CN1767840A - 自身免疫的增强方法 - Google Patents

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垣田浩孝
上嵨洋
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Abstract

提供了一种通过给予特殊活性成分的增强自身免疫的新方法，所述的特殊活性成分不会由于加热而导致其糖结合性消失、显示出良好的识别糖链的选择性以及激活细胞性免疫能力等的自身免疫增强活性。该活性成分是通过如下方法得到的：在以盐类水溶液从江蓠属红藻类提取的提取液中，通过加入硫酸铵使最终浓度达到20～40％饱和浓度以进行第一阶段的盐析，除去所沉淀的杂质，然后通过进一步加入硫酸铵使最终浓度达到60～80％饱和浓度以进行第二阶段的盐析，回收沉淀形式的粗活性级分，通过使用适当的溶剂溶解沉淀得到液态粗活性级分；进一步根据需要，通过进行100℃的1～10分钟的热处理除去杂质蛋白质，接着通过凝胶过滤色谱分离分子量为100,000或100,000以上的级分，并进一步通过色谱分离该成分，收集显示激活细胞免疫能力的级分，而得到该活性成分。

Description

自身免疫的增强方法
技术领域
本发明涉及一种通过给予特殊活性成分的增强自身免疫的新方法、该活性成分的制造方法、以及配合有该活性成分的化妆材料，其中所述的特殊活性成分是由江篱属红藻类(Gracilaria sp.)为原料得到的，其不会由于热处理而导致其糖结合性消失，显示出良好的识别糖链的选择性和激活细胞性免疫能力等的自身免疫增强活性。
背景技术
由于红细胞凝集素对各种动物的红细胞显示出特异的行为，因而被广泛用作医疗、制药、生物化学等领域的检查用试剂或分离用材料。该红细胞凝集素可大致区分为来源于动物和植物的红细胞凝集素，但从可大量获得、处理方便等方面考虑，来源于植物的红细胞凝集素在实际应用上正日益受到关注。
迄今为止，作为这些来源于植物的红细胞凝集素，已知有作为陆生植物来源的马蚕豆的刀豆球蛋白A(Con A)和小麦来源的小麦胚芽植物凝血素(WGA)等(参阅J.Bacteriol，1936年，第32卷，第227～237页)，作为海洋植物来源的来自龙须菜(Gracilaria verrucosa)的GAVI、来自日本沙菜(Hypneajaponica)的Hypnin A、B、C和D(参阅Bul.Jap.Soc.Sci.Fishe.，1981年，第47卷，第1079～1084页)等。
但是，尽管来源于陆生植物的红细胞凝集素能够容易地得到凝集活性较高的样品，但是其红细胞凝集的活性由于也受到诸如单糖类或二糖类之类的单纯的糖的抑制，因而存在识别糖链的选择性低的缺点。而尽管来源于海洋植物的红细胞凝集活性不会受到单糖类或二糖类的抑制，但是其受到像胎球蛋白、脱唾液胎球蛋白之类的糖蛋白质的抑制，因而虽然可以认为具有较高的识别糖链的选择性，但是却存在难以得到凝集活性高的样品的缺点。两者还都存在不能通过离子浓度的变化来控制凝集活性的缺点。
通常存在由于对红细胞凝集素在100℃进行热处理，而导致其糖结合能力丧失的缺点。
在红细胞凝集素相对于细胞的生物活性中，可以列举具有划时代意义的与淋巴细胞的反应。如果将淋巴细胞与非常低浓度的红细胞凝集素一起培养，可以使淋巴细胞增殖、分裂。像这样在静止期内引起淋巴细胞发生成长·增殖状态的触发效果被称为促分裂原刺激，它是一种对异物(抗原)的生物体免疫反应的关键性重要现象。促分裂原刺激功能是激活细胞性免疫能力功能中的一种，并且是红细胞凝集素的自然免疫活性增强的指标。
主要可被用作促分裂原的红细胞凝集素为刀豆球蛋白A(Con A)、菜豆凝集素P(PHA-P)、菜豆凝集素L(PHA-L)、美洲商陆凝集素(PWM)等，将它们与淋巴细胞一起培养48～72小时，通过测定在DNA中所吸收的标识胸苷的增加率进行检定。
由于具有促分裂原能力的红细胞凝集素与细胞的抗原特异性并无关系，并且能够活化几乎所有能够被活化的淋巴细胞，因而可以容易的跟踪、研究由细胞增殖所产生的变化。此外，已知红细胞凝集素还能够使T淋巴细胞诱导细胞伤害活性。由于被诱导的T细胞的细胞伤害活性是抗原非特异性的，因而可以对各种正常细胞和恶化细胞发挥作用。
这样，由于红细胞凝集素所产生的促分裂原活化的使用简单、容易，因而常被用作判断患有包含AIDS等各种疾病的患者免疫能力的方法。并且也常被用于研究各种免疫抑制效果和免疫疗法的效果的目的。最近，在癌症新疗法LAK疗法中的淋巴细胞分裂促进剂正日益引起人们的注意。
红细胞凝集素(由蛋白质形成的红细胞凝集素通常被称为凝集素)具有对糖链的特异性的识别、结合能力。这种性质，在作为促分裂原向生物体内直接给药或者向皮肤经皮给药时，能够识别细胞表层糖链，因而和不具有糖链结合能力的促分裂原(例如脂多糖等)相比，被认为能够通过与细胞表层的糖链结合接近细胞表层，从而更有效地发挥促分裂原的功能。
但是，由于具有这些促分裂原能力的红细胞凝集素的主要成分为蛋白质，如果在高温(约100℃)下热处理或者在40～50℃温度下长时间放置，就会丧失糖结合能力，因而在向生物体内给药时与其它药剂的合并、以及在用于皮肤涂布的乳剂或软膏时与其它成分的合并难免受到限制。因此，需要能够在热处理之后能够保持糖链结合能力的具有促分裂原能力的红细胞凝集素，本发明者首先提出了一种从江蓠属红藻类提取高活性红细胞凝集素的方法(日本专利申请特开平7-278004号公报)。但是，其高活性红细胞凝集素具有像增强自身免疫能力这样的生理活性，迄今为止都是未知的。
发明内容
鉴于上述情况，本发明的目的在于，提供一种通过给予特殊活性成分增强自身免疫的新方法，所述的特殊活性成分具有不会由于加热而导致其糖结合性消失，显示出良好的识别糖链的选择性以及激活细胞性免疫能力等的自身免疫增强活性。
本发明者针对来源于植物的，特别是来源于海洋植物的红细胞凝集素反复进行了各种研究，研究结果发现，在特定条件下从江蓠属红藻类(Gracilariasp.)中提取的红细胞凝集素，除了凝集活性高并且识别糖链的选择性高，而且还可以通过改变离子浓度控制凝集活性，不会由于加热而导致其糖结合性消失，显示出良好的识别糖链的选择性以及激活细胞性免疫能力等的自身免疫增强活性，基于上述发现，完成了本发明。
即，本发明提供了一种通过给予以使用盐类水溶液从江蓠属红藻类(Gracilaria sp.)提取的液态提取物为有效成分的活性成分增强自身免疫活性的新方法、自身免疫增强成分的制备方法以及配合该自身免疫增强成分的化妆品，其中制备方法的特征在于，向使用盐类水溶液从江蓠属红藻类(Gracilaria sp.)提取的提取液中，通过加入硫酸铵使最终浓度达到20～40％饱和浓度进行第一阶段的盐析，除去所沉淀的杂质，然后通过进一步加入硫酸铵使最终浓度达到60～80％饱和浓度进行第二阶段的盐析，分离沉淀形式的粗活性级分，通过使用适当的溶剂溶解沉淀得到液体粗活性级分，进一步根据需要，通过在100℃进行1～10分钟的热处理除去杂质蛋白质，接着通过凝胶过滤色谱分离得到分子量为100,000或100,000以上的级分，然后通过色谱分离、纯化该成分，收集显示激活细胞免疫能力的活性的级分。
上述硫酸铵的饱和浓度为基于Green，A.A.& Hughes，W.L.著(1955年)《酶学方法》(Methods in Enzymology)，第1卷，第67～90页所述的“结晶硫酸铵的添加量与浓度(％饱和)的关系表”所规定的浓度。
作为本发明所使用的增强自身免疫的成分是通过下述过程得到的液体，其中所述过程为例如在使用盐类水溶液从江蓠属红藻类(Gracilaria sp.)提取的提取液中，加入硫酸铵使最终浓度达到20～40％饱和浓度以进行第一阶段的盐析，除去所沉淀的杂质，然后通过进一步加入硫酸铵使最终浓度达到60～80％饱和浓度以进行第二阶段的盐析，回收沉淀形式的粗活性级分，通过使用适当的溶剂溶解沉淀得到液体粗活性级分，进一步根据需要，通过在100℃进行1～10分钟的热处理除去杂质蛋白质，接着通过凝胶过滤色谱分离分子量为100,000或100,000以上的级分，进一步通过色谱进行分离、纯化，收集显示激活细胞性免疫能力的活性的级分。
作为此时使用的盐类水溶液，是例如生理盐水、磷酸盐缓冲液、Tris盐酸缓冲液或者在其中添加了选自氯化钠、氯化钾、硫酸锌、氯化锌、2-巯基乙醇和二硫代苏糖醇中的至少一种的液体等，特别优选磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液或者其中添加了选自氯化钠、氯化钾、硫酸锌以及2-巯基乙醇的至少一种的液体。
上述得到的液体包含以糖为主成分的红细胞凝集素。作为这种糖，构成糖的单糖中的半乳糖的比例为70～100％，优选90～100％。当在本发明的自身免疫增强方法中使用上述液体时，除糖之外，还可以含有相对于糖质量，蛋白质质量为0.4或0.4以下的蛋白质。
并且，可以使用半乳糖作为标准品，通过苯酚硫酸法进行糖的定量；可以使用牛血清白蛋白作为标准品，通过Lowry法进行蛋白质的定量。
作为这时的原料，可以使用江蓠属红藻类，优选龙须菜(Gracilariaverrucosa)、绳龙须菜(Gracilaria chorda)、它们的亚种。本发明中的江蓠属红藻类(Gracilaria sp.)包括被分类为(1)江蓠属红藻类(Gracilaria sp.)的海藻，或者(2)被分类为Gracilariopsis sp.的海藻、或者(3)过去被分类为Gracilariopsis sp.的海藻。
例如，在日本产海藻中，江蓠属红藻类(Gracilaria sp.)包含非专利文献《新日本海藻志日本产海藻类总览》，吉田忠生著，内田老鹤圃发行，1998年版中的被分类为江蓠目(Gracilariales)江蓠科(Gracilariaceae)的海藻。
这些红藻类在寒水海洋也有分布，但是特别是在暖水海洋中分布较多，在日本，几乎全部的海岸地带都有分布，通常被用作琼脂的补充物或在食品中应用等。
为了适当地制造本发明所使用的自身免疫增强成分，依次在上述红藻类原料中实施(1)提取水溶性级分的步骤、(2)分离粗活性级分的步骤、以及根据需要(3)纯化凝集素的步骤。
如果对上述各个步骤进行进一步的详细说明，包括：首先在步骤(1)中，在红藻类的原料中加入含有盐类水溶液，例如生理盐水、磷酸盐缓冲液、Tris盐酸缓冲液或者在其中添加了选自氯化钠、氯化钾、硫酸锌、氯化锌、2-巯基乙醇和二硫代苏糖醇中的至少一种的液体，优选磷酸盐缓冲液、Tris盐酸缓冲液或者其中添加了选自氯化钠、氯化钾、硫酸锌以及2-巯基乙醇中的至少一种的液体匀浆化后，进行离心分离，得到作为上清液的粗提取液。
其次在步骤(2)中，在步骤(1)所得到的提取液中，首先通过加入硫酸铵使最终浓度达到20～40％饱和浓度以进行第一阶段的盐析，通过离心分离处理除去所生成的沉淀。通过这一操作，除去作为沉淀级分的色素等杂质。其次，通过在离心分离处理得到的上清液中加入硫酸铵使最终浓度达到60～80％饱和浓度以进行第二阶段的盐析，通过离心分离处理分离所生成的沉淀，然后使用含有氯化钠的磷酸缓冲液等缓冲液再溶解该沉淀级分，并根据需要，通过相对于含有氯化钠的磷酸缓冲液等缓冲液的透析进行纯化得到粗活性级分。该粗活性级分可直接用于本发明的自身免疫增强方法。
可以根据需要，对该粗活性级分进一步进行步骤(3)。在步骤(3)中，通过对上述步骤(2)中所得到的粗活性级分在100℃进行1～10分钟的热处理以除去沉淀的杂质蛋白质，然后通过凝胶过滤色谱分离得到分子量为10万或10万以上的级分，进而通过色谱分离该成分，得到纯化红细胞凝集素。这时，作为在最后阶段所使用的色谱，使用离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏水性相互作用色谱、或它们的组合是有利的。
其中所谓的分子量10万或10万以上的级分，是指在凝胶过滤色谱中，使用球形蛋白质作为标准分子量物质，计算出洗脱级分的分子量的结果为相当于10万或10万以上分子量的级分。
为了适当地制造本发明所使用的自身免疫增强成分，将0.1ml具有促分裂原能力的红细胞凝集素纯化样品加入到TSK凝胶G3000 PWXL柱中，在凝胶过滤色谱过程中，从凝胶过滤色谱柱按照每次0.1ml收集洗脱级分。这时，作为标准分子量物质，使用甲状腺球蛋白(分子量669000)、铁蛋白(分子量440000)、牛血清白蛋白(分子量67000)、卵白蛋白(分子量43000)。由其结果可知，具有显示下述级分的凝集活性的峰的顶点相当于分子量5.64×105，其中所述级分是具有促分裂原能力的红细胞凝集素的洗脱级分(红细胞凝集活性的级分)。
通过这样得到的本发明所使用的自身免疫增强成分进一步具有下述各项的特征：
(1)具有使用链霉蛋白酶处理的羊红细胞凝集的性质，且该凝集活性不受单糖类或二糖类的抑制，但受到胎球蛋白、脱唾液胎球蛋白的抑制，
(2)对兔红细胞的凝集活性随离子浓度的变化而变化，
(3)在使用球形蛋白质作为标准分子量物质时的凝集过滤色谱中，洗脱为相当于分子量100,000或100,000以上的级分，
(4)具有激活细胞免疫能力的活性，
(5)在100℃经过10分钟的热处理后也具有糖链结合活性，
(6)具有使人淋巴细胞幼稚化的活性，
(7)促进氚标记的胸苷向细胞核中的吞噬(取り込み)。
本发明所使用的自身免疫增强成分是来源于红藻类的新成分，并可通过离子浓度控制凝集活性，具有优良的识别糖链的选择性，具有激活细胞性免疫能力等自身免疫增强活性，且在100℃温度下进行热处理10分钟之后仍然具有糖结合活性的优点。
实施本发明的最佳方式
下面，通过实施例对用于实施本发明的最佳方式进行说明，但是本发明并不限于这些实例。
实施例1
(1)水溶性级分的提取步骤
使用0.15M的氯化钠水溶液将绳龙须菜(ツルシラモ)(日本德岛县吉野川河口域产)洗涤干净后，以阳光干燥得到干燥物。在100g该干燥物中加入700ml含有0.15M氯化钠的100mM的磷酸缓冲溶液(pH6.9)进行匀化，然后将该匀化液在4℃温度下放置6小时，通过离心分离得到上清液的粗提取液。
(2)粗活性成分的分离步骤
接着，在该粗提取液中加入硫酸铵使最终浓度达到35％饱和浓度以进行第一阶段的盐析。在硫酸铵的添加结束后，在4℃温度下放置1小时，通过离心分离除去生成的沉淀。在该操作中，色素等杂质作为沉淀级分被除去。接着，在离心分离得到的上清液中，加入硫酸铵使最终的浓度达到70％的饱和浓度，添加结束后，在4℃温度下放置1晚。通过离心分离将所生成的沉淀分离。将所得到的沉淀级分再次用包含0.15M氯化钠的100mM的磷酸缓冲液(pH 6.9)溶解，得到粗活性级分。所得到的粗活性级分相对于兔红细胞的红细胞凝集活性为256单位，比活性为3372.9单位/mg蛋白质，活性回收率为62.4％。其中，凝集活性的单位定义为能够检测出凝集活性的样品的最大稀释率的倒数。其结果如表5所示。
(3)凝集素的纯化步骤
然后，对这样得到的粗活性级分在100℃温度下热处理10分钟，通过离心分离除去不溶性的杂质蛋白质后，使用凝胶过滤色谱分离分子量为10万或10万以上的级分，使用TSK gel DEAE-5 PW的离子交换色谱进行分离，得到纯化样品。相对于兔红细胞显示出红细胞凝集活性的所得纯化样品的最小蛋白质浓度为0.8763μg/ml。由上述结果可知，通过本发明的自身免疫增强方法，可以有效地得到保持其活性的来源于红藻类的红细胞凝集素。
针对纯化标准品，进行相对于兔红细胞的凝集活性的离子浓度依存性试验，在0.15M氯化钠浓度下的凝集活性为2048单位，另一方面，在0.4M氯化钠的浓度下的凝集活性为8单位。其结果如表6所示。
纯化标准品进行100℃、10分钟的热处理后的凝集活性为2048单位，确认不会由于热处理导致其凝集活性消失。由于红细胞凝集素的凝集活性是红细胞凝集素的糖结合活性指标之一，因而由上述结果可知，本发明所使用的自身免疫增强成分向红细胞凝集素上的糖结合活性对热是稳定的。
为了研究纯化样品的促分裂原活性，进行人淋巴细胞幼稚化试验。人淋巴细胞幼稚化试验用于测定、比较患者和正常健康人的末梢血淋巴细胞的DNA合成能力。该反应被认为显示一般的细胞性免疫反应能力。作为测定方法，虽然有在固定染色标准品上统计染色体出现的细胞数的方法，进行形态学观察的方法等，但在本实施例中，采用了向细胞核中吞噬3H-胸苷的测定方法。使用取自3名健康正常人的淋巴细胞进行实验。
相对于100ml纯水，以1.05g RPMI 1640、0.2g NaHCO3、10000单位的青霉素、10mg链霉素、10ml胎牛血清的比例溶解的水溶液作为培养液，在使用过滤器过滤灭菌后，按照使用量放入小瓶，在-20℃温度下密封保存。
将菜豆凝集素溶于培养液中并将其浓度调整到10～50μg/ml作为比较用促分裂原。将其分装于灭菌小试管中，密封后在-20℃温度下保存。
按照如下方法进行淋巴细胞的分离。即，使用Ficoll-Conray法从添加肝素血液中分离淋巴细胞，用CMF-PBS(pH7.0)洗净3次。将分离的淋巴细胞悬浮于1ml的培养液中，计算淋巴细胞数。接着用培养液将浓度调整为5×105个/ml，得到淋巴细胞悬浮液。
按照下述方法进行淋巴细胞的培养。即，在微量培养板的各个孔中分别注入200μl的淋巴细胞悬浮液。接着在各个孔中分别注入20μl作为促分裂原溶液的纯化样品、作为阳性对照组的比较用促分裂原、作为阴性对照组的磷酸缓冲液(PES)。接着在CO2的浓度为5％、37℃的空气中，在湿润状态下培养3天。培养结束前8小时在各个孔中分别注入3H-胸苷并使其在培养液中的最终浓度达到1μCi/ml。
按照如下方法进行活性测定。即，应用Labo-MASH以食盐水收集孔内，同时在玻璃纤维过滤器上收集细胞，通过对其连续抽吸洗净过滤器上的细胞(约20秒，生理食盐水约1.5ml)。然后，剥离玻璃过滤器上的细胞粘着部分，放入计数瓶中。在充分干燥后，使用分配器在各个小瓶中注入5ml的甲苯闪烁物(POPO 0.1g+PPO 5g/升甲苯)作为液体闪烁物，通过闪光计数器进行测量。将对每个试样平均测定3次的平均值作为结果示于表1。
                               表1
         3H-胸苷的吞噬量(cpm)   与阴性对照组的比较(倍)
 试样1   试样2   试样3   平均值
  纯化样品  31320   42676   34506   36167   113.0
  阳性对照组  28233   39044   30157   32540   101.7
  阴性对照组  340   356   264   320   1.0
从该表可知，本发明所使用的自身免疫增强成分，较现有的来源于陆生植物的红细胞凝集素具有更高的促分裂原活性。
实施例2
(1)水溶性级分的提取步骤
使用0.15M的氯化钠水溶液将湿重500g的绳龙须菜(日本德岛县吉野川河口域产)洗净，在-30℃温度下冻结。使用包含30mM氯化钾和3μM硫酸锌、5mM 2-巯基乙醇的0.5M三(羟基甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 8.2)作为提取用缓冲液，向细粉碎的冻结海藻(相当于湿重500g的绳龙须菜)中加入800ml提取用缓冲液进行匀化，然后将该匀化的液体在4℃温度下放置6小时后，通过离心分离得到上清液的粗提取液。
(2)粗活性成分的分离步骤
接着，在该粗提取液中加入硫酸铵使最终浓度达到35％饱和浓度以进行第一阶段的盐析。在硫酸铵的添加结束后，在4℃温度下放置1小时后，通过离心分离除去生成的沉淀。在该操作中，色素等杂质作为沉淀级分被除去。接着，在离心分离得到的上清液中，加入硫酸铵使最终浓度达到70％的饱和浓度，添加结束后，在4℃温度下放置1晚，通过离心分离将所生成的沉淀分离。将分离得到的沉淀级分再次用包含0.15M氯化钠的100mM的磷酸缓冲液(pH6.9)溶解，接着相对于包含0.15M氯化钠的100mM的磷酸缓冲液(pH6.9)进行透析，得到粗活性级分。所得到的粗活性级分相对于兔红细胞的红细胞凝集活性为256单位。其中，凝集活性的单位被定义为能够检测出凝集活性的样品的最大稀释率的倒数。
(3)凝集素的纯化步骤
接着，对这样得到的粗活性级分在100℃温度下热处理1分钟，通过离心分离除去不溶性的杂质蛋白质，使用凝胶过滤色谱分离分子量为10万或10万以上的级分，使用TSK gel DEAE-5 PW的离子交换色谱进行分离，得到纯化样品。这样得到的纯化样品相对于兔红细胞的红细胞凝集活性为2048单位。由上述结果可知，本发明的自身免疫增强成分，可以以保持其活性的状态得到。
针对纯化标准品，进行相对于兔红细胞的凝集活性的离子浓度依存性试验，相对于在0.15M氯化钠浓度下的凝集活性为2048单位，在0.4M氯化钠的浓度下的凝集活性为8单位。
此外确认了，对纯化标准品进行100℃、10分钟的热处理后的凝集活性为2048单位，并且不会由于热处理导致其凝集活性消失。
对于粗活性级分和纯化标准品，测定了促分裂原活性。进行了人淋巴细胞幼稚化的试验。
接着，通过3H-胸苷的吞噬进行淋巴细胞幼稚化试验，测定粗活性级分和纯化样品的促分裂原活性。这时，全部的细胞培养中所需要的材料，例如微量培养板、细胞收集器、玻璃纤维过滤器、计数瓶、3H-胸苷、甲苯闪烁物(POPO 0.1g+PPO 5g/升甲苯)、液体闪烁计数器的准备以及使用它们所进行的操作都是在无菌条件下进行的。
接着，相对于100ml纯水，以1.05g RPMI 1640、0.2g NaHCO3、10000单位的青霉素、10mg链霉素、10ml胎牛血清的比例溶解的水溶液作为培养液，在使用过滤器过滤灭菌后，按照使用量放入小瓶中，在-20℃温度下密封保存。在该状态下保存2个月为能够使用的保存期限。使用时按照使用后即作废的方式，避免进行反复的冻结溶解。
使用Ficoll-Conray法从添加肝素血液中分离淋巴细胞。然后用CMF-PBS(pH7.0)洗净3次后，悬浮于1ml的培养液中，计算淋巴细胞数。接着用培养液调整为5×105个/ml。
在微量培养板的各个孔中分别平均注入200μl的淋巴细胞悬浮液进行淋巴细胞的培养。
接着，将加入了淋巴细胞的微量培养板放入清洁台内。通过3个实验区进行实验。以放置在未经紫外照射30分钟清洁台内的对照实验区作为实验区A。以从上方对微量培养板内的淋巴细胞紫外照射了30分钟的实验区作为实验区B。以从上方对微量培养板内的淋巴细胞紫外照射了16小时的实验区作为实验区C。如下所述进行紫外照射。将微量培养板放入彩色便携式(クロマトビユ一ポ一タブル)暗箱(フナコシ株式会社制造)中，通过暗箱上部安装的6瓦·轻便型UV灯UVL-56型黑光灯(フナコシ株式会社制造)，进行长波长(365nm)的紫外线照射。这时的365nm的紫外线强度是通过将MODEL UVX-36传感器(フナコシ株式会社制造)连接到数字式UVXRADIOMETER紫外线强度计上进行测定的。在微量培养板部位的紫外线强度为0.63mW/cm2。
接着，对于各个实验区，作为促分裂原溶液，在各个孔中分别平均注入20μl粗活性级分、纯化样品、磷酸缓冲液(PES)。粗活性级分是通过制备成经缓冲液稀释后的稀释液(稀释10倍～320倍)后用于实验的。粗活性级分中的3H-胸苷吞噬量(cpm)是将稀释液中的测定值乘以稀释倍数再换算成原溶液的值而求得的。纯化样品是通过制备成经缓冲液稀释后的稀释液(稀释10倍～320倍)，将稀释液用于实验的。纯化样品中的3H-胸苷吞噬量(cpm)是将稀释液中的测定值乘以稀释倍数再换算成原溶液的值而求得的。
接着在含有5％CO2的空气中、37℃的湿润状态下，培养3天。培养结束前8小时在各个孔中分别注入3H-胸苷并使其在培养液中的最终浓度达到1μCi/ml。
按照如下方法进行活性测定。使用Labo-MASH等通过食盐水收集孔内，同时在玻璃纤维过滤器上收集细胞，通过对其连续抽吸洗净过滤器上的细胞(约20秒，生理食盐水约1.5ml)。然后，剥离玻璃过滤器上的细胞粘着部分，放入计数瓶中。在充分干燥后，使用分配器在各个小瓶中分别注入5ml的液体闪烁物，通过闪光计数器进行测量。使用取自与实施例1中所用的3个人不同的其它3人的试样(以下称为试样a、试样b、试样c)的淋巴细胞进行实验。在同一实验条件下的实验次数为3次(表中记为1、2、3)，且平均为3次测量的平均值。其中试样a的结果如表2所示、试样b的结果如表3所示、试样c的结果如表4所示。
                                    表2
                           3H-胸苷的吞噬量(cpm)
      实验区A        实验区B       实验区C
  粗活性级分   1   123480   1   120920   1   79320
  2   125280   2   130600   2   93040
  3   149440   3   137960   3   80720
  平均   132733   平均   129827   平均   84360
  纯化样品   1   778000   1   665200   1   523600
  2   714000   2   783600   2   493200
  3   792000   3   717200   3   484400
  平均   761333   平均   722000   平均   500400
  阴性对照组   1   208   1   147   1   101
  2   234   2   137   2   96
  3   193   3   170   3   119
  平均   212   平均   151   平均   105
                                           表3
                        3H-胸苷的吞噬量(cpm)
      实验区A        实验区B        实验区C
  粗活性级分   1   169620   1   163600   1   88300
  2   178440   2   169080   2   118200
  3   215480   3   188680   3   96600
  平均   187813   平均   173787   平均   101000
  纯化样品   1   1136400   1   1112400   1   565200
  2   1077200   2   962000   2   651200
  3   945600   3   929600   3   473200
  平均   1053067   平均   1001333   平均   563200
  阴性对照组   1   334   1   225   1   156
  2   261   2   246   2   145
  3   326   3   207   3   140
  平均   307   平均   226   平均   147
                                            表4
                          3H-胸苷的吞噬量(cpm)
        实验区A         实验区B         实验区C
  粗活性级分   1   108200   1   102600   1   59680
  2   122520   2   119120   2   60840
  3   123640   3   121480   3   68360
  平均   118120   平均   114400   平均   62960
  纯化样品   1   660000   1   626000   1   370000
  2   674000   2   655200   2   383200
  3   618400   3   619600   3   403200
  平均   650800   平均   633600   平均   385467
  阴性对照组   1   206   1   130   1   102
  2   191   2   155   2   93
  3   176   3   146   3   101
  平均   191   平均   144   平均   99
如表2～4的实验区A所示，在实施例2中得到的包含粗活性级分及纯化样品的本发明中所使用的自身免疫增强成分，和阴性对照组相比，3H-胸苷的吞噬量分别为其600倍或600倍以上和3400倍或3400倍以上，明显高于对照组，因而可知其显示出优良的促分裂原活性。
此外，如表2～4的阴性对照组的平均值所示，如果进行紫外线照射，3H-胸苷的吞噬量，即免疫力被降低；而如实验区B和实验区C的结果所示，通过添加本发明所使用的自身免疫增强成分，即使进行紫外线照射，3H-胸苷的吞噬也得到促进。
由以上结果可知，通过对由于紫外线照射处理导致DNA合成能力(3H-胸苷的吞噬等)等免疫力降低的人淋巴细胞添加自身免疫增强成分的粗活性级分·纯化标准品，能够增强该淋巴细胞的DNA合成能力等免疫力。此外，如果紫外照射时间在30分钟以内，能够提高到与在未经紫外照射的人淋巴细胞中添加自身免疫增强成分时相同的DNA合成能力；并且，即使进行紫外照射16小时，也能够提高到在未经紫外照射的人淋巴细胞中添加自身免疫增强成分时50％或50％以上的DNA合成能力；其3H-胸苷的吞噬量远多于未经紫外线照射的阴性对照组。
比较例1
在实施例1-(2)粗活性级分的分离步骤中，除了使用50质量％乙醇进行分离处理以代替添加硫酸铵的2阶段盐析的分离处理(参阅Phytochemistry，第27卷，第2063～2067页(1988年))之外，按照与实施例1相同的方法得到粗活性级分。该粗活性级分的相对于兔红细胞的红细胞凝集活性为4单位，比活性为53.4单位/mg蛋白质，活性回收率为5.0％。其结果如表5所示。
比较例2
按照常用的方法(Comp.Biochem.Phisiol.，第102B卷，第445～449页(1992年)所述的方法)得到来源于红藻类的红细胞。所得到的粗活性级分的红细胞凝集活性为16单位，比活性为149.5单位/mg蛋白质，活性回收率为19.5％。其结果如表5所示。此外，对于兔红细胞显示出红细胞凝集活性的纯化样品的最小蛋白质浓度为32.6μg/ml，相当于实施例1的比活性的约1/40。
                                    表5
                         粗活性级分
  凝集活性1)(单位)   比活性(单位/mg蛋白质)  活性回收率2)(％)
  实施例1   256   3372.9   62.4
  比较例1   4   53.4   5.0
  比较例2   16   149.5   19.5
注1)凝集活性是通过连续稀释粗活性级分，由显示出凝集活性的最大稀释率计算出来的。
注2)活性回收率是以粗提取液总量的凝集活性为100％计算得到的。
比较例3
针对按照常用方法(Comp.Biochem.Phisiol.，第102B卷，第445～449页(1992年)所述的方法)从红藻类纯化的分子量为50,000的凝集素，研究其相对于兔红细胞的凝集活性的离子浓度依存性。在0.15M氯化钠和0.4M氯化钠浓度下的凝集活性均为1024单位，未发现凝集活性的离子浓度依存性。其结果如表6所示。
比较例4
将25mg ConA(和光纯药(株)制)溶于100ml的磷酸缓冲液，研究其兔红细胞的凝集活性的离子浓度依存性。在0.15M氯化钠和0.4M氯化钠浓度下的凝集活性均为64单位，未发现凝集活性的离子浓度依存性。其结果如表6所示。
                          表6
    纯化凝集素相对于兔红细胞的凝集活性(单位)1)
  0.15M NaCl浓度   0.4M NaCl浓度
  实施例1   2048   8
  比较例3   1024   1024
  比较例4   64   64
注1)凝集活性是通过连续稀释纯化凝集素，由显示凝集活性的最大稀释率计算出来的。
对Con A进行100℃、10分钟的热处理后未检出其凝集活性，确认由于热处理导致其凝集活性消失。
如表5所示，实施例1所得到的包含粗活性级分的本发明所使用的自身免疫增强成分，和比较例1和2的相比，凝集活性、比活性、活性回收率都要高，活性回收率为比较例1的约12倍，比较例2的约3倍，比活性是比较例1的约63倍，比较例2的约23倍。此外，从表6可知，实施例1的纯化凝集素活性与比较例3和4的不同，可以通过离子浓度控制相对于兔红细胞的凝集活性。
工业实用性
本发明的自身免疫增强方法中所使用的活性成分作为临床领域、医疗领域、生物化学工业领域的治疗用、检查用材料等，以及化妆品领域的添加剂是有用的。

Claims (27)

1.一种自身免疫增强方法，其特征在于，使用由江蓠属红藻类(Gracilariasp.)的盐类水溶液得到液态提取物。
2.如权利要求1所述的自身免疫增强方法，其中，江蓠属红藻类为龙须菜(Gracilaria verrucosa)、绳龙须菜(Gracilaria chorda)或者它们的亚种。
3.如权利要求1或2所述的自身免疫增强方法，其特征在于，液体提取物具有使经过链霉蛋白酶处理的羊红细胞凝集的活性，并且该凝集活性不受单糖类或二糖类的抑制，但受到胎球蛋白或脱唾液胎球蛋白的抑制。
4.如权利要求1～3任一项所述的自身免疫增强方法，其特征在于，液体提取物相对于兔红细胞的凝集活性因离子浓度的不同而不同。
5.如权利要求1～4任一项所述的自身免疫增强方法，其特征在于，液体提取物是在使用球形蛋白质作为标准分子量物质的凝胶过滤色谱中，洗脱为分子量相当于100,000或100,000以上的级分。
6.如权利要求1～5任一项所述的自身免疫增强方法，其特征在于，液体提取物具有激活细胞性免疫能力的活性。
7.如权利要求1～6任一项所述的自身免疫增强方法，其中，液体提取物在经过100℃、10分钟的热处理后仍具有糖链结合活性。
8.如权利要求1～7任一项所述的自身免疫增强方法，其特征在于，液体提取物具有将人淋巴细胞幼稚化的活性。
9.如权利要求1～8任一项所述的自身免疫增强方法，其特征在于，液体提取物促进氚标记胸苷向细胞核内的吞噬。
10.如权利要求1～9任一项所述的自身免疫增强方法，其中，液体提取物包含糖和蛋白质，且该蛋白质的质量相对于糖的质量为0.4或0.4以下。
11.如权利要求1～10任一项所述的自身免疫增强方法，其中，液体提取物包含1～60质量％的硫酸。
12.由江蓠属红藻类(Gracilaria sp.)的盐类水溶液得到的液体提取物作为人体的自身免疫增强剂的用途。
13.如权利要求12所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其中，江蓠属红藻类为龙须菜(Gracilaria verrucosa)、绳龙须菜(Gracilaria chorda)或者它们的亚种。
14.如权利要求12或13所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其特征在于，液体提取物具有使经过链霉蛋白酶处理的羊红细胞凝集的活性，并且该凝集活性不受单糖类或二糖类的抑制，但受到胎球蛋白、脱唾液胎球蛋白的抑制。
15.如权利要求12～14任一项所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其特征在于，液体提取物的相对于兔红细胞的凝集活性因离子浓度的变化而变化。
16.如权利要求12～15任一项所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其特征在于，液体提取物是在使用球形蛋白质作为标准分子量物质的凝胶过滤色谱中，洗脱为分子量相当于100,000或100,000以上的级分。
17.如权利要求12～16任一项所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其特征在于，液体提取物具有激活细胞性免疫能力的活性。
18.如权利要求12～17任一项所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其特征在于，液体提取物是在经过100℃、10分钟的热处理后仍具有糖链结合活性的提取物。
19.如权利要求12～18任一项所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其特征在于，液体提取物具有将人淋巴细胞幼稚化的活性。
20.如权利要求12～19任一项所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其特征在于，液体提取物促进氚标记胸苷向细胞核内的吞噬。
21.如权利要求12～20任一项所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其中，液体提取物包含糖和蛋白质，且该蛋白质的质量相对于糖的质量为0.4或0.4以下。
22.如权利要求12～21任一项所述的液体提取物作为自身免疫增强剂的用途，其中，液体提取物包含1～60质量％的硫酸。
23.一种用于自身免疫增强方法中的自身免疫增强成分的制造方法，其特征在于，使用盐类水溶液从江蓠属红藻类中提取，在得到的提取液中，通过加入硫酸铵使最终浓度达到20～40％饱和浓度以进行第一阶段的盐析，除去沉淀的杂质，然后向该提取液中通过进一步加入硫酸铵使最终浓度达到60～80％饱和浓度以进行第二阶段的盐析，回收沉淀形式的粗活性级分，通过使用适当的溶剂溶解沉淀，分离、收集显示激活细胞性免疫能力活性的液体提取物。
24.如权利要求23所述的用于自身免疫增强方法中的自身免疫增强成分的制造方法，其中，对液体提取物进一步在100℃进行1～10分钟的热处理除去杂质蛋白质，接着通过凝胶过滤色谱分离得到的分子量为100,000或100,000以上的级分，然后通过色谱分离、纯化该级分。
25.权利要求23或24所述的用于自身免疫增强方法中的自身免疫增强成分的制造方法，其中，盐类水溶液为包含氯化钠的磷酸缓冲液。
26.权利要求23或24所述的用于自身免疫增强方法中的自身免疫增强成分的制造方法，其中，盐类水溶液为包含选自氯化钾、硫酸锌以及2-巯基乙醇中的至少一种的三(羟基甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液。
27.一种化妆品原料，其特征在于，包含通过权利要求23～26任一项所述的制造方法得到的自身免疫增强成分。
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