属，也可以是侧耳属、层孔菌属、香菇属、金钱菌属、栓菌属、多孔菌属、射脉菌属、鬼伞属、伞菌属等；所述草类生物质原料包括麦草、稻草、蔗渣、芦苇等原料。
实现上述方法的一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置，包括发酵罐、真空泵、氧气瓶、蒸汽发生器、控制系统，所述发酵罐是恒温罐，其上部与所述真空泵连接，下部与所述氧气瓶、蒸汽发生器分别连接，所述控制系统与发酵罐、真空泵、氧气瓶分别连接。
为更好地实现本发明，所述真空泵通过缓解电磁阀、抽气电磁阀与发酵罐上部连接，所述氧气瓶依次通过减压阀、充气电磁阀、气体过滤器与发酵罐下部连接，所述缓解电磁阀、抽气电磁阀、充气电磁阀分别与控制系统连接。
所述发酵罐罐体的外壁依次设置有热交换夹层、保温层，所述热交换夹层下部通过循环泵与恒温槽下部连接，热交换夹层上部通过回流管与恒温槽上部连接，所述回流管安装有温度传感器，所述温度传感器与控制系统连接，所述发酵罐罐体的下部与气体过滤器出口通过阀门与蒸汽发生器顶部的蒸汽出口管连接，罐体的下密封端盖与蒸汽发生器中部的水入口管连接。
所述发酵罐罐体的中部连接有压力表，罐体的上密封端盖连接有压力表、顶放空阀、安全阀，所述蒸汽发生器顶部设有蒸汽温度压力指示器。
所述发酵罐容积为0.020～1.0m3。所述循环泵是磁力泵，所述恒温槽的导热介质是水。本发明采用磁力泵逆向强制循环，可保证发酵罐受热均匀，对发酵过程十分有利。
所述蒸汽发生器提供1.0kg/cm2蒸汽用于发酵罐内灭菌。
所述控制系统可以按照操作参数的设定值自动控制本装置的电路运行与所述缓解电磁阀、抽气电磁阀、充气电磁阀动作，并可根据所述温度传感器的信号自动调整所述恒温槽的水温，确保发酵罐温度稳定。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明采用间歇式的排气-通氧循环换气操作，通过真空泵将发酵体系中产生的二氧化碳废气排除，然后在通入氧气，极大的提高了气体交换效率，能够有效排除微生物生长时产生的二氧化碳，又能使新的氧气进入微生物菌丝生长区域，有利于微生物生理代谢活动的正常进行，促进了菌丝的生长，提高了微生物产酶的能力，同时解决了采用现有固体发酵装置容易造成菌种污染的问题；
(2)本发明不需采用现有固体发酵装置中的机械搅拌装置，使设备趋于更简单，节省设备成本，提高了发酵器单位容积的发酵原料装载量，实现真菌发酵产漆酶的高产高效；
(3)本发明可实现自动控制操作，抽气及充氧、恒温加热等操作均通过所述控制系统进行电子控制，自动运行，方便操作，有利于各参数的准确控制；
(4)本发明采用工业氧气替代了传统的压缩空气供氧方式，在最大程度上减少了通气量，瓶装的高压氧气在减压后只须经简单的过滤即可达到无菌要求，降低了杂菌污染的机会，给下一步的产物分离工作创造了良好的条件，同时虽然实施本发明需购买工业用氧气而增加一些成本，但是与传统的空压供氧方式相比，省去了空压机的大量电力及过滤介质的物料成本，综合起来看，成本提高无几，因此本发明在大规模生产中具有较大的推广应用价值。
附图说明
图1是本发明一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置的结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一
如图1所示，本真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置，包括发酵罐1、真空泵3、氧气瓶5、蒸汽发生器17、控制系统，发酵罐1是恒温罐，容积为0.020～1.0m3，其上部与真空泵3连接，下部与氧气瓶5、蒸汽发生器17分别连接，控制系统与发酵罐1、真空泵3、氧气瓶5分别连接。
真空泵3通过缓解电磁阀16、抽气电磁阀14与发酵罐1上部连接，氧气瓶5依次通过减压阀13、充气电磁阀15、气体过滤器8与发酵罐1下部连接，缓解电磁阀16、抽气电磁阀14、充气电磁阀15分别与控制系统连接。
发酵罐1罐体的外壁依次设置有热交换夹层2、保温层，热交换夹层2下部通过循环泵6恒温槽4下部连接，热交换夹层2上部通过回流管与恒温槽4上部连接，回流管安装有温度传感器7，温度传感器7与控制系统连接，发酵罐1罐体的下部与气体过滤器8出口通过阀门12与蒸汽发生器17顶部的蒸汽出口管连接，罐体的下密封端盖通过阀门12与蒸汽发生器17中部的水入口管连接。
发酵罐1罐体的中部连接有压力表9，罐体的上密封端盖连接有压力表9、顶放空阀10、安全阀11，蒸汽发生器17顶部设有蒸汽温度压力指示器18。
本真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置的工作过程是：
(1)发酵罐灭菌：在发酵前，通过蒸汽发生器产生蒸汽并通入发酵罐内，蒸汽压力为1.0kg/cm2，时间为40min，使发酵罐内部以及草类生物质原料灭菌，为发酵作准备。
(2)发酵过程：控制系统根据温度传感器的信号自动调整恒温槽的水温，确保发酵罐内温度恒定在25～40℃间的某一设定值。同时，控制系统通过自动控制充氧及抽气动作，进行间歇式的排气-通氧循环换气操作，即：控制系统启动抽气真空泵和抽气电磁阀，通过真空泵抽出发酵罐内气体，抽气时间为2～10分钟，负压压力为0～-0.02Mpa，每次抽气后，控制系统关闭真空泵和抽气电磁阀，开启缓解电磁阀释放负压；再启动充气电磁阀，通过氧气瓶充入氧气，通氧15～20分钟，氧气压力达到0.01～0.1Mpa，并保持2～6小时。
实施例二
本真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法，其步骤是：
(1)从平皿培养真菌菌种(白腐菌中的革耳属)挑取直径1cm的菌丝块5片，接入盛有100毫升的合成液体培养基(在1升土豆汁中加入无机盐，磷酸二氢钾5克，硫酸镁0.5克，氯化钙1克)中，28℃振荡培养5天后，转入盛有1000毫升的合成液体培养基，再振荡培养3天获得菌种种液，即用于扩大接种的菌丝液；
(2)把麦草放入发酵罐内，通过蒸汽发生器产生蒸汽并通入发酵罐内，蒸汽压力为1.0kg/cm2，时间为40min，使发酵罐内部以及麦草灭菌；
(3)从发酵罐内取出已灭菌的麦草，按每5千克麦草(绝干)接入700毫升菌种种液的比例，将菌种种液与已灭菌的麦草混合均匀；
(4)将转接了菌种种液的麦草放入发酵罐内发酵，发酵罐内保持恒温25℃，发酵过程中，进行间歇式的排气-通氧循环换气操作，通过真空泵抽出发酵罐内气体，抽气2分钟，负压压力为-0.02Mpa，每次抽气后再通过氧气瓶充入氧气，通氧15分钟，氧气压力达到0.01Mpa，并保持2小时；
(5)发酵22天后，取出麦草，挤出酶液，即可得到漆酶。
实施例三
本真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法，其步骤是：
(1)从平皿培养真菌菌种(白腐菌中的革耳属)挑取直径1cm的菌丝块5片，接入盛有100毫升的合成液体培养基(在1升土豆汁中加入无机盐，磷酸二氢钾5克，硫酸镁0.5克，氯化钙1克)中，28℃振荡培养5天后，转入盛有1000毫升的合成液体培养基，再振荡培养3天获得菌种种液，即用于扩大接种的菌丝液；
(2)把稻草放入发酵罐内，通过蒸汽发生器产生蒸汽并通入发酵罐内，蒸汽压力为1.0kg/cm2，时间为40min，使发酵罐内部以及稻草灭菌；
(3)从发酵罐内取出已灭菌的稻草，按每5千克稻草(绝干)接入800毫升菌种种液的比例，将菌种种液与已灭菌的稻草混合均匀；
(4)将转接了菌种种液的稻草放入发酵罐内发酵，发酵罐内保持恒温30℃；
(5)发酵过程中，进行间歇式的排气-通氧循环换气操作，通过真空泵抽出发酵罐内气体，抽气5分钟，负压压力为-0.01Mpa，每次抽气后再通过氧气瓶充入氧气，通氧16分钟，氧气压力达到0.05Mpa，并保持3小时；
(6)发酵24天后，取出稻草，挤出酶液，即可得到漆酶。
实施例四
本真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法，其步骤是：
(1)从平皿培养真菌菌种(白腐菌中的革耳属)挑取直径1cm的菌丝块5片，接入盛有100毫升的合成液体培养基(在1升土豆汁中加入无机盐，磷酸二氢钾5克，硫酸镁0.5克，氯化钙1克)中，28℃振荡培养5天后，转入盛有1000毫升的合成液体培养基，再振荡培养4天获得菌种种液，即用于扩大接种的菌丝液；
(2)把蔗渣放入发酵罐内，通过蒸汽发生器产生蒸汽并通入发酵罐内，蒸汽压力为1.0kg/cm2，时间为40min，使发酵罐内部以及蔗渣灭菌；
(3)从发酵罐内取出已灭菌的蔗渣，按每5千克蔗渣(绝干)接入900毫升菌种种液的比例，将菌种种液与已灭菌的蔗渣混合均匀；
(4)将转接了菌种种液的蔗渣放入发酵罐内发酵，发酵罐内保持恒温35℃，发酵过程中，进行间歇式的排气-通氧循环换气操作，通过真空泵抽出发酵罐内气体，抽气8分钟，负压压力为-0.05Mpa，每次抽气后再通过氧气瓶充入氧气，通氧18分钟，氧气压力达到0.08Mpa，并保持5小时；
(5)发酵26天后，取出蔗渣，挤出酶液，即可得到漆酶。
实施例五
本真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法，其步骤是：
(1)从平皿培养真菌菌种(白腐菌中的革耳属)挑取直径1cm的菌丝块5片，接入盛有100毫升的合成液体培养基(在1升土豆汁中加入无机盐，磷酸二氢钾5克，硫酸镁0.5克，氯化钙1克)中，28℃振荡培养5天后，转入盛有1000毫升的合成液体培养基，再振荡培养5天获得菌种种液，即用于扩大接种的菌丝液；
(2)把芦苇放入发酵罐内，通过蒸汽发生器产生蒸汽并通入发酵罐内，蒸汽压力为1.0kg/cm2，时间为40min，使发酵罐内部以及芦苇灭菌；
(3)从发酵罐内取出已灭菌的芦苇，按每5千克芦苇(绝干)接入1000毫升菌种种液的比例，将菌种种液与已灭菌的芦苇混合均匀；
(4)将转接了菌种种液的芦苇放入发酵罐内发酵，发酵罐内保持恒温40℃，发酵过程中，进行间歇式的排气-通氧循环换气操作，通过真空泵抽出发酵罐内气体，抽气10分钟，负压压力为0Mpa，每次抽气后再通过氧气瓶充入氧气，通氧20分钟，氧气压力达到0.1Mpa，并保持6小时；
(5)发酵28天后，取出芦苇，挤出酶液，即可得到漆酶。
实施例六
采用真菌是白腐菌中的侧耳属，其他操作要求与实施例二相同。
实施例七
采用真菌是白腐菌中的侧耳属，其他操作要求与实施例三相同。
实施例八
采用真菌是白腐菌中的侧耳属，其他操作要求与实施例四相同。
实施例九
采用真菌是白腐菌中的侧耳属，其他操作要求与实施例五相同。
实施例十
采用真菌是白腐菌中的层孔菌属，其他操作要求与实施例二相同。
实施例十一
采用真菌是白腐菌中的层孔菌属，其他操作要求与实施例三相同。
实施例十二
采用真菌是白腐菌中的层孔菌属，其他操作要求与实施例四相同。
实施例十三
采用真菌是白腐菌中的层孔菌属，其他操作要求与实施例五相同。
实施例十四
采用真菌是白腐菌中的香菇属，其他操作要求与实施例二相同。
实施例十五
采用真菌是白腐菌中的香菇属，其他操作要求与实施例三相同。
实施例十六
采用真菌是白腐菌中的香菇属，其他操作要求与实施例四相同。
实施例十七
采用真菌是白腐菌中的香菇属，其他操作要求与实施例五相同。
实施例十八
采用真菌是白腐菌中的金钱菌属，其他操作要求与实施例二相同。
实施例十九
采用真菌是白腐菌中的金钱菌属，其他操作要求与实施例三相同。
实施例二十
采用真菌是白腐菌中的金钱菌属，其他操作要求与实施例四相同。
实施例二十一
采用真菌是白腐菌中的金钱菌属，其他操作要求与实施例五相同。
实施例二十二
采用真菌是白腐菌中的栓菌属，其他操作要求与实施例二相同。
实施例二十三
采用真菌是白腐菌中的栓菌属，其他操作要求与实施例三相同。
实施例二十四
采用真菌是白腐菌中的栓菌属，其他操作要求与实施例四相同。
实施例二十五
采用真菌是白腐菌中的栓菌属，其他操作要求与实施例五相同。
实施例二十六
采用真菌是白腐菌中的多孔菌属，其他操作要求与实施例二相同。
实施例二十七
采用真菌是白腐菌中的多孔菌属，其他操作要求与实施例三相同。
实施例二十八
采用真菌是白腐菌中的多孔菌属，其他操作要求与实施例四相同。
实施例二十九
采用真菌是白腐菌中的多孔菌属，其他操作要求与实施例五相同。
实施例三十
采用真菌是白腐菌中的射脉菌属，其他操作要求与实施例二相同。
实施例三十一
采用真菌是白腐菌中的射脉菌属，其他操作要求与实施例三相同。
实施例三十二
采用真菌是白腐菌中的射脉菌属，其他操作要求与实施例四相同。
实施例三十三
采用真菌是白腐菌中的射脉菌属，其他操作要求与实施例五相同。
实施例三十四
采用真菌是白腐菌中的鬼伞属，其他操作要求与实施例二相同。
实施例三十五
采用真菌是白腐菌中的鬼伞属，其他操作要求与实施例三相同。
实施例三十六
采用真菌是白腐菌中的鬼伞属，其他操作要求与实施例四相同。
实施例三十七
采用真菌是白腐菌中的鬼伞属，其他操作要求与实施例五相同。
实施例三十八
采用真菌是白腐菌中的伞菌属，其他操作要求与实施例二相同。
实施例三十九
采用真菌是白腐菌中的伞菌属，其他操作要求与实施例三相同。
实施例四十
采用真菌是白腐菌中的伞菌属，其他操作要求与实施例四相同。
实施例四十一
采用真菌是白腐菌中的伞菌属，其他操作要求与实施例五相同。
对上述实施例二～四十一，用ABTS作底物测定漆酶酶活，酶活平均达2万国际单位/升，相同条件下，不进行换气发酵白腐菌所产的漆酶酶活平均仅为5000国际单位/升，酶活得到大大提高。
如上所述，便可较好地实现本发明。
Claims (9)
1、一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将真菌在合成液体培养基中发酵预培养8～10天获得菌种种液，即用于扩大接种的菌丝液；
(2)通过蒸汽发生器产生蒸汽并通入发酵罐内，蒸汽压力为1.0kg/cm2，时间为40min，使发酵罐内部以及草类生物质原料灭菌；
(3)按每5千克草类生物质原料(绝干)接入700～1000毫升菌种种液的比例，将菌种种液与已灭菌的草类生物质原料混合均匀；
(4)将转接了菌种的草类生物质原料放入发酵罐内发酵，发酵罐内保持恒温25～40℃(表述是否准确？)；
(5)发酵过程中，进行间歇式的排气-通氧循环换气操作，通过真空泵抽出发酵罐内气体，抽气2～10分钟，负压压力为0～-0.02Mpa，每次抽气后再通过氧气瓶充入氧气，通氧15～20分钟，氧气压力达到0.01～0.1Mpa，并保持2～6小时；
(6)发酵20～28天后，取出草类生物质原料，挤出酶液，即可得到漆酶。
2、按权利要求1所述一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法，其特征在于：所述真菌包括白腐菌中的革耳属、侧耳属、层孔菌属、香菇属、金钱菌属、栓菌属、多孔菌属、射脉菌属、鬼伞属、伞菌属。
3、按权利要求1所述一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵方法，其特征在于：所述草类生物质原料包括麦草、稻草、蔗渣、芦苇。
4、一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置，其特征在于：包括发酵罐、真空泵、氧气瓶、蒸汽发生器、控制系统，所述发酵罐是恒温罐，其上部与所述真空泵连接，下部与所述氧气瓶、蒸汽发生器分别连接，所述控制系统与发酵罐、真空泵、氧气瓶分别连接。
5、按权利要求4所述一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置，其特征在于：所述真空泵通过缓解电磁阀、抽气电磁阀与发酵罐上部连接，所述氧气瓶依次通过减压阀、充气电磁阀、气体过滤器与发酵罐下部连接，所述缓解电磁阀、抽气电磁阀、充气电磁阀分别与控制系统连接。
6、按权利要求5所述一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置，其特征在于：所述发酵罐罐体的外壁依次设置有热交换夹层、保温层，所述热交换夹层下部通过循环泵与恒温槽下部连接，热交换夹层上部通过回流管与恒温槽上部连接，所述回流管安装有温度传感器，所述温度传感器与控制系统连接，所述发酵罐罐体的下部与气体过滤器出口通过阀门与蒸汽发生器顶部的蒸汽出口管连接，罐体的下密封端盖与蒸汽发生器中部的水入口管连接。
7、按权利要求6所述一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置，其特征在于：所述发酵罐罐体的中部连接有压力表，罐体的上密封端盖连接有压力表、顶放空阀、安全阀，所述蒸汽发生器顶部设有蒸汽温度压力指示器。
8、按权利要求6所述一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置，其特征在于：所述发酵罐容积为0.020～1.0m3。
9、按权利要求6所述一种真菌发酵产漆酶的深层固体发酵装置，其特征在于：所述循环泵是磁力泵，所述恒温槽的导热介质是水。
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