CN1778308A - 胡黄连苷ii在制备治疗乙型肝炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药新药研究开发领域，具体而言，涉及胡黄连苷II在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。实验证明胡黄连苷II具有明显的抑制乙型肝炎病毒复制、保肝及调节免疫系统的效果，它具有明显的治疗乙型肝炎的作用，包括治疗急、慢性乙型肝炎。用该单体制备成的治疗乙型肝炎的药物毒副作用较低，使用安全性较高。

Description

胡黄连苷II在制备治疗乙型肝炎药物中的应用

发明领域

本发明属于中药新药研究开发领域，具体而言，涉及胡黄连苷II在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

背景技术

目前世界上有3.5亿慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者，占世界人口的5％。亚洲和非洲HBV携带率为8％-15％，HBV携带者中50％-70％病毒复制活跃，为慢性乙肝。5年随访研究表明，慢性乙肝病人肝硬化发生率为2％-20％，代偿性肝硬化发展成失代偿性肝硬化为20％-23％，发展成肝癌的占6％-15％。据调查推算，中国的慢性乙肝病人中，约25％-40％最终将死于肝硬化或合并肝癌。HBV携带者最终死于相关肝病的危险性，男性为50％，女性为15％。寻求理想的抗HBV药物一直是亟待解决的研究课题。

以往α干扰素(IFN-α)被认为是唯一有效的抗病毒治疗药物，但它的适应症有限，耐药性较强，易出现反弹，不良反应的发生率较高，且价格高昂贵。近年来，许多核苷类药物被发现具有很强的HBV作用，如拉米夫定、阿昔洛韦或其口服制剂泛昔洛韦、Adefovir及Lobucavir等，其中以拉米夫定的研究较为深入，但长期拉米夫定治疗慢性乙型肝炎可引起HBV DNA多聚酶基因酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)位点突变，使病毒对拉米夫定产生耐药，难以推广应用。

中药胡黄连原出于《唐本草》谓其“大寒”，“主骨蒸劳热，补脾胆，明目”。《新修本草》曰“主骨蒸劳热，补肝胆，明目，……厚肠胃”。《开宝本草》谓其“味苦、平、无毒”。《雷火炝制药性解》中，其归经“入肝、胆、胃三经”。缪希雍《本草经疏》曰“胡黄连，善除湿热，……一切湿热，邪热，阴分伏热所生诸病，莫不消除。”《药品化义》曰：“胡黄连，独入血分而清热。”《本草正义》言“湿火结聚，非此不能直达病所。”胡黄连善除湿热、消积聚，补肝胆，可清除慢性乙型肝炎的湿热病邪，保肝胆以助除疫毒，为彻底治疗本病提供了依据。

胡黄连是玄参科植物胡黄连Picrorhiza scrophulariifloraPennell干燥根茎，是多年生草本植物，生长于高寒地区的岩石上及土堆中，或者浅土层的向阳处，分布于四川西部，云南西北部、西藏南部。据文献记载，胡黄连中含有环烯醚萜苷类、葫芦素类、酚苷类，另外还含有少量的芳香酸和D-甘露醇，其中胡黄连苷II(Picroside II，Amphicoside)是属于环烯醚萜苷类化合物。目前对西藏胡黄连的化学成分研究已有较大进展，对胡黄连苷II的医疗用涂也有报道，如申请号为02125544.X中记载胡黄连苷II可用于治疗、预防过敏性炎性疾病，但至今尚未有胡黄连苷II用于治疗乙型肝炎的详细报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种胡黄连苷II在制备治疗乙型肝炎药物中的新应用。

本发明的另一个目的在于提供了含有胡黄连苷II的治疗乙型肝炎的药物组合物。

本发明人经过多年不懈的努力，终于研制出治疗乙型肝炎的中药药物，该中药药物的主要成分是从胡黄连药材中提取的胡黄连苷II单体，可以通过口服、经皮、经肌肉或皮下、静脉途径给药，该药物可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、注射剂、贴剂等形式存在。实验证明含有胡黄连苷II的药物组合物具有明显的治疗乙型肝炎的作用，包括治疗急、慢性乙型肝炎。该成果必将为胡黄连及其制剂走向国际市场提供重要的科学理论依据，为我国众多的乙型肝炎疾病患者提供了新型高效低毒的治疗乙肝中药。

胡黄连苷II是一种植物成分，主要存在于玄参科植物胡黄连属植物中，其化学结构式如下：

分子式：C₂₃H₂₈O₁₃

分子量：512

熔  点：214℃-215℃

溶解性：水、甲醇、乙醇易溶，丙酮溶解，乙酸乙酯稍溶。

本发明人通过系列实验证明胡黄连苷II具有明显的治疗乙型肝炎的作用。它具有抑制乙肝病毒复制、保护肝脏、调节机体免疫等功能，且毒副作用较低、作用机理明确。

为了证明胡黄连苷II对乙型肝炎有治疗作用，包括对急性、慢性乙型肝炎的治疗作用，本发明人采用口服和注射途径对胡黄连苷II进行了大量的动物实验，实验结果表明：对四氯化碳、D-胺基半乳糖和对乙酰氨基酚造成急性肝损伤大鼠和小鼠的肝脏有一定的预防保护作用；对免疫性肝炎和四氯化碳造成慢性肝损伤大鼠的肝脏有明显的保护作用；对四氯化碳(CCL₄)、D-胺基半乳糖和对乙酰氨基酚造成急性肝损伤大鼠和小鼠肝脏有明显的治疗作用；对免疫性肝炎和四氯化碳造成慢性肝损伤大鼠的肝脏有明显的治疗作用；对鸭乙型病毒性肝炎有明显的治疗作用；能明显降低2.2.15细胞培养上清液中乙肝病毒表面抗原和e抗原的含量。上述实验证明胡黄连苷II为一种治疗乙型肝炎的有效化合物。

胡黄连苷II在治疗乙型肝炎中的应用，其主要优点是该药物较西药如拉米夫定、阿西洛韦等毒性较小，宜长期服用。

本发明同时对胡黄连苷II治疗乙型肝炎的作用机理进行了初步探讨，主要进行了如下两个实验：对体外培养小鼠、大鼠肝细胞凋亡和相关基因表达实验和对小鼠肝细胞氧化损伤的保护及抗氧化作用的机理实验。两实验结果表明该化合物作用机理为：通过抑制Fas蛋白表达，上调Bc1-2蛋白表达来影响肝细胞凋亡；通过减少膜脂质过氧化产物，提高机体清除氧自由基能力，强化抗氧化解毒系统，对肝细胞氧化损伤具有保护作用，从而达到治疗乙型肝炎的作用。

本发明同时进行了胡黄连苷II的一般药理实验，包括：对小鼠自发活动及其它系统影响；对小鼠神经系统的影响(戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验)；对麻醉猫呼吸、血压、心电的影响实验。实验结果表明：给小鼠灌胃胡黄连苷II(22mg/kg、44mg/kg、88mg/kg)，对小鼠自发活动、神经系统有其它系统未见影响；对麻醉猫经十二指肠给予胡黄连苷II(7mg/kg、14mg/kg、28mg/kg)后，也未见对其血压、ECG、心率、心律，呼吸频率及呼吸深度有影响。

本发明还进行了胡黄连苷II的长期毒性试验，包括：

(1)胡黄连苷II灌胃大鼠长期毒性试验

胡黄连苷II以20mg/kg、142mg/kg、500mg/kg三个剂量分别给Wistar大鼠灌胃，每天1次，每周6次，连续26周。各给药组的一般情况、摄食量、体重、尿常规分析、血液学指标、血液生化指标、脏器重量、脏器系数、系统尸解及病理组织检查，与对照品比较均无显著性差异，未见明显毒性反应。停药后4周的恢复期，各项检测指标均未见迟缓毒性。

(2)Beagle犬口服胡黄连苷II长期毒性试验

给Beagle犬口服胡黄连苷II 10mg/kg、70mg/kg、250mg/kg三种剂量，每天1次，每周6次，连续给药26周。3个剂量组动物的一般情况、体重增长、心电图、血液学指标、血清生化学指标、尿常规、系统尸解、脏器系数及病理组织学检查，与对照组比较均无统计学意义，未见明显毒性反应。停药后4周的恢复期，观察以所有检测指标均未见迟缓毒性反应。长期毒性试验的结果表明，Beagle犬连续口服胡黄连苷II26周，未见有明显的毒性反应。

上述长期毒性实验证明胡黄连苷II的用药是安全的。

具体实施方式

用以下的实施例对胡黄连苷II治疗乙型肝炎的有益效果作进一步阐述，但本发明并不限于下列实施例包含的内容。

[实施例1]胡黄连苷II对CCL₄致小鼠急性肝损伤的治疗作用

取昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重22±2g，按体重随机分为正常组、模型组、阳性甘利欣(50mg/kg)、胡黄连苷II小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(30mg/kg)共6组，每组10只。除正常组给予等体积的花生油外，其余各组均腹腔注射0.12％的CCL₄花生油溶液0.1mL/10g，造成小鼠急性肝损伤模型。除正常与模型组给予等体积的生理盐水外，其余各组均于造模后1小时、10小时及21小时静脉注射胡黄连苷II或甘利欣一次，均按0.1mL/10g体积给药。于造模后22小时摘眼球取血，测血清ALT、AST。结果如下：

表1胡黄连苷II对小鼠CCl₄急性肝损伤血清ALT的影响( x±s)

组别	剂量(mg/kg)	n	ALT(U/L)
				正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--50102030	101010101010	55.29±13.11433.40±210.19△△△238.10±138.18*251.78±192.75237.39±145.20*183.50±65.04**

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，；与正常组比较△△△P＜0.001。

表2胡黄连苷II对小鼠CCl₄急性肝损伤血清AST的影响( x±s)

组别	剂量(mg/kg)	n	AST(U/L)
				正常对照组模型对照组阳性对照组	--50	101010	152.62±28.61606.61±345.85△△292.51±157.98*

胡黄连苷II

102030

101010

386.95±266.61318.87±241.04*242.04±121.35**

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较△△P＜0.01。

从以上实验结果可以看出，胡黄连苷II能明显降低CCl₄急性肝损伤小鼠血清ALT、AST值，因此胡黄连苷II对CCL₄诱发的小鼠急性肝损伤有明显的治疗作用。

[实施例2]胡黄连苷II对CCl₄致大鼠慢性肝损伤的治疗作用

方法：取SD大鼠78只，雌雄各半，体重300g左右。根据体重随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(甘利欣30mg/kg)、胡黄连苷II小(7mg/kg)、中(14mg/kg)和大(28mg/kg)剂量组，共6组。除正常对照组皮下注射花生油外，其余各组均皮下注射25％CCL₄花生油溶液2mL/kg，每周二、五各一次，连续8周，造成大鼠慢性肝损伤模型。除正常对照组及模型对照组给予等体积生理盐水外，阳性对照组、胡黄连苷II各剂量组于造模第2周均尾静脉注射给药0.5mL/100g(阳性组按0.6mL/100g体积给药，尾静脉注射给药不成功者腹腔注射给药)，每天1次，连续6周，并于给药第二周、第四周眶后取血测血清ALT、AST、TP、ALB。于第6周末次给药1小时后，各组腹腔注射剂量为30mg/kg的戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，离心取血清，测血清ALT、AST、TP、ALB，取肝脏测定羟脯胺酸及肝糖原水平。结果如下：

1.胡黄连苷II给药1周后对血清AST、ALT、TP及ALB的影响：

表3胡黄连苷II给药1周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤

                        的治疗作用(AST，ALT)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	ALT(U/L)	AST(U/L)
					正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--3071428	111212141314	62.31±15.28857.21±339.29△△△534.22±350.05*673.81±217.56615.20±345.40509.85±249.61**	183.93±54.46898.62±265.88△△△606.62±217.05**662.69±268.24*623.75±264.06*552.92±251.84**

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较△△△P＜0.001。

表4胡黄连苷II给药1周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤

          的治疗作用(TP，ALB)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	TP(g/dl)	ALB(g/dl)
					正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--3071428	111212141314	66.97±7.0657.63±6.84△△63.71±3.32*62.76±5.42*62.83±4.02*64.00±1.74**	3.64±0.223.20±0.36△△3.50±0.21*3.49±0.29*3.53±0.19**3.52±0.16**

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较△△P＜0.01。

表5胡黄连苷II给药1周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤

    的治疗作用(白蛋白/球蛋白-A/G)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	A/G
				正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--3071428	111212141314	1.27±0.391.41±0.591.26±0.261.32±0.411.34±0.351.24±0.16

由上表结果可见，无论是模型组与正常组比较，还是其余各组与模型组比较，A/G均无明显变化(P＞0.05)。

2.胡黄连苷II给药3周后对血清AST、ALT、TP及ALB的影响：

表6胡黄连苷II给药3周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤

        的治疗作用(AST，ALT)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	AST(U/L)	ALT(U/L)
					正常对照组模型对照组	--	1111	149.86±30.95944.19±188.45△△△	58.18±7.70965.33±231.68△△△

阳性对照组胡黄连苷II

3071428

11141213

660.14±280.40*708.23±303.42*627.81±241.95**648.47±191.58***

617.38±260.85**739.02±331.05614.43±290.39**566.35±265.13***

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与正常组比较△△△P＜0.001。

表7胡黄连苷II给药3周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤

        的治疗作用(TP，ALB)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	TP(g/dl)	ALB(g/dl)
					正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--3071428	111111141213	74.78±3.9164.29±3.83△△△69.54±3.74**68.78±7.3769.50±3.92**69.61±4.00**	3.64±0.223.27±0.35△△3.58±0.21*3.47±0.203.57±0.11*3.60±0.17**

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较△△＜0.01，△△△P＜0.001。

表8胡黄连苷II给药3周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤的

          治疗作用(A/G)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	A/G
				正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--3071428	111111141213	0.96±0.151.07±0.281.07±0.151.08±0.341.07±0.141.09±0.17

由上表结果可见，无论是模型组与正常组比较，还是其余各组与模型组比较，A/G均无明显变化(P＞0.05)。

3.胡黄连苷II给药6周后对血清AST、ALT、TP、ALB、肝糖原及肝脏羟脯氨酸的影响：

表9胡黄连苷II给药6周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤

        的治疗作用(AST，ALT)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	AST(U/L)	ALT(U/L)
					正常对照组模型对照组阳性对照组	--30	111111	154.36±18.86753.25±225.63△△△339.02±133.32***	55.58±10.43500.68±215.01△△△213.29±117.21**

胡黄连苷II

71428

141212

379.96±283.82**246.56±83.27***193.27±105.13***

259.19±255.31*213.89±237.69**136.05±61.27***

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与正常组比较△△△P＜0.001。

表10胡黄连苷II给药6周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤

       的治疗作用(TP，ALB)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	TP(g/dl)	ALB(g/dl)
					正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--3071428	111111141212	66.52±13.3347.79±6.67△△△56.76±8.07*50.39±4.7456.47±9.12*56.66±7.81**	3.01±0.832.22±0.55△2.94±0.53**2.67±0.43*2.78±0.52*2.96±0.56**

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较△△△P＜0.001。

表11胡黄连苷II给药6周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤

       的治疗作用(A/G)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	A/G
				正常对照组模型对照组	--	1111	1.03±0.661.04±0.63

阳性对照组胡黄连苷II

40102030

11141212

1.17±0.471.25±0.631.13±0.671.18±0.49

由上表结果可见，无论是模型组与正常组比较，还是其余各组与模型组比较，A/G均无明显变化(P＞0.05)。

表12胡黄连苷II给药6周后对CCl₄致大鼠慢性肝损伤

   的治疗作用(肝糖原和肝脏羟脯氨酸)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	肝糖原(mg/g肝重)	肝脏羟脯氨酸ug/g
					正常对照组模型对照组阳性对照组注射用胡黄连苷II	--3071428	111111141212	18.99±6.084.23±1.44△△△6.97±2.04**73.19±2.01***8.02±1.47***10.44±1.51***	160.06±19.68667.28±96.81△△△477.03±198.10**509.84±145.31**402.66±164.99***391.65±129.92***

注：与模型对照组比较**P＜0.01，***P＜0.001；与正常组比较△△△P＜0.001。

从上述试验结果可以看出：胡黄连苷II能明显降低血清ALT、AST及肝羟脯胺酸，升高TP、ALB及肝糖原值，肝损伤明显减轻。因此胡黄连苷II对CCl₄致大鼠慢性肝损伤有明显的治疗作用。

[实施例3]胡黄连苷II对小鼠免疫性肝损伤的治疗作用

方法：取昆明种小鼠72只，雌雄各半，体重24±3g按体重随机分为正常组、模型组、阳性甘利欣(50mg/kg)、胡黄连苷II小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(30mg/kg)共6组，每组12只。除正常组给予等体积的生理盐水外，其余各组均尾静脉注射卡介苗5×10⁷U/只一次，12天后小鼠再尾静脉注射LPS 6.0ug/只一次，造成小鼠肝损伤模型。除正常与模型组给予等体积的生理盐水外，其余各组均于注射卡介苗造模后每天尾静脉注射胡黄连苷II或甘利欣一次。胡黄连苷II及甘利欣均按0.1mL/10g体积给药。于注射LPS后12h，摘眼球取血，离心血清测ALT、AST；取肝脏、脾、胸腺，称重计算脏器系数。

实验结果如下：

表13胡黄连苷II对免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响

                        ( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	ALT(U/L)	AST(U/L)
					正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--50102030	121011101112	46.22±11.08714.83±304.29△△△304.21±153.97**462.94±229.94401.18±252.67*343.29±252.29**	154.18±40.86732.45±168.02△△△476.08±182.45**528.73±175.10*462.00±256.43*447.89±189.09**

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较△△△P＜0.001。

表14胡黄连苷II对免疫性肝损伤小鼠脏器系数影响( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	肝(％)	脾(％)	胸腺(％)
						正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--50102030	121011101112	4.13±0.257.85±1.22△△△6.67±0.55*6.80±0.74*6.69±0.73*6.40±1.02**	0.46±0.121.17±0.26△△△0.90±0.15*0.92±0.12*0.88±0.21*0.84±0.14**	0.22±0.040.23±0.060.25±0.060.19±0.040.26±0.050.21±0.04

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较△△△P＜0.001。

从上述试验结果可以看出：胡黄连苷II能降低肝损伤小鼠血清ALT、AST；亦能降低肝脏、脾系数、但对胸腺系数无明显影响；因此胡黄连苷II对免疫性肝损伤小鼠有明显的治疗作用。

[实施例4]胡黄连苷II口服给药对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

方法：采用巨噬细胞中性红法。取ICR小鼠60只，雄性，体重17-19g，按体重随机分为五组，即正常对照组、阳性对照组(左旋米唑，20mg/kg)、胡黄连苷II小(20mg/kg)、中(40mg/kg)和大(80mg/kg)剂量组。各给药组均灌胃给药，每日一次，连续5天。给药第5天，给药1小时后摘眼球放血处死小鼠，浸于75％酒精中消毒后，在超净台中以6mL的PBS注入腹腔内，按摩腹腔取出腹腔液，离心，洗细胞2次，以胎盘兰计数活细胞(活细胞数＞98％)，调整细胞浓度至2×10⁶/mL，加入96孔细胞培养板，200ul/孔，置37℃、5％CO2细胞培养箱中温育24小时使巨噬细胞贴壁，取出板甩去未贴壁的细胞，用PBS洗涤培养板3次，加入0.072％中性红溶液100ul/孔，继续温育30分钟，甩去多余的中性红溶液，再洗板3次。最后加入细胞溶解液(蒸馏水50mL，无水乙醇50mL，冰醋酸0.3mL)100ul/孔，摇动后4℃静置过夜，取出板室温静置30分钟后，用酶标仪测吸光值(A)，波长570nm。比较各组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活力。统计学方法：采用组间t检验。

实验结果如下：

表15胡黄连苷II对正常小鼠腹腔小鼠吞噬功能( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	A值
				正常对照组阳性对照组胡黄连苷II	-20204080	88888	0.148±0.0370.211±0.040*0.198±0.021**0.193±0.044*0.171±0.076

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

结果表明：胡黄连苷II可以明显增强正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，能够增强机体非特异性免疫功能。

[实施例5]胡黄连苷II口服给药对CCL₄致大鼠慢性肝损伤的预防保护作用

方法：取Wistar大鼠72只，根据体重随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(联苯双酯，150mg/kg)、胡黄连苷II小(2mg/kg)、中(4mg/kg)、大(8mg/kg)剂量组。各给药组按1mL/100g体积灌胃，正常及模型对照组给予等体积的生理盐水，每日1次，连续灌胃给药28天。灌胃给药7天后，除正常对照组皮下注射花生油溶液外，其余各组均皮下注射25％CCL4花生油溶液5mL/kg，每周2次，共3周，造成慢性肝损伤模型。于末次给药后1小时，腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)将大鼠麻醉，腹主动脉取血，测血清AST、ALT、TP及ALB，处死动物取肝脏，测定肝糖元和羟腹氨酸的含量。统计学方法：采用组间t检验。

实验结果如下：

表16胡黄连苷II口服给药对CCl₄致大鼠慢性肝损伤的预防

          保护作用(AST，ALT)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	AST(U/L)	ALT(U/L)
					正常对照组模型对照组阳性对	--150	1089	154.36±18.86710.90±230.66△△△330.78±137.55***	54.75±10.61300.90±142.68△△102.09±58.61**

照组胡黄连苷II

248

91010

198.39±65.10***216.17±42.37***176.43±93.60***

130.78±68.12*141.18±39.18*117.00±46.43**

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与正常组比较△△P＜0.01；△△△P＜0.001。

表17胡黄连苷II口服给药对CCl₄致大鼠慢性肝损伤的预防保护作用

                  (TP，ALB)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	TP(g/dl)	ALT(g/dl)
					正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--150248	108991010	68.44±14.0144.53±2.80△△△48.25±3.42*49.71±4.34*51.74±6.80*50.57±3.66**	3.05±0.862.07±0.22△2.66±0.612.45±0.46*2.23±0.50*2.55±0.32**

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较△P＜0.05；△△△P＜0.001。

表18胡黄连苷II口服给药对CCl₄致大鼠慢性肝损伤的预防保护作用

                (肝糖元和羟腹氨酸)( x±s)

组别	剂量mg/kg	n	肝糖元(mg/g)	肝脏羟腹氨酸(ug/kg)
					正常对照组模型对照组阳性对照组胡黄连苷II	--150248	108991010	19.05±6.414.64±150△△△7.36±1.67**6.46±1.39*8.35±1.19***10.58±1.62***	160.13±20.74684.46±108.29△△△488.94±204.62*475.66±208.20*475.56±187.02*377.46±138.87***

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与正常组比较，△△△P＜0.001。

以上结果表明，胡黄连苷II口服给药能显著降低四氯化碳大鼠慢性肝损伤血清ALT、AST的水平，也能抑制血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)及肝糖元的降低和肝脏羟腹氨酸的升高的作用，说明胡黄连苷II口服给药对CCL4致大鼠慢性肝损伤有预防保护作用。

[实施例6]胡黄连苷II对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的抑制作用

方法：

①胡黄连苷II对HepG₂2.2.15细胞的毒性实验

方法：将在对数生长期的HepG₂2.2.15细胞的培养瓶中上清液弃去，加入0.25％的胰酶1-2mL，消化后加培养液吹打，将细胞吹打成单个细胞悬液，进行细胞计数后，配制成1×10⁵个/mL的细胞浓度，接种于96孔培养板中，每孔200μL，37℃5％CO₂培养箱中培养24h，细胞长成单层后进行实验。将胡黄连苷II用培养液稀释6个浓度(35.0mg/mL、30.0mg/mL、15.0mg/mL、10.0mg/mL、7.5mg/mL、5.0mg/mL)。加于96孔培养板，每浓度5孔，每4天换同浓度药液，设无药物细胞为对照组，8天后观察结果。弃去96孔板各孔中上清，每孔加入MTT培养液0.4mg/mL200μL，37℃5％CO₂培养箱中培养4h，弃去各孔中液体，每孔加DMSO200μL震荡10min，用酶联免疫检测仪490nm波长测定OD值。

观察指标及数据统计方法：计算药物对细胞生长的抑制率、半数毒性浓度及无毒浓度。

抑制率＝(细胞对照组平均OD值-给药组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-空白对照组平均OD值)×100％

用BLiss法计算胡黄连苷II对2.2.15细胞的半数毒性浓度TC₅₀及无毒浓度(近似使95％的细胞存活的药物浓度)。

进行MTT实验(检测药物对2.2.15细胞的毒性)，目的是为胡黄连苷II对乙肝病毒HBsAg、HBeAg的抑制实验中药物浓度的设置提供依据；同对乙肝病毒HBsAg、HBeAg的抑制实验平行操作的MTT实验与药效实验相同均重复三次，其实验结果用于治疗指数(TI)的计算。

②胡黄连苷II对HepG₂2.2.15细胞培养中乙肝病毒HBsAg、HBeAg的抑制

方法：将HepG₂2.2.15细胞按1×10⁵个/mL的细胞浓度接种于24孔培养板中，每孔1mL，37℃5％CO₂培养箱中培养24h。将药液用培养液稀释，终浓度分别为：5mg/mL、3mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL。每浓度6孔，阳性药物用阿昔洛韦(0.5mg/mL)，37℃5％CO₂培养箱中培养，每4天换取培养液，换同浓度药液，将收集的上清液-20℃冰冻保存，第8天收集上清液，采用酶免法以实验波长570nm，参比波长450nm同时测定OD值。

观察指标及数据统计方法：计算抗原抑制百分率、半数抑制浓度(IC₅₀)及治疗指数(TI)。

抗原抑制百分率(％)＝(细胞对照组平均OD值-给药组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-空白对照组平均OD值)×100％；

用BLiss法算出胡黄连苷II和拉米夫定对HBsAg和HBeAg的半数抑制浓度(IC₅₀)，实验重复3次，观察药效稳定性。

TI＝TC₅₀(细胞生长抑制率为50％时的药物浓度)/IC₅₀(抗原抑制率为50％时的药物浓度)；

结果判定标准：TI＞2为有效；1≤TI≤2为有毒有效；TI＜1为毒性作用。可将受试药物与阳性对照药进行比较研究。

实验结果：分别计算出了胡黄连苷II和阳性药拉米夫定(各三批)对乙肝病毒两抗原的治疗指数(TI)，如下表所示：

表19胡黄连苷II对HBsAg、HbeAg的治疗指数

由上表可以看出，胡黄连苷II仅在第一批实验中对HBeAg TI的为1.9，其余各批实验结果无论对HBsAg还是HBeAg的TI均＞2，综合三批实验结果，胡黄连苷II对HBsAg和HBeAg TI的平均值分别为3.0和2.9；阳性药拉米夫定在三批实验中，对HBsAg均显示出较强的抑制作用，TI的平均值约7.2，但对HBeAg则无明显的抑制作用。本试验结果说明胡黄连苷II对乙肝病毒表面抗原和e抗原有明显的抑制作用。

[实施例7]胡黄连苷II对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染的鸭血清DHBV-DNA的抑制作用

方法：(1)建立鸭乙型肝炎动物模型：1日龄北京麻鸭，经腿胫静脉注射麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.3mL，以构建鸭乙型肝炎动物模型。7天后取血，进行斑点杂交实验，检测血清中DHBV-DNA含量，筛选感染阳性麻鸭。(2)实验分组及给药：选取感染阳性麻鸭，随机分为5组，每组15只，分别为：模型组(给予生理盐水)、阳性药组(静脉注射ACV，100mg/kg)、注射用胡黄连苷II小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三个剂量给药组；同时取至少10只麻鸭作为正常对照组(给予生理盐水)。药物经鸭胫静脉注射给药，每天1次，每次给药体积为0.2mL/只，连续给药10天。

观察指标及检测方法：用斑点杂交法检测鸭血清DHBV-DNA含量，按照Dig标记和检测试剂盒说明书方法进行操作。将上述鸭血清进行点膜，用Dig标记的DHBV全基因组DNA作为探针，进行斑点杂交，NBT/BCIP底物显色，用CMIAS系列-—多功能真彩色病理图象分析系统分析膜上斑点的积分光密度值，以该值来代表样本中DHBV-DNA水平。

数据统计与分析方法：将每组鸭给药后T₅、T₁₀和停药后P₃鸭血清DHBV-DNA水平与同组T₀比较(采用成对t检验)，分析差异的显著性；判断药物对该两指标的抑制效果。

实验结果：三批实验中，模型组在T₅、T₁₀和P₃的血清DHBV-DNA水平与T₀天比较均未见显著性差异(P＞0.05)，说明每批实验全程13天内模型组动物血清中DHBV-DNA水平基本平稳，可以在此时间段内进行抗乙肝病毒药物的体内药效学实验。三批实验中，阳性药给药后第5、10天的血清DHBV-DNA水平与给药前相比均有显著性下降(P＜0.05)，但停药后又有所回升。此三批实验结果说明阳性药ACV注射给药对DHBV-DNA有明显的抑制作用，实验方法成功。

第一批实验中，胡黄连苷II大剂量组给药后第5天、第10天的鸭血清DHBV-DNA含量与给药前比较有显著性下降(P＜0.05)，停药后第三天有下降趋势，但没有统计学差异(P＞0.05)；中、小剂量组给药后第5天的鸭血清DHBV-DNA含量有下降趋势，但没有统计学差异(P＞0.05)；第二批实验中，小剂量组全程13天内鸭血清DHBV-DNA含量没有显著性变化(P＞0.05)；中、大剂量组给药后第5天能明显降低鸭血清DHBV-DNA含量(P＜0.01)；第三批实验中，小、中剂量给药T₁₀血清中DHBV-DNA含量显著性下降(P＜0.05或P＜0.01)，大剂量组给药T₁₀和P₃血清中DHBV-DNA含量亦显著性下降(P＜0.01)。三批实验结果表明胡黄连苷II对DHBV-DNA有较好的抑制作用。详细结果结果见表20：

表20胡黄连苷II对鸭血清中DHBV-DNA的影响

批次	组别	剂量mg/kg	鸭数只	鸭血清DHBV-DNA积分光密度值( x±s)
								T0	T5	T10	P3
				1	模型组ACV胡黄连苷II	-100102040	1177911					0.482±0.2750.351±0.2810.211±0.2580.206±0.1740.268±0.236	0.510±0.3000.053±0.038*0.120±0.0620.110±0.0680.141±0.112*	0.459±0.2410.017±0.030*0.213±0.1360.139±0.0520.113±0.075*	0.343±0.1660.121±0.1680.250±0.1860.203±0.1620.145±0.140

2	模型组ACV胡黄连苷II	-100102040	108111013	0.209±0.0590.233±0.0410.252±0.0580.207±0.0490.252±0.064	0.189±0.0570.155±0.053*0.254±0.0610.161±0.064**0.204±0.074**	0.195±0.0560.174±0.069*0.207±0.0960.173±0.0820.235±0.075	0.208±0.0740.254±0.0720.260±0.0730.185±0.0830.268±0.100
								3	模型组ACV胡黄连苷II	-100102040	1016141515	0.625±0.1560.454±0.1660.537±0.1290.505±0.1290.555±0.169	0.605±0.1770.102±0.106***0.486±0.1540.470±0.153**0.486±0.090	0.609±0.2070.050±0.039***0.452±0.137*0.317±0.177**0.097±0.049***	0.547±0.1900.333±0.088*0.454±0.2140.471±0.2900.427±0.164**

注：1.统计处理方法：成对t检验。

2.给药后不同时间(T₅、T₁₀、P₃)鸭血清中DHBV-DNA含量与感染前(T₀)比较，呈显著性下降

*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

[实施例8]胡黄连苷II口服给药对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染的鸭血清DHBV-DNA的抑制作用

方法：(1)建立鸭乙型肝炎动物模型：1日龄北京麻鸭，经腿胫静脉注射麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.3mL，以构建鸭乙型肝炎动物模型。7天后取血，进行斑点杂交实验，检测血清中DHBV-DNA含量，筛选感染阳性麻鸭。(2)实验分组及给药：选取感染阳性麻鸭，随机分为5组，每组15只，分别为：模型组(给予生理盐水)、阳性药组(静脉注射ACV，100mg/kg)、胡黄连苷II小(24mg/kg)、中(36mg/kg)、大(54mg/kg)三个剂量给药组；同时取至少10只麻鸭作为正常对照组(给予生理盐水)。受试药物口服给药，每天1次，连续给药10天。

观察指标及检测方法：用斑点杂交法检测鸭血清DHBV-DNA含量，按照Dig标记和检测试剂盒说明书方法进行操作。将上述鸭血清进行点膜，用Dig标记的DHBV全基因组DNA作为探针，进行斑点杂交，NBT/BCIP底物显色，用CMIAS系列-—多功能真彩色病理图象分析系统分析膜上斑点的积分光密度值，以该值来代表样本中DHBV-DNA水平。

数据统计与分析方法：将每组鸭给药后T₅、T₁₀和停药后P₃鸭血清DHBV-DNA水平与同组T₀比较(采用成对t检验)，分析差异的显著性；判断药物对该两指标的抑制效果。

实验结果：三批实验中，模型组在T₅、T₁₀和P₃的血清DHBV-DNA水平与T₀天比较均未见显著性差异(P＞0.05)，说明每批实验全程13天内模型组动物血清中DHBV-DNA水平基本平稳，可以在此时间段内进行抗乙肝病毒药物的体内药效学实验。三批实验中，阳性药给药后第5、10及停药后第3天的血清DHBV-DNA水平与给药前相比均有显著性下降(P＜0.05)，说明阳性药ACV注射给药对DHBV-DNA有明显的抑制作用，实验方法成功。

第一批实验中，胡黄连苷II大剂量组口服给药后第10天及停药后第3天的鸭血清DHBV-DNA含量与给药前比较有显著性下降(P＜0.01；P＜0.05)，中、小剂量组DHBV-DNA含量没有明显变化；第二批实验中，胡黄连苷II大、小剂量组给药第10天鸭血清DHBV-DNA含量显著下降(P＜0.05；P＜0.01)；中剂量组给药后第5、10及停药后第3天DHBV-DNA均有显著性下降(P＜0.001；P＜0.01；P＜0.05)；第三批实验中，胡黄连苷II大剂量组给药后第5、10天鸭血清DHBV-DNA含量有非常显著性下降(P＜0.001)；中剂量组给药后第10天及停药后第3天鸭血清DHBV-DNA含量有显著性下降(P＜0.001；P＜0.05)；小剂量组DHBV-DNA含量没有明显变化。三批实验结果表明胡黄连苷II口服给药对DHBV-DNA有较好的抑制作用。详细结果结果见表21：

表21：胡黄连苷II口服给药对鸭血清中DHBV-DNA的影响

批次	组别	剂量mg/kg	鸭数只	鸭血清DHBV OD值(x±s)
								T0	T5	T10	P3
				1	生理盐水ACV胡黄连苷II	100543624	1315141415					0.42±0.120.44±0.080.43±0.110.37±0.080.45±0.10	0.41±0.120.15±0.05***0.39±0.120.39±0.090.45±0.08	0.36±0.100.09±0.03***0.30±0.14**0.38±0.110.41±0.11	0.32±0.100.37±0.09**0.31±0.14*0.39±0.100.43±0.11
2	生理盐水ACV胡黄连苷II	100543624	913121110					0.38±0.030.36±0.030.36±0.050.38±0.050.35±0.03	0.37±0.030.23±0.04***0.33±0.080.34±0.05***0.31±0.07	0.35±0.040.18±0.03***0.31±0.08*0.32±0.05**0.30±0.068**	0.35±0.040.31±0.04*0.36±0.060.34±0.05*0.33±0.04
				3	生理盐水ACV胡黄连苷II	100543624	1010141113					0.31±0.030.33±0.050.26±0.050.28±0.040.28±0.05	0.30±0.030.15±0.05***0.13±0.04***0.25±0.080.26±0.04	0.30±0.020.16±0.03***0.12±0.02***0.16±0.09***0.24±0.05	0.28±0.030.25±0.06***0.26±0.050.25±0.04*0.27±0.04

统计处理：成对t检验。

给药组不同时间(T₅、T₁₀、P₃)鸭血清DHBV OD值与感染前(T₀)OD值比较。

*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

Claims (5)

1.一种黄连苷II的医疗用途，其特征是在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征是在制备治疗急、慢性乙型肝炎药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的药物，其特征是含有黄连苷II的用于治疗乙型肝炎的药物组合物。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征是该组合物可以通过口服、经皮、经肌肉或皮下、静脉途径给药。

5.根据权利要求3和4所述的药物组合物，其特征在于组合物可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、注射剂、贴剂等形式存在。