DE19840671A1

DE19840671A1 - Verfahren zur Diagnose von Rezidiven bei nodal-negativem Brustkrebs

Info

Publication number: DE19840671A1
Application number: DE1998140671
Authority: DE
Inventors: Urs Eppenberger-Castori
Original assignee: STIFTUNG TUMORBANK BASEL
Current assignee: STIFTUNG TUMORBANK BASEL
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1998-08-26
Publication date: 2000-03-02

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Rezidiven bei nodal-gegativen Patientinnen mit einem Mammakarzinom, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Konzentrationen der Tumormarker VEGF und uPA im Brustgewebe bestimmt werden und die Werte jeweils mit Schwellenwerten verglichen werden. Aus dem Verhältnis der Werte beider Tumormarker zu den jeweiligen Schwellenwerten läßt sich die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Rezidiven prognostizieren. Dabei kann, falls die Werte für VEGF und uPA beide unter dem jeweiligen Schwellenwert liegen, vorausgesagt werden, daß die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines Rezidives unter 5% liegt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Wahr scheinlichkeit des zukünftigen Auftretens von Rezidiven bei nodal-negativen Patientinnen mit einem Mammakarzinom, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Konzentrationen der Tumor marker VEGF und uPA im Brustgewebe bestimmt werden und die Werte jeweils mit Schwellenwerten verglichen werden. Aus dem Verhält nis der Werte beider Tumormarker zu den jeweiligen Schwellen werten läßt sich die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Rezi diven prognostizieren.

In Deutschland wird pro Jahr bei 45 000 Patientinnen ein Mamma karzinom diagnostiziert. Bei etwa der Hälfte der Patientinnen wird zusätzlich ein Befall der benachbarten Lymphknoten mit Tumorzellen beobachtet. Bei diesen Patientinnen ist die Wahr scheinlichkeit hoch, daß nach Entfernung des ersten Tumors wei tere Tumore, sogenannte Rezidive, ausgebildet werden. Die Rezi dive können entweder durch Metastasierung oder aufgrund einer unvollständigen Entfernung des Primärtumors entstehen.

Patientinnen mit Befall der Lymphknoten mit Tumorzellen werden im Sinne dieser Erfindung als nodal-positiv, solche ohne Befall der Lymphknoten als nodal-negativ bezeichnet. Bei nodal-negati ven Patientinnen wird nur in einer Minderheit der Fälle das Auftreten von Rezidiven beobachtet (Kaufmann, M., Review of known prognostic variables, Rec. Res. Cancer Res. 140 : 77-87 (1996)). Gegenwärtig läßt sich zum Zeitpunkt der Entfernung des primären Mammakarzinoms nicht vorhersagen, bei welchen der no dal-negativen Patientinnen die Bildung von Rezidiven zu erwarten ist. Daher werden zur Zeit gemäß den Empfehlungen der Konsensus- Konferenz von St. Gallen (Goldhirsch, A. et al., Fith interna tional conference on adjuvant therapy of breast cancer, St. Gallen March 1995, International consensus panel on the treat ment of primary breast cancer, Eur. J. Cancer 31A(11):1754-1759, (1995)) die meisten der nodal-negativen Patientinnen nach der Operation zusätzlich mit einer Chemo- oder Hormontherapie behan delt (adjuvante Therapie). Zwangsläufig werden somit zahlreiche Patientinnen unnötig behandelt. Da zu befürchten ist, daß die adjuvante Chemotherapie selbst in vielen Fällen zum Auftreten von Rezidiven führt (Graeff, H. et al., prognostische und thera pierelevante Faktoren beim Mammakarzinom - Ergebnisse einer Kon sensuskonferenz, Onkologie 20, 426-429 (1997)), sollten über flüssige Behandlungen dieser Art unbedingt vermieden werden. Zusätzlich leiden die mit adjuvanter Chemotherapie behandelten Patientinnen regelmäßig unter starken Nebenwirkungen. Dabei handelt es sich unter anderem um Völlegefühl, Durchfall, Hitze wallungen, Haarausfall, Gewichtsabnahme und Erbrechen.

Es ist daher wünschenswert, den Kreis der Patientinnen, die mit einer adjuvanten Chemotherapie behandelt werden, soweit als möglich einzuschränken. Hierzu ist jedoch eine sichere Voraus sage darüber erforderlich, bei welchen der nodal-negativen Pa tientinnen ein Rezidiv zu erwarten ist. Während der vergangenen Jahre war es daher Ziel zahlreicher Forschungsarbeiten, Krite rien zu ermitteln, die es erlauben, frühzeitig Patientinnen mit niedrigem oder hohem Rezidivrisiko zu unterscheiden.

Derzeit wird in der Klinik die Wahrscheinlichkeit für das Auf treten eines Rezidives anhand folgender Kriterien bestimmt:
Tumordurchmesser, Befall der Lymphknoten mit Tumorzellen, Diffe renzierungsgrad der Tumorzellen, histologischer Typ des Tumors, Auftreten von Hormonrezeptoren im Tumorgewebe und das Alter der Patientin (Graeffet al., a.a.O).

Im Rahmen mehrerer Studien hat es sich gezeigt, daß neben diesen Parametern zwei Eigenschaften des Tumors entscheidend für seine Fähigkeit sind, Rezidive zu bilden:

a) Durchblutung des Tumors

Tumorzellen brauchen einen Zugang zur Blutbahn, um sich vom Primärtumor lösen zu können. Dies setzt einen hohen Anteil an Blutgefäßen im Tumorgewebe voraus. Der Tumor induziert durch die Produktion blutgefäßbildender, sogenannter angiogener Faktoren die Bildung von Blutgefäßen im Tumorgewebe. Drei wichtige angio gene Faktoren sind die Proteine Angiogenin, basischer Fibrobla stenwachstumsfaktor (bFGF) und vaskulärer endothelialer Wachs tumsfaktor (vascular endothelial growth factor, VEGF; siehe Folkman, J., Clinical applications of research on angiogenesis, N. Engl. J. Med. 333: 1757-1763, (1995); Harris, A. L., Antiangio genesis for cancer therapy, Lancet 349: 13-15, (1997); Gast, G. et al., Angiogenesis as a target for tumor treatment, Oncology 54: 177-184, (1997)).

b) Proteolytische Aktivität der Tumorzellen

Zur Bildung von Rezidiven ist müssen im Blut zirkulierende Tu morzellen in der Lage sein, durch die Gefäßwände zu wandern, um ins Gewebe eindringen zu können. Voraussetzung hierfür ist die Fähigkeit der Tumorzellen, Proteine abzubauen, welche die Gefäß wände und die darunterliegenden Gewebe umschließen. Diese Fähig keit wird als proteinabbauende oder auch proteolytische Aktivi tät der Tumorzellen bezeichnet. Ihr zugrunde liegt die Produk tion durch die Zellen sowohl von proteolytischen Enzymen als auch von Proteinen, die die proteolytische Aktivität regulieren. Beispiele für derartige Faktoren sind Plasminogenaktivator vom Urokinase-Typ (urokinase type plasminogen aktivator (uPA)) und dessen Inhibitor Plasminogenaktivator-Inhibitor I (PAI-I) (Weid ner, N., Tumor angiogenesis: review of current applications in tumor prognostication, Semin. Diag. Pathol. 10: 302-313 (1993)).

In mehrerem Studien ist untersucht worden, ob die Konzentratio nen an angiogenen und proteolytischen Faktoren im Mammakarzinom gewebe mit der Wahrscheinlichkeit der Bildung von Rezidiven assoziiert sind (Toi M. et al., Association of vascular endo thelial growth factor expression with tumor angiogenesis and early relapse in primary breast cancer, Jpn. J. Cancer Res. 85: 1045-1049, (1994)). Zu diesem Zweck wurden die Konzentratio nen dieser Faktoren im Tumorgewebe von Patientinnen gemessen. In keiner der Studien konnte allerdings eine ausreichende Korrela tion zwischen der Konzentration eines oder mehrerer Faktoren im Tumorgewebe und der Wahrscheinlichkeit der Bildung von Rezidiven ermittelt werden, da die Qualität der Voraussage davon abhängt, ob das Auftreten von Rezidiven zuverlässig vorhergesagt werden kann.

Durch die Messung von uPA und PAI-I konnten in einer Ver gleichsstudie, bei der sowohl nodal-positive und als auch nodal negative Patientinnen zusammen untersucht wurden, 75% aller Rezidive vorausgesagt werden (Grandahl-Hansen, J. et al., High levels of urokinase type plasminogen activator (uPA) and its inhibitor PAI-I in cytosolic extracts of breast carcinomas are associated with poor prognosis, Cancer Res. 53: 2513-2521, (1993)). Bei der Gruppe der nodal-negativen Patientinnen lag dieser Wert bei 85% (Jänicke, F. et al., Urokinase (uPA) and its inhibitor PAI-1 are strong and independent prognostic factors in node-negative breast cancer, Breast Cancer Res. Treat., 24: 195-208, (1993); Foekens, J. A. et al., Plasminogen activator inhibitor-1 and prognosis in primary breast cancer. J. Clin. Oncol. 12: 1648-1658, (1994)). Es zeigte sich bei einer anderen Studie, bei der das Rezidivrisiko in einer Patientinnengruppe unabhängig vom Befall der Lymphknoten untersucht wurde, daß durch eine Kombination der Messungen für VEGF, uPA und PAI-I keine Verbesserung der Vorhersagequalität zu erzielen ist (Ep penberger, U. et al., Molekulare Faktoren bestimmen die primäre und sekundäre Therapie des Mammakarzinoms, Therapeutische Um schau 54: 451-456, (1997)). Somit führten diese Studien zu dem Ergebnis, daß die Qualität der Vorhersagen, die im Stand der Technik möglich sind, nicht ausreicht, um das Auftreten von Rezidiven mit hoher Sicherheit vorherzusagen.

Das Fehlen einer sicheren Prognose ist besonders für die nodal negativen Patientinnen von Bedeutung, da bei diesen nach Entfer nung des Primärtumors eine Entscheidung über den Beginn einer Therapie zu treffen ist. Dabei steht die Frage im Vordergrund, ob überhaupt mit einer Therapie begonnen werden muß. Erst in zweiter Linie ist über die Art der Therapie zu entscheiden.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das eine sichere Prognose von Rezi diven bei nodal-negativen Patientinnen ermöglicht. Auf der Basis einer derartigen Prognose kann gegebenenfalls eine Therapieemp fehlung erfolgen.

Zur Lösung der gestellten Aufgabe wird ein Verfahren vorgeschla gen, bei dem die Mengen an VEGF und uPA im Brusttumorgewebe von nodal-negativen Patientinnen quantitativ gemessen und mit dem jeweiligen Schwellenwert verglichen werden. Dabei ist die Wahr scheinlichkeit für das Auftreten eines Rezidivs bei einer Pa tientin sehr gering, sofern sowohl die Mengen für VEGF als auch die für uPA unter dem jeweiligen Schwellenwert liegen.

Im Rahmen der Erfindung hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß es bei nodal-negativen Patientinnen im Gegensatz zu anderen Patientinnengruppen durch die kombinierte Messung von VEGF und uPA im Gewebe der Primärtumoren möglich ist, diejenigen Patien tinnen zu ermitteln, bei denen die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Rezidiven so gering ist, daß von einer adjuvanten Chemotherapie abgesehen werden kann. Die Verwendung eines ver gleichsweise hohen Schwellenwertes ermöglicht es dabei, bei überraschend vielen Patientinnen festzustellen, daß die Wahr scheinlichkeit des Auftretens von Rezidiven gering ist. Unerwar teterweise spielen andere Faktoren wie bFGF oder PAI-1 für die Voraussage von Rezidiven bei nodal-negativen Patientinnen keine Rolle.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Prognose von Rezidiven bei nodal-negativen Patientinnen mit Mammakarzinom vorgeschla gen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) die Mengen an vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (vascular endothelial growth factor, VEGF) und Plasminogen aktivator vom Urokinase-Typ (urokinase type plasminogen activator, uPA) im Gewebe des jeweiligen Mammakarzinoms be stimmt und
b) die in Stufe a) für VEGF und uPA ermittelten Werte jeweils mit Schwellenwerten für VEGF bzw. uPA vergleicht, um die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Rezidiven zu bestimmen.

Erfindungsgemäß wird das Mammakarzinomgewebe der Patientin ent nommen. Dies kann beispielsweise während einer Operation, bei der das Tumorgewebe entfernt wird, oder im Rahmen einer Biopsie geschehen.

Anschließend wird das Gewebe für die Mengenbestimmungen präpa riert. Je nach Art der Mengenbestimmung sind unterschiedliche Präparationsmethoden erforderlich. Erfindungsgemäß wird vorge schlagen, die Messungen in zytosolischen Extrakten des Tumorge webes durchzuführen. Dazu wird das Tumorgewebe zunächst mit dem Fachmann bekannten Methoden homgenisiert. Die Zusammensetzungen der verwendeten Puffer sind dem Fachmann bekannt (Jänicke, F. et al., Both the cytosols and detergent extracts of breast cancer tissues are suited to evaluate the prognostic impact of the urokinase type plasminogen activator and its inhibitor, plasmi nogen activator inhibitor type 1, Cancer Res., 54: 2527-2530, (1994)). Ferner ist dem Fachmann bekannt, welche Variationen der Puffer möglich sind. Zu diesen Variationen zählen unter anderem der Zusatz von Detergentien oder von Proteaseinhibitoren (Jänic ke, F. et al., Both the cytosols and detergent extracts of bre ast cancer tissues are suited to evaluate the prognostic impact of the urokinase type plasminogen activator and its inhibitor, plasminogen activator inhibitor type 1, Cancer Res., 54: 2527-2530, (1994)).

Anschließend werden die Zellkerne und die an die Zellmembran gebundenen Bestandteile der Zellen durch mehrere aufeinander folgende Zentrifugationsschritte abgetrennt. Die so erhaltenen zytosolischen Extrakte werden für die Messung verwendet.

Erfindungsgemäß eingeschlossen ist auch jede andere Präparation methode von Tumorgewebe, die es ermöglicht, die Mengen an VEGF und uPA in dem Gewebe zu messen. Insbesondere können VEGF und uPA in Rohextrakten ohne vorherige Ultrazentrifugation und in Extrakten mit Puffern, welche Detergentien (z. B. Triton X-100, Tween-20 und ähnliche) enthalten, gemessen werden. Diese nicht tionischen Detergentien werden häufig verwendet, um schwach an Membranen gebundene Proteine ebenfalls in Lösung zu bringen.

Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, die Konzentrationen an VEGF und uPA mittels "Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay" (ELISA) oder "Chemiluminescence Linked Immuno Sorbent Assay" (CLISA) zu messen. Die zugrundeliegenden Techniken sind dem Fachmann be kannt (Crowther, J. R. ELISA: theory and practice. Methods in molecular biology, Vol. 42, Humana Press, Totowa (1995); Diaman dis, E. and Christopoulus, T., Immunoassay, Academic Press, San Diego, (1996); Stanley, P. E. and Kricka, L. J. (eds.) Biolumi nescence and chemiluminescence current Status. Wiley Press, Cambridge (1991)). Bei ELISA und CLISA wird die Menge an VEGF bzw. uPA durch Bindung an für VEGF bzw. uPA spezifische Antikör per bestimmt, wobei die Bindung durch eine Farbreaktion nach gewiesen wird.

Die Mengen an VEGF und uPA können erfindungsgemäß auch durch weitere Verfahren bestimmt werden. Dazu zählen beispielsweise der Radioimmungssay (RIA) und der Enzymimmunoassay (EIA; Porst mann, T. und Kiessig, S. T., Enzyme immunoassay techniques. An overview, J. Immunol. Meth. 150: 5-21, (1992)) oder entsprechende Aktivitätstests. Bei den Aktivitätstests wird die biologische Aktivität des zu untersuchenden Stoffes getestet. Die Induktion der Bildung von Blutgefäßen durch VEGF kann beispielsweise im "Rabbit Cornea Assay" (Conrad, T. J. et al., In vivo measurement of corneal angiogenesis with video data acquisition and compute rized image analysis, Lab. Invest. 70: 426-434, 1994), bei der Implantierung von Matrigel (Baatout, S., Endothelial difieren tiation using Matrigel (review). Anticancer Res., 17: 451-455, (1997) oder beim "Hühner Embryo Chorioallatois Memmbrane Assay" (Ribatti, D. et al., The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on angiogenesis. Int. J. Dev. Biol. 40: 1189-1 197, (1996) gemessen werden. Die biologische Aktivität von uPA kann beispielsweise durch Messung der proteo lytischen Aktivität der Fraktionen bestimmt werden. Durch spezi fische Inhibierung von uPA kann der Anteil von uPA an der pro teolytischen Aktivität bestimmt werden. Die Menge an uPA kann außerdem durch Nachweis der mRNA mittels Northern Blot Analyse, RT-PCR oder RNAse Protection bestimmt werden (Sambrook et al., Molecular cloning, 2^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

Erfindungsgemäß werden die für VEGF und uPA im Gewebe des jewei lige Mammakarzinoms ermittelten Werte mit Schwellenwerten (cut off-values) für VEGF bzw. uPA verglichen. Die Schwellenwerte wurden ermittelt, indem im Mammakazinomgewebe von mehr als 100 nodal-negativen Patientinnen die Mengen an VEGF bzw. uPA be stimmt wurden. Dann wurde bei jeder dieser Patientinnen beobach tet, ob und wann bei ihr Rezidive auftraten. Die Patientinnen wurden dann in zwei Gruppen aufgeteilt: Unterhalb einer gewissen Menge an VEGF und uPA im Tumorgewebe war die Wahrscheinlichkeit' der Ausbildung von Rezidiven sehr gering, oberhalb dieser Menge sehr hoch. Diese Menge wurde als der Schwellenwert bezeichnet.

Erfindungsgemäß liegt bei: der Messung von VEGF und uPA in zyto solischen Extrakten der Schwellenwert für VEGF bei 0,18 ng/mg Gesamtprotein, während der Schwellenwert für uPA bei 0,8 ng/mg Gesamtprotein liegt.

Die Gesamtproteinmenge kann nach jeder beliebigen, dem Fachmann bekannten Methode, beispielsweise nach Bradford (Bradford, M. M., A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72: 248-245, (1976)), bestimmt werden.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens kann somit durch den Vergleich der Mengen an VEGF und uPA im Mammakarzinomgewebe der jeweiligen Patientin mit den Schwellenwerten für VEGF bzw. uPA die Wahrscheinlichkeit bestimmt werden, mit der ein Rezidiv auftreten wird. Dem liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß bei nodal-negativen Patientinnen durch den gleichzeitigen Vergleich der Mengen an VEGF und uPA im Tumorgewebe mit den jeweiligen Schwellenwerten die Prognose des Auftretens von Rezi diven mit einer im Stand der Technik nicht erreichten Genauig keit möglich ist. Bei Konzentrationen an VEGF und uPA unter dem jeweiligen Schwellenwert ist die Wahrscheinlichkeit für das Auf treten von Rezidiven gering. Bei einem Schwellenwert von 0,18 ng/mg für VEGF und 0,8 ng/mg für uPA ist die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Rezidiven kleiner als 10%. Durch Wahl dieser hohen Schwellenwerte ist es gleichzeitig möglich, viele Patientinnen zu bestimmen, bei denen die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines Rezidives sehr gering ist. Auf diese Weise werden viele Patientinnen ermittelt, die als gesund gelten und bei denen die Therapieempfehlung lautet, auf eine adjuvante Chemotherapie zu verzichten.

Liegt eine der beiden Konzentrationen über dem Schwellenwert, so ist die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines Rezidives erhöht. Liegen die Werte für VEGF und uPA beide über dem Schwel lenwert, so ist die Wahrscheinlichkeit hoch, daß Rezidive auf treten.

Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er Mittel zur Bestimmung der Menge an VEGF in den Extrakten des jeweiligen Mammakarzinoms und Mittel zur Bestimmung der Menge an uPA in den Extrakten des jeweiligen Mammakarzinoms ent hält.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit Mittel, um VEGF und/oder uPA mittels "Enzyme Linked Immuno Sorbent As say" (ELISA) zu messen. Dabei muß der Kit mindestens die folgen den Bestandteile umfassen:

1. Antikörper gegen VEGF und/ oder uPA, entweder lyophilisiert oder in stabilisierter gekühlter Lösung, wobei diese Anti körper an eine Oberfläche, bevorzugt an eine Kunststoff oberfläche gebunden werden können;
2. Detektions-Antikörper, ebenfalls gerichtet gegen VEGF und/ oder uPA, eventuell markiert mit einem Enzym, in stabili sierter Lösung; und
3. geeignete Standards von VEGF und uPA (lyophilisiert, gefro ren oder in stabilisierter gekühlter Lösung), die eine akkurate Kalibrierung der Messung erlauben.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit Mittel, um VEGF und/oder uPA mittels "Chemiluminescence Linked Immuno Sorbent Assay" (CLISA) zu messen. Dabei muß der Kit min destens die folgende Bestandteile umfassen:

1. Antikörper gegen VEGF und/oder uPA, entweder lyophilisiert oder in stabilisierter gekühlter Lösung, wobei diese Anti körper an eine Oberfläche, bevorzugt an eine Kunststoff oberfläche gebunden werden können;
2. Detektions-Antikörper, ebenfalls gerichtet gegen VEGF und uPA, markiert mit Chemolumineszentmarker in stabilisierter Lösung; und
3. geeignete Standards von VEGF und uPA (lyophilisiert, gefro ren oder in stabilisierter gekühlter Lösung), die eine akkurate Kalibrierung der Messung erlauben.

Kommerziell erhältliche Einzelkits, mit denen VEGF und uPA ein zeln mittels ELISA, CLISA, EIA oder RIA gemessen werden können, können zu dem erfindungsgemäßen Kit zusammengestellt werden, sofern das erfindungsgemäße Verfahren durch die Kombination dieser Einzelkits durchgeführt werden kann.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und unter Verwendung der erfindungsgemäßen Kits ist es erstmals möglich geworden, bei nodal-negativen Patientinnen genaue Voraussagen über das Auf treten von Rezidiven zu machen. Mittels der Erfindung kann die Zahl der nodal-negativen Patientinnen, die mit einer adjuvanten Therapie behandelt werden müssen, auf diejenigen mit hohem Rezi divrisiko eingeschränkt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren erläutert.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Rückfallfreies Überleben bei Patienten mit primärem Brustkrebs ohne Differenzierung in nodal-negative bzw. nodal-positive Patientinnen als Funktion von VEGF- (A) und Angiogenin- (B) Konzentrationen, wobei VEGF + bzw. Angiogenin + bedeuten, daß die Werte für die einzelnen Patientinnen über dem Schwellenwert liegen und VEGF - bzw. Angiogenin - bedeuten, daß die Werte für die einzelnen Patientinnen unter dem Schwellenwert liegen. Die Zahl in Klammern gibt die Anzahl an Rückfällen in der einzelnen Gruppe pro Gesamtzahl an Patientinnen in der Gruppe an.

Fig. 2 Rückfallfreies Überleben bei Patienten mit primärem Brustkrebs ohne Differenzierung in nodal-negative bzw. nodal-positive Patientinnen als Funktion von uPA- (A) und PAI-1- (B) Konzentrationen, wobei uPA + bzw. PAI-1 + bedeuten, daß die Werte für die einzelnen Patientin nen über dem Schwellenwert liegen und uPA- bzw. PAI-1 - bedeuten, daß die Werte für die einzelnen Patientin nen unter dem Schwellenwert liegen. Die Zahl in Klam mern gibt die Anzahl an Rückfällen in der einzelnen Gruppe pro Gesamtzahl an Patientinnen in der Gruppe an.

Fig. 3 Rückfallfreies Überleben bei Patienten mit primärem Brustkrebs ohne Differenzierung in nodal-negative bzw. nodal-positive Patientinnen als Funktion von VEGF-, uPA- (A) und PAI-1- (B) Konzentrationen, wobei VEGF +, uPA + bzw. PAI-1 + bedeuten, daß die Werte für die einzelnen Patientinnen über dem Schwellenwert liegen und VEGF -, uPA - bzw. PAI-1 - bedeuten, daß die Werte für die einzelnen Patientinnen unter dem Schwellenwert liegen. Die Zahl in Klammern gibt die Anzahl an Rück fällen in der einzelnen Gruppe pro Gesamtzahl an Pa tientinnen in der Gruppe an.

Fig. 4A Rückfallfreies Überleben in Patientinnen mit primärem Brustkrebs ohne Differenzierung in nodal-negative bzw. nodal-positive Patientinnen (n = 287) als Funktion der Anzahl der befallenen Lymphknoten (keiner, 1 bis 4, mehr als 4).

Fig. 4B Rückfallfreies Überleben bei nodal-negativen Patien tinnen als Funktion von uPA- (A) und VEGF- (B) Kon zentrationen, wobei uPA + bzw. VEGF + bedeuten, daß die Werte für die einzelnen Patientinnen über dem Schwellenwert liegen und uPA - bzw. VEGF - bedeuten, daß die Werte für die einzelnen Patientinnen unter dem Schwellenwert liegen. Die Zahl in Klammern gibt die Anzahl an Rückfällen in der einzelnen Gruppe pro Ge samtzahl an Patientinnen in der Gruppe an.

Beispiele Beispiel 1 Auswahl der Patientinnen

Die Studie wurde an 305 Patientinnen durchgeführt, die an einem unbehandelten, operierbaren primären Brustkrebs litten. Es wur den nur solche Patientinnen in die Studie aufgenommen, die nicht mit einer neoadjuvanten Therapie behandelt wurden und die vor der Mammakarzinomdiagnose noch kein oder höchstens ein Karzinom hatten. Bei allen Patientinnen wurde das primäre Mammakarzinom entfernt. Im Überwachungszeitraum (Median 27 Monate, Bereich 15 bis 51 Monate) starben von den 305 überwachten Patientinnen 49, bei 87 weiteren zeigte sich ein Rezidiv. Der klinische und pa thologische Status dieser Patientinnen ist in Tabelle 1 ge zeigt.

Beispiel 2 Klinische Proben und Präparation der zytosolischen Extrakte

Das den Patientinnen entnommene Brustgewebe wurde bei -70°C gelagert. Vor der Homogenisierung wurden die Proben in flüssigem Stickstoff zu Pulver verarbeitet. Die Homogenisierung geschieht vorzugsweise mit einem Mikrodismembrator der Firma Braun, Mel sungen. Eine Alternative ist die Pulverisierung unter Flüssig stickstoff mit Keramik-Mörser und -Pistill. Diese zweite Methode muss bei sehr kleinen Gewebeproben angewendet werden.

Das Pulver wurde anschließend in dem 3-4fachen Volumen an Homo genisierungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 1.5 mM EDTA, 5 mM Dinatriummolybdat, 100 ml/l Glycerol und 1 mM Monothiogly cerol) aufgenommen. Die Homogenisierung wurde 20-40 Sekunden lang bei 4°C in einem 13 ml-Röhrchen aus Polypropylen mit einem Gewebehomogenisator "Ultraturrax" (IKA-Werke) durchgeführt. Die Homogenate wurden bei 800 g 30 Minuten lang bei 2°C zentrifu giert, die daraus resultierenden Überstände wurden bei 100 000 g und 2°C 40 Minuten lang zentrifugiert. Die auf diese Weise als Überstände erhaltenen zytosolischen Extrakten, die die löslichen Proteine enthalten, wurden bei -70°C gelagert. Die Proteinkon zentration in den zytosolischen Extrakten wurde nach Bradford bestimmt. Die durchschnittliche Proteinkonzentration betrug 21 µg/l.

Beispiel 3 Bestimmung der Konzentration an VEGF in den zytosolischen Ex trakten

Die Konzentrationen an vascular endothelia growth factor (VEGF) wurden mit einem spezifischen Chemilumineszenz-Immunosorbentas say gemessen (Schlaeppi, J. M. et al., Chemoluminescence immuno assay for vascular endothelial growth factor in tumor-tissue homogenates, Clinical Chemistry 42: 1777-1784 (1996)). 200 µl der zytosolischen Extrakte wurden 1 : 3 mit PBS-Tween (0,1%, W/V) verdünnt und in die Vertiefungen einer 96-well Mikrotiter platte gegeben, die mit einem monoklonalen Antikörper gegen VEGF beschichtet waren. Nach Übernachtinkubation bei 4°C wurden die Vertiefungen gewaschen und mit einer Lösung inkubiert, die Acri dinium markierten Detektionsantikörper enthielt. Die Lumineszenz wurde in einem Luminometer gemessen. Dieser VEGF-Test erkennt beide sekretierten Isoformen von VEGF (VEGF₁₂₁ und VEGF₁₆₅) . Die Detektionsgrenze betrug 0,1 ng/ml. Für die statistische Auswer tung wurden VEGF-Werte unter 0,1 ng/ml mit 0 gleichgesetzt. Unter Einbeziehung des Verdünnungsfaktors wurde die VEGF-Konzen tration in ng/ml bestimmt. Um den Wert ng VEGF/mg Protein zu erhalten, wurde die VEGF-Konzentration auf die Proteinkonzen trationen der zytosolischen Extrakte bezogen.

Beispiel 4 Bestimmung von Angiogenin und bFGF in den zytosolischen Extrak ten

Die Konzentrationen an Angiogenin und basic fibroblast growth factor (bFGF) wurden in den zytosolischen Extrakten mit Hilfe von ELISA-Kits von R Systems (Minneapolis, MN, USA) und Onco gene Science Inc. (jetzt Calbiochem Oncogene Research Products, Cambridge, MA, USA) bestimmt. Die zytosolischen Extrakte wurden in den Vertiefungen der ELISA-Platten mit dem entsprechenden Probenpuffer verdünnt (1 : 100 für Angiogenin und 1 : 10 für bFGF).

Beispiel 5 Bestimmung von uPA, PAI-1 und Steroid-Hormon-Rezeptoren

Die Konzentrationen an urokinase type plasminogen activator (uPA), plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), Oestrogen- Rezeptor (ER) und Progesteron-Rezeptor (PgR) wurden mit Hilfe der folgenden Kits bestimmt:
uPA und PAI-1 mit ELISA-Kits von American Diagnostica (Green wich, CT, USA).

ER und PgR mit EIA-Kits von Abbott (Abbott Park, IL, USA).

Die cutoff-Werte für ER und PgR wurden bei 20 fmol/mg entspre chend publizierten Werten (Duffy, M. M. et al., Estradioal recep tors in human breast carcinomas assayed by use of monclonal antibodies, Clin. Chem. 32: 1972-1974 (1986)) festgelegt.

Beispiel 6 Statistische Auswertung der VEGF-Konzentrationen in den zytosolischen Extrakten

Der Median der Konzentration an VEGF betrug 0,45 ng/mg zytosoli sches Protein (Bereich 0 bis 13,8; Mittelwert ± Standardabwei chung 1,19 ± 1,8 ng/mg Protein) (Tabelle 1). Die Inter- und Intraassayvariationen betrugen 8,2 bis 8,3% und 7,2 bis 7,6%, respektive. Cox univariate Regressionsanalyse unter Verwendung nicht-transformierter oder logarithmisch transformierter VEGF- Werte (Cox, D. R., Regression models and life tables, J. R. Stat. Soc. (B) 34: 187-220, (19972), Tibshirani, R., A plain man's guide to the proportional hazards model, Clin. Invest. Med. 5: 63-68, (1982)) ergab, daß in der Studie mit 305 nodal-negativen und nodalpositiven Patientinnen die intratumoralen VEGF-Werte mit dem Rückfallrisiko positiv assoziiert waren (P < 0,05). Isotonische Regressionsanalyse ergab einen optimalen VEGF cutoff bei 0,14 ng/mg Protein. Dieser Wert liegt nahe bei der Detek tionsgrenze des Versuches. Vergleichbare Werte an VEGF wurden im benachbarten Gewebe der entsprechenden primären Tumore gefunden (Median 0 ng/mg, Bereich 0 bis 0,43, Mittelwert ± Standardabwei chung 0,02 ± 0,07 ng/mg Protein). Der optimale cutoff fiel bei nahe mit der ersten Quartfile der VEGF-Verteilung zusammen. Diese betrug 0,18 ng/mg Protein, dieser Wert wurde im folgenden als cutoff-Wert (Schwellenwert) verwendet, da auch mit diesem Wert der RFS-Wert signifikant (p < 0,001) unterschiedlich war für VEGF-negative Patientinnen (24%) und VEGF-positiven (76%) Patientinnen (RFS: relapse free survival (rückfallfreies Über leben), Länge des Zeitraumes zwischen Entfernung des Primärtu mors und Auftreten des Rezidivs; RFS-Wert: Anteil der Patientin nen ohne Rezidiv), wobei negativ bedeutet, daß der Wert für die einzelne Patientin unter dem Schwellenwert liegt und positiv, daß der Wert für die einzelne Patientin über dem Schwellenwert liegt. Die VEGF-positive Untergruppe hatte einen berechneten RFS-Wert von 58% (Konfidenzintervall (CI): 51% bis 67% nach 40 Monaten (Fig. 1A).

Dieser RFS-Wert war schlechter als der der VEGF negativen Unter gruppe (83%, CI: 75% bis 97%). Diese RFS-Werte gelten für die Gesamtheit aller Brustkrebspatientinnen ohne Unterscheidung in nodal-negative bzw. nodal-positive Patientinnen. Isotonische Regressionsanalysen der Subgruppen, die aufgeteilt wurden ent sprechend des Nodal-Status, des Menopause-Status oder des Östro gen-Rezeptor-Status ergaben keinen anderen optimalen cutoff-Wert für VEGF.

Beispiel 7 Statistische Auswertung der bFGF und Angiogeninkonzentrationen in zytosolischen Extrakten

Da intratumorale Neovaskularisierung nicht nur durch VEGF, son dern auch durch andere Faktoren wie bFGF und Angiogenin hervor gerufen wird, wurden auch die Proteinkonzentrationen von bFGF und Angiogenin in den zytosolischen Extrakten bestimmt. Die Medianwerte für bFGF und Angiogenin waren 0,28 ng/mg zytosoli sches Protein (Bereich 0 bis 6,5, Mittelwert ± Standardabwei chung 0,77 ± 1,16 ng/mg Protein) für bFGF und 31,7 ng/mg zytoso lisches Protein (Bereich 0 bis 138; Mittelwert ± Standardabwei chung 31,6 ± 20,1 ng/mg Protein) für Angiogenin. Es konnte keine Korrelation zwischen den bFGF-Konzentrationen und der RFS-Rate fetsgestellt werden, weder im gesamten Patientenkollektiv noch in den entsprechenden nodalnegativen und nodalpositiven Unter gruppen.

Ein optimaler cutoff-Punkt für Angiogenin wurde bei 38 ng/mg zytosolisches Protein gefunden. Dieser Wert ist höher als der Median für Angiogenin, der in den entsprechenden Gewebeproben und im gesunden benachbarten Gewebe gemessen wurde (Median 22, 3; Bereich 8 bis 79; Mittelwert ± Standardabweichung 25,5 ± 18,9 mg/mg Protein). Dieser cutoff-Wert ermöglichte eine signi fikante Unterscheidung der RFS-Werte (P < 0,005) zwischen Pa tienten mit negativen (72%) und positiven Angiogeninkonzentra tionen (28%) (Fig. 1B). Es konnte keine signifikante Korrela tion zwischen den Angiogeninkonzentrationen und dem RFS-Wert in nodalnegativen Mammakarzinompatientinnen gefunden werden.

Beispiel 8 Statistische Auswertung der uPA- und PAI-1-Konzentrationen in zytosolischen Extrakten

Die Fähigkeit der Tumorextrakte, extrazelluläre Matrix abzu bauen, wurde bestimmt, indem die uPA (n = 294) und PAI-1 (n = 297) Konzentrationen in den entsprechenden zytosolischen Fraktionen gemessen wurden. Der Median für uPA war 0,58 ng/mg zytosolisches Protein (Bereich 0 bis 7,9; Mittelwert ± Standardabweichung 0,85 ±0,18 ng/mg Protein). Der Median für PAI-1 war 5,7 ng/mg zyto solisches Protein ((Bereich 0 bis 44; Mittelwert ± Standardab weichung 7,4 ± 0,16 ng/mg Protein). Die Konzentration an uPA und PAI-1 waren im univariaten Cox-Modell mit dem RFS-Wert bei Pa tientinnen mit primärem Brustkrebs ohne Differenzierung in no dal-negative bzw. nodal-positive Patientinnen signifikant asso ziiert. Entsprechend der isotonischen Regressionsanalyse war der optimale cutoff (Schwellenwert) für uPA 0,8 ng/mg Protein und der für PAI-1 8,8 ng/mg Protein. Eine signifikante Abnahme der Durchschnittszeit bis zum Rückfall korrelierte mit positiven Werten für uPA (36% positive, P < 0,001) und PAI-1 (30% posi tive, P < 0,0001). Dies wird aus den Kaplan-Meier-Kurven deut lich (Fig. 2).

Der kombinierte Effekt von dichotomisierten uPA- und PAI-1-Daten führte zu einer signifikanten Unterscheidung des RFS von Patien tinnen, bei denen beide Werte negativ waren, und Patientinnen, bei denen beide Werte positiv waren (P < 0,0001). Patientinnen mit entweder uPA oder PAI-1 positiven Tumoren hatten eine schlechtere Prognose verglichen mit den Patientinnen, bei denen beide Faktoren negativ waren (P < 0,05 und P < 0,01). Bei der Untersuchung der Patientinnen, bei denen beide Faktoren positiv waren, konnte keine relevante Verbesserung der Voraussage er zielt werden. In der nodalnegativen Patientinnensubgruppe (n = 159) war uPA ein stärkerer zytosolischer Voraussagefaktor (P < 0,01) als PAI-1 (nicht signifikant). Dieses Resultat zeigt sich auch in der multivariaten Cox-Regressionsanalyse (Tabel le 2: P = 0,08 und P = 0,01 für PAI-1 und uPA, respektive).

Tabelle 2

Univariate und multivariate Cox-Analyse für den RFS-Wert in Patientinnen mit primä rem Mammakarzinom (alle Patienten)

Beispiel 9 Zusammenhang zwischen VEGF, bFGF. Angiogenin, uPA. PAI-1 und ER- Status, PgR. Status, Nodal-Status und Tumorgröße

Unter Verwendung des Mann-Whitney-Tests (Mann, H. B. and Whitney, D. R., On a test of whether one of two random variable is stocha stically larger than the other, Annals of Mathematical Stati stics 18: 50-60, (1947)) konnte keine Beziehung hergestellt wer den zwischen den intratumoralen Proteinkonzentrationen an VEGF, bFGF, uPA und PAI-1 und dem entsprechenden Alter oder Nodal- und ER-Status der entsprechenden Patientinnen. Dies zeigt an, daß diese Faktoren voneinander biologisch unabhängig sind. Eine Korrelationsanalyse, bei der die VEGF-, bFGF-, uPA- und PAI-1- Konzentrationen mit der Tumorgröße (pT1 bis pT4) verglichen wurden, ergaben allerdings eine signifikante Assoziation zwi schen steigenden Faktorgrößen und pT1 und pT2 Tumoren (p < 0,001). Die Konzentrationen an den Faktoren in den Stadien pT3 oder pT4 unterschieden sich nicht signifikärit von den Kon zentrationen im Stadium pT2 (Tabelle 1). Dies zeigt an, daß die. Förderung des Tumorwachstums durch diese Faktoren wichtiger ist bei kleineren Tumoren. Die Faktoren wirken durch eine Erhöhung der intratumoralen Gefäßpermeabilität. Dies ermöglicht, daß mehr Sauerstoff und größere Mengen an Nährstoffen den Tumor erreichen. Im Gegensatz dazu waren die Konzentrationen an Angio genin von der Tumorgröße unabhängig.

Zwischen den VEGF- und Angiogeninkonzentrationen wurde eine schwach positive Assoziation gefunden (X² - 2,6, P = 0,1). 20% der Tumore mit VEGF negativen Konzentrationen zeigten einen Angiogenin-positiven Status. Die Spearmann Rank Correlation Koeffizienten (Conover, W. J., Practical Nonparametric Statistics, 2^nd ed. New York, Wiley, (1980)) zwischen VEGF und den Hormonrezeptoren waren schwach: -0,21 und -0,2 für PgR und ER, respektive. In den PgR-negativen Tumoren waren die VEGF- Werte (P ≦ 0,001) und PAI-1-Werte (P ≦ 0,001) höher, verglichen mit ihren Konzentrationen in PgR-positiven Tumoren (Tabelle 1). Es konnte keine Assoziation gefunden werden für BFGF, uPA und Angiogenin im bezug auf den PgR-Status. VEGF korrelierte positiv mit bFGF (rho = 0,27, P < 0,005), Angiogenin (rho = 0,20, P < 0,05), uPA (rho = 0,31, P < 0,001) und PAI-1 (rho = 0,42, P < 0,0001).

Beispiel 10 VEGF, uPA und PAI-1 in multivariaten Analysen für den RFS-Wert

Um die prognostische Bedeutung von VEGF mit der anderer Faktoren zu vergleichen, wurde der VEGF-Status mit anderen zytosolischen Markern wie uPA, PAI-1, ER, und PgR in einer Cox-multivariaten Analyse (Cox, D. R., Regression models and life tables (with discussion), Journal of the Royal Statistics, Series B, 34: 187-220, (19972)) des RFS-Wertes kombiniert (Tabelle 2), dabei wur den auch klinische Parameter (Menopausestatus, Tumorgröße und Nodalstatus) mit einbezogen. Der Differenzierungsgrad korrelier te mit der Rückfallrate (P < 0, 001), aber dies wurde nicht in die multivariaten Modelle eingefügt, da eine große Anzahl an Werten fehlt. Der Nodal-Status (Fig. 4) und die Tumorgröße wurden mit einer erhöhten Wiederholungsrate assoziiert (negati ver Trend).

Obwohl bei der univariaten Analyse alle untersuchten zytosoli schen Faktoren mit dem RFS-Wert signifikant assoziiert waren, waren nur VEGF (P = 0,04) und uPA (P = 0,01) im multivariaten Modell noch von Bedeutung (Tabelle 2). Die kombinierte Bedeutung der dichotomisierten VEGF-, uPA- und PAI-1-Daten auf die RFS- Rate wird durch Kaplan-Meier-Kurven (Kaplan, E. L. and Meier, P., Nonparametric estimationfrom incomplete observations, Journal of the American Statistical Association, 53: 457-481, (1958)) ge zeigt (Fig. 3). Fünf der acht möglichen Kombinationen an VEGF, uPA und PAI-1 waren statistisch relevant repräsentiert in den 286 Tumoren. Die 66 VEGF negativen Tumore (23%) zeigten in 80% der Fälle einen uPA- und PAI-1-negativen Status (n = 53); in 12% der Fälle einen uPA-positive und PAI-1-negativen Status (n = 8) und in 8% einen uPA- und PAI-1-positiven Status (n = 5), wobei negativ bedeutet, daß der Wert für die einzelne Patientin unter dem Schwellenwert liegt und positiv, daß der Wert für die ein zelne Patientin über dem Schwellenwert liegt. Für die Untergrup pe VEGF-negativ, uPA-negativ, PAI-1-positiv, konnte kein Tumor gefunden werden. Wie in Fig. 3 gezeigt, korrelierte ein negati ver Status an VEGF, uPA und PAI-1 mit einer besseren RFS-Rate verglichen mit einem VEGF-positiven, uPA- und PAI-1-negativen Status (P = 0,05). Beide Untergruppen zeigten eine bessere RFS- Prognose verglichen mit Tumoren die positive Werte für VEGF, uPA und PAI-1 zeigten (P < 0,001). Gemäß diesen Resultaten ist eine Überexpression an uPA und PAI-1 assoziiert mit intratumoralen VEGF-Konzentrationen.

Beispiel 11 VEGF- und uPA in nodalnegativen Mammakarzinompatientinnen

In den nodalnegativen Patientinnen waren VEGF und uPA starke Prognosefaktoren (P < 0,01 für beide), so daß mittels univariate Analyse zwischen einer guten und einer schlechten Prognose un terschieden werden konnte. Wenn VEGF und uPA in die Analyse als kontinuierliche Variablen in Kombination mit der Tumorgröße eingebracht wurden, ergaben im multivariaten Cox-Regressions modell beide Faktoren ein besseres Ergebnis (Tabelle 3). Die kombinierten Effekte der dichotomisierten VEGF- und uPA-Daten werden in Fig. 4 gezeigt und mit dem RFS-Wert in Korrelation mit der Anzahl an Lymphknoten, die in Mitleidenschaft gezogen wurden, verglichen. Gemäß der Kaplan-Meier-Analyse hatte die VEGF- und uPA-negative Untergruppe eine um 18% bessere RFS-Rate als die gesamte nodalnegative Gruppe nach einem Medianunter suchungszeitraum von 37 Monaten (Fig. 4A/B), während Patienten mit VEGF-/uPA-positiven Tumoren eine RFS-Prognose hatten, die so schlecht war wie bei Patientinnen, bei denen 1 bis 4 Lymphknoten betroffen waren (VEGF-/uPA-negativ versus VEGF-/uPA-positiv P < 0,001). Bei nodal-negativen Patientinnen waren VEGF und uPA somit überraschenderweise bessere Prognosefaktoren als bei den Patientinnen, bei denen nicht nach dem Nodal-Status differen ziert wurde.

Tabelle 3

Multivariate Cox-Analyse für den RFS-Wert in nodal-negativen Patientinnen mit primärem Mammakarzinom

Claims

1. Verfahren zur Prognose von Rezidiven bei nodal-negativen Patientinnen mit Mammakarzinom, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Mengen an vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (vascular endothelial growth factor, VEGF) und Plasmi nogenaktivator vom Urokinase-Typ (urokinease type plas minogen activator, uPA) im Gewebe des jeweiligen Mamma karzinoms bestimmt und
b) die in Stufe a) für VEGF und uPA ermittelten Werte je weils mit Schwellenwerten für VEGF bzw. uPA vergleicht, um die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Rezidiven zu bestimmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Menge an VEGF und uPA in zytosolischen Extrakten des jeweiligen Mammakarzinoms bestimmt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß der Schwellenwert für VEGF 0,18 ng/mg Gesamtprotein ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeich net, daß der Schwellenwert für uPA 0.8 ng/mg Gesamtprotein ist.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich net, daß die Konzentrationen an VEGF und uPA mittels ELISA bestimmt werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich net, daß die Konzentrationen an VEGF und uPA mittels CLISA bestimmt werden.

7. Kit zur Durchführung der Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er Mittel zur Bestimmung der Menge an VEGF in Extrakten des jeweiligen Mammakarzinoms und zur Bestimmung der Menge an uPA in Extrakten des jeweiligen Mammakarzinoms enthält.

8. Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Bestimmung der Mengen an VEGF und uPA im Gewebe jeweils enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) sind.

9. Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Bestimmung der Mengen an VEGF und uPA im Gewebe jeweils chemoluminescense linked immunosorbent assays (CLISA) sind.