CN1742765A - 中药奇可力多糖及其免疫制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种以菊苣的地下块茎(奇可力)为原料,生产奇可力多糖抗肿瘤免疫调节剂的方法。该方法为肿瘤的免疫疗法提供一种新型、安全、无毒、口服有效,便于长期服用的免疫增强剂的生产方法。
Description
技术领域:
本发明涉及一种用奇可力进行提取多糖并用于抗肿瘤免疫调节剂的方法。本发明涉及中药制药技术领域。
技术背景:
恶性肿瘤常称癌症,是一组严重威胁人类健康的常见病、多发病。治疗恶性肿瘤的方法包括外科手术、放射治疗和化学治疗(简称化疗)。化疗强调全身性治疗而有别于适合局部肿瘤治疗的外科手术和放射治疗。
自从1943年Gilman等首先将氮芥应用于淋巴瘤的治疗,揭开了现代肿瘤化疗学的序幕以来,抗恶性肿瘤药(antineoplastic·drugs)的基础和临床研究取得长足进步,化疗已从姑息性目标向根治性目标迈进,约5%恶性肿瘤有可能通过化疗得到治愈。然而,占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗却未能达到满意的效果。肿瘤化疗主要存在两大障碍:其一,抗恶性肿瘤药物的毒性反应。现今临床使用的传统细胞毒类抗恶性肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性不强,在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常的组织细胞也有不同程度的损伤。毒性反应成为化疗时药物用量受限的关键因素。其二,肿瘤细胞产生耐药性。化疗过程中,肿瘤细胞对抗恶性肿瘤药物产生不敏感现象即耐药性,是肿瘤化疗失败的重要原因,亦是肿瘤化疗急需解决的难题。
近年来,细胞分子生物学的进步以及肿瘤药理学的发展,为恶性肿瘤的药物防治提供了不少新靶点,抗恶性肿瘤药正从传统的细胞毒类药物向针对机制的多环节作用的新型抗恶性肿瘤药物发展,如肿瘤细胞诱导分化剂、肿瘤细胞凋亡(apoptosis)诱导剂、抗肿瘤侵袭及转移药、新生血管生成抑制剂、肿瘤耐药性逆转剂以及肿瘤基因治疗等。
奇可力(Chicory)是菊科菊苣属(Cichoriumintgbus Linne)二至多年生草本植物,原产于地中海地区。在我国主要分布于中部、东北及新疆等地。目前在华北、东北等地区有大面积栽培。奇可力性喜凉,适于北方地区种植。
奇可力的主要成分为菊糖(Inulin),它是一种多聚果糖,聚合度DP为2~60,平均为10,属于水溶性膳食纤维。除了具有低聚糖的功能外,还能促进人体对钙、镁的吸收利用,菊糖具有生物活性,它具有良好抗疲劳、提高机体免疫能力抗肿瘤疗效。
技术实施方案:
上述奇可力多糖的制备方法,以菊苣的地下块茎(奇可力)为原料,按下列步骤制备:
(1)奇可力干燥粉碎,过50-100目筛;
(2)上述奇可力细粉用4~20倍量20~90%乙醇回流提取,回收乙醇并浓缩至相对密度为1.02~1.08,静置,取消液用稀盐酸调pH至酸性后,用醋酸乙酯萃取,合并萃取液,回收醋酸乙酯,得奇可力多糖提取物;
(3)奇可力多糖减压干燥,粉碎成细粉,即得。
本发明奇可力多糖应用在提高机体免疫能力抗肿瘤方面,可与一种或多种药学上可接受的载体(辅料)配制成药剂。
上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体或辅料,例如:稀释剂、赋形剂和水等,填充剂如淀粉、糊精、蔗糖、甘露醇、乳糖,微晶纤维素等;粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮;润湿剂如甘油:崩解剂如甲基淀粉钠,羟丙纤维素,交联羧甲基纤维素,琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠;吸收促进剂如季铵化合物;表面活性剂如十六烷醇、吐温80、十二烷基硫酸钠;吸附载钵如高岭土和皂粘土;润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外在药剂中还可以含有其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明奇可力多糖药剂可通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于患者。用于口服时,可将其制成常规的固体制剂如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等,制成液体制剂如水或油悬浮剂其它液体制剂如糖浆、合剂、酏剂等;用于肠胃外给药时,可将其制成注射用的溶液、粉针、水或油性悬浮剂等。本发明优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒剂、合剂和粉针、注射液。
本发明的奇可力多糖及其药剂的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化,其日剂量以奇可力多糖计算可以是1mg/kg~600mg/kg体重,优选5mg/kg~400mg/kg体重。可以一次或多次施用。
本发明奇可力多糖应用于提高机体免疫能力抗肿瘤方面,疗效确切,无毒副作用。
具体实施方式:
实施例1奇可力多糖的制备
①取奇可力15kg,用8倍量75%乙醇回流提取二次,每次回流提取1小时,过滤,合并滤液,回收尽乙醇,并浓缩至相对密度为1.02~1.08,静置,过滤,高速离心,用稀盐酸调pH至2~3,用6倍量浓缩液体积的醋酸乙酯萃取,合并萃取液,回收醋酸乙酯即得奇可力多糖提取物。②将奇可力多糖提取物,减压干燥,粉碎,过80目筛,即得本发明奇可力多糖。
实施例2奇可力多糖粉针剂的制备
实施例1奇可力多糖 15克
甘露醇 20克
取实施例1奇可力多糖,置适宜容器中,加注射用水约900ml,加入甘露醇搅拌均匀,再加注射用水至1000ml,用0.22um的微孔滤膜过滤,在无菌条件下,灌装于西林瓶中,部分塞上丁橡胶塞,装盘,冷冻干燥。冻干结束后压塞、压盖即得。
实施例3奇可力多糖注射液液的制备
实施例1奇可力多糖 15g
吐温-80 1ml
注射用水 加至1000mt
取实施例1奇可力多糖,用900ml注射用水溶解,再用1%的氢氧化钠溶液调pH至6~7,加1ml吐温-80,补加注射用水至1000ml,静置,用0.22um微孔滤膜过滤,灌封,流通蒸汽灭菌,即得。
实施例4奇可力多糖胶囊剂的制备
实施例1奇可力多糖 600g
糊精 350g
羧甲基纤维素钠 50g
硬脂酸镁 15g
取实施例1奇可力多糖、糊精、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁混合均匀,过80目筛,用干式制粒机制粒,用60目筛整粒,灌于胶囊中,即得。
以上实施例仅为了对本发明作进一步的说明,而本发明的范围不受所举实施例的局限。
本发明提供的多糖是一种新型的抗肿瘤免疫作用新药,为证明其治疗抗肿瘤作用效果,发明者使用按上述实施例1中提供的方法制备得到的多糖,进行了药效学实验,研究结果如下:
三批奇可力多糖抗肿瘤作用的动物实验结果
摘要:三批奇可力多糖灌胃给药对肉瘤(S180)、肝癌(Hep)、、胃癌(MFC)细胞荷瘤小鼠肿瘤生长具有明显的抑瘤作用,其中对S180作用显著,较低剂量即可显示明显作用;延长S180荷瘤鼠生存时间;同时可增加吞噬指数a、廓清指数k及胸腺系数;对体外淋巴细胞转化功能亦有增强作用。
试验材料
动物:昆明种小鼠,雌雄各半,体重18-22g。由吉林大学实验动物部提供。质量合格证号:医动字第10-5107号。
药物:三批奇可力多糖(以下简称多糖)由长春市昌达天然植物开发有限公司提供,注射用环磷酰胺,由上海华联制药有限公司生产,规格:200mg/支。批号:990905。RPMI1640由Hyclone公司提供;ConA由Sigma公司生产。
肿瘤细胞株:肉瘤(S180)、肝癌(Hep)、胃癌(MFC)由本室常规传代培养。
试验与结果:
1、多糖对S180肉瘤的抑制作用[1]
无菌条件下取接种第7天S180瘤源动物的腹水,加无菌生理盐水稀释,使其浓度为1×107个活癌细胞/ml,取50只小鼠,雌雄各半,每只小鼠右前肢腋下皮下接种0.2ml,约含2×106个活瘤细胞。接种后次日将实验动物随机分成五组,空白对照组,阳性对照组及给药三个剂量组,剂量分别为:2.0g/kg、1.0g/kg、0.5g/kg。空白对照组每日灌胃给予生理盐水0.2ml/10g,连续给药10天;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺30mg/kg,隔日给药;多糖三个剂量组均为每日灌胃给药,连续10天。荷瘤小鼠停药后次日将动物处死,解剖皮下瘤块并称重,分别计算各组的平均瘤重,计算抑瘤率。发酵生产的三批多糖重复试验。
抑瘤率=(空白对照组瘤重-给药组瘤重)/空白对照组瘤重×100%结果见表1。
表1多糖对小鼠S180的抑制作用(
x±SD,n=10)
批次 | 空白组 | 阳性对照组 | 大剂量组 | 中剂量组 | 小剂量组 |
第一批瘤重抑瘤率 | 1.15±0.44 | 0.31±0.28***74.2 | 0.64±0.25**45.8 | 0.75±0.4434.8 | 0.86±0.4527.2 |
第二批瘤重抑瘤率 | 1.21±0.41 | 0.33±0.25***73.7 | 0.66±0.15**43.9 | 0.78±0.44**37.2 | 0.89±0.3228.8 |
第三批瘤重抑瘤率 | 1.42±0.47 | 0.46±0.24***68.3 | 0.74±0.45**49.6 | 0.86±0.35*37.3 | 0.97±0.4930.8 |
注:与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
由表1结果可见,在三批抑瘤试验中,多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤生长呈现出明显的抑制作用。各次换瘤试验抑瘤率均体现出一定的量效关系。实验中亦观察到环磷酰胺对S180有显著的抑瘤作用。
2、多糖对肝癌的抑制作用
无菌条件下取接种第7天Hep瘤源动物的腹水,加无菌生理盐水稀释,使其浓度为1×107个活癌细胞/ml,取50只小鼠,雌雄各半,每只小鼠右前肢腋下皮下接种0.2ml,约含2×106个活瘤细胞。接种后次日将实验动物随机分成五组,空白对照组、阳性对照组、多糖给药组分三个剂量组:2.0g/kg、1.0g/kg、0.5g/kg。空白对照组每日灌胃给蒸馏水0.2ml/10g,连续给药10天;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺30mg/kg,隔日给药;多糖三个剂量均为每日灌胃给药,连续10天。荷瘤小鼠停药后次日将动物处死,解剖皮下瘤块并称重,分别计算各组的平均瘤重,计算抑瘤率。
抑瘤率=(空白对照组瘤重-给药组瘤重)/空白对照组瘤重×100%结果见表2。
表2多糖对小鼠肝癌的抑制作用(
x±SD,n=10)
肝癌 | 空白组 | 阳性对照组 | 大剂量组 | 中剂量组 | 小剂量组 |
瘤重抑瘤率 | 0.841±0.396 | 0.271±0.219**68.6 | 0.489±0.259*41.6 | 0.518±0.27937.8 | 0.691±0.37118.2 |
与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01。
由表2结果可见,多糖对肝癌荷瘤Hep小鼠肿瘤生长具有一定的抑制作用,其中大剂量组(2g/kg)作用较明显,抑瘤率达41.6%,与空白组比较有显著性差异(P<0.05)
3、多糖(第三批)对胃癌的作用
实验动物分配、荷瘤及给药方法同2,结果见表3
表3多糖对小鼠胃癌的抑瘤作用(
x±SD,n=10)
空白组 | 阳性对照组 | 大剂量组 | 中剂量组 | 小剂量组 | |
第一次瘤重抑瘤率第二次瘤重抑瘤率 | 2.37±0.311.39±0.41 | 0.31±0.0987.8%0.19±0.0491% | 1.42±0.35**41%0.92±0.2734%* | 1.81±0.36*25%1.06±0.2224% | 2.21±0.448%1.14±0.3318% |
与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01.
4、多糖对S180肉瘤荷瘤小鼠免疫吞噬功能的影响[2]
接种方法同上,取40只小鼠,雌雄各半,接种后次日将实验动物随机分成4组,空白对照组,多糖给药组分三个剂量组:1.5g/kg、0.5g/kg、0.167g/kg。空白对照组每日灌胃给予生理盐水0.2ml/10g,连续10天;多糖给药各组每日灌胃给药一次,连续10天。末次给药后30min,尾静注印度墨汁0.1ml/10g,眶后静脉丛取血20μl,于1、5min测光密度值,并称体重、脾重、胸腺重,计算廓清指数K及吞噬活性a。结果见表4。
表4多糖对荷瘤小鼠免疫吞噬功能的影响(
x±SD,n=10)
组别 | 剂量数(g/kg) | 脾系数(g/100g) | 胸腺系数(g/100g) | 廓清指数K | 吞噬指数a |
空白组多糖 | 1.50.50.167 | 0.85±0.120.91±0.130.92±0.140.88±0.13 | 0.249±0.0510.254±0.0590.249±0.0440.245±0.044 | 0.048±0.0160.082±0.022***0.076±0.019*0.077±0.018* | 4.91±0.536.17±0.71**6.05±0.95*6.09±0.7* |
与空白组比较*P<0.05,**P<0.01.***P<0.001
由表3结果可见,多糖可增加廓清指数K及吞噬活性a,与空白组比较具有显著性差异。
4、多糖对体外淋巴细胞转化功能的影响[3]
小鼠摘眼球放血处死,无菌条件下取出脾脏,置于盛有RPMI1640培养液的玻璃研磨器内,研磨成单细胞悬液,经200目尼龙网过滤至离心管中,1500转/分,离心5分钟,弃上清,同样方式洗涤细胞两次,最后制成5×106细胞悬液。取细胞悬液100μl加入96孔培养板中,再加入刀豆A(ConA)或多糖溶液100μl,使每孔最终体积200μl。37℃ CO2培养箱培养72小时,终止培养液前6小时加入MTT20μl,培养结束后每孔加入DMSO20μl,570nm测光密度值(OD)。结果见表5。
表5多糖对体外淋巴细胞转化功能的影响(
x±SD,n=10)
组别 | OD值 |
空白组ConA组多糖250μg/ml25μg/ml2.5μg/ml0.25μg/ml0.025μg/ml多糖+ConA组250μg/ml25μg/ml2.5μg/ml0.25μg/ml0.025μg/ml | 0.093±0.0190.529±0.211*0.889±0.6710.183±0.479*0.942±0.403*0.768±0.291*0.756±0.6140.161±0.073△0.191±0.017△0.129±0.015△0.556±0.6940.217±0.016* |
注:与空白组比较,*P<0.05,与ConA组比较△P<0.05
由表5结果可见,多糖单独使用即可促使淋巴细胞转化,其中25μg/ml、2.5μg/ml、0.25μg/ml三个剂量组作用明显,与空白组比较具有显著性差异(P<0.05)。
6、多糖体外抑瘤作用研究
采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法体外药敏试验。于无菌室、超净台中分别取S180,B16和胃癌培养液,进行活细胞记数,取(2~5)×105个/ml浓度的癌细胞,加入10%小牛血清的RPMI1640培养液于96孔培养皿,100μl/孔,给予每组6孔置37℃、CO2培养箱孵育4h,分别加入配制好的5种浓度的多糖,使培养液终浓度分别为:250μg/ml、25μg/ml、2.5μg/ml、0.25μg/ml和0.025μg/ml,空白对照组不加药液,继续培养48h,终止培养前加MTT染料,加DMSO溶解甲瓒,酶标仪测定OD值(见表6)。
表6多糖体外抑瘤作用(
x±SD,n=10)
组别 | 剂量(μg) | S180 | Hep | 胃癌 | B16 |
空白组多糖 | 250252.50.250.025 | 1.444±0.4311.509±0.5511.491±0.3821.371±0.4491.421±0.3111.388±0.451 | 1.111±0.3191.162±0.4311.067±0.3320.978±0.3121.21±0.4061.196±0.386 | 0.884±0.2690.789±0.2120.835±0.3310.915±0.3120.779±0.2210.821±0.263 | 1.647±0.4851.691±0.5821.602±0.4291.659±0.5471.521±0.6101.591±0.589 |
与空白组比较P>0.05
体外抑瘤试验表明,多糖在250μg/ml~0.025μg/ml剂量其间,体外无抑瘤作用(P>0.05)。
7、多糖对S180荷瘤小鼠生命延长的影响[4]
取雄性小鼠100只,小鼠经皮肤消毒后,腹腔注射接种S180 0.2ml/只,癌细胞数目为2×106个,接种24h后将动物随机分成5组,空白对照组、阳性对照组及给药三个剂量组分别为:1.5g/kg、0.5g/kg、0.167g/kg组。空白对照组每日灌胃给予生理盐水0.2ml/10g,连续给药10天;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺30mg/kg,隔日给药;多糖三个剂量组均为每日灌胃给药,连续12天。观察小鼠生存天数。
计算实验动物生命延长率:
生命延长率=(给药组平均生存天数-空白组平均生存天数)/空白组平均生存天数×100%。结果见表7。
表7多糖对S180荷瘤小鼠生存期的影响(x±SD,n=10)
空白组 | 阳性对照组 | 大剂量组 | 中剂量组 | 小剂量组 | |
生存期(b)生命延长率(%) | 18.7±3.5 | 22.1±36*17.8 | 25.8±5.1**38.8 | 24.9±5.8**33.5 | 27.3±6.6**46.3 |
与对照组比较**P<0.01,*P<0.05
由表7结果可见。多糖各剂量组及环磷酰胺阳性对照组均能明显延长S180荷瘤小鼠生存的时间。
结论
实验结果表明,多糖具有明显的抑瘤作用,灌胃给药,可明显抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长,延长S180荷瘤小鼠生存时间,与空白组比较具有显著差异性。对肝癌、胃癌细胞生长亦具有一定抑制作用。多糖可增加吞噬活性a,廓清指数K及胸腺系数,对体外淋巴细胞转化功能亦具有增强作用。但多糖未表现明显体外抑瘤作用,说明多糖抑瘤作用与免疫调节或增加免疫功能有关。
Claims (3)
1、利用奇可力提取多糖抗肿瘤免疫调节剂的方法。
2、工艺流程:(1)奇可力用4~20倍量20~90%乙醇回流提取,回收乙醇并浓缩至相对密度为1.02~1.08,静置,取消液用稀盐酸调pH至酸性后,用醋酸乙酯萃取,合并萃取液,回收醋酸乙酯,得奇可力多糖提取物;
(2)奇可力多糖减压干燥,粉碎成细粉,即得。
3、上述方法得到奇可力多糖可以通过常规工艺制作成各种剂型药物用于提高机体免疫能力抗肿瘤。
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CN 200410011073 CN1742765A (zh) | 2004-09-01 | 2004-09-01 | 中药奇可力多糖及其免疫制剂 |
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Cited By (1)
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CN102958500A (zh) * | 2010-06-30 | 2013-03-06 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 咖啡酰酒石酸及衍生物在食品或饮料中用于调节皮肤色素沉着的用途 |
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2004
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |