ES2351690T3 - Un método para diagnosticar o pronosticar patógenos bacterianos respiratorios principales en un sujeto. - Google Patents

Abstract

Un método de diagnóstico y/o de pronóstico de infecciones respiratorias bacterianas en un sujeto, que comprende las etapas de: (a) llevar a cabo una medida in vitro del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR); (ii) un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR); y/o (iii) uno o más productos de degradación de (i) o (ii), en una muestra de fluido biológico que procede de un sujeto; y (b) usar el valor obtenido de la medida para evaluar el estado del sujeto.

Description

Un método para diagnosticar o pronosticar patógenos bacterianos respiratorios principales en un sujeto.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere al diagnóstico y/o pronóstico de los principales patógenos bacterianos respiratorios. En particular, se refiere a Streptococcus pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis. Más particularmente, se refiere a las medidas de la concentración del receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR) en fluidos biológicos humanos (esputo, fluido cístico, ascitis, suero, plasma, orina) como herramienta para diagnosticar una infección bacteriana respiratoria, así como el pronóstico de la progresión de la enfermedad.

Antecedentes de la invención

El receptor celular para urocinasa (uPAR, CD87) desempeña múltiples funciones en la migración celular, adhesión celular, proteolisis pericelular y remodelación tisular. uPAR es expresado por la mayoría de leucocitos, incluyendo monocitos, macrófagos, neutrófilos y plaquetas. uPAR es un antígeno de la activación en monocitos y células T, y las células T procedentes de individuos infectados con el HIV-1 expresan niveles elevados de uPAR^{1}, 1994. La infección de leucocitos in vitro por HIV-1 provoca el aumento de la expresión en la superficie celular de uPAR, en un proceso que parece estar coordinado temporalmente con el comienzo de la replicación vírica^{2}.

uPAR se puede desprender de la superficie celular generando una forma soluble del receptor (suPAR) que carece del anclaje GPI. El mecanismo de desprendimiento está mal comprendido, pero se puede producir mediante la escisión hidrolítica del anclaje de GPI catalizada por la fosfolipasa D específica de GPI. Se han identificado formas solubles de uPAR (suPAR) en sobrenadantes de cultivos celulares y en diversos fluidos biológicos tales como ascitis tumoral, fluido cístico, suero, plasma y también recientemente en orina^{3}.

Los niveles de suPAR en suero, plasma y orina son elevados en pacientes que sufren diferentes tipos de cáncer^{4}, el síndrome de hemoglobinuria nocturna paroxísmica (PNH)^{5}, y en pacientes con artritis reumatoide^{6}. El nivel plasmático de suPAR es además un marcador de pronóstico para la supervivencia global en pacientes que sufren infección por HIV-1^{7}. Dekkers et al., (2000) en Infection and Immunity 68(4): 2156-2160 encuentran que la endotoxina, inyectada en sujetos, induce la expresión de uPAR en monocitos y aumenta la expresión de uPAR en monocitos in vitro. Coleman et al., (2001) en J. Immunology 166: 473-480 encuentran que Borrelia burgdorferi y componentes bacterianos (proteína A de la superficie) aumentan la expresión y liberación de uPAR en monocitos humanos. Florquin et al (2001) en Kidney International 59: 2054-2061, encuentran que los niveles de uPAR en plasma y orina son elevados en pacientes con urosepticemia y endotoxemia. Fause et al., (2000) en J. Neuroimmunology 111: 234-240 encuentran que la lesión asociada con la expresión de uPAR contribuye al menos en parte a la alteración de la berrera hematoencefálica y a la disfunción inmunológica en la patogénesis de la malaria cerebral. Heegaard et al., (1994) en Fibrinolysis 8: 22-30 encuentran un incremento en el nivel de uPAR en células lácteas durante la mastisis. Todd et al., (1985) en J. Immunology 135(6): 3869-3877 encuentran que el nivel de expresión de un antígeno de membrana plasmática (Mo3e) en fagocitos mononucleares está potenciado por la exposición a lipopolisacárido bacteriano. Eugen-Olsen et al., (2002) en Int. J. Lung Disease 6(8): 686-692 encuentran que los niveles de suPAR son elevados en pacientes con tuberculosis. El documento WO 0138871 describe un método para diagnosticar y pronosticar la infección por HIV en un sujeto, que comprende medir un marcador en forma de suPAR, uPAR o un producto de la degradación del mismo en una muestra biológica procedente del sujeto. Juffermans et al., (2001) en Infection and Immunity 69(8): 5182-5185 encuentran que pacientes con tuberculosis tienen mayores niveles de expresión de uPAR monocítico. Garcia-Monco et al., (2002) en J. Neuroimmunology 129: 216-223 encuentran que suPAR está presente en suero y en líquido cerebroespinal de pacientes con meningitis carcinomatosa, trastornos paraneoplásicos e infecciones bacterianas y víricas del sistema nervioso central.

El origen celular de suPAR circulante es desconocido. Muchas células, si no todas, que expresan uPAR también desprenden formas solubles del receptor cuando se cultivan in vitro. Se ha sugerido que la fuente de suPAR sérico en exceso, en pacientes con cáncer, deriva de las células cancerosas y/o macrófagos infiltrantes de tumores, ya que estas células expresan a menudo niveles elevados de uPAR, y experimentos que usan ratones xenoinjertados que poseen tumores humanos han demostrado de hecho que el tejido tumoral libera suPAR a la circulación y orina^{8}.

Sumario de la invención

El problema técnico afrontado por la presente invención es proporcionar un nuevo marcador para diagnosticar y pronosticar patógenos bacterianos respiratorios principales, en particular Streptococcus pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis. Un problema técnico adicional afrontado por la presente invención es proporcionar un marcador del mencionado tipo, que es simple y que se puede medir.

La presente invención ha proporcionado una solución a los problemas técnicos anteriores, dirigiéndose la invención a un método para diagnosticar o pronosticar infecciones bacterianas respiratorias principales, provocadas por patógenos, tales como Streptococcus pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis, en un sujeto, que comprende las etapas de

(a)

llevar a cabo in vitro una medida del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR), (ii) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR), y/o (iii) uno o más productos de la degradación de (i) o (ii), en una muestra de fluido biológico procedente de un sujeto, y

(b)

usar el valor de medida obtenido para evaluar el estado del sujeto.

La invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que uPAR soluble (suPAR) está presente en niveles elevados en suero, plasma y orina de pacientes con dos patógenos bacterianos respiratorios principales, Streptoco- ccus pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis, y que el nivel de suPAR es útil como un marcador de diagnóstico. También, el nivel de suPAR en individuos con dos patógenos bacterianos respiratorios principales, Streptococcus pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis, es un pronóstico para el desarrollo de la enfermedad y muerte. El nivel de suPAR es un nuevo factor de enorme diagnóstico y pronóstico, incluso en el contexto de otros factores de pronóstico conocidos relacionados con la infección por Streptococcus pneumoniae o Mycobacterium tuberculosis del pulmón.

Además, la presente invención se basa en el reconocimiento de que la cantidad de suPAR se correlaciona con la cantidad de uPAR, y que, por lo tanto, las cantidades de uPAR son igualmente adecuadas como indicadores de diagnóstico y de pronóstico de la infección con tuberculosis.

Una ventaja adicional de la invención es que la medida de suPAR se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, una técnica de ELISA simple, o incluso una barrita, por lo tanto puede proporcionar un suplemento muy barato, simple y rápido a las herramientas de pronóstico usadas actualmente para personas infectadas con tuberculosis. De este modo, en países en desarrollo sin la posibilidad financiera de llevar a cabo los ensayos costosos usados en países occidentales, los niveles de suPAR se podrían usar 1) para determinar el estado de la tuberculosis (diagnóstico), 2) para seleccionar pacientes para el tratamiento (pronóstico), y 3) para monitorizar el progreso del tratamiento.

Además, la presente invención implica la ventaja de que mientras que los niveles de suPAR se pueden medir de forma muy simple, usando por ejemplo una muestra de orina o muestra de esputo, que es fácil de obtener, los ensayos convencionales de diagnóstico y pronóstico para por ejemplo tuberculosis son inciertos, complejos e implican, por ejemplo, el crecimiento en cultivo de esputo, ensayo clínico y radiografía de rayos X del tórax.

La invención se refiere además a un método para evaluar la progresión del estado de un sujeto que sufre una infección bacteriana respiratoria principal, provocada por un patógeno, tal como tuberculosis o Streptococcus pneumoniae, que comprende las etapas de

(a)

llevar a cabo una medición in vitro del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR), (ii) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR), y/o (iii) uno o más productos de la degradación de (i) o (ii), en cada una de un número de muestras de fluido biológico procedentes de un sujeto, en el que las muestras se obtienen en diferentes puntos de tiempo, y

(b)

usar los valores de medida obtenidos para evaluar la progresión del estado del sujeto.

Este método se puede usar para monitorizar continuamente el estado, por ejemplo la eficacia de tratamiento del paciente.

Finalmente, la presente invención se refiere al uso de un kit de ELISA o al uso de un kit de barrita para evaluar el estado físico de un sujeto que sufre infección bacteriana respiratoria, comprendiendo cada uno del kit de ELISA y del kit de barrita a) un agente de captura inmovilizado capaz de capturar uno o más marcadores en forma de (i) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR), y/o (ii) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR), y/o (iii) uno o más productos de la degradación de (i) o (ii), y b) una pareja de unión capaz de unirse al mencionado marcador, comprendiendo la pareja de unión c) un sistema de marcado.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Niveles de suPAR entre esputo positivo a TB (SP), cultivo positivo a TB (CP), TB supuesta (PTB), positivo a TB que recibe tratamiento al enrolarse (TAE), y negativo a TB (NEG). La gráfica de cajas muestra la mediana (línea negra en la caja), cuartiles (caja) y valores atípicos (casos con valores de longitudes de caja entre 1,5 y 3 desde el extremo superior o inferior de la caja), pero no extremos (casos con valores de longitudes de caja mayores de 3 desde el borde superior o inferior de la caja).

La figura 2a muestra la relación entre los valores de suPAR y la probabilidad de ser diagnosticado positivo a TB. Los 16 pacientes que están en tratamiento para TB en el momento de la inclusión no se incluyeron en el análisis. De este modo, se incluyeron en el análisis los individuos positivos a TB (esputo y cultivo positivos a TB y TB supuesta) y los individuos negativos a TB. Los pacientes con suPAR creciente tienen una mayor probabilidad de ser diagnosticados con TB activa (P = 0,0001). No se muestran los pacientes con valores de suPAR por encima de 8,3 ng/ml (n = 8). Las líneas azules en la parte inferior indican los valores de suPAR de los pacientes individuales, y la línea elevada es el valor de la mediana. Las líneas punteadas son intervalos de 95% de confianza.

Figura 2b. Probabilidad de ser diagnosticado con TB cuando se excluye el esputo positivo a TB. Los pacientes incluidos en el análisis de probabilidad son los 35 de cultivo positivo, los 63 de TB supuesta y los 64 negativos a TB. De este modo, predice la probabilidad de todos los sospechosos con TB, excluyendo el positivo microscópico y los 16 pacientes en tratamiento al enrolarse. Ocho muestras tuvieron valores de suPAR por encima de 8,5 ng/ml, y no se muestran. La figura muestra que la probabilidad de ser positivo a TB a pesar de un análisis microscópico de esputo negativo a TB aumenta con el aumento de los niveles de suPAR (p = 0,001). Las líneas azules en la parte inferior indican los valores de suPAR de los pacientes individuales, y la línea elevada es el valor de la mediana. Las líneas punteadas son intervalos de 95% de confianza.

Figura 2c. La figura es idéntica a la figura 2b, excepto por la exclusión de individuos infectados con HIV-1. Hubo una relación significativa entre el aumento de suPAR y la probabilidad de ser diagnosticado como cultivo positivo o TB supuesta (p = 0,02). Las líneas azules en la parte inferior indican los valores de suPAR de los pacientes individuales, y la línea elevada es el valor de la mediana. Las líneas punteadas son intervalos de 95% de confianza.

La figura 2d muestra la probabilidad de ser positivo a TB entre positivos a HIV-1 según el valor de suPAR. p = 0,08. Hubo una tendencia hacia una relación entre el aumento de suPAR y la probabilidad de ser diagnosticado como cultivo positivo o TB supuesta (p = 0,08). Las líneas azules en la parte inferior indican los valores de suPAR de los pacientes individuales, y la línea elevada es el valor de la mediana. Las líneas punteadas son intervalos de 95% de confianza.

Figura 3. Curvas de supervivencia de Kaplan Meier que muestran la supervivencia entre los 182 pacientes con TB activa. La línea delgada indica pacientes con bajo suPAR, y la línea en negrita indica pacientes con suPAR elevado. Figura A: no hay diferencia significativa cuando se estratifican pacientes según el valor de la mediana. Figura B: los pacientes con valores de suPAR por encima de 2 veces el valor de la mediana (es decir, >4,2 ng/ml, n = 38), murieron de forma significativamente más rápido que los pacientes con suPAR por debajo de 2 veces el valor de la mediana (n = 144), p = 0,007, prueba de rangos logarítmicos.

Figura 4. Después del tratamiento, había disponible suero procedente de 101 individuos. La gráfica de cajas muestra los niveles de suPAR previos y posteriores (los posteriores marcados con -P) de estos 101 individuos. A: esputo positivo a TB (SP), B: cultivo positivo a TB (CP), C: TB supuesta (PTB), D: positivo a TB que recibe tratamiento al alistarse (TAE), y E: negativo a TB (NEG). Por simplicidad, la gráfica de cajas muestra la mediana (línea negra en caja) y cuartiles (caja), pero no los valores atípicos ni los extremos (casos con valores de longitudes de caja mayores de 1,5 desde el borde superior o inferior de la caja).

Figura 5. Gráficas de cajas basadas en los valores de la mediana, cuartiles, y extremos de los niveles de suPAR plasmático. A: grupo de control (mediana = 2,6 ng/ml) y pacientes bacteriémicos neumocócicos (mediana = 5,5 ng/ml). suPAR estaba significativamente elevado en pacientes comparados con los controles (p = 0,001). B: pacientes que sobreviven a la infección (mediana = 5,0 ng/ml) y pacientes que mueren por la infección (mediana = 9,4 ng/ml). El nivel aumentado de suPAR en el grupo de pacientes muertos era estadísticamente significativo (p = 0,0001). Las cajas representan el intervalo intercuartil que contiene el 50% de valores, y los bigotes, que se extienden desde las cajas, los valores más elevados y más bajos, excluyendo valores atípicos y extremos. Los círculos (o) representan valores atípicos (longitudes de la caja de 1,5 y 3) y las estrellas (*) representan los extremos (valores con longitudes de caja mayores de 3).

Figura 6. Niveles de suPAR en individuos con TB sospechosa según si los pacientes fueron positivos o negativos para AFB en microscopía directa.

Figura 7. Niveles de suPAR en pacientes con TB no tratados y tratados.

Figura 8. El eje Y a la izquierda muestra el nivel sérico de suPAR (ng/ml). El eje Y a la derecha muestra el porcentaje en células que expresan el receptor uPAR (células CD87 positivas).

Descripción detallada de la invención

En lo siguiente, la invención se explica en particular con referencia a suPAR por razones de simplicidad. Esto no se debería de entender como una limitación del alcance de la presente invención para suPAR. Además, las extrapolaciones adecuadas a uPAR y los productos de degradación de estas dos sustancias caen dentro de la pericia de la persona experta en la técnica.

Se ha encontrado sorprendentemente que la concentración de suPAR, una molécula que en general se sabe que está implicada en la migración y adhesión celular, está incrementada en suero y/o esputo procedente de personas con dos patógenos bacterianos respiratorios principales, Streptococcus pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis, en comparación con controles sanos.

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Los patógenos bacterianos respiratorios principales son:

Streptococcus pneumoniae (incluyendo S. pneumoniae resistente a fármacos)

Chlamydia pneumoniae y Chlamydia psittaci

Legionella spp.

Coxiella burnetii

Virus respiratorios de Haemophilus influenzae

Bacilos gramnegativos entéricos (especialmente Klebsiella spp.)

Hongos endémicos (coccidioidomycosis, histoplasmosis, blastomycosis)

Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes

Mycoplasma pneumoniae

Mycobacterium tuberculosis

Pseudomonas aeruginosa

Pneumocystis carinii

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La muestra de fluido biológico puede ser cualquier fluido que se puede obtener de seres humanos, es decir, esputo, fluido cístico, ascitis, sangre, suero, plasma, y orina. Se prefiere la orina debido al hecho de que es fácil de obtener. Cuando se usa orina como la muestra de fluido biológico, la medida del marcador se debería de correlacionar con el nivel de concentración total de la muestra, por ejemplo correlacionando la medida del marcador con el contenido de creatinina en la muestra.

Preferiblemente, la muestra de fluido biológico se almacena a una temperatura por debajo de 0ºC, más preferiblemente desde -20ºC hasta -80ºC, hasta la medida.

La medida del marcador en la muestra de fluido biológico se puede llevar a cabo usando para ello cualquier método/dispositivo disponible. Los ejemplos de tales métodos/dispositivos de medida son ELISA, RIA (radioinmunoensayo), transferencia Western, TR-FIA (ensayos inmunofluorométricos resueltos en el tiempo), análisis de FACS, barritas, etc. Los métodos/dispositivos de medida preferidos son ELISA y las barritas.

Un ELISA se puede llevar a cabo en un número de diferentes realizaciones, muchas de las cuales son aplicables en la presente invención. Una realización de ELISA, que es particularmente adecuada para uso en la presente invención, es la descrita por ^{8}, y ^{9}.

La medida del marcador se puede llevar a cabo usando una barrita adecuada. Preferiblemente, la barrita es una barrita que comprende un anticuerpo para el marcador como agente de captura.

Preferiblemente, la medida de uPAR en la muestra de fluido biológico se lleva a cabo mediante análisis de FACS, transferencia Western o ELISA.

Preferiblemente, la medida de la degradación de los productos de uPAR/suPAR se lleva a cabo usando transferencia Western o TR-FIA (ensayos inmunofluorométricos resueltos en el tiempo).

La medida de uPAR se lleva a cabo en muestras de fluido biológico que contienen células que expresan uPAR, es decir, muestras de sangre.

El valor de medida del nivel de marcador obtenido en la etapa (a) se puede usar para evaluar el estado del sujeto comparando el valor de medida con el nivel del marcador en sujetos que no tienen una infección pulmonar bacteriana con Streptococcus pneumoniae o Mycobacterium tuberculosis.

Como se menciona anteriormente, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para evaluar la progresión del estado de un sujeto que sufre una infección por Streptococcus pneumoniae o Mycobacterium tuberculosis.

Los valores de medida del nivel de marcador obtenidos en la etapa (a) se pueden usar para evaluar la progresión del estado de un sujeto comparando los valores de medida con el nivel del marcador en sujetos no infectados con tuberculosis o Streptococcus pneumoniae, y/o comparando el transcurso temporal de los valores de medida con el de los sujetos no infectados con tuberculosis o Streptococcus pneumoniae.

La invención se refiere además al uso de un kit de ELISA para evaluar el estado físico de un sujeto que sufre una infección por tuberculosis, que comprende a) un agente de captura inmovilizado capaz de capturar uno o más marcadores en forma de (i) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR), (ii) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR), y/o (iii) uno o más productos de degradación de (i) o (ii), y b) una pareja de unión capaz de unirse al marcador, comprendiendo la pareja de unión c) un sistema marcador.

El agente de captura puede ser un anticuerpo para el marcador.

La pareja de unión puede ser un anticuerpo para el marcador.

Preferiblemente, el sistema marcador está conjugado con la pareja de unión. El sistema marcador puede ser cualquier sistema marcador usado convencionalmente, tal como un anticuerpo para el agente de unión conjugado con una enzima, por ejemplo un conjugado de inmunoglobulina con fosfatasa alcalina.

Además, la invención se refiere al uso de una barrita para evaluar el estado físico de un sujeto que sufre una infección por tuberculosis o Streptococcus pneumoniae, que comprende a) un agente de captura inmovilizado capaz de capturar uno o más marcadores en forma de (i) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR), (ii) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR), y/o (iii) uno o más productos de degradación de (i) o (ii), y b) una pareja de unión capaz de unirse al marcador, comprendiendo la pareja de unión c) un sistema marcador.

El agente de captura puede ser un anticuerpo para el marcador.

La pareja de unión puede ser un anticuerpo para el marcador.

Preferiblemente, el sistema marcador está conjugado con la pareja de unión. El sistema marcador puede ser cualquier sistema marcador usado convencionalmente, tal como un anticuerpo para el agente de unión conjugado con una enzima, por ejemplo un conjugado de inmunoglobulina con fosfatasa alcalina.

Definiciones

En relación con la presente invención, "uPAR" se define como cualquier forma de uPAR (igual que CD87) presente en la superficie de células que expresan uPAR en fluidos biológicos.

La expresión "células que expresan uPAR" se refiere a todas las células que expresan uPAR (CD87), tales como monocitos, leucocitos, macrófagos, y neutrófilos.

En relación con la presente invención, "suPAR" (uPAR soluble) se define como cualquier forma de uPAR (igual que CD87) presente en fluidos biológicos en una forma no unida a células.

"Fluidos biológicos" se definen como cualquier fluido que se puede obtener de seres humanos, es decir, esputo, fluido cístico, ascitis, sangre, suero, plasma, y orina.

La expresión "producto de degradación de suPAR o uPAR", como se usa aquí, significa todos los fragmentos de los mismos observados usando transferencia Western o anticuerpos frente a suPAR o uPAR. En particular, dicha expresión incluye los fragmentos D1, D2 y D3 de suPAR.

Ejemplos Ejemplo 1 Diagnóstico de TB activa mediante medida de suPAR en suero Objetivo

Determinar si pacientes sospechosos de tener TB activa tienen niveles elevados de suPAR en suero, es decir, si los niveles de suPAR se pueden usar para diagnosticar TB activa.

Descripción del experimento

Mycobacterium tuberculosis es un patógeno intracelular que reside predominantemente en macrófagos. El receptor del activador de plasminógeno tipo urocinasa (uPAR) está localizado principalmente en monocitos y macrófagos. uPAR es una proteína glucosilada de tres dominios (D1-D3) que se une a urocinasa con elevada afinidad a través de su dominio D1. El complejo uPAR/uPA está implicado en la activación del plasminógeno, la proteolisis pericelular y remodelación tisular, así como en la activación de integrina, adhesión y migración celulares. El uPAR se une a la superficie celular mediante un anclaje de GPI, que se puede escindir, dando como resultado una forma soluble del receptor (suPAR). Las formas solubles de uPAR (suPAR) incluyen el receptor de longitud completa (D1-D3) así como un fragmento D2D3 con propiedades quimiotácticas ^{10}, y un fragmento D1 con función desconocida. suPAR se ha identificado en sobrenadantes de cultivos celulares y en fluidos biológicos tales como fluido cístico, suero, plasma y orina^{11}. Debido a las dificultades de diagnosticar la infección por tuberculosis en países en desarrollo y la elevada mortalidad provocada por la infección, se han investigado los niveles de suPAR entre individuos que se sospecha que tienen tuberculosis activa en una cohorte en Guinea-Bissau. Se muestra aquí que suPAR posee información tanto de diagnóstico como de pronóstico en pacientes que sufren tuberculosis activa.

Población y vigilancia de la TB

Se siguieron cuatro áreas suburbanas en Bissau, la capital de Guinea-Bissau, con alrededor de 46.000 habitantes, a través de un sistema de vigilancia demográfica, desde 1978. En mayo de 1996, se implementó en el área un sistema de vigilancia de la TB, en cooperación con el hospital de TB nacional, Hospital Raoul Follereau (HRF). Todos los adultos que viven permanente o temporalmente en el área de estudio, que se presentan en cualquiera de los 2 centros de salud con síntomas o signos de tuberculosis activa, se enviaron al hospital para investigación posterior. Dos enfermeras realizaron visitas cada tercer mes en los domicilios en los que se habían encontrado casos de TB, examinando y entrevistando a los miembros del hogar a fin de encontrar casos secundarios. Los casos sospechosos se enviaron al hospital de TB para exámenes médicos adicionales. Los pacientes que viven en el área, pero que iniciaron el tratamiento contra TB en cualquier otra parte, también se enviaron para una investigación posterior y su inclusión si las enfermeras que distribuyen el medicamento en el programa nacional contra TB los identificaba.

Criterios de inclusión

Los criterios para la inclusión en el estudio fue uno o más de los siguientes síntomas y signos sin otra enfermedad explicativa: tos >1 mes sin mejora con antibióticos, fiebre constante o periódicamente durante más de 1 mes, pérdida de peso, disnea, hemoptisis, sudoraciones nocturnas o linfadenopatía. Las personas con edades <15 años y las mujeres embarazadas no se incluyeron. Los pacientes que aceptaron se investigaron clínicamente, se les entrevistó usando cuestionarios estandarizados referentes a antecedentes personales, factores de riesgo sociodemográfico y de comportamiento, se les investigó con radiografía de rayos X del tórax, microscopía directa del esputo matutino durante 3 días consecutivos, cultivo de esputo y prueba de Mantoux (usando Multiteste®, Bio-Merieux, Francia). Se extrajo sangre para ensayar infección por HIV, hematología y parámetros inmunológicos. En este estudio se incluyeron doscientos sesenta y dos pacientes sospechosos de estar infectados con TB. Los pacientes entraron en el estudio entre 1996 y 1998. 147 fueron hombres y 115 mujeres. La edad media fue 41,4 años (intervalo 15-80). Basándose en los exámenes, a los pacientes se les dividió en 4 grupos: 1) a los pacientes positivos por AFB en microscopía directa del esputo (bacilos ácido alcohol resistentes, AFB, en microscopía directa) se les denominó esputo positivo a TB. 2) A los pacientes negativos en microscopía pero positivos en cultivo se les denominó cultivo positivo a TB. 3) A los pacientes con signos clínicos, síntomas y cambios radiográficos compatibles con TB intratorácica activa, pero sin confirmación bacteriológica en microscopía directa del esputo o en cultivo, se les trató con antibióticos (cotrimoxazol o amoxicilina) y después se volvieron a evaluar clínicamente y radiográficamente. Si no había mejora y continuaba la sospecha, se supuso que el paciente tiene TB y se le denomina TB supuesta. 4) A los pacientes a los que no se les diagnostiva TB se trataron según diagnóstico (por ejemplo neumonía). A estos pacientes se les denominó negativos a TB.

Tratamiento de TB

A una fase intensiva de 4 meses de Tratamiento Observado Directamente (DOT) diario con dosis estándar de etambutol, isoniazida, rifampicina, y pirazinamida, le siguió una fase de continuación de 4 meses con etambutol e isoniazida recogidos por el paciente en el centro de salud dos veces al mes. Este régimen de tratamiento fue recomendado para individuos infectados por HIV por el programa nacional contra TB en Guinea-Bissau cuando el proyecto de investigación se inició en 1996; por razones de confidencialidad y comparabilidad, los individuos positivos a HIV y negativos a HIV recibieron el mismo tratamiento. Además, a todos los pacientes se les dio complejo de vitamina B y multivitaminas diariamente. A los pacientes que presentaron una enfermedad grave se les ofreció hospiralización si había camas disponibles. En la fase intensiva, a los pacientes que no se presentaron para el tratamiento se les visitó el mismo día por una enfermera y se les alentó a continuar el tratamiento. El cumplimiento del tratamiento se verificó mediante recuento de las pastillas y un ensayo de orina mediante INH a los 2, 5 y 8 meses de seguimiento; la información se anotó en tarjetas y formularios de tratamiento.

Métodos de laboratorio

En la inclusión, se recogieron muestras de esputo matutino durante tres días consecutivos mediante un auxiliar de campo, y se transportaron en un recipiente cerrado herméticamente a 4ºC el mismo día National Public Health Laboratory (LNSP) en Bissau para microscopía directa y cultivo. Antes del cultivo, las muestras se digirieron y se descontaminaron de microorganismos no micobacterianos con el método de sulfato de laurilo. Una alícuota de 0,5 ml del espécimen homogeneizado se inoculó en un tubo con medio de huevo de Löwenstein-Jensen (LJ) convencional y en uno que contiene LJ modificado con 0,6% de piruvato. Los tubos se inocularon a 37ºC y se examinaron semanalmente durante 7 semanas. El crecimiento de las micobacterias se confirmó mediante microscopía de bacilos ácido alcohol resistentes. Los aislados se transportaron congelados al Swedish Institute for Infectious Disease Control (SMI) en Estocolmo, para confirmación.

Ensayo del HIV

Los sueros se cribaron en busca de HIV en LNSP usando Capillus® HIV-1/HIV-2 (Cambridge Diagnostics, Galway, Irlanda) y Enzygnost® Anti-HIV 1+2 Plus (Behring Diagnostics Gmbh, Marburg, Alemania). Las muestras positivas se confirmaron entonces con Multispot® HIV-1/HIV-2 (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, Francia). Las muestras reactivas duales se enviaron congeladas al SMI en Estocolmo, y se confirmaron usando Immunocomb® II Hiv-1&2 Bispot (Orgenics, Yavne, Israel). Los recuentos de células CD4 y CD8 se midieron usando el método de inmuno-fosfatasa alcalina^{13}.

Medida de suPAR

Las medidas de suPAR se llevaron a cabo retrospectivamente sobre muestras de suero congeladas, usando un ELISA de sándwich. Se incubaron inmunoplacas (Maxisorb, Nunc, Dinamarca) toda la noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal murino frente a suPAR humano, R2 (2 \mug/ml), en tampón de revestimiento (15,1 mM de Na_{2}CO_{3}, 35,7 mM de NaHCO_{3}, pH 9,6). Tras incubar, los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS, 0,1% de Tween 20). La unión no específica se bloqueó con 2% de seroalbúmina bovina (BSA filtrada, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), durante 30 minutos a 37ºC (agitación). Después de lavar tres veces, las placas se incubaron con 10 ul de muestras de suero diluidas con 90 \mul de tampón, pH 7,4 (7,3 mM de KH_{2}PO_{4}, 50,7 mM de Na_{2}HPO_{4}, 0,1 M de NaCl, 0,5% de rojo fenol), durante una hora a temperatura ambiente. La capa detectora consistió en anticuerpo policlonal de conejo anti-suPAR humano (1 \mug/ml) en tampón de dilución. El anticuerpo secundario usado fue un anticuerpo anti-inmunoglobulina de conejo monoclonal, conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma), diluido 1:2000 en tampón de dilución. Treinta minutos después de añadir el sustrato (1 comprimido de fosfato de p-nitrofenilo, Sigma) en 12 ml de disolución de sustrato, pH 9,5 (0,1 M de base Tris, 0,1 M de NaCl, 5 mM de MgCl_{2}), las reacciones se detuvieron usando 50 \mul/pocillo de NaOH 1 M, y se midieron a 405 nm. En todas las placas se incluyeron tres patrones de laboratorio. Las variaciones entre ensayos e intraensayos fueron menores que 10%. El nivel de detección de suPAR fue 0,03 ng/ml.

Estadística

Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando el programa estadístico SSPS, Versión 10, o SAS. Para comparaciones entre grupos, se usó la prueba de la U de Mann-Whithey o la prueba de la t de Student. Se evaluó la probabilidad de que suPAR prediga TB activa usando un modelo de regresión logística. Todos los ensayos de probabilidad se llevaron a cabo como ensayos de relación de probabilidad. La diferencia entre las curvas de Kaplan-Meier se analizó mediante la prueba de rangos logarítmicos. La capacidad de suPAR sérico para predecir la mortalidad en el contexto de otros marcadores de pronóstico conocidos se evaluó formalmente usando el modelo de peligros proporcionales de Cox. Todos los ensayos se llevaron a cabo como ensayos de relación de probabilidad parcial. El modelo estadístico permitió la relación distinta de lineal de suPAR con la mortalidad. La relación lineal fue suficiente. Se usó un nivel de significancia de 5%. El análisis de regresión de Cox se llevó a cabo desde el tiempo de la inclusión hasta la terminación del tratamiento o la eliminación debido a muerte (N = 30), comenzando desde la guerra de Guinea Bissau (6 de junio de 1998) (N = 50), o pérdida de seguimiento debido a que el paciente se mudó nuevamente a las áreas rurales (N = 23). Los dieciséis pacientes que recibieron tratamiento contra TB en el momento del alistamiento no se incluyeron en el análisis de supervivencia, puesto que el tratamiento puede haber afectado a su nivel de suPAR. Independientemente del estado del HIV, los pacientes infectados de forma dual (positivos tanto a HIV-1 como a HIV-2) se incluyeron en los análisis como positivos a HIV-1, puesto que se ha encontrado que los individuos infectados en forma dual tienen el mismo riesgo y gravedad de infección a TB que los individuos infectados con HIV-1.

Ética

A todas las personas incluidas por los doctores a cargo del estudio se les ofreció asistencia psicológica previa y posterior para tanto el resultado de HIV como la enfermedad de TB. A los sujetos se les informó por escrito en portugués y verbalmente en su propia lengua antes de ser alistados en el estudio. Se obtuvo una autorización por escrito de todos los pacientes. El estudio fue aprobado por el Ministry of Public Health en Guinea-Bissau, y por el Central Ethical Committee de Dinamarca.

Resultados

Los 262 individuos tuvieron un suPAR medible, y el nivel de la mediana de suPAR fue 2,1 ng/ml (intervalo 0,66-18,7 ng/ml) en el alistamiento. No hubo ninguna correlación entre la edad y suPAR (p = 0,9), y ninguna diferencia en los niveles de suPAR entre hombres y mujeres (p = 0,87) (tabla 1). De los 262 individuos, ya se sabía que 16 tenían TB activa y estaban bajo tratamiento apropiado en el momento del alistamiento. De los 244 individuos restantes, la TB activa se diagnosticó en 182, que entraron consiguientemente en el régimen de tratamiento de 8 meses. Entre estos, se encontraron positivos a 84 mediante microscopía directa de esputo (esputo positivo a TB), y 35 casos fueron negativos en microscopía directa pero positivos en cultivo (cultivo positivo a TB), y 63 fueron diagnosticados en los terrenos clínico y radiológico (TB supuesta). A los 64 restantes se diagnosticó neumonía o bronquitis (negativo a TB).

suPAR es elevado en la infección por tuberculosis

Los niveles de suPAR fueron significativamente mayores entre los pacientes positivos a TB (esputo positivo a TB, cultivo positivo a TB, y TB supuesta, N = 182) en comparación con los pacientes negativos a TB (N = 64) (p < 0,001) (Figura 1). Los niveles de suPAR fueron elevados en los 84 esputos positivos a TB (p < 0,001), y en los 35 cultivos positivos a TB (p = 0,005), en comparación con los 64 negativos a TB. No hubo ninguna tendencia respecto a niveles de suPAR elevados en los 63 casos de TB supuesta diagnosticados, en comparación con los negativos a TB (p = 0,06). No se observó ninguna diferencia en los niveles de suPAR entre los 16 pacientes que recibieron tratamiento antes de la inclusión en el estudio y los negativos a TB (p = 0,72, prueba de la t). En la figura 1 se muestran los niveles de suPAR.

suPAR posee valor de diagnóstico para TB

Cuando se incluyen a todos los alistados en el estudio, hubo una probabilidad significativamente mayor de ser diagnosticado con TB al aumentar suPAR. Esto se muestra como una gráfica de probabilidad en la Figura 2a. Debido a las dificultades para diagnosticar los individuos con esputo negativo, el análisis más interesante fue si suPAR posee valor de diagnóstico en los 162 individuos con esputo negativo, es decir, cuando se excluyen los 84 esputos positivos a TB. Se encontró que hubo un mayor riesgo de ser diagnosticado como cultivo positivo a TB o TB supuesta al aumentar los niveles de suPAR (p = 0,001, Figura 2b). Debido a que la infección por HIV-1 afecta al nivel de suPAR, se realizó el mismo análisis para los 130 individuos negativos a HIV-1 (76 pacientes con cultivo positivo a TB o También supuesta negativos a HIV-1 y 54 pacientes negativos a TB negativos a HIV-1), y se encontró la misma asociación entre la proba-
bilidad creciente de ser diagnosticado como positivo a TB al aumentar los niveles de suPAR (p = 0,02, Figura 2c).

Mayor nivel de suPAR en la inclusión entre los pacientes bacteriológicos de TB que murieron durante el seguimiento

A los pacientes se les siguió desde el momento de la inclusión, y se trataron durante un período de 8 meses. Treinta murieron durante el seguimiento con un nivel de la mediana de suPAR en la inclusión de 3,26 (intervalo 1,04-18,70), que fue significativamente mayor que entre los 232 supervivientes (mediana de suPAR de 2,12, intervalo 0,66-16,22) (p = 0,02). Entre los 119 pacientes con TB bacteriológicamente confirmados (esputo positivo a TB y cultivo positivo a TB), diez murieron durante el seguimiento. Aquellos que murieron tuvieron niveles de suPAR significativamente mayores (mediana 5,98 ng/ml, intervalo 1,3-18,3) que los supervivientes (mediana 3,04 ng/ml (intervalo 0,9-14,7)) (Mann Whitney, p = 0,022). Entre los 63 pacientes con TB supuesta, 13 murieron durante el período de tratamiento. El nivel de suPAR en la inclusión de los 13 que murieron tuvo una mediana de 2,35 ng/ml (intervalo 1,0-6,6) frente a una mediana de 2,12 ng/ml (intervalo 0,7-6,6) entre los supervivientes (p = 0,45). Entre los 64 pacientes negativos a TB, 7 murieron durante el seguimiento, con una mediana de suPAR de 3,32 (intervalo 1,43-18,70), y 57 estaban vivos en el seguimiento, teniendo una mediana de suPAR de 1,17 ng/ml (intervalo 0,81-16,22) (p = 0,04). Cuando se dividen los pacientes en 4 grupos de igual tamaño basándose en el nivel de suPAR, hubo una tendencia hacia una mayor mortalidad entre pacientes en el cuartil de suPAR más elevado, en comparación con el cuartil de suPAR más bajo (5/65 frente a 13165, p = 0,07) (tabla 1).

Análisis de Kaplan Meier en pacientes con TB activa

No hubo ninguna diferencia en la supervivencia entre pacientes con TB activa (esputo con TB, cultivo con TB o TB supuesta, n = 182) cuando se divide a los pacientes por el valor de la mediana de suPAR (Figura 3A). Los pacientes con más de dos veces el valor de la mediana, es decir, pacientes que tienen un suero con una cantidad mayor de 4,2 ng de suPAR/ml (n = 38) tuvieron un mayor riesgo de morir durante el seguimiento, en comparación con los pacientes que tuvieron valores de suPAR por debajo de 4,2 ng/ml (N = 144) (MR = incremento de 3,05 por ng de suPAR, p = 0,007), Figura 3B.

Nivel de suPAR como predictor del resultado de infección por HIV-1

Se encontró que 47 estaban infectados por HIV-1 o estaban infectados de forma dual en el momento de la inclusión. Los infectados por HIV-1 tuvieron un nivel de mediana de suPAR de 2,34 ng/ml (intervalo 0,92-18,7). De los 47 pacientes, 13 murieron durante el seguimiento (suPAR de mediana 3,43, intervalo 1,15-18,70). Estos pacientes tuvieron un valor de suPAR significativamente mayor que los 34 pacientes vivos al abandonar el estudio (mediana de suPAR de 2,05, intervalo 0,92-6,88) (p = 0,015, Mann Whitney). El análisis de regresión de Cox en los infectados con HIV-1 mostró que suPAR estaba significativamente asociado con la supervivencia en este grupo (p < 0,001, MR = 1,53). Hubo una diferencia similar en los niveles de suPAR entre los 66 individuos infectados por HIV-2 (mediana de suPAR de 2,44, intervalo 0,91-18,30), de los cuales 7 murieron durante el seguimiento (mediana de suPAR de 3,32, intervalo 1,04-18,3), 59 sobrevivieron (mediana de suPAR de 2,44, intervalo 0,91-14,71), aunque la diferencia no fue significativa debido al número más pequeño de muertes (p = 0,64). No hubo ninguna diferencia significativa entre los niveles de suPAR en pacientes con TB con o sin infección por HIV, o entre el número de infectados por HIV-1 ó 2 entre los diferentes grupos de diagnóstico de TB (Tabla 2).

El nivel sérico de suPAR se correlaciona con la supervivencia en el análisis de regresión de Cox

Excluyendo los 16 pacientes que recibieron tratamiento en el alistamiento, se siguió a 182 pacientes diagnosticados con TB activa durante un período de 8 meses después del inicio del tratamiento, y 23 murieron. En los análisis de regresión de Cox univariados, los niveles de suPAR estaban significativamente asociados con la muerte durante el tratamiento (incremento en la relación de la tasa de mortalidad (MR) = 1,18 por incremento de ng de suPAR, p = 0,01), como lo estaba la infección por HIV-1 (MR = 2,66, p = 0,023) y el estado como positivo a TB basado en los campos clínico y radiológico (TB supuesta) (p = 0,03). Cuando se tratan a todos los pacientes positivos a TB de forma igual independientemente de su estado de HIV, no se encontró ningún efecto del método de diagnóstico en el tiempo hasta la muerte cuando se tiene en cuenta el nivel de suPAR (p = 0,43). No se encontró que ni la positividad a HIV-2 (p = 0,63), edad (p = 0,72), sexo (p = 0,19) o el logaritmo decimal de los recuentos de células T CD4 transformadas (p = 0,42) estaban significativamente asociados con la supervivencia durante el período de seguimiento.

En un análisis de Cox multivariado que incluye todos los factores significativos, todos permanecieron significativos siendo la MR 3,9 (p = 0,003) para TB negativa bacteriológica (TB supuesta) en comparación con los pacientes positivos bacteriológicos a TB, MR = 2,1 (p = 0,12) para la positividad a HIV-1 en comparación con pacientes con TB negativos a HIV-1, y 1,28 (p < 0,001) por incremento de ng de suPAR.

Cuando se excluyen los pacientes positivos a HIV-1, 14 murieron entre los 149 pacientes con TB restantes. Entre estos pacientes negativos a HIV-1 con TB activa, suPAR todavía retuvo su poder predictivo (RR = 1,14, p = 0,05). De este modo, se observó la misma relación de dosis/respuesta (suPAR/tiempo hasta la muerte) cuando se excluyen los pacientes positivos a HIV-1.

Discusión

Mycobacterium tuberculosis afecta las vidas de millones de personas en el mundo, y se estima que 3 millones mueren cada año por la enfermedad. En este ejemplo se encuentra, por primera vez, que la molécula de suPAR tiene un valor de diagnóstico y de pronóstico en la infección por TB.

En este ejemplo, 32 por ciento de los 262 individuos que se sospecha que son positivos a TB se encontraron positivos mediante microscopía directa. Estos esputos positivos a TB tuvieron niveles mayores que los diagnosticados por el cultivo (cultivo positivo a TB) o diagnosticados clínicamente (TB supuesta). Todos estos pacientes tuvieron niveles de suPAR mayores que los negativos a TB.

Debido a las dificultades par diagnosticar TB activa en pacientes negativos en microscopía, una cuestión importante en este estudio fue si suPAR puede tener valor de diagnóstico en individuos en los cuales se sospecha que sigue habiendo TB. Se encontró que hubo una probabilidad creciente de pacientes de ser diagnosticados con TB activa mediante cultivo (cultivo positivo) o mediante investigación clínica (TB supuesta) con un nivel creciente de suPAR. Los negativos a TB se incluyeron en el estudio en la sospecha de TB debido a síntomas relacionados, y se consideró que tenían neumonía tras los ensayos negativos en el examen del cultivo y clínico y se trataron con antibióticos después de la entrada. No se sabe si el nivel de suPAR puede ser mayor entre los negativos a TB, en comparación con un grupo de control de individuos sanos. Sin embargo, hubo una notable diferencia entre los negativos a TB y los grupos diagnosticados como TB activos, indicando que la neumonía no provocaría un incrmento importante en suPAR.

Dieciséis pacientes recibieron tratamiento apropiado contra TB en el momento de la inclusión. El nivel sérico de suPAR en estos pacientes fue significativamente menor que en los pacientes diagnosticados con TB tras la inclusión, y comparable a los negativos a TB. Esto indica que el nivel de suPAR puede caer tras el tratamiento, y que suPAR se puede usar para monitorizar el efecto del tratamiento.

suPAR sirvió de pronóstico para la supervivencia en esta cohorte. Entre los esputos positivos a TB y cultivos positivos a TB, 10 murieron durante el seguimiento, y estos individuos tuvieron valores de suPAR significativamente mayores en la inclusión. Usando el análisis de regresión de Cox, suPAR estaba significativamente asociado con la supervivencia entre los 182 pacientes a los que se les diagnosticó TB. Se ha demostrado previamente que suPAR sirve de pronóstico para la progresión de la enfermedad por HIV-1, y esta observación se confirmó en este estudio. Cuando se excluyen los positivos a HIV-1 y los positivos de forma dual, suPAR todavía siguió asociado significativamente con la supervivencia entre los pacientes con TB activa. Otro factor significativamente asociado con la supervivencia en el análisis de regresión de Cox es el tipo de diagnóstico de TB. Los pacientes diagnosticados con TB activa mediante examen clínico solamente (TB supuesta) tuvieron un mayor riesgo de morir durante el seguimiento, lo que probablemente es debido al tratamiento retrasado. La observación del nivel más elevado de suPAR en los esputos positivos a TB seguidos de los cultivos positivos a TB y los individuos negativos a TB en los ensayos bacteriológicos (TB supuesta) indicó que suPAR puede correlacionarse con la carga bacteriana de la tuberculosis. Puesto que es probable que niveles incrementados de suPAR reflejen un incremento de la expresión de uPAR sobre la superficie celular, los hallazgos sugieren que suPAR y/o uPAR pueden estar implicados en la patogénesis de la infección por tuberculosis. La interacción inicial entre M. tuberculosis y macrófagos hospedantes es una primera etapa importante en la patogénesis de la tuberculosis. Esta etapa está mediada por receptores de monocitos/macrófagos específicos y ligandos presentes en la superficie de TB. Se ha dado a conocer que varios receptores de macrófagos median la unión a M. tuberculosis, incluyendo los receptores del complemento CR1, CR3 y CR4, el receptor de glucano, el receptor de manosa, el receptor de lipopolisacáridos, y los receptores de tipo toll. Sin embargo, no se ha demostrado que ninguno de estos receptores sea esencial para la interacción macrófago/M. tuberculosis. La implicación de CR3 en la entrada de la tuberculosis se ha aclarado además por el uso de modelos de ratones carentes de CD11b, que muestran una reducción de 60% en la infecciosidad de la tuberculosis pero ningún efecto sobre la replicación intracelular. Se ha demostrado que uPAR se compleja con CR3 (mac-1, CD11b/CD18). uPAR se une a CR3 a través de CD11b (revisado en ^{14}), dando como resultado la activación del complejo. De este modo, una posible razón para el papel de diagnóstico y de pronóstico de suPAR en TB podría ser debida a la implicación y potenciación de la entrada de la tuberculosis en la célula uPAR/CD11b. Otra posibilidad es que uPAR aumente por la replicación intracelular de TB y refleje de ese modo el número de células infectadas. Aparte de la infección por HIV y ahora por la tuberculosis, el nivel sérico de suPAR es también un marcador de pronóstico para la supervivencia global en pacientes que sufren cáncer ovárico y colorrectal, y para la respuesta a terapia en leucemia^{15, 11}. Otro posible elevador de suPAR es Borrelia burgdorferi, puesto que un reciente estudio in vitro mostró niveles incrementados de uPAR en células monocíticas tras la infección. Para ser capaces de comparar datos entre estudios individuales en cáncer, infección por TB y por HIV, es necesario desarrollar un ensayo de suPAR reproducible y comercialmente disponible. El ensayo usado en este estudio es comparable al ensayo usado en un estudio previo de suPAR como factor de pronóstico en la progresión de HIV^{7} y descrito en el estudio de Stephens et al.^{16}.

En conclusión, se encuentra que suPAR es elevado en pacientes con TB activa, y que los pacientes con un nivel elevado de suPAR tienen un mayor riesgo de morir durante el período de tratamiento.

TABLA 1 Pacientes divididos en cuatro grupos de igual tamaño según su nivel de suPAR. Los paréntesis muestran el número de pacientes que murieron durante el seguimiento

1

TABLA 2 La tabla ilustra el número (y porcentaje de grupo de diagnóstico de TB) y suPAR (mediana, intervalo) de infectados por HIV entre pacientes agrupados según el diagnóstico de TB

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Ejemplo 2

El nivel sérico de receptor de urocinasa soluble es elevado en pacientes con tuberculosis, predice la mortalidad durante el tratamiento y se puede usar para monitorizar la eficacia del tratamiento contra TB.

Objetivo

Investigar si el nivel sérico del receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR) posee información de pronóstico en individuos infectados con Mycobacterium tuberculosis durante el período de tratamiento, y si se puede usar para monitorizar la eficacia del tratamiento contra TB.

Diseño

suPAR se midió mediante ELISA en 262 individuos en el momento del alistamiento en una cohorte basada en la sospecha de tuberculosis activa, y en 101 individuos tras 8 meses de seguimiento. Los 262 individuos son los mismos que los investigados en el Ejemplo 1.

Resultados

Los niveles de suPAR fueron elevados en pacientes con TB activa en comparación con individuos negativos a TB (p < 0,001). Los niveles de suPAR fueron los más elevados en pacientes positivos para TB en microscopía directa (N = 84, mediana de suPAR de 3,17 ng/ml, p > 0,001), seguido de los pacientes negativos en microscopía directa pero positivos en cultivo (N = 35, mediana de suPAR de 2,41 ng/ml, p = 0,005) y por pacientes diagnosticados en terrenos clínicos (N = 63, mediana de suPAR de 2,13, p = 0,06), en comparación con 64 individuos negativos a TB (mediana de suPAR de 1,73 ng/ml). Durante el período de tratamiento de 8 meses, 23 casos de TB murieron. En un modelo de Cox multivariado que controla el estado de HIV, edad, sexo, recuento de CD4 y tipo de diagnóstico de TB, el incremento de mortalidad por ng de suPAR fue 1,25 (95% Cl, 1,12-1,40). Después del tratamiento, los niveles de suPAR habían disminuido hasta los niveles de individuos negativos a TB.

Conclusiones: los niveles de suPAR son elevados en pacientes con TB y están asociados con la mortalidad. Además, suPAR es un marcador de la eficacia del tratamiento.

Población de estudio y métodos Criterios de inclusión y métodos de laboratorio

Los sujetos incluidos en este estudio son los mismos que en el ejemplo 1. La diferencia entre el estudio descrito aquí y el del ejemplo 1 es que este estudio investiga el papel de suPAR como marcador durante los 8 meses de terapia.

Además, durante el período de tratamiento, 30 pacientes murieron. Después de 8 meses de seguimiento, se extrajo una segunda muestra de sangre. De los 262 individuos incluidos en este estudio, 101 individuos estaban disponibles para una segunda toma de muestra.

Estadística

Para comparaciones entre grupos, se usó la prueba de la U de Mann-Whithey, excepto para comparaciones entre niveles de suPAR pre- y post-tratamiento frente a TB, en cuyos casos se usaron las pruebas de la t de muestras pareadas. La diferencia entre las curvas de Kaplan-Meier se analizó mediante la prueba de rangos logarítmicos. La capacidad de suPAR sérico para predecir la mortalidad, dando cuenta de otros marcadores de pronóstico conocidos, se evaluó formalmente usando un modelo de peligros proporcionales de Cox, que permite relaciones no lineales entre suPAR y la mortalidad. Todos los ensayos se realizaron como ensayos de relación de probabilidad parcial. El análisis de tiempo hasta la muerte se llevó a cabo desde el momento de la inclusión hasta el primero de los sucesos: terminación del tratamiento, 8 meses de seguimiento, muerte (N = 30), comenzando desde la guerra en Guinea Bissau que influyó en el tratamiento (N = 50), o pérdida de seguimiento debido a que el paciente se mudó nuevamente a las áreas rurales (N = 23). Los dieciséis pacientes que recibieron tratamiento contra TB en la inclusión no se incluyeron en el análisis de supervivencia puesto que el tratamiento puede haber afectado a su nivel de suPAR. En cuanto al estado del HIV, los pacientes infectados dualmente (tanto positivos a HIV-1 como a HIV-2, N = 19) se incluyeron en los análisis como positivos a HIV-1, puesto que se ha encontrado que los individuos infectados en forma dual tienen el mismo riesgo y gravedad de infección por TB que los individuos infectados con HIV-1. Se llevaron a cabo análisis estadísticos usando el programa SSPS, Versión 10, o SAS versión 8.1. Para la significancia, se usó un nivel de 5%.

Ética

Todos los sujetos recibieron información escrita en portugués e información verbal dada en su lengua étnica local, antes del alistamiento. Se obtuvo una autorización por escrito de todos los pacientes. El estudio fue aprobado por el Ministry of Public Health en Guinea-Bissau, y por el Central Ethical Committee de Dinamarca.

Resultados

Los 262 individuos tuvieron suPAR medible, y el nivel de la mediana de suPAR fue 2,1 ng/ml (intervalo 0,66-18,7 ng/ml) en el alistamiento. No hubo ninguna correlación entre la edad y suPAR (p = 0,9), o en los niveles de suPAR entre hombres y mujeres (p = 0,87) (tabla 1). De los 262 individuos, ya se sabía que 16 tenían TB activa y estaban bajo tratamiento apropiado en el momento del alistamiento. De los 246 individuos restantes, se diagnosticó TB activa en 182, los cuales entraron consiguientemente en el régimen de tratamiento de 8 meses. Entre estos, 84 fueron esputos positivos a TB, 35 casos fueron cultivos positivos a TB, y 63 fueron diagnosticados TB supuesta. A los 64 restantes se les diagnosticó como negativos a TB. Durante el período de tratamiento, 30 casos murieron, y de estos 7 fueron negativos a TB (Tabla 1).

suPAR está elevado en la infección por tuberculosis

Los niveles de suPAR fueron significativamente mayores entre los pacientes positivos a TB (esputo positivo a TB, cultivo positivo a TB y TB supuesta, N = 182) en comparación con los pacientes negativos a TB (N = 64, p < 0,001). Parece que el nivel de suPAR se correlaciona con el número de micobacterias en el esputo, puesto que se encontraron los niveles más elevados de suPAR entre los 84 pacientes con esputo positivo a TB (p < 0,001), seguido de los pacientes con cultivo positivo a TB (p < 0,001), y los pacientes con TB supuesta (p = 0,06), cuando se compara con los niveles de suPAR encontrados en los 64 negativos a TB como se muestra en la figura 1. No se observó ninguna diferencia en los niveles de suPAR entre los 16 pacientes que recibieron tratamiento contra TB en el momento del alistamiento y los negativos a TB (p = 0,72). En la tabla 1 se muestra el agrupamiento de pacientes en cuartiles según el nivel de suPAR.

Análisis de Kaplan Meier en pacientes con TB activa

No hubo ninguna diferencia significativa en la tasa de supervivencia entre pacientes con TB activa (esputo de TB, cultivo de TB, o TB supuesta, n = 182) cuando se divide a los pacientes por el valor de la mediana de suPAR (Figura 3A). Los pacientes con suPAR elevado (más de dos veces el valor de la mediana, es decir, los pacientes que tienen más de 4,2 ng de suPAR/ml de suero (n = 38)) murieron de forma significativamente más rápida tras el alistamiento, en comparación con los pacientes por debajo de 4,2 ng/ml (N = 144, p = 0,007), Figura 3B.

El nivel sérico de suPAR se correlaciona con la supervivencia en el análisis de regresión de Cox

Excluyendo los 16 pacientes que ya habían comenzado el tratamiento en el momento del alistamiento, se siguió a 182 pacientes diagnosticados con TB activa durante un período de hasta 8 meses después del inicio de tratamiento; 23 de estos murieron. En los análisis de regresión de Cox univariados, los niveles de suPAR estaban significativamente asociados con la muerte durante el tratamiento, siendo el incremento en la relación de la tasa de mortalidad (MR) 1,18 por incremento de ng de suPAR (95% Cl: 1,06-1,30), como lo estaba la infección por HIV-1 (MR = 2,71, 95% Cl 1,16-6,29) y el estado como positivo a TB diagnosticado en los campos clínico y radiológico (TB supuesta) (MR = 2,48, 95% Cl: 1,09-5,66). Cuando se trató a todos los pacientes positivos a TB por igual independientemente de su estado del HIV, y ajustando el nivel de suPAR, no se encontró ningún efecto del método diagnóstico sobre la mortalidad (p = 0,43). No se encontró que ninguno de la positividad a HIV-2 (p = 0,63), edad (p = 0,72), sexo (p = 0,19) o el logaritmo decimal de los recuentos de células CD4 transformadas (p = 0,42) estaban significativamente asociados con la supervivencia.

Todos los factores que se encontró que eran significativos en los análisis univariados siguieron siendo significativos en el análisis de Cox multivariado. Controlando para el diagnóstico de TB (TB supuesta en comparación con los casos de TB positivos en microscopía directa o en cultivo, MR = 3,5 (95% Cl: 1,39-8,67)), y el estado de HIV (positivo a HIV-1 en comparación con pacientes con TB negativos a HIV-1, MR = 2,5 (95% Cl: 1,07-5,99)), el incremento en la mortalidad por ng de suPAR fue MR = 1,25 (95% Cl: 1,12-1,40).

Cuando se excluye a los individuos positivos a HIV-1, 14 murieron entre los 149 paciente con TB que quedan durante el seguimiento. Entre estos 149 pacientes con TB, suPAR siguió reteniendo poder predictivo (MR = 1,14, 95% Cl: 1,00-1,31). De este modo, la asociación positiva entre suPAR y la muerte fue similar en sujetos positivos a HIV-1 y negativos a HIV-1.

Nivel de suPAR como predictor para el resultado entre los individuos infectados por HIV-1 o -2

Se ha demostrado previamente que suPAR es un factor de pronóstico potente para la progresión del HIV-1. En el presente estudio, se encontró que 47 de los 262 individuos sospechosos de tener TB eran HIV-1 positivos en el momento de la inclusión, y 13 murieron. El análisis de regresión de Cox univariado en los infectados por HIV-1 mostró que suPAR estaba asociado de forma significativamente negativa con la supervivencia (n = 47, MR = 1,53 por ng de incremento de suPAR, 95% Cl: 1,22-1,92). Ningún otro parámetro (edad, sexo, diagnóstico de TB o recuento de CD4) estaba significativamente asociado con la supervivencia en este subgrupo. Sesenta y seis de los 262 individuos fueron positivos a HIV-2 en la inclusión (sin incluir los infectados de forma dual), de los cuales siete murieron durante el seguimiento. Hubo un efecto similar de suPAR sobre la supervivencia (n = 66, MR = 1,13, 95% Cl: 0,97-1,32), aunque la diferencia no fue significativa debido al número más pequeño de muertes. Ni la edad, sexo, diagnóstico de TB o recuentos de CD4 estaban significativamente asociados con la supervivencia en el grupo de HIV-2. No hubo diferencias significativas en los niveles de suPAR en pacientes con TB con o sin infección por HIV, o entre individuos infectados por HIV-1 y -2 en los diferentes grupos de diagnóstico de TB.

El tratamiento estaba asociado con una disminución en los niveles de suPAR

De los 262 individuos incluidos en este estudio, estuvieron disponibles muestras de suero procedentes de 101 pacientes después de 8 meses de tratamiento. En la inclusión, a 45 se les diagnosticó como esputo positivo a TB, 15 como cultivo positivo a TB, 22 como TB supuesta, 6 recibieron tratamiento en el alistamiento, y 13 como negativos a TB. En la figura 3 se muestran los niveles de suPAR previos a y posteriores al tratamiento para estos individuos. El tratamiento estaba asociado con una disminución significativa en suPAR entre los 45 esputo positivo a TB (95% Cl: -2,07 - -0,56 ng/ml) y una disminución no significativa para los 15 cultivo positivo a TB (95% Cl: -2,12 - 0,24 ng/ml). No se observó ninguna diferencia en los valores de suPAR previos a y posteriores al tratamiento para TB supuesta (95% Cl: -0,81 - 0,84) o para pacientes que recibieron tratamiento en el alistamiento (95% Cl: -3,3 - 3,1). Se observó un incremento en suPAR tras el tratamiento entre los 13 negativos a TB (3 positivos a HIV-2 y 10 negativos a HIV (p = 0,041, 95% Cl: 3,31-1,33 ng/ml). El incremento fue más prominente entre los tres positivos a HIV-2. Los niveles de suPAR posteriores al tratamiento no difirieron entre los diferentes grupos de diagnóstico (figura 3).

Discusión

Mycobacterium tuberculosis afecta a las vidas de millones de personas en el mundo, y se estima que 2 millones mueren por la enfermedad cada día. En el presente ejemplo, se encontró que los niveles de suPAR eran elevados en pacientes con TB, se correlacionan con el tipo de diagnóstico de TB, y posee un valor de pronóstico. Además, el tratamiento estaba asociado con niveles reducidos de suPAR en suero.

Se encontró que suPAR era significativamente mayor entre los casos de TB en comparación con los casos que no eran de TB. Además, los niveles más elevados de suPAR se encontraron en los casos de TB positivos en microscopía directa, seguido de los casos negativos en microscopía directa pero positivos en cultivo, y después los casos de TB negativos tanto en microscopía directa como en cultivo. Dado que el cultivo es un método más sensible que la microscopía directa diagnosticando la presencia de AFB en esputo, estos resultados pueden indicar que el nivel de suPAR en sangre se correlaciona con el número de bacterias en esputo y consiguientemente la carga bacteriana en los bronquios. Los niveles aumentados de suPAR pueden ser un resultado de la movilización de macrófagos en los bronquios. La adherencia y migración de monocitos implica una interacción funcional entre uPAR e integrinas, como también es apoyado por estudios en ratones carentes de uPAR {May, Kanse, et al. 1998 mayo 1998/id} La interacción uPAR/integrina mejor descrita es aquella entre uPAR y CD11b/CD18 (receptor 3 de complemento o MAC-1) {Simon, Rao, et al. 1996 14/id}. Después de que se presentó esta patente, Juffermans y colaboradores mostraron el aumento concurrente de uPAR y CD11b durante endotoxemia experimental usando LAM, un componente de la pared celular de M. tuberculosis^{17}. De forma interesante, también se ha mostrado que CD11b/CD18 media la adhesión de M. tuberculosis a macrófagos^{18}, sugiriendo que TB puede explotar este aumento para adherirse e infectar a macrófagos reclutados. De este modo, se propone que esto puede ser una nueva diana para la interacción con M. tuberculosis.

Usando el análisis de regresión de Cox, se encontró que suPAR está significativamente asociado con la supervivencia entre los 182 pacientes diagnosticados con TB. En Guinea-Bissau, la prevalencia del HIV es mayor entre los casos de TB en comparación con controles sanos. Se ha mostrado previamente que suPAR es un potente marcador de pronóstico para la progresión de la enfermedad por HIV-1^{11}, y esta observación se confirmó en le presente estudio. Sin embargo, incluso cuando se excluyen los infectados por HIV-1, suPAR todavía siguió estando significativamente asociado con la supervivencia entre los pacientes con TB activa.

Ocho meses de tratamiento condujeron a una disminución significativa de los niveles de suPAR, dando como resultado resultados similares entre aquellos diagnosticados con o sin TB en la inclusión. También, dieciséis pacientes ya estaban recibiendo tratamiento apropiado contra TB en el momento de la inclusión. Los niveles séricos de suPAR en estos pacientes fueron significativamente menores que en los pacientes diagnosticados con TB tras la inclusión, y comparables con los negativos a TB. Estas observaciones muestran que la medida de suPAR puede ser una herramienta útil para monitorizar la respuesta al tratamiento en pacientes con TB.

suPAR es elevado y de valor de pronóstico para el resultado en la infección por HIV-1. Este estudio ha mostrado que el nivel sérico de suPAR es elevado en pacientes con TB, y que el nivel previo al tratamiento está positivamente asociado con la mortalidad en pacientes que reciben tratamiento para TB.

Conclusiones

El nivel sérico de receptor de urocinasa soluble (suPAR) es elevado en pacientes con tuberculosis activa y el más alto en pacientes que tienen esputo positivo en análisis microscópico. Se encontró que el suPAR estaba positivamente asociado con la mortalidad en pacientes con TB durante el tratamiento, incluso cuando se excluyen los coinfectados por HIV-1, para los cuales se sabe que suPAR es un marcador de pronóstico muy potente. Tras el tratamiento, los pacientes con esputo positivo tuvieron niveles de suPAR significativamente menores, sugiriendo que suPAR se podría usar para monitorizar la eficacia del tratamiento contra TB.

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Ejemplo 3

El nivel plasmático del receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble es elevado en pacientes con bacteriemia por Streptococcus pneumoniae, y posee un potente valor de pronóstico.

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) es el agente principal de la neumonía adquirida en comunidad, y en alto grado está asociado con bacteriemia. La incidencia anual de neumonía se estima que es de 1 a 12 por 1000 en la población de países desarrollados. La bacteriemia neumocócica oscila de 9 a 18 por 100.000 por año. La mortalidad de la bacteriemia neumocócica oscila desde 17% hasta 36%, con la mayor mortalidad en los ancianos.

El receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR/CD87) es expresado en diferentes tipos celulares, incluyendo neutrófilos, linfocitos, macrófagos, células endoteliales y células malignas.

Es bien conocido que uPAR está implicado en numerosas funciones biológicas. uPAR y su ligando el activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPA) están implicados en la conversión de plasminógeno en plasmina. Además, uPAR se une a \beta-integrinas, así como señala el reclutamiento de células inflamatorias^{10}. En la patogénesis del cáncer, uPA y uPAR juegan un papel clave en la invasión tisular por la degradación de la matriz extracelular. uPAR se puede escindir de la superficie celular mediante un número de proteasas, tales como quimiotripsina, fosfolipasa C y uPA^{19}. La escisión proteolítica de uPAR a partir de la superficie celular libera una forma activa quimiotáctica de suPAR. Como alternativa, uPAR es liberado/segregado desde la superficie celular sin proteolisis.

Recientemente, se ha dado a conocer una fuerte correlación entre el estado mórbido progresivo de la infección por HIV-1 y suPAR elevado, sugiriendo el uso de suPAR como un marcador de pronóstico. Finalmente, como se muestra en esta solicitud de patente, los pacientes con tuberculosis pulmonar tienen niveles séricos incrementados de suPAR.

El posible papel de suPAR y uPA en las respuestas inmunitarias frente a otras enfermedades infecciosas sigue siendo incierto. Los ratones carentes de genes que carecen de uPAR han mostrado un reclutamiento reducido de neutrófilos pulmonares y una mortalidad incrementada frente a la infección con S. pneumoniae, en comparación con ratones de tipo salvaje^{20}. El ácido lipotecoico de Streptococcus pyogenes facilita el aumento de uPAR monocítico in vitro. También se ha dado a conocer el aumento de uPAR por monocitos inducidos por proteínas de la superficie de Borrelia burgdorferi^{21}.

El nivel sérico de la prt YKL-40 se ha descrito como elevado durante la neumonía, y como un factor de pronóstico independiente en pacientes bacteriémicos neumocócicos. Aquí se investiga si la bacteriemia por S. pneumoniae afecta al nivel plasmático de suPAR. Por primera vez, se da a conocer que suPAR es elevado y posee un valor de pronóstico en pacientes con bacteriemia por S. pneumoniae.

Sujetos y Métodos

Pacientes. Entre octubre de 1999 y junio de 2001, se incluyeron adultos (18 años o mayores) con bacteriemia por S. pneumoniae admitidos en uno de cinco hospitales universitarios Aalborg, Aarhus, Odense, Hvidovre o Rigshospitalet) en Dinamarca. En la inclusión (admisión hospitalaria) se extrajeron muestras de sangre, y se recogieron de forma prospectiva datos clínicos durante el tiempo de admisión, como se describe (G. Kronborg, N. Weis, H. O. Madsen, S. S. Pedersen, C. Wejse, H. Nielsen, P. Skinhøj, P. Garred, presentado para publicación). Se extrajo sangre de un grupo de 30 individuos sanos (trabajadores del laboratorio) para comparación (grupo de control).

Se incluyó un total de 141 pacientes, 77 mujeres y 64 varones. La edad media de los pacientes fue 64 años, con un intervalo de 20-99 años. Sesenta y seis por ciento de los pacientes tuvieron una enfermedad subyacente, y la neumonía fue el foco más habitual de infección (n = 116). Veinticuatro pacientes murieron en el hospital (tasa de mortalidad de casos = 17%). En la Tabla 3 se dan las características de referencia de los pacientes. Todos los pacientes recibieron un tratamiento antibiótico apropiado desde su admisión o cuando el cultivo de sangre se hizo positivo. El estudio fue aprobado por los comités éticos locales.

ELISA. Placas Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se revistieron e incubaron toda la noche a 4ºC con 100 \mul de anticuerpo monoclonal murino anti-suPAR 2 \mug/ml frente a suPAR humano, diluido en tampón de revestimiento (15,1 mM de Na_{2}CO_{3}, 35,7 mM de NaHCO_{3}, pH 9,6). Las placas se lavaron con tampón (PBS, Tween 20 al 0,1%) y se bloquearon usando SuperBlock (Pierce Chemicals) diluido 1:1 en PBS. Se añadieron muestras de plasma diluidas en tampón de dilución (7,3 mM de KH_{2}PO_{4}, 50,7 mM de Na_{2}HPO_{4}, 0,1 M de NaCl, 0,5% de rojo fenol, pH 7,4), y las placas se incubaron toda la noche a 4ºC. El suPAR unido se detectó usando 100 \mul de anticuerpo policlonal de conejo anti-suPAR humano 1,0 \mug/ml (un regalo generoso de la doctora Gunilla Hoyer-Hansen) y anticuerpo policlonal anti-conejo de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, MO, USA), diluido 1:2000. Cada etapa estuvo precedida por un lavado de 6 veces con tampón de lavado, los anticuerpos se diluyeron en tampón de dilución y las placas se incubaron 1 h a 37ºC. El sustrato (1 comprimido de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma, St. Louis, MO, USA), en 12 ml de 0,1 M de base Tris, 0,1 M de NaCl, 5 mM de MgCl_{2}, pH 9,5) se añadió a los pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Las reacciones se detuvieron añadiendo 50 \mul de NaOH 1 M por pocillo, y la absorbancia se leyó a 405 nm. Todas las medidas de ELISA se llevaron a cabo por duplicado. YKL-40 se midió mediante ELISA.

Estadística. Las comparaciones entre grupos se realizaron con la prueba de la U de Mann Whitney. suPAR como marcador de pronóstico se analizó usando análisis de regresión logística. Un valor de p por debajo de 0,05 se consideró como significativo. Todos los análisis se llevaron a cabo usando el software SPSS (SPSS, Chicago, II, USA).

Resultados

suPAR es elevado en pacientes bacteriémicos neumocócicos. El nivel plasmático de suPAR fue medible en las 141 muestras, con un valor de la mediana de 5,5 ng/ml (intervalo 2,4-21,0 ng/ml). El nivel de la mediana de suPAR en el grupo de control fue 2,6 ng/ml (intervalo 1,5-4,0 ng/ml). Los niveles de suPAR en los pacientes baceriémicos neumocócicos fue significativamente mayor que en los controles sanos (Fig. 5A, p = 0,001).

suPAR predice el resultado de la infección. La división de los pacientes en un grupo que sobrevive a la infección (n = 117) y un grupo de pacientes en los que la infección terminó con muerte (n = 24) mostró niveles de suPAR significativamente mayores en el último grupo (Fig. 5B; p = 0,0001). De los pacientes muertos, el 79% (n = 19) tuvo niveles de suPAR por encima de la mediana de 5,5 ng/ml.

Los parámetros clínicos de importancia de pronóstico en términos de muerte debido a la infección fueron, como se describe (G. Kronborg et al., presentado para publicación): síntomas cerebrales (confusión, inconsciencia) en el momento de la admisión (p = 0,03), hipotensión (p = 0,047) e insuficiencia renal (p = 0,002); véase la Tabla 1. El nivel de suPAR fue significativamente elevado en pacientes con hipotensión (p = 0,0001) e insuficiencia renal (p = 0,0001). suPAR también fue elevado en el grupo de alcohólicos crónicos (p = 0,0001). Las enfermedades subyacentes no estuvieron significativamente asociadas con un resultado mortal de bacteriemia neumocócica, excepto por el alcoholismo (p = 0,04).

suPAR está correlacionado con YKL-40, pero no con CRP. YKL-40 es una lectina segregada desde neutrófilos y macrófagos (25). Cuando se comparan los niveles de suPAR con los niveles de YKL-40 (n = 89), se encuentra una fuerte correlación entre suPAR e YKL-40 (coeficiente de correlación de rangos de Spearman: 0,70, p=0,0001).

La mayoría de los pacientes midieron su nivel de CRP. No hubo ninguna correlación entre los niveles de suPAR y los niveles de CRP (n = 131). Los niveles elevados de CRP no fueron un pronóstico de muerte.

suPAR es un marcador de pronóstico independiente. En un análisis multivariado de regresión logística (Tabla 3) que incluye todos los parámetros que se encuentra que son significativos en el análisis univariado (síntomas cerebrales, ventilación mecánica, tratamiento de hipotensión, insuficiencia renal, abuso de alcohol e YKL-40), sólo suPAR siguió estando significativamente asociado con la muerte. Los pacientes con suPAR plasmático por encima de 10 ng/ml tuvieron una tasa de mortalidad (MR) de 13 (p = 0,04) y un incremento de 1,31 por ng de suPAR (95% CI: 1,10-1,57), oscilando suPAR desde 2,4 hasta 21 ng/ml.

Discusión

En este estudio, se demuestra por primera vez que los niveles de suPAR son muy elevados en pacientes con bacteriemia neumocócica. Niveles elevados de suPAR se han detectado previamente en pacientes con diversas formas de enfermedades neoplásicas, así como en infección por HIV-1 y en enfermedades pulmonares relacionadas, por ejemplo pacientes con tuberculosis activa no tratada.

suPAR plasmático es un fuerte predictor de muerte, con una tasa de mortalidad de incremento de 1,31 por ng de suPAR (suPAR varió entre 2,4 y 21,0 ng/ml) en bacteriemia neumocócica. A partir de este estudio sólo se pueden sacar conclusiones sobre el valor de pronóstico de suPAR para pacientes con bacteriemia neumocócica. La hipotensión, insuficiencia renal, síntomas cerebrales, abuso crónico de alcohol e YKL-40 plasmática elevada fueron todos de valor pronóstico, pero sólo los niveles elevados de suPAR fueron un predictor independiente de muerte en el análisis de regresión logística multivariado. Se sugiere que suPAR plasmático es un nuevo marcador de pronóstico para pacientes con infecciones neumocócicas.

Es difícil de comparar los valores de suPAR de los diferentes estudios debido a variaciones entre ensayos así como también a diferencias en las condiciones clínicas de los pacientes incluidos. Sin embargo, parece que suPAR es muy elevado en pacientes con bacteriemia neumocócica, en comparación con controles sanos. En un estudio de Riisbro et al., 53 pacientes con cáncer ovárico tuvieron un nivel de mediana de suPAR de 1,3 ng/ml, y los sujetos sanos tuvieron un nivel de mediana de 0,9 ng/ml, dando una elevación de 44% en pacientes con cáncer. Los pacientes neumocócicos tuvieron un incremento notablemente mayor en la mediana de suPAR de 112% en comparación con controles sanos.

Se encuentra una estrecha correlación entre suPAR e YKL-40. En el análisis multivariado, YKL-40 por encima de 500 ng/ml, los síntomas cerebrales y la hemodiálisis estuvieron asociados con MR elevada, pero no tuvieron significancia.

Se ha dado a conocer un suPAR plasmático elevado a partir de un grupo (n = 13) de pacientes con septicemia en la UCI^{22}, conduciendo a especulaciones de que la secreción de suPAR incrementa durante la inflamación aguda. Se compararon los niveles de suPAR frente a CRP, y no se encontró ninguna relación. Este hallazgo está apoyado por Slot et al.^{6}, quienes no encontraron ninguna relación entre suPAR y CRP en pacientes con enfermedades reumáticas. De este modo, este estudio encuentra una prueba sustancial para descartar la posibilidad de que suPAR sea un agente reaccionante de fase aguda.

La prueba del origen de suPAR plasmático sigue siendo escasa. Sin embargo, se sabe que uPAR consiste en tres dominios y que la escisión proteolítica entre el dominio 1 (D1) y 2 + 3 (D2D3) crea el dominio activo quimiotáctico D2D3^{10}. La escisión proteolítica está mediada tanto por su propio ligando, uPA, como por diferentes proteasas, por ejemplo quimiotripsina. Se ha usado un anticuerpo de captura de anti-uPAR monoclonal dirigido contra el dominio 3 en los ELISA. Esto significa que en el ensayo se detectó tanto suPAR intacto como el dominio quimiotáctico D2D3. El suPAR plasmático elevado observado en beteriemia neumocócica puede estar provocado por secreción incrementada desde leucocitos. Durante la neumonía neumocócica, se liberan citocinas y diferentes agentes quimiotácticos, y la mortalidad incrementada está asociada con un nivel de interleucina-6 pulmonar elevado.

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uPAR desempeña un papel importante en la inmunidad tanto innata como adquirida. En ratones transgénicos que carecen de uPAR, May et al.^{23} mostraron que la presencia de uPAR es crucial para que los leucocitos se adhieran al endotelio. Los ratones que carecen de uPAR muestran una respuesta inmunitaria reducida frente a S. pneumoniae, con un reclutamiento disminuido de neutrófilos al pulmón, y los ratones que carecen de uPA tienen una respuesta inmunitaria incrementada frente a S. pneumoniae^{20}. Estas observaciones sugieren que uPAR es necesario para el reclutamiento de neutrófilos, pero el mecanismo es independiente de la capacidad proteolítica. Además de la activación de plasmina, se cree que uPAR media la interacción célula con célula a través de integrinas, y de ese modo está implicado en la transducción de señales. Está bien descrito que las bacterias invasivas usan el sistema de plasmina del hospedante para degradar la matriz extracelular, por ejemplo los estreptococos del grupo A activan plasminógeno mediante estreptocinasa. Todavía es necesario investigar el posible papel proteolítico de uPAR/uPA en la migración de neutrófilos y monocitos frente a tuberculosis y Streptococcus pneumoniae.

Las elevaciones dadas a conocer de suPAR plasmático durante la bacteriemia pueden reflejar el aumento de uPAR en neutrófilos, monocitos y células vasculares, e indican una mayor actividad de neutrófilos y monocitos. En conclusión, similar a pacientes con tuberculosis, suPAR plasmático es elevado y un predictor independiente de muerte en pacientes con bacteriemia neumocócica.

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TABLA 3

5

6

Tabla 3. Distribución de edades y sexo de los 141 pacientes incluidos y factores de pronóstico en bacteriemia por S. pneumoniae. La tabla muestra la tasa de mortalidad (MR) predicha por los diferentes factores de pronóstico. Todos los factores en el análisis univariado de regresión logística fueron significativos (p < 0,05). En el análisis multivariado, sólo los niveles de suPAR por encima de 10 ng/ml siguieron siendo significativos. Los síntomas cerebrales se definen como inconsciencia o confusión grave en la admisión. # Los datos sólo estuvieron disponibles para 139 pacientes. CI: Intervalo de confianza.

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Ejemplo 4 Correlación entre la positividad del frotis para TB y el nivel de suPAR Objetivo

Determinar si suPAR tiene valor de diagnóstico en la infección por TB, comparándolo con el análisis microscópico.

Material y sujetos

En el estudio se incluyeron 69 pacientes procedentes de cuatro áreas suburbanas en Bissau, la capital de Guinea Bissau. Los criterios para la inclusión en el estudio fueron uno o más de los siguientes síntomas y signos sin otra enfermedad explicativa: tos persistente (> 1 mes) sin mejora con antibióticos, fiebre constante o periódica durante más de 1 mes, pérdida de peso, disnea, hemoptisis, sudoraciones nocturnas o linfadenopatía. suPAR se midió en esputo procedente de 69 pacientes. Todos los pacientes se ensayaron para determinar bacilos ácido alcohol resistentes (AFB) en microscopía directa de esputo. suPAR se midió usando ELISA.

Resultados

Los 69 individuos tuvieron suPAR medible en esputo. La mediana de suPAR fue 24,9 ng/ml de esputo (intervalo 3,1-50,0). Nueve pacientes fueron positivos par AFB en microscopía directa, y estos pacientes tuvieron una mediana de suPAR de 50 ng/ml (máximo en ensayo, intervalo 9,73-50). Esto fue significativamente mayor que entre 60 pacientes negativos para AFP en microscopía directa (mediana de suPAR 20,3 ng/ml; intervalo 3,1-50 ng/ml), p = 0,002 prueba de Mann Whitney (Figura 6).

Discusión

Este estudio muestra que pacientes positivos para AFB tienen niveles de suPAR significativamente mayores que los individuos negativos para AFB en microscopía directa. De este modo, suPAR posee información de diagnóstico sobre positividad de esputo a TB en pacientes con TB.

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Ejemplo 5 Pacientes con TB activa tienen mayor suPAR en esputo Objetivo

Determinar si suPAR es medible en esputo, y si los pacientes que reciben terapia tienen niveles de suPAR menores que los pacientes que son positivos a TB pero no reciben terapia.

Materiales y sujetos

En el estudio se incluyeron veinticinco pacientes procedentes de cuatro áreas suburbanas en Bissau, la capital de Guinea Bissau. Los criterios para la inclusión en el estudio fueron uno o más de los siguientes síntomas y signos sin otra enfermedad explicativa: tos persistente (> 1 mes) sin mejora con antibióticos, fiebre constante o periódica durante más de 1 mes, pérdida de peso, disnea, hemoptisis, sudoraciones nocturnas o linfadenopatía. suPAR se midió en esputo procedente de 25 pacientes. Todos los pacientes tuvieron signos, síntomas y cambios radiológicos compatibles con TB activa en el tórax y con hallazgos de bacilos ácido alcohol resistentes (AFB) en microscopía directa de esputo. Siete de los pacientes recibieron terapia en el momento de la toma de muestras de esputo, y 18 pacientes recibieron terapia después de que se tomó la muestra de esputo. El tratamiento consistió en una fase intensa de 4 meses de Tratamiento Observado Directamente diariamente con etambutol, isoniazida, rifampicina, y pirazinamida, seguido de una fase de continuación durante 4 meses con isoniazida y etambutol recogidos en el centro de salud dos veces al mes por el paciente. Este régimen de tratamiento se recomendó para individuos infectados con HIV por el programa de tuberculosis nacional en Guinea-Bissau cuando se inició el proyecto de investigación en 1996. Por razones de confidencialidad y capacidad de comparación, los individuos infectados y no infectados por HIV recibieron el mismo tratamiento. Además, a todos los pacientes se les dio diariamente complejo de Vitamina B y multivitaminas. La adhesión al tratamiento se verificó mediante recuento de pastillas y un ensayo de orina mediante INH a los 2, 5 y 8 meses de seguimiento. Los pacientes que abandonan fueron visitados por una enfermera y se les alentó a continuar el tratamiento. Los fármacos específicos contra el HIV o el tratamiento profiláctico para enfermedades relacionadas con el HIV no estaban disponibles en Guinea-Bissau, que es uno de los países más pobres del mundo.

Resultados

18 pacientes positivos para AFB y 7 pacientes positivos para AFB pero que reciben tratamiento. Hubo niveles de suPAR significativamente mayores en esputo para los pacientes que no recibieron terapia en comparación con los 7 pacientes con TB que recibieron terapia (p = 0,024) (Figura 7).

Discusión

En este estudio, se encuentra que suPAR es medible en esputo. De forma muy importante, se muestra que los pacientes con TB que no reciben terapia tienen niveles de suPAR significativamente mayores, en comparación con pacientes con TB después de que se ha iniciado la terapia. De este modo, el inicio de la terapia da como resultado una disminución de suPAR de esputo, y por lo tanto la medida de suPAR en esputo se puede usar para monitorizar la eficacia del tratamiento contra TB.

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Ejemplo 6 Objetivo

Determinar si suPAR es medible en el líquido espinal.

Materiales y métodos

Se obtuvo líquido espinal de 23 pacientes con enfermedad neumocócica, y de 1 control. suPAR se midió usando ELISA.

Resultados

suPAR fue medible en líquido espinal procedente de 24 individuos incluidos en el estudio. La mediana de suPAR fue 3,49 ng/ml de líquido espinal. El paciente de control tuvo un valor de suPAR de 0,69 ng/ml.

Discusión

Se muestra aquí que suPAR es medible en líquido espinal. De este modo, la medida de suPAR en líquido espinal se puede usar con fines de diagnóstico y de pronóstico.

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Ejemplo 7

El nivel de suPAR no está influido por la infección por HCV o por terapia con alfa-interferón y ribavirina.

Antecedentes

Se ha mostrado que el nivel de suPAR (receptor de urocinasa soluble) aumenta en pacientes con infección por HIV, tuberculosis o S. pneumocócica, y que suPAR es un marcador de pronóstico independiente muy significativo para estas enfermedades. El objetivo de este estudio fue determinar si el nivel de suPAR se altera por infección por HCV y su tratamiento. Si suPAR está modulado por la infección por HCV, esto puede influir en el valor de pronóstico de suPAR en pacientes infectados con HIV, Tuberculosis o S. pneumocócica coinfectados con HCV.

Sujetos y métodos

Se trataron cuarenta y siete pacientes positivos a HCV con alfa-interferón y ribavirina durante 12 meses. Todos los pacientes fueron negativos a HIV y HBV. Se extrajeron muestras de sangre inmediatamente antes de la terapia (T0), y al final del tratamiento (T12) y 6 meses más tarde (T18). Para comparación, se incluyeron muestras de plasma procedentes de 30 controles sanos. suPAR se midió usando ELISA, y la carga viral de HCV mediante
RT-PCR.

Resultados

Hubo una caída significativa en la carga viral de HCV después de la terapia (prueba de la t de muestras emparejadas, p=0,033). No hubo ninguna diferencia en los niveles de suPAR entre pacientes antes del tratamiento (mediana de suPAR: 2,58 ng/ml (intervalo 1,15-6,01), después del tratamiento (mediana de suPAR: 2,52 ng/ml (intervalo 1,24-6,26) y a los 6 meses del seguimiento (mediana de suPAR de 2,43 ng/ml (intervalo 1,21-4,98). No se observó ninguna diferencia en suPAR entre pacientes y los controles (p=0,68). suPAR se correlacionaba mucho en todos los puntos de tiempo (T0-T12, T0-T18, y T12-T18, todos p<0,001, todos r>0,67, correlación de Pearson). Además, no hubo ninguna diferencia en suPAR entre los 30 pacientes que responden y los 19 pacientes que no responden
(p=0,39).

Conclusión

El nivel plasmático de suPAR siguió siendo estable a lo largo del tiempo, indicando el uso posible de suPAR como marcador serológico. El nivel de suPAR sérico no está influido por la infección por HCV, título de HCV, por la introducción de terapia con alfa-interferón y ribavirina, o por la respuesta a la terapia. Estos datos sugieren que la coinfección de HCV/HIV no influye en suPAR como marcador de pronóstico en pacientes infectados por HIV, tuberculosis o S. pneumocócica.

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Ejemplo 8

La expresión de uPAR en PBMC se correlaciona con el nivel sérico de suPAR.

Antecedentes

Determinar si hay una relación significativa entre la expresión de uPAR en la superficie y el nivel sérico de suPAR.

Métodos

Se recogió sangre de 10 donantes de sangre sanos que acuden al hospital de donaciones en Hvidovre Hospital. Se recogió el suero, y la concentración de suPAR se midió usando ELISA. Se recogió PBMC usando una centrifugación en gradiente Histopaq, y se midió la expresión de CD87 usando anticuerpo R2, y un anticuerpo secundario conjugado con FITC frente a anticuerpo de ratón, usando análisis de FACS. Como control de la especificidad, se incluyó un anticuerpo de control negativo idiotípico.

Resultados

Todos los donantes de sangre tuvieron receptor de uPAR medible en la PBMC, y suPAR medible en suero. Los niveles séricos de suPAR se correlacionan significativamente con la expresión de uPAR en la superficie (correlación de Pearson, p < 0,05) (Figura 8).

Discusión

Se ha mostrado aquí una relación significativa entre la expresión de uPAR en la superficie de las PBMC (CD87) y el nivel sérico de suPAR. Esto está de acuerdo con las observaciones de otros^{11}, que también encuentran que uPAR en células circulantes se correlaciona significativamente con el nivel plasmático/sérico de suPAR. De este modo, por lo tanto, es razonable suponer que la expresión de uPAR en la superficie puede ser un potente factor de pronóstico en pacientes con infección por Streptococcus pneumoniae o Mycobacterium tuberculosis. El CD87 (uPAR) se pudo medir usando FACS, y de ese modo añadir información valiosa en cuanto al diagnóstico así como al estado de progresión de los pacientes.

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Listado de referencias

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10. Fazioli, F., M. Resnati, N. Sidenius, Y. Higashimoto, E. Appella, y F. Blasi. 1997. A urokinase-sensitive region of the human urokinase receptor is responsible for its chemotactic activity. EMBO J 16:7279-7286.

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13. Lisse, I. M., H. Whittle, P. Aaby, M. Normark, A. Gyhrs, y L. P. Ryder. 1990. Labelling of T cell subsets under field conditions in tropical countries. Adaptation of the immuno-alkaline phosphatase staining method for blood smears. J Immunol Methods 129:49-53.

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15. Sier, C. F., R. Stephens, J. Bizik, A. Mariani, M. Bassan, N. Pedersen, L. Frigerio, A. Ferrari, K. Dano, N. Brunner, y F. Blasi. 1998. The level of urokinase-type plasminogen activator receptor is increased in serum of ovarian cancer patients. Cancer Res. 58:1843-1849.

16. Stephens, R. W., A. N. Pedersen, H. J. Nielsen, M. J. Hamers, G. Hoyer-Hansen, E. Ronne, E. Dybkjaer, K. Dano, y N. Brunner. 1997. ELISA determination of soluble urokinase receptor in blood from healthy donors and cancer patients. Clin. Chem. 43:1868-1876.

17. Juffermans, N. P., P. E. Dekkers, A. Verbon, P. Speelman, S. J. van Deventer, and P. T. van Der. 2001. Concurrent upregulation of urokinase plasminogen activator receptor and cd11b during tuberculosis and experimental endotoxemia. Infect. Immun. 69:5182-5185.

18. Melo, M. D., I. R. Catchpole, G. Haggar, y R. W. Stokes. 2000. Utilization of CD11 b knockout mice to characterize the role of complement receptor 3 (CR3, CD11b/CD18) in the growth of Mycobacterium tuberculosis in macrophages. Cell Immunol. 205:13-23.

19. Hoyer-Hansen, G., E. Ronne, H. Solberg, N. Behrendt, M. Ploug, L. R. Lund, V. Ellis, y K. Dano. 1992. Urokinase plasminogen activator cleaves its cell surface receptor releasing the ligand-binding domain. J Biol Chem 267:18224-18229.

20. Rijneveld, A. W., M. Levi, S. Florquin, P. Speelman, P. Carmeliet, y P. T. van Der. 2002. Urokinase receptor is necessary for adequate host defense against pneumococcal pneumonia. J. Immunol. 168:3507-3511.

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23. May, A. E., F. J. Neumann, A. Schomig, y K. T. Preissner. 2000. VLA-4 (alpha(4)beta(1)) engagement defines a novel activation pathway for beta(2) integrin-dependent leukocyte adhesion involving the urokinase receptor. Blood 96:506-513.

Claims (15)

1. Un método de diagnóstico y/o de pronóstico de infecciones respiratorias bacterianas en un sujeto, que comprende las etapas de:

(a)

llevar a cabo una medida in vitro del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR); (ii) un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR); y/o (iii) uno o más productos de degradación de (i) o (ii), en una muestra de fluido biológico que procede de un sujeto; y

(b)

usar el valor obtenido de la medida para evaluar el estado del sujeto.

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2. Un método según la reivindicación 1, en el que la infección respiratoria bacteriana está provocada por los patógenos Streptococcus pneumoniae o Micobacterium tuberculosis.

3. Un método de pronóstico de infecciones respiratorias bacterianas en un sujeto según la reivindicación 2, en el que la infección respiratoria bacteriana es una bacteriemia por Streptococcus pneumoniae, en el que la etapa a) se efectúa usando ELISA, el marcador es suPAR, y la muestra de fluido biológico es plasma.

4. Un método según la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra de fluido biológico es una muestra de orina, y en el que la medida del marcador se correlaciona con la concentración total de la muestra.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que la etapa a) se efectúa por medio de una barrita.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que la etapa a) se efectúa usando ELISA.

7. Un método de evaluación de la progresión del estado de un sujeto que padece una infección respiratoria bacteriana, que comprende las etapas de:

(a)

llevar a cabo una medida in vitro del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR); (ii) un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR); y/o (iii) uno o más productos de degradación de (i) o (ii), en cada una de un conjunto de muestras de fluidos biológicos que proceden de un sujeto, en el que las muestras se obtienen en diferentes puntos de tiempo; y

(b)

usar los valores de medida obtenidos para evaluar la progresión del estado del sujeto.

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8. Un método según la reivindicación 7, en el que la infección respiratoria bacteriana está provocada por los patógenos Streptococcus pneumoniae o Micobacterium tuberculosis.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que el sujeto evaluado está en tratamiento.

10. Uso de un kit de ELISA para evaluar el estado físico de un sujeto que padece una infección respiratoria bacteriana, comprendiendo el kit: a) un agente de captura inmovilizado capaz de capturar uno o más marcadores en forma de (i) un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR); y/o (ii) un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR); y/o (iii) de uno o más productos de degradación de (i) o (ii), y b) una pareja de unión capaz de unirse a dicho marcador, comprendiendo la pareja de unión c) un sistema de
marcado.

11. Uso de un kit de barrita para evaluar el estado físico de un sujeto que padece una infección respiratoria bacteriana, que comprende: a) un agente de captura inmovilizado capaz de capturar uno o más marcadores en forma de (i) un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR); y/o (ii) un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR); y/o (iii) de uno o más productos de degradación de (i) o (ii), y b) una pareja de unión capaz de unirse a dicho marcador, comprendiendo la pareja de unión c) un sistema de marcado.

12. Uso según las reivindicaciones 10 u 11, en el que la infección respiratoria bacteriana está provocada por los microorganismos patógenos Streptococcus pneumoniae o Micobacterium tuberculosis.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el agente de captura es un anticuerpo anti-marcador.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la pareja de unión es un anticuerpo anti-marcador.

15. Uso según la reivindicación 10, en el que la infección respiratoria bacteriana es una bacteriemia a Streptococcus pneumoniae, en el que el agente de captura inmovilizado es un anticuerpo monoclonal murino dirigido contra un suPAR humano capaz de capturar un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR), la pareja de unión es un anticuerpo policlonal de conejo anti-suPAR humano, y el sistema de marcado es un anticuerpo policlonal de ratón anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina.