CN1765418A - 禽网状内皮组织增殖症病毒亚单位疫苗及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种禽网状内皮组织增殖症病毒亚单位疫苗的制备方法，即：利用Bac－to－BacBaculovirus Expression Systems，构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重组杆状病毒。用REV特异性单克隆抗体分别做间接免疫荧光抗体试验(IFA)和免疫转印试验，均可从感染的Sf9昆虫细胞中检出REV env。重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解后制备成油乳疫苗免疫SPF鸡后，可以诱发维持45天以上的特异性抗REV抗体，并可抵抗REV病毒感染。
Description
所属技术领域
本发明所涉及的是一种禽用网状内皮组织增殖症病毒亚单位疫苗的生产方法，属于兽用生物制品的生产领域。
技术背景
禽网状内皮组织增殖症(Reticuloendoetheliosis，RE)是由反转录病毒科的禽网状内皮组织增殖症病毒(Reticuloendoetheliosis virus，REV)引起的鸡、鸭、火鸡和其他禽类的一组综合症，包括致死性网状细胞瘤、矮小综合症以及淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤(Jackson C A W，et al.Proventriculitis，″Nakanuke″and reticuloendoheliosis inchickens following vaccination with herpesvirus of turkeys.J Vet，1977，53：457-458；崔治中，等.禽白血病及禽网状内皮增生病感染情况的调查.中国畜禽传染病，1987，(1)：37-38)。REV感染后禽生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；引起感染鸡的免疫抑制，干扰其它禽病疫苗的免疫效果，导致免疫失败。REV已经成为继马立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)之后又一重要的禽肿瘤病毒(Jackson C A W，et al.Proventriculitis，″Nakanuke″andreticuloendoheliosis in chickens following vaccination with herpesvirus of turkeys.J Vet，1977，53：457-458；Witter R L.Reticuloendotheliosis.In：Calnek B W，et al.ed.Disease of Poultry，10th ed.USA(Ames)：Iowa State University Press，1997，467-484.)。它不但可以引起雏鸡严重的免疫抑制，还严重影响雏鸡的正常发育。如果用被REV污染的鸡胚制备弱毒疫苗，更会污染疫苗。目前，REV在我国的流行越来越严重，在某些鸡场中对REV阳性抗体的检出率可能高达21.4％～71.0％，其中出现免疫抑制状态的鸡群对REV抗体阳性率要比正常鸡群高的多(崔治中，等.禽白血病及禽网状内皮增生病感染情况的调查.中国畜禽传染病，1987，(1)：37-38；崔治中，等.禽网状内皮组织增生病病毒感染和鸡群的免疫抑制.中国兽药杂志，2000，34(1)：1-3.)。近年来，国内大量的流行病学调查及病例报告表明，REV感染及其在我国鸡群中造成的危害已相当普遍。REV可在年轻鸡群中引起免疫抑制和生长滞缓(特别是与其它病毒共感染时)，也可引起肿瘤，很多专家已认为近几年我国鸡群中显著增加的肿瘤发病率均与REV感染相关。2001年，金文杰等[9]从传染性法氏囊病的病料中检测到REV的感染率为22.7％；2003年，姜世金等(姜世金，等中.传染性腺胃炎发病鸡中MDV REV CAV共感染的检测.中国兽医杂志，2004，40(4)：10-12.)曾用斑点杂交方法对我国800余份发生禽肿瘤的样品进行检测，其中REV的阳性率高达80％以上；2004年，张志等(张志，等.从J亚群白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒.中国兽医学报，2004，24(1)：10-13.)从马立克氏病病毒感染的病例中检测到REV的共感染率至少为36.8％。显然，REV的感染应引起人们的重视。
REV可以在鸡胚和鸡胚成纤维细胞上复制，但复制量较低，用其做成疫苗免疫鸡后，很难诱发抗体。因此迄今为止，国内外还没有可以用来有效防治REV的疫苗。更没有商品化用于预防REV的疫苗，这一严峻现实对于抗REV疫苗提出了新需求。
env基因编码两种糖蛋白gp90和gp20(Tsai W P，et al.Site directed cytotoxic antibodyagainst the C-terminal segment of the surface glycoprotein gp90 of avain reticuloendotheliosisvirus.Virology，1988，166：608-611；Tsai W P，et al.，Biosynthesis and chemical and immunologicalcharacterization of avain reticuloendotheliosis virus env gege-encoded proteins.Virology，1986，155：567-583.)。其中gp90蛋白是REV病毒的免疫原性蛋白，具有受体结合功能，能够激发感染宿主产生中和抗体，是囊膜糖蛋白的表面蛋白；gp20为穿膜蛋白。本发明人试图通过杆状病毒双向表达载体构建REV的env基因真核表达载体，以作为进一步研究抗REV基因工程疫苗的基础。
本发明的目的
本发明的目的是通过杆状病毒双向表达载体构建REV的env基因真核表达载体，以制备抗REV基因工程亚单位疫苗。
本发明的详细描述
本发明的发明要点是：利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems，构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重组杆状病毒，用重组杆状病毒感染Sf9细胞，经培养，收集细胞，经超声波裂解，制成油乳苗。
1表达REV env基因的重组杆状病毒的构建
用Invitrogen公司的Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems(CAT.NO.10359-016)杆状病毒表达载体试剂盒构建重组杆状病毒。[Bac to bac杆状病毒表达系统购自Invitrogen公司，主要由转移供体载体pFastBacTMDUAL、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、E.coliDH10BacTM菌株和CellFECTIN转染试剂构成。pFastBacTMDUAL为双向真核表达载体，含有两个强启动子，分别为Polh启动子和p10启动子，能同时高效表达两段外源基因。E.coli DH10BacTM菌株中含有天然杆状病毒全基因组质粒及表达转座酶的辅助质粒(Helper plasmid)。]
详细的操作程序按厂家的说明书进行，现简述如下：
1.1引物设计和env基因的PCR扩增
根据SNV株REV的前病毒基因组DNA测得的全基因序列(GenBank DQ003591)设计一对引物。上游引物：5’-CAG
GAATTCAAGAATGGACTGTCTCACC-3’；下游引物：5’-AGA
GTCGACCAAGCATGGGTACAGAAG-3’。其中，上游引物含有EcoRI酶切位点，下游引物含有SalI酶切位点。引物合成后，以SNV株REV的前病毒基因组DNA为模板，PCR扩增包含整个env基因的片段，大小约1.87kb。
1.2含REV env基因的重组供体质粒的构建：取上文env基因的PCR产物和试剂盒提供的供体质粒pFastBacTMDUAL分别经EcoRI和SalI双酶切，电泳，回收带有EcoRI和SalI粘性末端的env基因和线性化的转移供体质粒。然后将两者以1∶3的摩尔比在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜，使目的基因整合到供体载体pFastBacTMDUAL上的Polh启动子下游。取10μL连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，以转化菌制备含有REV env基因的重组供体质粒DNA。
1.3含REV env基因重组杆状病毒全基因组质粒的构建：将重组供体质粒DNA约200ng转化大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞。在
同时含
卡那霉素、庆大霉素、四环素和指示剂TPTG和x-gal的LB琼脂平板上，37℃避光培养24～48h，挑选白色菌落，连续传代3次，性状稳定的白色菌落即为含有REV env基因的重组杆状病毒全基因组质粒转化的重组菌落。然后按操作手册从该重组菌提取含有REV env基因的重组杆状病毒全基因组质粒DNA，以此质粒DNA为模板进行PCR扩增验证。EcoRI单酶切此PCR产物，作进一步验证。
1.3.1含REV env基因的重组供体质粒的酶切鉴定
经初步筛选的重组供体质粒经EcoRI和SalI酶切后，电泳结果呈现两条特异带，其中一条为env基因，大小约1.8kb；另一条为载体，大小约为5.1kb。均与预期值一致，该重组供体质粒定名为pFastBac-REV env。
1.3.2含REV env基因重组杆状病毒全基因组质粒DNA的验证
将上述重组转移供体质粒pFastBac-REVenv转化大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞，在抗生素及指示剂的筛选下，选取白色菌落，经3次传代后，所得的菌落全部为白色菌落。选取其中一菌落大量扩增，提取质粒DNA作为模板，以PUC/M13引物，PCR扩增出一条约4.4kb的特异条带，EcoRI单酶切成两条特异带，分别为1.8kb和2.6kb，与试验设计预期的大小相符。从而验证所筛选的菌落为含有REV env基因的重组表达载体质粒转化的阳性菌落，该重组质粒定名为rBACMID-REVenv。
2表达REV env重组杆状病毒的检测
用含有REV env基因的重组杆状病毒全基因组质粒rBACMID-REVenv的DNA转染Sf9细胞(SF9细胞：Life Technologies，Cat.No.11496-015；SF9细胞培养液：Grace′s Insect Cell Culture Medium，Supplemented(1X)，liquid，Life Technologies，C at.No.11590-056，应用前添加10％胎牛血清)，在转染后3d，一些细胞开始出现细胞病变，贴壁的细胞开始悬浮起来，细胞形态变大，折光性增强，表明已有病毒形成。
3含REV env基因的重组杆状病毒全基因组质粒NDA转染Sf9细胞
将Sf9细胞用无血清、无抗生素的
Sf-900SFM培养液(Life Technology，Cat.No10902)洗涤2次，然后加入上述培养基将细胞吹打起来，离心，弃上清，加入培养基将细胞重悬，取2mL含有9×105个细胞的无血清、无抗生素的培养基置于35mm的一次性平皿中，27℃静置1h。取A、B两个1.5mL的离心管，A管中加入5μL含REV env基因的重组杆状病毒全基因组的质粒DNA溶液(0.2μg/μL)和100μL无血清、无抗生素的培养基；B管中加入6μLCellFECTIN转染试剂和100μL无血清、无抗生素的培养基。将两管合并于C管中，混匀，室温作用35min后，加入800μL无血清、无抗生素的培养基轻轻混匀。将平皿中的上清吸干，用C管中的混合物覆盖细胞，27℃培养5h。吸干平皿中的转染混合物，加入2mL无血清、无抗生素的培养基，继续培养，3d后收集、保存含有转染细胞产生的重组杆状病毒上清液，并继续培养转染的Sf9细胞。
4重组杆状病毒感染细胞中REV env基因表达的检测
重组杆状病毒感染细胞中REV env基因表达的检测采用间接免疫荧光抗体检测。其方法是：收集构建的重组杆状病毒转染了3d和7d的Sf9细胞。离心后，将浓缩的细胞约2×105个涂布于载玻片上，待自然干燥后，丙酮固定10min，自然干燥，在载玻片上滴加抗REV的鼠源单克隆抗体11B118和11B154(Cui Z Z，Lee L F，Silva R F.Monoclonal antibodies againstavian reticuloendotheliosis virus：Identification of strain-specific and strain-commonepitopes.J Imnunol，1986，136：4237-4242.)的混合液作为第一抗体(简称一抗)，37℃作用45min，用PBS漂洗3次，甩干残留的PBS；加入FITC标记的羊抗鼠IgG(Sigma公司)第二抗体(简称二抗)，37℃作用45min，用PBS漂洗3次，甩干残留的PBS，滴加50％的甘油，荧光显微镜下观察，出现特异性绿色荧光的判定为阳性。
重组REV env基因的表达的检测结果：在转染后3d和7d分别取Sf9细胞用REV的单克隆抗体做IFA检测REV env的表达，转染后3d有5％～10％的细胞呈IFA阳性，转染7d后IFA检测的阳性细胞比例可达95％以上，表明已发生病毒向未感染细胞的传染(见附图1)。取转染了3d的含有重组杆状病毒的上清，以MOI为0.1的量接种处于对数生长期的Sf9细胞，经IFA检测也同样为阳性。说明已形成了能表达REV env的重组杆状病毒(该重组杆状病毒命名为
REVenv-rAcNPV，2005年7月20日送藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC 1417)。
5表达REV env重组杆状病毒的检测
用含有REV env基因的重组杆状病毒全基因组质粒rBACMID-REVenv的DNA转染Sf9细胞，在转染后3d，一些细胞开始出现细胞病变，贴壁的细胞开始悬浮起来，细胞形态变大，折光性增强，表明已有病毒形成。
5.1 SDS-PAGE凝胶电泳H和Western blot检测：取转染72h后收集、保存的含有重组杆状病毒的上清接种Sf9细胞，培养72h后收集感染重组杆状病毒的细胞约5×106个，加入1.5mL的离心管中，2000r/min离心5min，弃上清，用PBS洗涤2次，弃上清，加入细胞裂解液100μL，冰浴30min，加入2×上样缓冲液100μL煮沸3min，离心5min，取上清用于加样。用同样的方法处理用天然杆状病毒感染的Sf9细胞作为阴性对照。按常规的方法制备凝胶，加样，电泳。按文献(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫，等译.第二版.北京：科学出版社，1996.)介绍的方法进行Western blot试验，检测sf9细胞中env基因的表达。本试验所选用的一抗为抗REV的鼠源单克隆抗体11B118和11B154(Cui Z Z，LeeL F，Silva R F.Monoclonal antibodies against avian reticuloendotheliosis virus：Identificationof strain-specific and strain-common epitopes.J Imnunol，1986，136：4237-4242.)两种单克隆抗体(简称单抗)的混合液。
5.2 SDS-PAGE和Westernblot检测结果：用转染3d的重组杆状病毒上清感染新鲜的Sf9细胞，培养72h后收集细胞。此细胞经SDS-PAGE电泳后再用Western blot进一步分析(图2)，发现重组杆状病毒所表达的蛋白(泳道1)可以与REV特异性单抗11B118和11B154两种单抗混合液反应，天然杆状病毒中的蛋白(泳道2)则不与两种单抗反应，表明REV env基因得到了表达，而且被剪切成两种蛋白，大小分别约为45kD和62kD。
6 env基因重组表达产物——亚单位疫苗的制备
用以上重组杆状病毒(毒株名，
REVenv-rAcNPV，2005年7月20日送藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC 1417。)以MOI值
(multiplicity of infection，感染倍数，即加入的病毒单位数/细胞数)为2～3的量感染处于对数生长期的Sf9细胞(SF9细胞培养液：Grace′s Insect Cell Culture Medium，Supplemented(1X)，liquid，LifeTechnologies，Cat.No.11590-056，应用前添加10％胎牛血清)，弃去培养液，接入病毒后加入无血清和无抗生素的细胞维持液37℃培养4～5d，细胞膨胀变大，并有部分感染细胞悬浮于上清中后，以3000r/min离心30min收集细胞，经超声波(用上海新芝生物技术研究所和宁波新芝科器研究所生产的JY92型超声波细胞粉碎机，在功率为400W下工作20次，每次20秒，间歇50秒)裂解，按水相∶油相＝1∶3的比例依照常规油乳剂苗的制备法制成油乳苗，相当于每毫升油乳苗中含有400万感染的Sf9细胞。
7亚单位疫苗在SPF鸡的免疫反应及抗体水平的检测
以0.5mL/只的剂量用肌肉注射的途径免疫45日龄的无特异性病原(SPF)鸡，
15天后重 复免疫一次。SPF鸡在带过滤空气装置的隔离罩内饲养，饲料及饮用水均高压灭菌，维生素及饲料添加剂亦经过无菌检测。
在免疫后16d、34d、45d采集的血清用ELISA标准试剂盒(Reticuloendothelisosis Virus Antibody Test Kit，购于IDEXX公司)进行检测。ELISA试验检测结果的S/P值＞0.5判为阳性。
检测结果如下：
SPF鸡免疫接种试验表明(表1)，用感染的Sf9细胞裂解产物胸部
第2次肌肉注射免疫 后16d，4只鸡中(编号为1～4)有3只鸡血清对
REV抗体检测的ELISA读数的S/P值
([待 检样品孔读数-已知阴性对照孔读数]/[标准阳性对照孔读数-已知阴性对照孔读数])大于0.5，呈现强阳性，最高的一只鸡血清的S/P值竟高达1.3891，只有一只鸡血清的S/P值为0.48，尽管我们用标准判定为阴性，但其值也远高于对照鸡(编号为5～7)血清的0.02。随着免疫时间的延长，鸡体内REV的中和抗体滴度开始下降。在
第二次免疫注射后34d检测时，尽管4只鸡中仍然有3只可以判定为阳性，但其S/P的平均值已降至0.7977。在二免后45d，鸡血清中REV的中和抗体滴度进一步下降，除一只鸡意外死亡外，其余3只鸡血清的S/P值均已降至0.5以下，但仍高于对照组鸡。
表1用亚单位疫苗免疫的SPF鸡体内产生抗REV抗体的ELISA检测结果
| 鸡号 | 16d | 34d | 45d | ||||
| ELISA S/P | 判定结果 | ELISA S/P | 判定结果 | ELISA S/P | 判定结果 | ||
| 免疫接种鸡未免疫接种鸡 | 1234567 | 0.47700.82011.38910.91630.0332-0.0083-0.0249 | *+a++--- | 0.29710.79920.91210.68200.02930.03350.0041 | -+++--- | 0.1411ND0.40660.41490.0664-0.02080.0083 | -**--- |
+：判定为阳性；-：判定为阴性；*：接近阳性；ND：没有做。
a：.以S/P值大于0.5为判定阳性
ELISA S/P值([待检样品孔读数-已知阴性对照孔读数]/[标准阳性对照孔读数-已知阴性对照孔读数])
8亚单位疫苗免疫SPF鸡后的REV病毒攻毒试验
按本说明书”6”项中叙述的方法制备含有env基因表达产物的重组杆状病毒油乳苗，以0.5ml/只的剂量免疫45日龄SPF鸡。所有SPF鸡在无菌隔离罩内饲养。待30d后，用REV病毒以106TID50/只的量进行攻毒，以后每隔10天无菌采血，进行血液病毒分离试验并采用间接免疫荧光试验进行检测，以确定血液中REV病毒是否存在。
2.5 env基因重组表达产物免疫SPF鸡后的REV病毒攻毒试验结果
攻毒后10d和20d分别采血分离病毒结果全部为阴性。血清用ELISA标准试剂盒检测，其抗体水平并未升高。以上说明REV病毒并未在鸡体内增殖，从而证明SPF鸡在免疫此重组疫苗后，能产生坚强的免疫，以抵抗REV病毒的侵袭。
附图说明
附图1.转染后3天(A)和7天(B)以REV特异性单克隆抗体11B118做间接免疫荧光抗体反应显示SF9细胞中的REV抗原。
附图2用免疫转印实验显示REV-env蛋白。
槽1：用能表达REV-env的重组杆状病毒感染的Sf9细胞；
槽2：天染杆状病毒感染的Sf9细胞；槽M：蛋白质分子量标志。
本发明的优点
本发明使用真核表达的囊膜糖蛋白免疫SPF鸡后，确实可以刺激鸡体产生抗REV抗体，在免疫接种16d后REV中和抗体的滴度最高可达1.3891。攻毒试验结果表明在免疫此重组疫苗后，REV病毒并未在鸡体内增殖，能使免疫鸡产生坚强的免疫，以抵抗REV病毒的侵袭。
Claims (2)
1一种用于预防禽网状内皮组织增殖症病毒亚单位疫苗的生产方法，其特征是：用重组杆状病毒以MOI值即感染倍数为2～3的量感染处于对数生长期的Sf9细胞，37℃培养4～5d，细胞膨胀变大，并有部分感染细胞悬浮于上清中后，收集细胞，经超声波裂解，以常规法按水相∶油相＝1∶3的比例制成油乳苗，相当于每毫升油乳苗中含有400万感染的Sf9细胞。
2按照权利要求1所述的禽网状内皮组织增殖症病毒亚单位疫苗的生产方法，其特征是制备疫苗所用含REV env基因重组杆状病毒，是通过利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒囊膜糖蛋白基因的重组杆状病毒，该病毒命名为REVenv-rAcNPV，2005年7月20日送藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC 1417。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20070801 Termination date: 20180729 |