CN1723394A - 诊断或预后受试者体内主要呼吸道细菌病原体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了诊断和/或预后受试者体内呼吸道细菌感染的方法，其包括步骤：(a)对来自受试者的生物液体样品中的标志水平进行体外测量，这种标志存在的形式为(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，(ii)可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)和/或(iii)上述(i)或(ii)的一种或多种降解产物；和(b)利用所获得的测量数值评估受试者的状态。特别是，可以诊断和/或预后肺炎链球菌和结核分枝杆菌的感染。

Description

诊断或预后受试者体内主要 呼吸道细菌病原体的方法
本发明技术领域
本发明涉及主要呼吸道细菌病原体的诊断和/或预后。具体涉及肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。更详细的是它涉及人生物液体(痰、囊液(cystic fluid)、腹水、血清、血浆、尿)中可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)浓度的测定，以作为诊断呼吸道细菌感染及预后疾病发展的一种手段。
发明背景
尿激酶的细胞受体(uPAR、CD87)在细胞迁移、细胞粘附、细胞外周蛋白酶解和组织重建中起着多种作用。uPAR由大多数白细胞表达，包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和血小板。uPAR是存在于单核细胞和T细胞中的一种活化抗原，感染HIV-1的个体中T细胞uPAR的表达水平增加1，1994。体外白细胞的HIV-1感染导致在似乎与病毒开始复制在时间上一致的过程中细胞表面的uPAR表达上调2。
uPAR可以由产生缺乏GPI-锚的可溶性受体(suPAR)的细胞表面释放。虽然对这种释放的机制还不很了解，但它可能通过GPI特异的磷脂酶D催化的GPI-锚水解分裂而发生。可溶性uPAR(suPAR)已经在细胞培养物的上清液中和诸如肿瘤腹水、囊液、血清、血浆等各种生物液体中以及最近也在尿中得到了鉴定3。
在患不同癌症4、阵发性夜间血红蛋白尿综合症(PNH)5的患者及类风湿关节炎6患者的体内，血清、血浆和尿中suPAR的水平增加。血浆中suPAR水平还是对感染HIV-1的患者的总存活的一种预后标志7。
对循环性suPAR的细胞来源还不了解。在进行体外培养时，如果不是全部，也有许多表达uPAR的细胞也释放这种可溶性受体。已有人提出，癌症患者体内过量的血清suPAR来源于癌细胞和/或肿瘤浸润巨噬细胞，因为这些细胞常常表达高水平的uPAR，并且，采用携带人肿瘤的异种移植小鼠进行的试验已经明确证实肿瘤组织的确向循环系统和尿中释放了suPAR8。
发明概要
本发明所要解决的技术问题是提供一种诊断和预后主要呼吸道细菌病原体，尤其是肺炎链球菌和结核分枝杆菌的新型标志。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种测定起来简单而经济的上述类型标志。
本发明已经提供了上述技术问题的解决方案，本发明涉及一种诊断或预后受试者体内诸如肺炎链球菌和结核分枝杆菌等主要呼吸道细菌病原体的方法，其包括步骤：(a)对来自受试者的生物液体样品中的一种或多种标志的水平进行体外测量，这种标志存在的形式有(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，(ii)可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)和/或(iii)上述(i)或(ii)的一种或多种降解产物；和(b)利用所获得的测量值评估受试者的状态。
本发明基于一个惊人的发现，即携带肺炎链球菌和结核分枝杆菌这两种主要呼吸道细菌病原体的患者血清、血浆和尿中存在的可溶性uPAR(suPAR)水平升高，并且suPAR的水平可用作诊断标志。同样，携带肺炎链球菌和结核分枝杆菌这两种主要呼吸道细菌病原体的个体中suPAR水平可以预后疾病的发生及死亡。SuPAR水平是一种新型并具高度诊断和预后价值的因子，即使已存在有其它关于肺部肺炎链球菌或结核分枝杆菌感染的预后因子。
此外，本发明还基于一个认知，即suPAR的量与uPAR的量相关，由此uPAR的量也同样适合作为结核感染的诊断和预后标志。
本发明的另一个优势是suPAR的测量可采用例如简单的ELISA技术或甚至一根试条来进行，并由此可为目前所采用的预测结核感染患者的手段提供了一种非常便宜、简单而快速的补充。因此，在没有经济能力进行西方国家所采用的、费用昂贵的检测的发展中国家，suPAR水平可用于：1)确定结核的状态(诊断)；2)选择患者治疗(预测)；以及3)监测治疗的进展。
此外，本发明包括的优势还有suPAR水平可采用易于获取的样品，例如尿样或痰样非常简单地得到测定，而对例如结核的常规诊断和预测是不确定、复杂的，并包括例如在痰培养中的繁殖、临床检验和胸X-射线透视。
本发明还涉及评估感染结核或肺炎链球菌等主要呼吸道细菌病原体的受试者的状态的进展的方法，其包括步骤(a)对在不同时间点取自受试者的多个生物液体样品中每一个样品中一种或多种标志的水平进行体外测量，标志的形式包括：(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，(ii)可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)和/或(iii)上述(i)或(ii)的一种或多种降解产物；(b)利用所获得的测量值评估受试者的状态的进展。
此方法可被用于持续监控患者的状况例如治疗效果。
最后，本发明涉及利用上述知识的ELISA试剂盒和试条试剂盒(stick-kit)。
附图简述
图1TB痰阳性(SP)、TB培养物阳性(CP)、推测的TB(PTB)、在登记时接受治疗的TB阳性(TAE)和TB阴性(NEG)中suPAR水平。框式图显示了中值(框中的黑线)、四分位值(框)和异常值(数值距框顶边或底边1.5至3倍框长度的情况)，但没有显示极值(数值距框顶边或底边3倍框长度以上的情况)。
图2a显示了suPAR值和被诊断为TB阳性的概率间的关系。有16例在参与时接受了TB治疗的患者没有被包括在分析之内。因此，包括在分析之中的是TB阳性(TB痰和培养物阳性以及推测的TB)和TB阴性个体。SuPAR水平增加的患者有更高的概率被诊断为活动性TB(p＝0.0001)。SuPAR值高于8.3ng/ml(n＝8)的患者没有显示出来。底部的蓝线表示每个患者的suPAR值，高出线为中值。点线为95％置信区间。
图2b在排除TB痰阳性后被诊断为TB的概率。包括在概率分析中的患者是35例培养物阳性，63例推测的TB和64例TB阴性。因此，它预示了除去显微镜检阳性和16例在登记时接受治疗的患者以外，所有TB疑似的概率。8个样品的suPAR值高于8.5ng/ml并且没被显示出来。此图显示，尽管经痰显微镜检呈TB阴性但为TB阳性的概率随suPAR水平的增加而增加(p＝0.001)。底部的蓝线表示每个患者的suPAR值，高出线为中值。点线为95％置信区间。
图2c此图同图2b，但排除了HIV-1感染个体。在增高的suPAR和被诊断为培养物阳性或推测的TB之间存在显著联系(p＝0.02)。底部的蓝线表示每个患者的suPAR值，高出线为中值。点线为95％置信区间。
图2d显示在HIV-1阳性中根据suPAR值被诊断为TB阳性的概率，P＝0.08。在增高的suPAR和被诊断为培养物阳性或推测的TB的概率之间存在关联的趋势(p＝0.08)。底部的蓝线表示每个患者的suPAR值，高出线为中值。点线为95％置信区间。
图3显示182例活动性TB患者中存活情况的Kaplan Meier存活曲线。细线表示低suPAR的患者，粗线表示高suPAR患者。图A：当根据中值分级患者时不存在显著差异。图B：SuPAR值高于中值2倍(即＞4.2ng/ml，n＝38)的患者死亡明显快于suPAR值低于中值2倍的患者(n＝144)，p＝0.007，对数秩检验(log rank test)。
图4治疗后，从101例个体中获取血清。框式图显示这些101例个体在治疗前和治疗后(治疗后以-P标记)suPAR水平。A：TB痰阳性(SP)，B：TB培养物阳性(CP)，C：推测的TB(PTB)，D：在登记时接受治疗的TB阳性(TAE)及E：TB阴性(NEG)。为简单起见，此框式图显示了中值(框中的黑线)和四分位值(框)，但没显示异常值和极值(数值距框顶边或底边大于1.5倍框长度的情况)。
图5基于血浆suPAR水平的中值、四分位值和极值的框式图。A：对照组(中值＝2.6ng/ml)和肺炎球菌菌血症患者(中值＝5.5ng/ml)。与对照相比，患者体内suPAR显著增高(p＝0.001)。B：受感染而存活的患者(中值＝5.0ng/ml)和因感染而死亡的患者(中值＝9.4ng/ml)。死亡患者组中suPAR水平的升高在统计上呈显著性(p＝0.0001)。框代表四分位值之间的范围，包含数值的50％，whiskers从框延伸至最高值和最低值，排除了异常值和极值。环(o)代表异常值(1.5和3倍框长度)，星号(*)代表极值(大于3倍框长度的值)。
图6根据在直接显微镜检中患者对AFB呈阳性或阴性而患有疑似TB的个体中suPAR水平。
图7未接受治疗和接受了治疗的TB患者中suPAR水平。
图8左边的Y轴显示了血清suPAR的水平(ng/ml)。右边的Y轴显示了表达uPAR受体的细胞(CD87阳性细胞)的百分比。
发明详细说明
以下，为简便起见，特别就suPAR对本发明进行了解释。这不应被理解为将本发明的范围限制为suPAR。此外，本领域技术人员很容易适当地外推到uPAR及上述两种物质的降解产物。
发明人已经惊奇地发现，与健康的对照相比较，在感染肺炎链球菌和结核分枝杆菌这两种主要呼吸道细菌病原体的患者血清和/或痰中，suPAR(一种众所周知在细胞迁移和粘附中起作用的分子)的浓度增高。
主要呼吸道细菌病原体可选自：
肺炎链球菌(包括抗药性肺炎链球菌)
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)和鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)
军团菌属物种(Legionella spp.)伯氏考克斯氏体(Coxiellaburnetii)
流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，呼吸道病毒
肠道革兰氏阴性杆菌(特别是克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.))
特有真菌(球孢子菌病，组织孢浆菌病，芽生菌病)b
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
肺炎枝原体(Mycoplasma pneumoniae)
结核分枝杆菌
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosaa)
卡氏肺孢子虫(Pneumocystis cariniib)
生物液体样品可以是任何能从人体获取的液体，即痰、囊液、腹水、血液、血清、血浆和尿。尿是优选的，因为它易于获取。当用尿作为生物液体样品时，标志的测量应该和样品的总浓度水平相关联，例如，通过将标志的测量与样品中肌酸酐的含量相关联。
优选地，生物液体样品在0℃以下的低温保存，更优选的是保存于-20℃至-80℃，直到测定。
因此，生物液体样品中标志的测量可以采用任何可利用的方法或仪器进行。这种测量方法或仪器的例子有ELISA、RIA(放射免疫测定)、Western杂交印迹、TR-FIA(时间分辨免疫荧光测定)、FACS测定、试条(sticks)等。优选的测定方法或仪器是ELISA和试条。
ELISA可以以许多不同的实施方式进行，其中许多都可应用于本发明。有文献8和9描述了一个特别适合在本发明中应用的ELISA实施方式，该文献通过该引用被并入本文。
标志的测量可以采用任何适合的试条进行。优选地，这种试条包含标志的抗体作为捕获剂。
优选地，生物液体样品中uPAR的测量通过FACS分析、Western印迹或ELISA进行。
优选地，uPAR/suPAR降解产物的测量采用Western印迹或TR-FIA(时间分辨免疫荧光测定)进行。
uPAR的测量在包含uPAR表达细胞的生物液体样品，即血液样品中进行。
在步骤(a)中所获得的标志水平的测量值可用于通过将测量值与肺部无肺炎链球菌或结核分枝杆菌细菌感染的受试者体内标志水平相比较而评估受试者的状态。
如上所述，本发明的一个方面涉及评估受肺炎链球菌或结核分枝杆菌感染受试者的状态的进展的方法。
在步骤(a)中所获得的标志水平的测量值可用于通过将测量值与肺部没有结核或肺炎链球菌感染的受试者体内标志水平进行比较，和/或通过将测量值的时间过程与没有感染结核或肺炎链球菌的受试者比较而评估受试者的状态进展。
本发明还涉及评估感染结核的受试者身体状态的ELISA试剂盒，包括a)能够捕获一个或多个标志的固化捕获剂，标志形式有(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，(ii)可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)和/或(iii)上述(i)或(ii)的一种或多种降解物；和b)能够与标志结合的结合配偶体，此结合配偶体包含c)标记系统。
捕获剂可以是标志的抗体。
结合配偶体可以是标志的抗体。
优选地，标记系统与结合配偶体相缀合。标记系统可以是任何常规使用的标记系统，比如与酶相缀合的结合剂的抗体，例如，免疫球蛋白碱性磷酸酶缀合物。
此外，本发明涉及评估遭受结核或肺炎链球菌感染的受试者的身体状态的试条，包含a)能够捕获一个或多个标志的固化捕获剂，标志形式有(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，(ii)可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)和/或(iii)上述(i)或(ii)的一种或多种降解产物；和b)能够与所述标志结合的结合配偶体，此结合配偶体包含c)标记系统。
捕获剂可以是标志的抗体。
结合配偶体可以是标志的抗体。
优选地，标记系统与结合配偶体相缀合。标记系统可以是任何常规使用的标记系统，比如与酶相缀合的结合剂的抗体，例如，免疫球蛋白碱性磷酸酶缀合物。
定义
关于本发明的“uPAR”定义为存在于生物液体中uPAR表达细胞表面上的任何形式的uPAR(同CD87)。
语句“uPAR表达细胞”指诸如单核细胞、白细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞等所有表达uPAR(CD87)的细胞。
关于本发明的“suPAR”(可溶性uPAR)定义为存在于生物液体中非细胞结合态的任何形式的uPAR(同CD87)。
“生物液体”定义为能从人体获取的任何液体，即痰，囊液，腹水，血液，血清，血浆和尿。
在此所使用的语句“suPAR或uPAR的降解产物”意指使用Western印迹或抗suPAR或uPAR的抗体观察到的其所有片段。尤其是，上述语句包括suPAR的D1、D2和D3片段。
实施例
实施例1：通过测量血清suPAR诊断活动性TB
目的：
确定怀疑患有活动性TB(结核病)的患者的血清中suPAR水平是否增加，即suPAR的水平是否可用于诊断活动性TB。
试验描述
结核分枝杆菌是一种主要寄生在巨噬细胞中的胞内病原体。尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)主要存在于单核细胞核和巨噬细胞上。uPAR是一种三结构域糖基化蛋白(D1-D3)，它通过其D1结构域与尿激酶以高亲和性结合。uPAR/uPA复合物在纤溶酶原激活、细胞外周蛋白酶解、组织重建以及整联蛋白激活、细胞粘附与迁移中起作用。uPAR通过GPI锚结合在细胞表面，它可被切开，结果形成了可溶解形式的受体(suPAR)。可溶性uPAR(suPAR)包括全长受体(D1-D3)及具有趋化性特性的D2D3片段10和未知功能的D1片段。suPAR已经在细胞培养物上清液中及诸如囊液、血清、血浆和尿等生物液体中得到鉴定11。
由于在发展中国家难以诊断结核病感染以及这类感染所引起的高死亡率，我们在几内亚比绍(Guinea-Bissau)的一个人群中调查了被怀疑患有活动性结核病的个体中suPAR水平。在此我们显示suPAR包含患有活动性结核的患者中的诊断和预测信息。
群体及TB监测
自1978年起，通过人口监测体系跟踪了几内亚比绍的首都比绍的4个郊区的约46,000位居民。1996年5月，通过与国家TB医院，即Raoul Follereau(HRF)医院的合作在这个地区实施了TB监测体系。长期或临时居住在研究地区、在这2个健康中心中的任何一个中呈现活动性结核病病症或病征的所有成年人被送往医院进行进一步调查。两个TB护士每3个月一次对发现TB病例的家庭进行访问，检查并约见家庭成员以发现继发病例。疑似病例被送往TB医院进行进一步的医疗检查。居住在这个地区而在其它地方开始TB治疗的患者，如果被在国家TB计划内配发药物的护士鉴别，则也对其进行进一步调查与入选。
入选标准
入选本研究的标准是在没有其它解释性疾病的情况下一种或多种以下症状和病征：咳嗽达1个月以上且使用抗生素没有改善；持续或周期性发烧一月以上；体重减轻；呼吸困难；咯血；夜汗或淋巴结病。年龄小于15岁的人及孕妇没有包括在内。经患者同意后对其进行临床调查，使用关于病史、社会人口学和行为学危险因子的标准问卷进行口头调查，采用胸腔X-射线透视、连续3天的晨痰直接显微镜检、痰培养及Mantoux检验(使用Multiteste，Bio-Merieux，法国)进行调查。抽血检验HIV感染、血液学和免疫学参数。本研究包括262例TB疑似患者。患者在1996年至1998年间登记注册。有147男性和115女性。平均年龄为41.4岁(范围从15岁至80岁)。基于检查，将患者分为4组：1)痰直接显微镜检中AFB阳性(Acid Fast Bacilli(耐酸细菌)，AFB；直接显微镜检)患者，被称为TB痰阳性；2)显微镜检呈阴性而培养物呈阳性的患者，被称为TB培养物阳性；3)对临床病征、症状及X-射线变化与胸内活动性TB一致，而在痰直接显微镜检或培养物中没得到细菌学验证的患者以抗生素(增效复方磺胺或羟氨苄青霉素)进行治疗，然后再进行临床及胸X-射线透视评测。如果没有改善并仍为疑似，则推测患者患有TB，并称为推测的TB；4)对没有被诊断患有TB的患者，根据诊断结果(例如，肺炎)进行治疗。这些患者被称为TB阴性。
TB治疗
每天以标准剂量的乙胺丁醇、异烟肼、利福平及吡嗪酰胺进行四个月加强阶段的直接观察的治疗(DOT)，然后是4个月的延续期，由患者在健康中心每月二次接受乙胺丁醇及异烟肼。这项治疗方案是当研究计划于1996年启动时，由几内亚比绍的国家TB项目针对HIV感染个体推荐的，为了保密性和可比较性，HIV阳性和HIV阴性个体接受同样的治疗。此外，所有患者每天服用维生素B复合物及多种维生素。如果床位允许，则为病情严重的患者提供住院治疗。在加强阶段，护士在同一天探访没有接受治疗的患者并鼓励其继续接受治疗。
在2、5及8个月的随访期，通过计算药丸数及INH尿液检测验证坚持治疗，信息记录于治疗卡和治疗表格上。
实验室方法
入选时，由室外助手连续3天采集早晨痰样，并在于当天用一个4℃的密封容器运送到比绍的国家公共卫生实验室(LNSP)进行直接显微镜检及培养。在培养前，用十二烷基硫酸法消化并净化样品，以除去非分枝杆菌微生物。将0.5ml的等分匀浆化样品接种于一支内含常规Lwenstein-Jensen鸡蛋培养基(LJ)的试管中及一支内含附加0.6％的丙酮酸的修改LJ的试管中。试管于37℃温育并每周一次共检验七周。用耐酸显微镜检术确认分枝杆菌的生长。分离菌被冷冻运送到瑞典斯德哥尔摩的传染病控制研究所(SMI)进行验证。
HIV检测
在LNSP对血清采用CapillusHIV-1/HIV-2(CambridgeDiagnostics，Galway，Iraland)及EnzygnostAnti-HIV 1+2 Plus(Behring Diagnostics Gmbh，Marburg，Germany)鉴别HIV。然后以MultispotHIV-1/HIV-2(Sanofi Diagnostics Pasteur，Marnes-Ia Coquette，法国)确认阳性样品。将双重反应性样品冷冻运送到斯德哥尔摩的SMI，并采用ImmunocombII Hiv-1&2 Bispot(Orgenics，Yavne，以色列)验证。采用免疫碱性磷酸酶法测量CD4-和CD8-细胞数目。
suPAR测量
采用三明治ELISA回顾性地对冷冻血清样品的suPAR进行测量。将免疫板(Immunoplates)(Maxisorb，Nunc，Denmerk)与抗人suPAR的鼠单克隆抗体R2(2μg/ml)在包被缓冲液(15.1mM Na2CO3，35.7mMNaHCO3，pH9.6)中于4℃温育过夜。温育后，以洗脱缓冲液(PSB，0.1％Tween20)洗脱孔室3次。以磷酸缓冲盐水(PBS)中2％的牛血清白蛋白(过滤BSA，Sigma Chemical Co，St Louis，MO，USA)于37℃振荡30分钟以阻断非特异性结合。在洗脱3次后，将免疫板与以90μl缓冲液，pH7.4(7.3mM KH2PO4，50.7mM Na2HPO4，0.1M NaCl，0.5％酚红)稀释的1 0μl血清样品于室温下温育1小时。检测层由稀释缓冲液中的多克隆兔抗人suPAR(1ug/ml)组成。所使用的第二抗体为与碱性磷酸酶连接的单克隆抗兔免疫球蛋白(Sigma)，以稀释缓冲液按1∶2000比例稀释。在12ml的底物溶液，pH9.5(0.1M Tris，0.1M NaCl，5mM MgCl2)中加入底物(1片对硝基苯基磷酸盐，Sigma)30分钟后，每孔加入50μl 1M NaOH以终止反应并于450nm波长下进行测量。所有免疫板上包含有3个实验标准品。测定间和测定内变异小于10％。SuPAR的检测水平为0.03ng/ml。
统计
所有的统计分析采用统计程序SSPS第10版或SAS进行。采用MannWhitney U检验或斯氏T检验进行组间比较。采用逻辑回归模型评估以suPAR预测活动性TB的概率。所有的概率检验按似然比率测定进行。以log-rank检验分析Kaplan-Meier曲线间的差异。采用Cox比例危险模型正式评估在其它已知预后标志的背景下血清suPAR预测死亡率的能力。按部分似然比率测定进行所有的测试。统计模型允许suPAR与死亡率间存在非线性关系。线性关系是充分的。采用5％的显著水平。从入选时开始直到治疗由于死亡(N＝30)、几内亚比绍战争开始(1998年6月6日)(N＝50)、或因患者迁回到农村地区(N＝23)以至失去跟踪调查而中止或修改，进行Cox回归分析。16例在登记时正接受TB治疗的患者没有被包括在存活分析中，由于治疗可能已经影响了他们的suPAR水平。关于HIV的情况，双重感染(HIV-1和HIV-2均为阳性)的患者作为HIV-1阳性被包含在分析之中，因为已经发现双重感染个体与HIV-1个体具有同样的TB感染危险和严重性。
伦理
由负责该研究的医生向所有入选试验对象提供对HIV结果及TB疾病提供治疗前后咨询。在研究中，于登记前用葡萄牙语以书面形式以及用他们自己的语言以口头形式通知受试者。从所有患者都获得了知情同意。该研究得到了几内亚比绍共和国的公共卫生部及丹麦的中央伦理委员会的批准。
结果
在登记时，所有262人都有可测量的suPAR，suPAR中值水平为2.1ng/ml(变化范围为0.66-18.7ng/ml)。在年龄和suPAR间不存在相关性(p＝0.9)，且在男人和女人间suPAR水平没有差异(p＝0.87)(表1)。在262人中，在登记时，16人已经知道感染活动性TB并正接受适当的治疗。从其余244人中，在182人中诊断出了活动性TB，这些人随后被纳入8个月的治疗计划。在这些人中，通过痰直接显微镜检发现84例阳性(TB痰阳性)，35例在直接显微镜检下呈阴性而在培养物中呈阳性(TB培养物阳性)以及63例基于临床及放射性根据被诊断(推测的TB)。其余的64例被诊断为患有肺炎或支气管炎(TB阴性)。
结核感染中suPAR升高
TB阳性患者(TB痰阳性，TB培养物阳性及推测的TB，N＝182)中suPAR水平显著高于TB阴性患者(N＝64)(p＜0.001)(图1)。与64例TB阴性相比，84例痰阳性中(p＜0.001)及35例培养物阳性中(p＝0.005)的suPAR水平增加。与TB阴性相比，63例诊断为推测的TB中suPAR水平有增加的趋势(p＝0.06)。入选在研究中之前已经接受了治疗的16例患者与TB阴性间的suPAR水平中没有观察到差异(p＝0.72，t检验)。suPAR水平见图1。
suPAR携含TB诊断价值
在研究中包括所有登记了的试验对象时，suPAR增加被诊断为TB的概率显著增加。这显示在图2a的概率图中。由于难于诊断痰阴性个体，最令人感兴趣的分析是当排除了84例痰阳性后，在162例痰阴性个体中suPAR是否携含诊断价值。我们发现，随着suPAR水平增加，被诊断为TB培养物阳性或推测的TB的危险增加(p＝0.001，图2b)。因为HIV-1感染影响suPAR水平，我们对130例HIV-1阴性个体(76例HIV-1阴性TB培养物阳性或推测的TB及54例HIV-1阴性TB阴性患者)进行了同样的分析，并发现在被诊断为TB阳性的概率增加与suPAR水平增加间存在同样的相关性(p＝0.02，图2c)。
跟踪调查期间死亡的TB细菌学患者在入选研究时suPAR的水平更 高
患者从入选开始时进行跟踪调查并接受8个月的治疗。30例患者在跟踪期死亡，他们在入选时的中值suPAR水平为3.26(变化范围为1.04-18.70)，这显著高于232例幸存者的(中值suPAR为2.12，变化范围为0.66-16.22)(p＝0.02)。在119例经细菌学验证的TB患者(TB痰及TB培养物阳性)中，有10例在跟踪期死亡。那些死亡的患者的suPAR水平(中值为5.98ng/ml，变化范围为1.3-18.3)显著高于幸存者的(中值为3.04ng/ml，变化范围为0.9-14.7)(MannWhitney检验，p＝0.022)。在63例推测的TB中，有13例于治疗期间死亡。这13例死亡患者在入选时的suPAR水平的中值为2.35ng/ml(变化范围为1.0-6.6)，相应地幸存者的中值为2.12ng/ml(变化范围为0.7-6.6)(p＝0.45)。在64例TB阴性中，有7例在跟踪期死亡，其中值suPAR为3.32(变化范围为1.43-18.7)，57例在跟踪时存活的患者的中值suPAR为1.17ng/ml(变化范围为0.81-16.22)(p＝0.04)。当根据suPAR水平把患者分成4个同等大小的组时，与最低的suPAR四分值相比，具最高suPAR四分值的患者死亡率倾向更高(5/65对13/65，p＝0.07)(表1)。
活动性TB患者的Kaplan Meier分析
当按suPAR中值分组患者时，在患活动性TB(TB痰、TB培养物或推测的TB，n＝182)的患者间存活不存在差异(图3A)。与suPAR值低于4.2ng/ml(N＝144)的患者相比，suPAR超过中值两倍的患者，即每ml血清suPAR高于4.2ng的患者在跟踪期死亡的危险更大(MR＝3.05每ng suPAR增加，p＝0.007)，图3B。
以suPAR水平预测HIV-1感染的后果
在入选研究时发现了47例HIV-感染或双重感染的患者。HIV-1感染者的中值suPAR水平为2.34ng/ml(变化范围为0.92-18.7)。在这47例患者中，有13例在跟踪期死亡(中值suPAR为3.34，变化范围为1.15-18.70)。在研究检查中这些患者的suPAR值显著高于34例存活的患者(中值suPAR为2.05，变化范围为0.92-6.88)(p＝0.015，Mann Whitney)。对HIV-1感染的Cox回归分析显示suPAR与这个小组中的存活显著相关(p＜0.001，MR＝1.53)。在66例感染HIV-2的患者之间，suPAR水平存在相似的差异(中值suPAR为2.44，变化范围为0.91-18.30)，其中7例于跟踪期死亡(中值suPAR为3.32，变化范围为1.04-18.3)，59例存活(中值suPAR为2.44，变化范围0.91-14.71)，尽管差异由于死亡数较少而不显著(p＝0.64)。在感染TB而又感染或没感染HIV的患者的suPAR水平间或不同TB诊断小组间受HIV1或2感染的患者数目间不存在显著差异(表2)。
在Cox回归分析中血清suPAR水平与存活相关
除去16例在登记时已经接受治疗的患者，对182例诊断为活动性TB的患者在治疗开始后进行长达8个月的跟踪调查，有23例死亡。在单变量Cox回归分析中，suPAR水平与治疗期间的死亡显著相关(死亡率比率(MR)增加为1.18每ng suPAR增量，p＝0.01)，与HIV-1感染(MR＝2.66，p＝0.023)和状态及基于临床和放射性基础(推测的TB)的TB阳性一样(p＝0.03)。当同样治疗所有TB阳性患者而不管其HIV状况时，我们发现，在考虑suPAR水平时，诊断方法对死亡的时间不产生影响(p＝0.43)。并发现HIV-2阳性(p＝0.63)、年龄(p＝0.72)、性别(p＝0.19)或log10转化的CD4 T细胞计数(p＝0.42)都与跟踪期间的存活无显著相关性。
在包含所有显著因子的多变量Cox分析中，它们全部都保持显著性，与细菌学阳性TB患者相比，细菌学阴性TB(推测的TB)的MR为3.9(p＝0.003)；与HIV-阴性的TB患者相比，HIV-1阳性的MR＝2.1(p＝0.12)，MR为1.28(p＜0.001)每ng suPAR增量。
当排除HIV-1阳性患者后，在其余149例TB患者中有14例死亡。在这些感染活动性TB的HIV-1阴性患者中，suPAR仍然保持预测的能力(RR＝1.14，p＝0.05)。因此，在排除HIV-1阳性患者后，我们观察到了同样的剂量/反应(suPAR/死亡时间)关系。
讨论
结核分枝杆菌影响全世界数百万人的生命，并且每年估计有3百万人死于这种疾病。在这个实施例中，我们首次发现suPAR分子具有诊断和预后TB感染的价值。
在此实施例中，通过直接显微镜检在262例疑似为TB阳性的患者中33％发现为阳性。这些TB痰阳性比那些通过培养物(TB培养物阳性)或临床诊断(推测的TB)具有更高的水平。所有这些患者都比TB阴性具有更高的suPAR水平。
由于难以诊断显微镜检阴性患者中的活动性TB，在本研究中的一个重要问题是对TB疑似个体，suPAR是否具有诊断价值。我们发现随着suPAR水平的增加，患者通过培养物(培养物阳性)或临床调查(推测的TB)被诊断为患有活动性TB的概率增加。由于相关症状而疑似为TB的原因，本研究包括了TB阴性，这些TB阴性在培养物和临床检验的测试中呈阴性后被视为患上了肺炎，并在登记后以抗生素进行治疗。我们不知道与健康个体的对照组相比，TB阴性中的suPAR水平是否可能更高。然而，在TB阴性和被诊断为患有活动性TB的群体之间存在显著差异，由此表明肺炎不会导致suPAR的主要增加。
在入选时，有16例患者正接受适当的TB治疗。这些患者中血清suPAR水平显著低于入选后被诊断为TB的患者，并与TB阴性相当。这表明suPAR水平可在治疗后下降，并且suPAR能被用于监测治疗的效果。
在这个群体中，suPAR可以预后存活。在TB痰和培养物阳性中，有10例患者于跟踪期死亡，并且这些患者在入选时具有显著较高的suPAR水平。采用Cox回归分析，在182例诊断为TB的患者中，suPAR与存活显著相关。我们以前已经显示了suPAR可以预后HIV-1疾病进展，这种观察结果在本研究中得到了证实。当排除了HIV-1和双重阳性后，在感染活动性TB的患者中suPAR与存活间仍然保持显著的相关性。在Cox回归分析中，另一个与存活显著相关的因子是TB诊断的类型。仅仅通过临床测试诊断为活动性TB的患者(推测的TB)在跟踪期可能由于治疗耽搁而有更大的死亡危险。在TB痰阳性中观察到了最高的suPAR水平，其次是TB培养物阳性和细菌学检验呈阴性的TB个体(推测的TB)，由此表明suPAR可能与肺炎细菌负荷量相关。由于suPAR水平的增加可能反映细胞表面uPAR表达的提高，Mustjoki，我们的发现表明了suPAR和/或uPAR可能参与结核感染的发病。在结核分枝杆菌和宿主巨噬细胞间最初的相互作用是结核致病重要的第一步。这个步骤通过特定的单核细胞/巨噬细胞受体和存在于TB的表面上的配体介导。已经报道了几种介导与结核分枝杆菌结合的巨噬细胞受体，包括补体受体CR1、CR3和CR4、葡聚糖受体、甘露糖受体、脂多糖受体及toll-like受体。然而已经证明这些受体对巨噬细胞/结核分枝杆菌的相互作用都不是必须的。在结核菌的侵染中涉及到CR3已经通过使用CD11b敲除小鼠模型得到进一步的启发，这些小鼠表现出结核感染率降低了60％而对细胞内复制不产生影响。已经显示了uPAR与CR3(mac-1，CD11b/CD18)形成复合物。uPAR通过CD11b结合CR3(参见14)从而使复合物激活。因此，suPAR在TB中的诊断和预后作用的一个原因可能是由于参与和增强uPAR/CD11b结核细胞进入。另外一个可能性是uPAR通过细胞内TB复制而上调并由此反映了受感染细胞数目。除了HIV和现在的结核感染，血清suPAR水平还是患有卵巢癌和结肠直肠癌的患者的总体存活和对白血病治疗的反应的预后标志15，11。另外一个使suPAR上升的可能因素是包柔氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)，因为最近的一项体外研究表明在感染后单核细胞上uPAR的水平增加。为了能够比较癌症、TB和HIV感染的个体研究间的资料，有必要开发出一种可重复制备及可进行商业利用的suPAR检测方法。在本研究中使用的检测方法可以与我们以前对suPAR作为HIV进展预后因子的研究7中所采用的及Stephens等16的研究所描述的检测方法相似。
结果，我们发现在患有活动性TB的患者中suPAR提高，并且高suPAR水平的患者在治疗期间有更大的死亡危险。
表1按suPAR水平将患者分为同等大小的4组。括号内为在跟踪期间死亡的患者数。
第一个四分组中值1.21，变化范围0.66-1.51N＝65 第二个四分组中值1.84，变化范围1.51-2.18N＝66 第三个四分组中值2.90，变化范围2.23-3.43N＝66 第四个四分组中值5.10，变化范围3.52-18.70N＝65 总计N
TB痰阳性 9(1) 17(1) 27(1) 31(6) 84(9)
TB培养物阳性 6(0) 10(0) 7(0) 12(1) 35(1)
推测的TB 16(2) 17(4) 18(4) 12(3) 63(13)
TB阴性 27(2) 17(1) 12(2) 8(2) 64(7)
入选时接受治疗 7(0) 5(0) 2(0) 2(0) 16(0)
总计 65(5) 66(6) 66(7) 65(12) 262(30)
HIV-1阳性 10(2) 11(0) 12(5) 14(6) 47
HIV-2阳性 14(1) 16(2) 18(1) 18(3) 66
年龄(中值) 44 39 39 36
男性女性 3728 3630 3828 3629 147115
表2此表说明了在根据TB诊断分组的患者中受HIV感染的人数(及占TB诊断组的百分比)及suPAR(中值，范围)。
诊断，N(占组的百分数)suPAR中值(范围) HIV-1感染 HIV-2感染 HIV阴性 死亡
痰阳性，N＝843.17(0.99-18.30) 11(13.1％)3.11(1.8-10.9) 24(28.6％)3.28(1.3-18.3) 49(58.3％)3.09(1.0-13.4) 9(10.7％)5.86(1.3-18.3)
培养物阳性，N＝352.41(0.91-8.21) (25.7％)2.23(1.2-7.0) 6(17.1％)3.07(0.9-6.7) 20(57.1％)2.25(1.1-8.2) 1(2.9％)7.01
推测的TB，N＝632.31(0.66-6.77) 13(20.6％)2.50(1.2-6.8) 19(30.1％)2.08(1.0-6.0) 31(49.2％)2.13(0.7-5.3) 13(20.6％)2.53(1.0-6.8)
在登记时进行治疗，N＝161.62(0.77-7.30) 4(25％)1.79(1.4-3.3) 1(6.3％)1.53 (68.8％)1.29(0.8-7.3) 0
TB阴性，N＝641.73(0.81-18.70) 10(17.9％)1.67(0.9-18.7) 16(25.2％)2.15(1.0-4.6) 38(56.9％)1.63(0.8-16.2) 7(10.9％)3.32(1.4-18.7)
实施例2
在结核患者中，血清可溶性尿激酶受体的水平增加，预示了治疗期间的死亡率并可用于监测TB治疗的效果。
目标
为了调查受结核分枝杆菌感染的个体在治疗期间的血清可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)的水平是否携含预后信息及是否可用于监测TB治疗的有效性。
设计
用ELISA测量在登记时基于疑似为活动性结核而登记为一个群体的262人中及经8个月跟踪调查后的101人中的suPAR。此262人与实施例1中被调查的相同。
结果
与TB阴性个体相比，活动性TB患者中suPAR水平升高(p＜0.001)。与64例TB阴性个体(中值suPAR为1.73ng/ml)相比，直接显微镜检的TB阳性患者中suPAR水平最高(N＝84，中值suPAR为3.17ng/ml，p＝0.001)，其次是直接显微镜检呈阴性而培养物呈阳性的患者(N＝35，中值suPAR为2.14ng/ml，p＝0.005)和根据临床依据诊断的患者(N＝63，中值suPAR为2.13ng/ml，p＝0.06)。在8个月的治疗期中，有23例TB病例死亡。在检测HIV状态、年龄、性别、CD4计数及TB诊断类型的多变量Cox模型中，每ng suPAR的死亡率增加为1.25(95％CI 1.12-1.40)。治疗后，suPAR水平已经降低到TB阴性个体的水平。
结论：TB患者中suPAR水平升高并与死亡率相关。此外，suPAR是治疗有效性的标志。
研究群体和方法
入选标准和实验室方法
本研究中所包括的受试者与实施例1中的相同。在此所描述研究与实施例1中研究的差别是此研究调查了在8个月的治疗期内suPAR作为标志的作用。
此外，在治疗期间，有30例患者死亡。在8个月的跟踪期后，抽取第二次血样。在本研究中包括的262人中，从101人中获得了第二次血样。
统计
为了在组间进行比较，采用Mann-Whitney U-检验，除了在比较TB治疗前后间suPAR水平时使用了成对样品t检验。用log-rank检验分析Kaplan-Meier曲线间的差异。采用允许suPAR和死亡率间非线性关系的Cox比例危险模型正式评估与其它已知预后标志相比，血清suPAR预测死亡率的能力。所有的检验按部分似然比率检验进行。从入选开始到以下事件发生期间对死亡时间进行分析，这些事件包括：治疗终止、8个月的跟踪期、死亡(N＝30)、几内亚比绍共和国内战争的开始而影响了治疗(N＝50)，或由于患者迁回到农村地区而失去了跟踪(N＝23)。在入选时正接受TB治疗的16例患者没有被包括在存活分析中，因为治疗可能已经影响了他们的suPAR水平。关于HIV状态，双重感染的患者(HIV-1和HIV2都为阳性，N＝19)被作为HIV-1阳性包括在分析中，因为双重感染患者与HIV-1患者具有同样TB感染的危险性和严重性。使用程序SSPS第10版或SAS第8.1版进行统计学分析。采用5％的显著水平。
伦理
所有受试者在登记前都收到了葡萄牙文的书面通知及他们当地种族语言的口头通知。从所有患者都获得了知情同意。研究得到了几内亚比绍公共卫生部及丹麦中央伦理委员会的批准。
结果
所有262人在登记时都具有可测量的suPAR，其中值suPAR水平为2.1ng/ml(范围为0.66-18.7ng/ml)。在年龄与suPAR之间(p＝0.9)或男性与女性suPAR水平间(p＝0.87)不存在相关(表1)。在262人中，已经知道有16人感染有活动性TB并在登记时正接受适当的治疗。在其余246人中，有182人被诊断为活动性TB，并随后被纳入8个月的治疗计划之中。在这些人中，有84例为TB痰阳性，35例为TB培养物阳性，63例被诊断为推测的TB。其余64例被诊断为TB阴性。在治疗期间有30例死亡，其中7例为TB阴性(表1)。
在结核感染中suPAR升高
TB阳性患者(TB痰阳性，TB培养物阳性及推测的TB，N＝182)的suPAR水平显著高于TB阴性患者(N＝64，p＜0.001)。suPAR水平似乎与痰中分枝杆菌的数目相关，因为当与64例TB阴性的suPAR水平相比时，发现在84例TB痰阳性中suPAR水平最高(p＜0.001)，其次是TB培养物阳性(p＜0.001)及推测的TB(p＝0.06)，如图1所示。没有观察到在登记时接受TB治疗的16例患者和TB阴性间的suPAR水平存在差异(p＝0.72)。按suPAR水平将患者等分为4组，见表1。
对活动性TB患者的Kaplan Meier分析
当按中值suPAR水平分组患者时，活动性TB(TB痰、TB培养物或推测的TB，n＝182)患者中的存活率没有显著差异(图3A)。高suPAR的患者(比中值高2倍以上，即每ml血清中suPAR高于4.2ng的患者(n＝38))在登记后死亡显著快于低于4.2ng/ml的患者(N＝144，p＝0.007)，图3B。
在Cox回归分析中血清suPAR水平与存活相关
除去在登记时就已经开始治疗的16例患者，对182例被诊断为患有活动性TB的患者在开始治疗后进行长达8个月的跟踪调查，其中有23例死亡。在多变量Cox回归分析中，suPAR水平与治疗期间的死亡显著相关，死亡率比率(mortality rate ratio)(MR)增加为1.18每ng suPAR增加(95％CI：1.06-1.30)，与HIV-1感染(MR＝2.71，95％CI：1.16-6.29)和状态及根据临床和放射依据诊断为TB阳性(推测的TB)一样(MR＝2.48，95％CI：1.09-5.66)。当同样处理所有TB阳性患者而不考虑他们的HIV状态并对suPAR水平进行调整时，我们发现诊断方法对死亡率没有影响(p＝0.43)。发现HIV-2阳性(p＝0.63)、年龄(p＝0.72)、性别(p＝0.19)或log10 CD4细胞数目(p＝0.42)都与存活无显著相关。
所有在多变量分析中发现呈现显著性的因子在多变量Cox分析中仍然保持显著性。在作为TB诊断(推测的TB，与直接显微镜检或培养物TB阳性病例相比较，MR＝3.5(95％CI：1.39-8.67))及HIV状态(HIV-1阳性TB，与HIV-1阴性TB患者相比较，MR＝2.5(95％CI：1.07-5.99))的对照中，每ng suPAR的死亡率增加为MR＝1.25(95％CI：1.12-1.40)。
在排除HIV-1阳性患者后，在其余的149例TB患者中，有14例在跟踪期死亡。对于这149例TB患者，suPAR仍然具有预测的能力(MR＝1.14，95％CI：1.00-1.31)。因此，在HIV-1阳性与HIV-1阴性受试者中，suPAR与死亡之间的正相关是类似的。
suPAR水平作为感染HIV-1或2患者后果的预测指标
我们以前已经显示了suPAR是HIV-1进展的一个强预后因子。本研究中，在疑似患有活动性TB的262人中，有47例在入选时被发现呈HIV-1阳性并有13例死亡。对HIV-1感染的多变量Cox回归分析表明，suPAR与存活呈显著的负相关(n＝47，MR＝1.53每ng suPAR增加，95％CI：1.22-1.92)。在此小组中，没有其它参数(年龄、性别、TB诊断或CD4计数)与存活显著相关。在入选时，在262人中有66人为HIV-2阳性(没包括双重感染)，其中有7人在跟踪期死亡。suPAR对存活有类似的影响(n＝66，MR＝1.13，95％CI：0.97-1.32)，尽管由于死亡数目较小而使差异不显著。在HIV-2群体中，年龄、性别、TB诊断及CD4计数都不与存活显著相关。在不同的TB诊断组中，受和没受HIV感染的TB患者中或HIV-1和HIV-2感染的个体之间，suPAR水平没有显著差异。
治疗与suPAR水平降低相关
在本研究所包含的262人中，治疗8个月后从101例患者中获取了血清样品。在入选时，有45人被诊断为TB痰阳性，15人被诊断为TB培养物阳性，22人为推测的TB，6人在登记时接收治疗，13人为TB阴性。这些人治疗前后的suPAR水平见图3。治疗与45例TB痰阳性中suPAR显著降低相关(95％CI：-2.07- -0.56ng/ml)并与15例TB培养物阳性中suPAR非显著降低相关(95％CI：-2.12-0.24ng/ml)。对于推测的TB(95％CI：-0.81-0.84)或在登记时接受治疗的患者(95％CI：-3.3-3.1)，在其治疗前后的suPAR水平中没有观察到差异。在13例TB阴性(3例HIV-2阳性和10例HIV阴性)中，经治疗后观察到了suPAR增加(p＝0.041，95％CI：3.31-1.33ng/ml)。在3例HIV-2阳性中增加最为明显。在不同的诊断组之间，治疗后的suPAR水平没有不同(图3)。
讨论
结核分枝杆菌影响着全世界数百万人的生命，每年估计有2百万人死于这种疾病。在本实施例中，我们发现TB患者中suPAR水平升高，与TB诊断类型相关且携含预后价值。此外，治疗与血清suPAR水平降低有关。
发现TB病例中suPAR显著高于非TB病例。而且，发现直接显微镜检TB阳性病例中suPAR水平最高，其次是直接显微镜检呈阴性而培养物呈阳性的病例，再次是直接显微镜检和培养物都呈阴性的病例。如果培养物是一种比直接显微镜检更敏感的诊断痰中AFB存在的方法，这些结果可能表示血液中suPAR水平与痰中细菌数量相关，并由此与支气管中细菌负荷相关。SuPAR水平的升高可能是巨噬细胞动员到支气管中的结果。单核细胞的粘附和迁移涉及suPAR与整联蛋白间的功能性互作，这也得到uPAR剔除小鼠的研究的支持(May，Kanse，等，1998 MAY 1998/id)。描述得最充分的uPAR整联蛋白间的互作是在uPAR与CD11b/CD18补体受体3或MAC-1)之间(Simon，Rao，等，199614/id)。在这项专利被提交后，Juffermans和同事们发现在使用LAM(结核分枝杆菌的一种细胞壁成分)进行的实验性内毒素血症中，uPAR与CD11b同时上调。令人感兴趣的是，CD11b/CD18也表现出介导结核分枝杆菌向巨噬细胞的附着，表明TB可能利用这种上调而附着并感染被募集的巨噬细胞。因此，我们提出，这可能是与结核分枝杆菌相互作用的一个新的靶标。
采用Cox回归分析，发现在182例被诊断为患有TB的患者中，suPAR与存活显著相关。在几内亚比绍，TB患者中的HIV流行程度比健康对照高。我们以前已经显示了suPAR是对HIV-1疾病进展的一种强预后标志11，并且这种观察在本研究中得到证实。然而，即使在排除了HIV-1感染后，在活动性TB患者中，suPAR仍然与存活保持显著相关。
8个月的治疗导致suPAR水平显著降低，结果是那些在入选时被诊断为感染或没感染TB的患者间的suPAR水平相似。另外，有16例患者在入选时正接受适当的TB治疗。这些患者的血清suPAR水平显著低于在入选后被诊断为TB的患者，并与TB阴性相当。这些观察结果显示，suPAR测量值可能是监测TB患者治疗反应的有用工具。
SuPAR增高并可以预后HIV-1感染的后果。此项研究已经显示，TB患者中血清suPAR水平增加，而且在接受TB治疗的患者中治疗前的suPAR水平与死亡率呈正相关。
结论
在患有活动性结核的患者中血清可溶性尿激酶受体(suPAR)水平升高，且在直接显微镜分析呈痰阳性的患者中最高。即使在不包括HIV-1共感染者(已知suPAR对其是一种强预后标志)时，也发现suPAR与治疗期间TB患者的死亡率呈正相关。在治疗后，痰阳性患者具有显著低suPAR水平，这表示suPAR可被用于监测TB治疗有效性。
实施例3
血浆可溶尿激酶纤溶酶原激活物受体的水平在患有肺炎链球菌菌血症的患者中升高并携含强烈预后价值。
肺炎链球菌是社区获得性肺炎的主要致病因子，并与菌血症高度相关。在发达国家中，每年肺炎的发生率估计为每1000人中1至12例。每年肺炎球菌菌血症为每100,000人中有9至18例。肺炎球菌菌血症的死亡率为17％到36％，其中在老年人中的死亡率最高。
尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR/CD87)在不同类型细胞上表达，包括嗜中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞和恶性细胞。
众所周知，uPAR与许多生物学功能相关。uPAR及其配体尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)在纤溶酶原转换为纤溶酶中起作用。此外，uPAR结合β整合蛋白并作为炎症细胞的募集信号10。在癌症的致病机制中，uPA和uPAR通过胞外基质的降解在组织入侵中起关键作用。uPAR可通过许多蛋白酶从细胞表面切离，这些酶例如胰凝乳蛋白酶、磷脂酶C及uPA19。uPAR从细胞表面的蛋白酶解切离释放出具趋化性活性的suPAR。另一个选择是，uPAR不经蛋白酶解从细胞表面释放/分泌。
最近，我们报道了在HIV感染的前进式疾病状态与suPAR升高之间存在密切的相关性，由此表明可利用suPAR作为预后标志。最后，如本专利申请所显示的，肺结核患者血清suPAR水平升高。
SuPAR和uPA在对其它传染病免疫反应中的可能作用还不清楚。缺乏uPAR的基因剔除小鼠与野生型小鼠相比表现出肺嗜中性粒细胞募集减少及肺炎链球菌感染的死亡率增加20。化脓链球菌中的脂磷壁酸质促进体外单核细胞uPAR上调。已有报道包柔氏疏螺旋体表面蛋白诱导单核细胞uPAR上调21。
血清中蛋白质YKL-40的水平在肺炎期间升高已经得到了描述，并成为肺炎球菌菌血症患者中的一个独立预后因子。在此我们调查了肺炎链球菌菌血症是否会影响血浆中suPAR水平。我们首次报道，在肺炎链球菌菌血症的患者中suPAR升高并携含预后价值。
受试者及方法
患者
在1999年10月至2001年6月期间，入选了在丹麦的5所大学医院(Aalborg，Aarhus，Odense，Hvidovre或Rigshospitalet)之一入院的患有肺炎链球菌菌血症的成年(18岁或18岁以上)患者。在入选(医院入院)时抽取血样并在入院期间收集临床数据(如G.Kronborg，N.Weis，H.O.Madsen，S.S.Pedersen，C.Wejse，H.Nielsen，P.Skinnj，P.Garred所述，交付印刷)。从一组30人的健康个体(试验工作人员)抽取血液进行比较(对照组)。
试验总计包括141例患者，其中有77例女性和64例男性。患者的平均年龄为64岁，范围为从20岁到99岁。这些患者的66％患有一种基础性疾病，肺炎是最普遍的感染灶(n＝116)。有24例患者在医院死亡(病亡率为1 7％)。这些患者的基线特征见表3。所有的患者从入院起或当血液培养物呈阳性时接受适当的抗生素治疗。本研究得到了当地伦理委员会的批准。
ELISA
包被Maxisorb平板(Nunc，Roskilde，丹麦)，并与稀释于包被缓冲液(15.1mM Na2CO3，35.7mM NaHC3，pH9.6)中的100ul 2ug/ml抗人suPAR鼠单克隆抗suPAR抗体于4℃温育过夜。以缓冲液(PBS，0.1％Tween20)洗脱平板并用按1∶1比例稀释在PBS中的SuperBlock(Pierce Chemicals)封闭。加入于稀释缓冲液(7.3mM KH2PO4，50.7mMNa2HPO4，0.1M NaCl，0.5％酚红，pH7.4)中稀释的血浆样品，并将平板于4℃温育过夜。结合的suPAR采用100μl 1.0μg/ml兔抗人suPAR多克隆抗体(Gunilla Hoyer-Hansen博士赠送)及与碱性磷酸酶(Sigma，St.Louis，MO，USA)结合的鼠抗兔多克隆抗体(按1∶2000稀释)检测。在每一步前用洗脱缓冲液洗脱6次，以稀释缓冲液中稀释抗体，平板于37℃温育1小时。向板孔中加入底物(1片对硝苯基磷酸(Sigma，St.Louis，MO，USA)，溶于12ml含0.1M NaCl，5mM MgCl2的0.1 Tris碱，pH9.5中)，并于室温温育30分钟。通过每孔加入50μl 1M NaOH以终止反应并于405nm下测量吸收值。所有ELISA测定都一式二份进行。用ELISA测定YKL-40。
统计
采用Mann Whitney U检验进行组间比较。以逻辑回归分析分析作为预后标志的suPAR。在p值低于0.05时被视为显著。所有分析都用SPSS软件(SPSS，Chicago，II，USA)进行。
结果
肺炎球菌菌血症患者中suPAR升高。在所有141例样品中，血浆suPAR水平都可测量，其中值为5.5ng/ml(变化范围为2.4-21.0ng/ml)。对照组中的suPAR中值水平为2.6ng/ml(变化范围为1.5-4.0ng/ml)。肺炎球菌菌血症患者suPAR水平显著高于健康对照(图5A，p＝0.001)。
SuPAR预示感染的后果。将患者分为两组，一组为受感染后存活者(n＝117)，另一组为受感染而死亡的患者(n＝24)，这样的分组显示后一组中显著更高的suPAR水平(图5B，p＝0.0001)。在死亡的患者中，有79％(n＝19)的患者suPAR水平高于中值5.5ng/ml。
在由于感染而导致的死亡方面具有预后重要性的临床参数是(如G.Kronborg等所述，交付印刷)：在入院时出现脑部症状(精神错乱，神志丧失(unconsciousness))(p＝0.03)、低血压(p＝0.047)及肾衰竭(p＝0.002)；见表1。在低血压(p＝0.0001)和肾衰竭(p＝0.0001)患者中suPAR水平显著升高。在长期酗酒的群体中suPAR也得到升高(p＝0.0001)。除酒精中毒外，基础疾病与肺炎球菌菌血症的死亡后果无显著相关性，除了酒精中毒(p＝0.04)。
suPAR与YKL-40相关，而不与CRP相关。YKL-40是从嗜中性粒细胞和巨噬细胞中分泌的一种凝集素(25)。当比较suPAR水平与YKL-40水平(n＝89)时，我们发现，在suPAR和YKL-40之间存在很强的相关性(Spearman秩相关系数为0.70，p＝0.0001)。
大多数患者已经测量了他们的CRP水平。在suPAR水平和CRP水平(n＝131)之间不存在相关性。高CRP水平并不预后死亡。
suPAR是一个独立的预后标志。在对于单变量分析中发现呈显著性的所有参数(脑部症状、机械换气、低血压治疗、肾衰竭、酗酒及YKL-40)进行逻辑多变量回归分析中(表3)，仅仅只有suPAR与死亡保持显著相关。血浆suPAR高于10ng/ml的患者的死亡率(MR)为13(p＝0.04)并且每ng suPAR增加1.31(95％CI：1.10-1.57)，suPAR变化范围为2.4ng/ml至21ng/ml。
讨论
在本研究中，我们首次证明了在肺炎球菌菌血症患者中，suPAR水平大大升高。此前，已经在患各种恶性疾病和HIV-1感染及有关肺部疾病(如未进行治疗的活动性结核患者)的患者中检测到了suPAR水平升高。
在肺炎球菌菌血症中，血浆suPAR是死亡的一个强指示剂，每ngsuPAR增加(suPAR在2.4至21.0ng/ml之间变化)的死亡率为1.31。从本研究中，我们只能得到关于suPAR对肺炎球菌菌血症患者具有预后价值的结论。低血压、肾衰竭、脑部症状、长期酗酒及血浆YKL-40的升高都具有预后价值，但在多变量逻辑回归分析中，只有suPAR水平的升高是对死亡的一个独立预测者。我们建议将血浆suPAR作为对肺炎球菌感染患者的一个新型预后标志。
很难对不同研究中的suPAR值进行比较，因为检测间的变化及包含的患者的临床状况不同。然而，与健康的对照相比，在肺炎球菌菌血症患者中，suPAR似乎极大地升高。在Riisbro等的研究中，53例卵巢癌患者的中值suPAR水平为1.3ng/ml，而健康受试者的中值水平为0.9ng/ml，在癌症患者中suPAR增加了44％。与健康的对照相比，感染肺炎球菌的患者中值suPAR显著升高了112％。
我们发现在suPAR与YKL-40间存在紧密相关性。在多变量分析中，YKL-40高于500ng/ml、脑部症状及血液透析都与MR增加相关，但都不具显著性。
已经报道过一组(n＝13)ICU脓毒症患者中血浆suPAR升高22，由此推测在急性炎症阶段suPAR的分泌增加。我们将suPAR水平与CRP进行了比较并发现没有相关性。这个发现也为Slot等6所支持，他们发现在患风湿病的患者中suPAR与CRP间没有相关性。因此，本研究发现了排除suPAR是一种急性期反应物的概率的确实证据。
血浆suPAR来源的证据仍然缺乏。然而，已经知道uPAR由3个结构域组成，结构域1(D1)和2+3(D2D3)间的蛋白酶解切离导致了具有趋化活性的结构域D2D310。蛋白酶解切离由其自身的配体uPA及不同的蛋白酶(例如糜蛋白酶)介导。在ELISA中，我们使用了针对结构域3的单克隆抗uPAR捕获抗体。这意味着在我们的分析中，完整的suPAR和趋化性结构域D2D3都得到了检测。在肺炎球菌菌血症中所看到的血浆suPAR升高可能是由其从白细胞分泌增加导致的。在肺炎链球菌肺炎中，细胞因子和不同趋药性因子得到释放，并且死亡率增加与肺部高白细胞介素-6水平相关。
uPAR在先天性和获得性免疫中都起重要作用。May23等通过缺乏uPAR的转基因小鼠显示uPAR的存在对白细胞粘附到内皮极其重要。缺乏uPAR的剔除小鼠表现出对肺炎链球菌的免疫应答降低，募集至肺部的嗜中性粒细胞减少，并且缺乏uPA的小鼠对肺炎链球菌的免疫应答增强20。这些观察表明uPAR对嗜中性粒细胞的募集是必需，然而这种机制独立于蛋白酶水解能力。除了血纤溶酶活化外，相信uPAR通过整合蛋白介导了细胞和细胞的相互作用并由此在信号转导中起作用。已经充分描述了入侵的细菌利用宿主的纤溶酶系统降解胞外基质，例如A类链球菌通过链球菌激酶激活纤溶酶原。uPAR/uPA在嗜中性粒细胞和单核细胞迁移以抵抗结核及肺炎链球菌中可能的蛋白酶解作用还有待进一步研究。
所报道的在菌血症期间血浆suPAR的升高可能反映了嗜中性粒细胞、单核细胞及脉管细胞上uPAR的上调，并说明了嗜中性粒细胞和单核细胞活性的增加。结果，与结核患者相似，在肺炎球菌菌血症患者中，血浆suPAR升高并成为预测死亡的一个独立指示物。
表3
特征 n ％ 死亡率(％)
年龄，岁18-6061-75＞75男性 54503764 39352645 11221921
单变量分析低血压治疗#脑部症状#血液透析#酒精中毒YKL-400-200ng/ml201-500501-suPAR0.5ng/ml     n41112129303064     MR192.98.43.01.01.511.81.0     95％ Cl    p3.0        1.0-9.0    0.051.1-7.4    0.032.3-30.7   0.0021.0-8.5    0.04-          -0.2-9.0    0.62.4-58.8   0.003-          -
    5.1-1010.1-     5519     3.020.6     0.8-10.15.3-80     0.080.0001
多变量分析低血压治疗#脑部症状#血液透析#酒精中毒YKL-400-200ng/ml201-500501-suPAR0.5ng/ml5.1-1010.1-     n411121293030645519     MR193.76.40.81.00.83.91.02.213.0     95％ Cl0.10.8-17.10.3-1180.2-6.2-0.08-7.90.4-35-0.3-16.81.1-158     p0-2    0.10.090.20.8-0.80.2-0.40.04
表3入选的141例患者的年龄和性别分布和肺炎链球菌菌血症的预后因子。此表显示了由不同预后因子预测的死亡率(MR)。所有因子在单变量逻辑回归分析中都是显著的(p＜0.05)。在多变量分析中，只有高于10ng/ml的suPAR水平保持显著性。将脑部症状定义为在入院时神志丧失或严重精神错乱。#数据仅从139例患者中获得。CI：置信区间。
实施例4
TB涂片阳性与suPAR水平间的相关
目的
通过与显微镜检分析相比较以确定suPAR在TB感染中是否具有诊断价值。
材料和受试者
本研究包括来自几内亚比绍共和国的首都比绍4个郊区的69例患者。在本研究中入选的标准是在没有其它解释性疾病的情况下的下列一种或多种症状和病征：持续咳嗽(达1个月以上)且服用抗生素没有改善，持续或周期性发烧一月以上，体重减轻、呼吸困难、咳血、夜汗或淋巴结病。测量了69例患者的痰中suPAR。对所有患者以痰直接显微镜检检测耐酸杆菌(AFB)。采用ELISA测量suPAR。
结果
所有69人的痰中均含有可测量的suPAR。中值suPAR为每ml痰24.9ng(变化范围为3.1-50.0)。在直接显微镜检中有9例患者对AFB呈阳性，这些患者的中值suPAR为50ng/ml(检测中的最大值，变化范围为9.73-50)。这显著高于在直接显微镜检中对AFB呈阴性的60例患者(中值suPAR为20.3ng/ml；变化范围为3.1-50ng/ml)，p＝0.002，Mann Whitney检验(图6)。
讨论
本研究显示了在直接显微镜检中AFB阳性患者具有比AFB阴性个体显著高的suPAR水平。因此，在TB患者中suPAR携带有关TB痰阳性的诊断信息。
实施例5
活动性TB患者痰中具有更高的suPAR
目的
为了确定痰中suPAR是否可以被测量及接受治疗的患者suPAR水平是否低于呈TB阳性而没接受治疗的患者。
材料与受试者
本研究包括来自几内亚比绍共和国的首都比绍4个郊区的25例患者。在本研究中入选标准是在没有其它解释性疾病的情况下的下列一种或多种以下症状和病征：持续咳嗽(达1个月以上)且服用抗生素没有改善，持续或周期性发烧一月以上，体重减轻、呼吸困难、咳血、夜汗或淋巴结病。测量了25例患者痰中suPAR。所有的患者都有与胸部活动性TB及在痰直接显微镜检中发现耐酸杆菌(AFB)一致的病征、症状及X-射线变化。7例患者在取痰样时接受了治疗，18例患者在取痰样后接受治疗。治疗由每天以标准剂量的乙胺丁醇、异烟肼、利福平及吡嗪酰胺进行四个月加强阶段的直接观察治疗(DOT)组成，然后是4个月的延续期，由患者在健康中心每月二次接受乙胺丁醇及异烟肼。这项治疗方案是当研究计划于1996年启动时，由几内亚比绍共和国的国家TB项目针对HIV感染个体推荐的。为了保密性和可比较性，HIV阳性和HIV阴性个体接受同样的治疗。此外，所有患者每天服用维生素B复合物及多种维生素。在跟踪期的2、5及8个月，通过计算药丸数及INH尿液检测验证坚持治疗。由护士探访拖欠债务的患者并鼓励其继续治疗。特效的HIV药或对HIV相关疾病的预防治疗在几内亚比绍共和国这个全世界最穷的国家之一中，是不能获得的。
结果
有18例患者对AFB呈阳性，有7例患者对AFB呈阳性但正在接受治疗。在没有接受治疗的患者的痰中suPAR水平显著高于接受了治疗的7例TB患者(p＝0.024)(图7)。
讨论
在本研究中，我们发现痰中suPAR是可测量的。最重要的是，我们显示了没接受治疗的TB患者suPAR水平显著高于治疗开始后的TB患者。因此，治疗的开始导致痰中suPAR降低，痰suPAR的测量由此可用于监测TB治疗的有效性。
实施例6
目的
为了确定脊髓液中的suPAR是否可以测量。
材料与方法
从23例患有肺炎球菌疾病的患者及1例对照中获取脊髓液。采用ELISA测定suPAR。
结果
在本研究所包括的所有24人的脊髓液中suPAR都是可以测量的。中值suPAR为每ml脊髓液3.49ng。对照患者的suPAR值为0.69ng/mL。
讨论
在此我们显示了脊髓液中的suPAR是可以测量的。因此，脊髓液中suPAR的测量可被用于诊断和预后目的。
实施例7
SuPAR水平不受HCV感染或α-干扰素与病毒唑治疗的影响。
背景
我们已经显示了在感染HIV、结核或肺炎链球菌的患者中suPAR(可溶性尿激酶受体)水平增加，而且suPAR是这些疾病的独立的、高度显著的预后标志。本研究的目的是确定suPAR水平是否因HCV感染及治疗而改变。如果suPAR受HCV感染调节，这可能会影响suPAR在共感染了HCV的HIV、结核或肺炎链球菌感染患者中的预后价值。
受试者和方法
47例HCV阳性患者接受α-干扰素及病毒唑治疗12个月。所有患者都呈HIV及HBV阴性。在临治疗前(T0)、治疗结束(T12)及其6个月后(T18)抽取血样。包括30例健康对照的血浆样品作比较。采用ELISA测量suPAR并以RT-PCR测量HCV病毒负荷。
结果
在治疗后HCV病毒负荷显著下降(成对样品t检验，p＝0.033)。在治疗前(中值suPAR为2.58ng/ml，变化范围为1.15-6.01)、治疗后(中值suPAR为2.52ng/ml，变化范围为1.24-6.26)及6个月的跟踪期(中值suPAR为2.43ng/ml，变化范围为1.21-4.98)间，患者的suPAR水平没有差异。在患者和对照间没有观察到suPAR的差异(p＝0.68)。在所有时间点上suPAR高度相关(T0-T12，T0-T18及T12-T18，p值均小于0.001，r值均大于0.67，Pearson相关)。此外，在30例有反应者和19例无反应者间suPAR没有差异(p＝0.39)。
结论
血浆suPAR水平随着时间的推移保持稳定，表明了suPAR作为一种血清学标志的可能用途。血清suPAR水平不受HCV感染、HCV效价、α-干扰素及病毒唑治疗的介入或对治疗起反应的影响。这些数据表明HCV/HIV共感染不影响suPAR作为HIV感染、结核或肺炎链球菌感染患者的预后标志。
实施例8
uPAR在PBMC上的表达与血清suPAR水平相关
背景
为了确定uPAR的表面表达和血清suPAR水平之间是否存在显著关系。
方法
从来到Hvidovre医院献血部的10个健康献血者中采集血液。收集血清并采用ELISA测量suPAR浓度。使用Histopaq梯度离心收集PBMC，并利用R2抗体和抗鼠抗体的第二FITC结合抗体采用FACS分析测量CD87的表达。采用独特型阴性对照抗体作为特异性的对照。
结果
所有献血者的PBMC上都具有可测量的uPAR受体以及血清中具有可测量的suPAR。血清suPAR水平与uPAR表面表达显著相关(Pearson相关，p＜0.05)(图8)。
讨论
在此，我们已经显示了PBMC表面表达uPAR(CD87)和血清suPAR水平间的显著相关性。这与其它人的观测结果一致11，他们也发现循环细胞上的uPAR与血浆/血清中suPAR水平显著相关。因此，假定uPAR的表面表达可作为肺炎链球菌或结核分枝杆菌感染患者的强预后因子是合理的。可以采用FACS测量CD87(uPAR)并由此增加了关于诊断及患者进展状态的有价值的信息。
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Claims (14)

1.诊断受试者中呼吸道细菌感染和/或对其预后的方法，包括步骤：
(a)对来自受试者的生物液体样品中的一种或多种标志的水平进行体外测量，这些标志的形式为(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，(ii)可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)，和/或(iii)上述(i)或(ii)的一种或多种降解产物；和
(b)使用所获得的测量值评估受试者的状态。
2.根据权利要求1的方法，其中呼吸道细菌感染由病原体肺炎链球菌或结核分枝杆菌引起。
3.根据权利要求1或2的方法，其中生物液体样品为尿样，并且其中标志的测量与样品的总浓度水平相关。
4.根据权利要求1至3中任何一项的方法，其中步骤a)借助于试条而实现。
5.根据权利要求1至3中任何一项的方法，其中步骤a)采用ELISA实现。
6.评估遭受呼吸道细菌感染的受试者状态进展的方法，包括步骤
(a)对来自受试者的若干生物液体样品的每一个样品中的一种或多种标志的水平进行体外测量，这些标志的形式为(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，(ii)可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)，和/或(iii)上述(i)或(ii)的一种或多种降解产物，其中所述样品在不同时间点获取；和
(b)使用所获得的测量值评估受试者的状态的进展。
7.根据权利要求6的方法，其中呼吸道细菌感染由病原体肺炎链球菌或结核分枝杆菌引起。
8.根据权利要求7的方法，其中被评估的受试者处在治疗之中。
9.用于评估遭受呼吸道细菌感染的受试者身体状态的ELISA试剂盒，包括a)能够捕获一种或多种标志的固定化捕获剂，这些标志的形式为(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，(ii)可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)，和/或(iii)上述(i)或(ii)的一种或多种降解产物；和b)能够结合所述标志的结合配偶体，此结合配偶体包含c)标记系统。
10.根据权利要求9的试剂盒，其中呼吸道细菌感染由病原体肺炎链球菌或结核分枝杆菌引起。
11.用于评估遭受呼吸道细菌感染的受试者身体状态的试条试剂盒，包括a)能够捕获一种或多种标志的固定化捕获剂，这些标志的形式为(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，(ii)可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)，和/或(iii)所述(i)或(ii)的一种或多种降解产物；和b)能够结合所述标志的结合配偶体，此结合配偶体包含c)标记系统。
12.根据权利要求11的试条试剂盒，其中呼吸道细菌感染由病原体肺炎链球菌或结核分枝杆菌引起。
13.根据权利要求9至12中任何一项的试剂盒，其中捕获剂是抗标志的抗体。
14.根据权利要求9至12中任何一项的试剂盒，其中结合配偶体是抗标志的抗体。
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