ES2351690T3 - Un método para diagnosticar o pronosticar patógenos bacterianos respiratorios principales en un sujeto. - Google Patents
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Abstract
Un método de diagnóstico y/o de pronóstico de infecciones respiratorias bacterianas en un sujeto, que comprende las etapas de: (a) llevar a cabo una medida in vitro del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR); (ii) un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR); y/o (iii) uno o más productos de degradación de (i) o (ii), en una muestra de fluido biológico que procede de un sujeto; y (b) usar el valor obtenido de la medida para evaluar el estado del sujeto.
Description
Un método para diagnosticar o pronosticar
patógenos bacterianos respiratorios principales en un sujeto.
La presente invención se refiere al diagnóstico
y/o pronóstico de los principales patógenos bacterianos
respiratorios. En particular, se refiere a Streptococcus
pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis. Más
particularmente, se refiere a las medidas de la concentración del
receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble
(suPAR) en fluidos biológicos humanos (esputo, fluido cístico,
ascitis, suero, plasma, orina) como herramienta para diagnosticar
una infección bacteriana respiratoria, así como el pronóstico de la
progresión de la enfermedad.
El receptor celular para urocinasa (uPAR, CD87)
desempeña múltiples funciones en la migración celular, adhesión
celular, proteolisis pericelular y remodelación tisular. uPAR es
expresado por la mayoría de leucocitos, incluyendo monocitos,
macrófagos, neutrófilos y plaquetas. uPAR es un antígeno de la
activación en monocitos y células T, y las células T procedentes de
individuos infectados con el HIV-1 expresan niveles
elevados de uPAR^{1}, 1994. La infección de leucocitos in
vitro por HIV-1 provoca el aumento de la
expresión en la superficie celular de uPAR, en un proceso que
parece estar coordinado temporalmente con el comienzo de la
replicación vírica^{2}.
uPAR se puede desprender de la superficie
celular generando una forma soluble del receptor (suPAR) que carece
del anclaje GPI. El mecanismo de desprendimiento está mal
comprendido, pero se puede producir mediante la escisión
hidrolítica del anclaje de GPI catalizada por la fosfolipasa D
específica de GPI. Se han identificado formas solubles de uPAR
(suPAR) en sobrenadantes de cultivos celulares y en diversos fluidos
biológicos tales como ascitis tumoral, fluido cístico, suero,
plasma y también recientemente en orina^{3}.
Los niveles de suPAR en suero, plasma y orina
son elevados en pacientes que sufren diferentes tipos de
cáncer^{4}, el síndrome de hemoglobinuria nocturna paroxísmica
(PNH)^{5}, y en pacientes con artritis reumatoide^{6}.
El nivel plasmático de suPAR es además un marcador de pronóstico
para la supervivencia global en pacientes que sufren infección por
HIV-1^{7}. Dekkers et al., (2000) en
Infection and Immunity 68(4): 2156-2160
encuentran que la endotoxina, inyectada en sujetos, induce la
expresión de uPAR en monocitos y aumenta la expresión de uPAR en
monocitos in vitro. Coleman et al., (2001) en J.
Immunology 166: 473-480 encuentran que Borrelia
burgdorferi y componentes bacterianos (proteína A de la
superficie) aumentan la expresión y liberación de uPAR en monocitos
humanos. Florquin et al (2001) en Kidney International 59:
2054-2061, encuentran que los niveles de uPAR en
plasma y orina son elevados en pacientes con urosepticemia y
endotoxemia. Fause et al., (2000) en J. Neuroimmunology 111:
234-240 encuentran que la lesión asociada con la
expresión de uPAR contribuye al menos en parte a la alteración de
la berrera hematoencefálica y a la disfunción inmunológica en la
patogénesis de la malaria cerebral. Heegaard et al., (1994)
en Fibrinolysis 8: 22-30 encuentran un incremento en
el nivel de uPAR en células lácteas durante la mastisis. Todd et
al., (1985) en J. Immunology 135(6):
3869-3877 encuentran que el nivel de expresión de
un antígeno de membrana plasmática (Mo3e) en fagocitos mononucleares
está potenciado por la exposición a lipopolisacárido bacteriano.
Eugen-Olsen et al., (2002) en Int. J. Lung
Disease 6(8): 686-692 encuentran que los
niveles de suPAR son elevados en pacientes con tuberculosis. El
documento WO 0138871 describe un método para diagnosticar y
pronosticar la infección por HIV en un sujeto, que comprende medir
un marcador en forma de suPAR, uPAR o un producto de la degradación
del mismo en una muestra biológica procedente del sujeto.
Juffermans et al., (2001) en Infection and Immunity
69(8): 5182-5185 encuentran que pacientes
con tuberculosis tienen mayores niveles de expresión de uPAR
monocítico. Garcia-Monco et al., (2002) en J.
Neuroimmunology 129: 216-223 encuentran que suPAR
está presente en suero y en líquido cerebroespinal de pacientes con
meningitis carcinomatosa, trastornos paraneoplásicos e infecciones
bacterianas y víricas del sistema nervioso central.
El origen celular de suPAR circulante es
desconocido. Muchas células, si no todas, que expresan uPAR también
desprenden formas solubles del receptor cuando se cultivan in
vitro. Se ha sugerido que la fuente de suPAR sérico en exceso,
en pacientes con cáncer, deriva de las células cancerosas y/o
macrófagos infiltrantes de tumores, ya que estas células expresan a
menudo niveles elevados de uPAR, y experimentos que usan ratones
xenoinjertados que poseen tumores humanos han demostrado de hecho
que el tejido tumoral libera suPAR a la circulación y
orina^{8}.
El problema técnico afrontado por la presente
invención es proporcionar un nuevo marcador para diagnosticar y
pronosticar patógenos bacterianos respiratorios principales, en
particular Streptococcus pneumoniae y Mycobacterium
tuberculosis. Un problema técnico adicional afrontado por la
presente invención es proporcionar un marcador del mencionado tipo,
que es simple y que se puede medir.
La presente invención ha proporcionado una
solución a los problemas técnicos anteriores, dirigiéndose la
invención a un método para diagnosticar o pronosticar infecciones
bacterianas respiratorias principales, provocadas por patógenos,
tales como Streptococcus pneumoniae y Mycobacterium
tuberculosis, en un sujeto, que comprende las etapas de
- (a)
- llevar a cabo in vitro una medida del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR), (ii) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR), y/o (iii) uno o más productos de la degradación de (i) o (ii), en una muestra de fluido biológico procedente de un sujeto, y
- (b)
- usar el valor de medida obtenido para evaluar el estado del sujeto.
La invención se basa en el descubrimiento
sorprendente de que uPAR soluble (suPAR) está presente en niveles
elevados en suero, plasma y orina de pacientes con dos patógenos
bacterianos respiratorios principales, Streptoco- ccus
pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis, y que el nivel
de suPAR es útil como un marcador de diagnóstico. También, el nivel
de suPAR en individuos con dos patógenos bacterianos respiratorios
principales, Streptococcus pneumoniae y Mycobacterium
tuberculosis, es un pronóstico para el desarrollo de la
enfermedad y muerte. El nivel de suPAR es un nuevo factor de enorme
diagnóstico y pronóstico, incluso en el contexto de otros factores
de pronóstico conocidos relacionados con la infección por
Streptococcus pneumoniae o Mycobacterium tuberculosis
del pulmón.
Además, la presente invención se basa en el
reconocimiento de que la cantidad de suPAR se correlaciona con la
cantidad de uPAR, y que, por lo tanto, las cantidades de uPAR son
igualmente adecuadas como indicadores de diagnóstico y de
pronóstico de la infección con tuberculosis.
Una ventaja adicional de la invención es que la
medida de suPAR se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, una
técnica de ELISA simple, o incluso una barrita, por lo tanto puede
proporcionar un suplemento muy barato, simple y rápido a las
herramientas de pronóstico usadas actualmente para personas
infectadas con tuberculosis. De este modo, en países en desarrollo
sin la posibilidad financiera de llevar a cabo los ensayos costosos
usados en países occidentales, los niveles de suPAR se podrían usar
1) para determinar el estado de la tuberculosis (diagnóstico), 2)
para seleccionar pacientes para el tratamiento (pronóstico), y 3)
para monitorizar el progreso del tratamiento.
Además, la presente invención implica la ventaja
de que mientras que los niveles de suPAR se pueden medir de forma
muy simple, usando por ejemplo una muestra de orina o muestra de
esputo, que es fácil de obtener, los ensayos convencionales de
diagnóstico y pronóstico para por ejemplo tuberculosis son
inciertos, complejos e implican, por ejemplo, el crecimiento en
cultivo de esputo, ensayo clínico y radiografía de rayos X del
tórax.
La invención se refiere además a un método para
evaluar la progresión del estado de un sujeto que sufre una
infección bacteriana respiratoria principal, provocada por un
patógeno, tal como tuberculosis o Streptococcus pneumoniae,
que comprende las etapas de
- (a)
- llevar a cabo una medición in vitro del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR), (ii) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR), y/o (iii) uno o más productos de la degradación de (i) o (ii), en cada una de un número de muestras de fluido biológico procedentes de un sujeto, en el que las muestras se obtienen en diferentes puntos de tiempo, y
- (b)
- usar los valores de medida obtenidos para evaluar la progresión del estado del sujeto.
Este método se puede usar para monitorizar
continuamente el estado, por ejemplo la eficacia de tratamiento del
paciente.
Finalmente, la presente invención se refiere al
uso de un kit de ELISA o al uso de un kit de barrita para evaluar
el estado físico de un sujeto que sufre infección bacteriana
respiratoria, comprendiendo cada uno del kit de ELISA y del kit de
barrita a) un agente de captura inmovilizado capaz de capturar uno o
más marcadores en forma de (i) receptor del activador de
plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR), y/o (ii) receptor del
activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR), y/o
(iii) uno o más productos de la degradación de (i) o (ii), y b) una
pareja de unión capaz de unirse al mencionado marcador,
comprendiendo la pareja de unión c) un sistema de marcado.
Figura 1. Niveles de suPAR entre esputo
positivo a TB (SP), cultivo positivo a TB (CP), TB
supuesta (PTB), positivo a TB que recibe tratamiento al
enrolarse (TAE), y negativo a TB (NEG). La gráfica de cajas
muestra la mediana (línea negra en la caja), cuartiles (caja) y
valores atípicos (casos con valores de longitudes de caja entre 1,5
y 3 desde el extremo superior o inferior de la caja), pero no
extremos (casos con valores de longitudes de caja mayores de 3
desde el borde superior o inferior de la caja).
La figura 2a muestra la relación entre los
valores de suPAR y la probabilidad de ser diagnosticado positivo a
TB. Los 16 pacientes que están en tratamiento para TB en el momento
de la inclusión no se incluyeron en el análisis. De este modo, se
incluyeron en el análisis los individuos positivos a TB
(esputo y cultivo positivos a TB y TB
supuesta) y los individuos negativos a TB. Los pacientes
con suPAR creciente tienen una mayor probabilidad de ser
diagnosticados con TB activa (P = 0,0001). No se muestran los
pacientes con valores de suPAR por encima de 8,3 ng/ml (n = 8). Las
líneas azules en la parte inferior indican los valores de suPAR de
los pacientes individuales, y la línea elevada es el valor de la
mediana. Las líneas punteadas son intervalos de 95% de
confianza.
Figura 2b. Probabilidad de ser diagnosticado con
TB cuando se excluye el esputo positivo a TB. Los pacientes
incluidos en el análisis de probabilidad son los 35 de cultivo
positivo, los 63 de TB supuesta y los 64 negativos a
TB. De este modo, predice la probabilidad de todos los
sospechosos con TB, excluyendo el positivo microscópico y los 16
pacientes en tratamiento al enrolarse. Ocho muestras tuvieron
valores de suPAR por encima de 8,5 ng/ml, y no se muestran. La
figura muestra que la probabilidad de ser positivo a TB a pesar de
un análisis microscópico de esputo negativo a TB aumenta con el
aumento de los niveles de suPAR (p = 0,001). Las líneas azules en
la parte inferior indican los valores de suPAR de los pacientes
individuales, y la línea elevada es el valor de la mediana. Las
líneas punteadas son intervalos de 95% de confianza.
Figura 2c. La figura es idéntica a la figura 2b,
excepto por la exclusión de individuos infectados con
HIV-1. Hubo una relación significativa entre el
aumento de suPAR y la probabilidad de ser diagnosticado como cultivo
positivo o TB supuesta (p = 0,02). Las líneas azules en la parte
inferior indican los valores de suPAR de los pacientes
individuales, y la línea elevada es el valor de la mediana. Las
líneas punteadas son intervalos de 95% de confianza.
La figura 2d muestra la probabilidad de ser
positivo a TB entre positivos a HIV-1 según el valor
de suPAR. p = 0,08. Hubo una tendencia hacia una relación entre el
aumento de suPAR y la probabilidad de ser diagnosticado como
cultivo positivo o TB supuesta (p = 0,08). Las líneas azules en la
parte inferior indican los valores de suPAR de los pacientes
individuales, y la línea elevada es el valor de la mediana. Las
líneas punteadas son intervalos de 95% de confianza.
Figura 3. Curvas de supervivencia de Kaplan
Meier que muestran la supervivencia entre los 182 pacientes con TB
activa. La línea delgada indica pacientes con bajo suPAR, y la línea
en negrita indica pacientes con suPAR elevado. Figura A: no hay
diferencia significativa cuando se estratifican pacientes según el
valor de la mediana. Figura B: los pacientes con valores de suPAR
por encima de 2 veces el valor de la mediana (es decir, >4,2
ng/ml, n = 38), murieron de forma significativamente más rápido que
los pacientes con suPAR por debajo de 2 veces el valor de la
mediana (n = 144), p = 0,007, prueba de rangos logarítmicos.
Figura 4. Después del tratamiento, había
disponible suero procedente de 101 individuos. La gráfica de cajas
muestra los niveles de suPAR previos y posteriores (los posteriores
marcados con -P) de estos 101 individuos. A: esputo positivo a
TB (SP), B: cultivo positivo a TB (CP), C: TB
supuesta (PTB), D: positivo a TB que recibe tratamiento al
alistarse (TAE), y E: negativo a TB (NEG). Por simplicidad,
la gráfica de cajas muestra la mediana (línea negra en caja) y
cuartiles (caja), pero no los valores atípicos ni los extremos
(casos con valores de longitudes de caja mayores de 1,5 desde el
borde superior o inferior de la caja).
Figura 5. Gráficas de cajas basadas en los
valores de la mediana, cuartiles, y extremos de los niveles de
suPAR plasmático. A: grupo de control (mediana = 2,6 ng/ml) y
pacientes bacteriémicos neumocócicos (mediana = 5,5 ng/ml). suPAR
estaba significativamente elevado en pacientes comparados con los
controles (p = 0,001). B: pacientes que sobreviven a la infección
(mediana = 5,0 ng/ml) y pacientes que mueren por la infección
(mediana = 9,4 ng/ml). El nivel aumentado de suPAR en el grupo de
pacientes muertos era estadísticamente significativo (p = 0,0001).
Las cajas representan el intervalo intercuartil que contiene el 50%
de valores, y los bigotes, que se extienden desde las cajas, los
valores más elevados y más bajos, excluyendo valores atípicos y
extremos. Los círculos (o) representan valores atípicos (longitudes
de la caja de 1,5 y 3) y las estrellas (*) representan los extremos
(valores con longitudes de caja mayores de 3).
Figura 6. Niveles de suPAR en individuos con TB
sospechosa según si los pacientes fueron positivos o negativos para
AFB en microscopía directa.
Figura 7. Niveles de suPAR en pacientes con TB
no tratados y tratados.
Figura 8. El eje Y a la izquierda muestra el
nivel sérico de suPAR (ng/ml). El eje Y a la derecha muestra el
porcentaje en células que expresan el receptor uPAR (células CD87
positivas).
En lo siguiente, la invención se explica en
particular con referencia a suPAR por razones de simplicidad. Esto
no se debería de entender como una limitación del alcance de la
presente invención para suPAR. Además, las extrapolaciones
adecuadas a uPAR y los productos de degradación de estas dos
sustancias caen dentro de la pericia de la persona experta en la
técnica.
Se ha encontrado sorprendentemente que la
concentración de suPAR, una molécula que en general se sabe que
está implicada en la migración y adhesión celular, está incrementada
en suero y/o esputo procedente de personas con dos patógenos
bacterianos respiratorios principales, Streptococcus
pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis, en comparación
con controles sanos.
\newpage
Los patógenos bacterianos respiratorios
principales son:
- Streptococcus pneumoniae (incluyendo S. pneumoniae resistente a fármacos)
- Chlamydia pneumoniae y Chlamydia psittaci
- Legionella spp.
- Coxiella burnetii
- Virus respiratorios de Haemophilus influenzae
- Bacilos gramnegativos entéricos (especialmente Klebsiella spp.)
- Hongos endémicos (coccidioidomycosis, histoplasmosis, blastomycosis)
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus pyogenes
- Mycoplasma pneumoniae
- Mycobacterium tuberculosis
- Pseudomonas aeruginosa
- Pneumocystis carinii
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra de fluido biológico puede ser
cualquier fluido que se puede obtener de seres humanos, es decir,
esputo, fluido cístico, ascitis, sangre, suero, plasma, y orina. Se
prefiere la orina debido al hecho de que es fácil de obtener.
Cuando se usa orina como la muestra de fluido biológico, la medida
del marcador se debería de correlacionar con el nivel de
concentración total de la muestra, por ejemplo correlacionando la
medida del marcador con el contenido de creatinina en la
muestra.
Preferiblemente, la muestra de fluido biológico
se almacena a una temperatura por debajo de 0ºC, más preferiblemente
desde -20ºC hasta -80ºC, hasta la medida.
La medida del marcador en la muestra de fluido
biológico se puede llevar a cabo usando para ello cualquier
método/dispositivo disponible. Los ejemplos de tales
métodos/dispositivos de medida son ELISA, RIA (radioinmunoensayo),
transferencia Western, TR-FIA (ensayos
inmunofluorométricos resueltos en el tiempo), análisis de FACS,
barritas, etc. Los métodos/dispositivos de medida preferidos son
ELISA y las barritas.
Un ELISA se puede llevar a cabo en un número de
diferentes realizaciones, muchas de las cuales son aplicables en la
presente invención. Una realización de ELISA, que es particularmente
adecuada para uso en la presente invención, es la descrita por
^{8}, y ^{9}.
La medida del marcador se puede llevar a cabo
usando una barrita adecuada. Preferiblemente, la barrita es una
barrita que comprende un anticuerpo para el marcador como agente de
captura.
Preferiblemente, la medida de uPAR en la muestra
de fluido biológico se lleva a cabo mediante análisis de FACS,
transferencia Western o ELISA.
Preferiblemente, la medida de la degradación de
los productos de uPAR/suPAR se lleva a cabo usando transferencia
Western o TR-FIA (ensayos inmunofluorométricos
resueltos en el tiempo).
La medida de uPAR se lleva a cabo en muestras de
fluido biológico que contienen células que expresan uPAR, es decir,
muestras de sangre.
El valor de medida del nivel de marcador
obtenido en la etapa (a) se puede usar para evaluar el estado del
sujeto comparando el valor de medida con el nivel del marcador en
sujetos que no tienen una infección pulmonar bacteriana con
Streptococcus pneumoniae o Mycobacterium
tuberculosis.
Como se menciona anteriormente, un aspecto de la
presente invención se refiere a un método para evaluar la
progresión del estado de un sujeto que sufre una infección por
Streptococcus pneumoniae o Mycobacterium
tuberculosis.
Los valores de medida del nivel de marcador
obtenidos en la etapa (a) se pueden usar para evaluar la progresión
del estado de un sujeto comparando los valores de medida con el
nivel del marcador en sujetos no infectados con tuberculosis o
Streptococcus pneumoniae, y/o comparando el transcurso
temporal de los valores de medida con el de los sujetos no
infectados con tuberculosis o Streptococcus pneumoniae.
La invención se refiere además al uso de un kit
de ELISA para evaluar el estado físico de un sujeto que sufre una
infección por tuberculosis, que comprende a) un agente de captura
inmovilizado capaz de capturar uno o más marcadores en forma de (i)
receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR),
(ii) receptor del activador de plasminógeno de tipo urocinasa
soluble (suPAR), y/o (iii) uno o más productos de degradación de
(i) o (ii), y b) una pareja de unión capaz de unirse al marcador,
comprendiendo la pareja de unión c) un sistema marcador.
El agente de captura puede ser un anticuerpo
para el marcador.
La pareja de unión puede ser un anticuerpo para
el marcador.
Preferiblemente, el sistema marcador está
conjugado con la pareja de unión. El sistema marcador puede ser
cualquier sistema marcador usado convencionalmente, tal como un
anticuerpo para el agente de unión conjugado con una enzima, por
ejemplo un conjugado de inmunoglobulina con fosfatasa alcalina.
Además, la invención se refiere al uso de una
barrita para evaluar el estado físico de un sujeto que sufre una
infección por tuberculosis o Streptococcus pneumoniae, que
comprende a) un agente de captura inmovilizado capaz de capturar
uno o más marcadores en forma de (i) receptor del activador de
plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR), (ii) receptor del activador
de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR), y/o (iii) uno o
más productos de degradación de (i) o (ii), y b) una pareja de
unión capaz de unirse al marcador, comprendiendo la pareja de unión
c) un sistema marcador.
El agente de captura puede ser un anticuerpo
para el marcador.
La pareja de unión puede ser un anticuerpo para
el marcador.
Preferiblemente, el sistema marcador está
conjugado con la pareja de unión. El sistema marcador puede ser
cualquier sistema marcador usado convencionalmente, tal como un
anticuerpo para el agente de unión conjugado con una enzima, por
ejemplo un conjugado de inmunoglobulina con fosfatasa alcalina.
En relación con la presente invención,
"uPAR" se define como cualquier forma de uPAR (igual que CD87)
presente en la superficie de células que expresan uPAR en fluidos
biológicos.
La expresión "células que expresan uPAR" se
refiere a todas las células que expresan uPAR (CD87), tales como
monocitos, leucocitos, macrófagos, y neutrófilos.
En relación con la presente invención,
"suPAR" (uPAR soluble) se define como cualquier forma de uPAR
(igual que CD87) presente en fluidos biológicos en una forma no
unida a células.
"Fluidos biológicos" se definen como
cualquier fluido que se puede obtener de seres humanos, es decir,
esputo, fluido cístico, ascitis, sangre, suero, plasma, y
orina.
La expresión "producto de degradación de suPAR
o uPAR", como se usa aquí, significa todos los fragmentos de los
mismos observados usando transferencia Western o anticuerpos frente
a suPAR o uPAR. En particular, dicha expresión incluye los
fragmentos D1, D2 y D3 de suPAR.
Determinar si pacientes sospechosos de tener TB
activa tienen niveles elevados de suPAR en suero, es decir, si los
niveles de suPAR se pueden usar para diagnosticar TB activa.
Mycobacterium tuberculosis es un patógeno
intracelular que reside predominantemente en macrófagos. El receptor
del activador de plasminógeno tipo urocinasa (uPAR) está localizado
principalmente en monocitos y macrófagos. uPAR es una proteína
glucosilada de tres dominios (D1-D3) que se une a
urocinasa con elevada afinidad a través de su dominio D1. El
complejo uPAR/uPA está implicado en la activación del plasminógeno,
la proteolisis pericelular y remodelación tisular, así como en la
activación de integrina, adhesión y migración celulares. El uPAR se
une a la superficie celular mediante un anclaje de GPI, que se puede
escindir, dando como resultado una forma soluble del receptor
(suPAR). Las formas solubles de uPAR (suPAR) incluyen el receptor de
longitud completa (D1-D3) así como un fragmento
D2D3 con propiedades quimiotácticas ^{10}, y un fragmento D1 con
función desconocida. suPAR se ha identificado en sobrenadantes de
cultivos celulares y en fluidos biológicos tales como fluido
cístico, suero, plasma y orina^{11}. Debido a las dificultades de
diagnosticar la infección por tuberculosis en países en desarrollo
y la elevada mortalidad provocada por la infección, se han
investigado los niveles de suPAR entre individuos que se sospecha
que tienen tuberculosis activa en una cohorte en
Guinea-Bissau. Se muestra aquí que suPAR posee
información tanto de diagnóstico como de pronóstico en pacientes que
sufren tuberculosis activa.
Se siguieron cuatro áreas suburbanas en Bissau,
la capital de Guinea-Bissau, con alrededor de 46.000
habitantes, a través de un sistema de vigilancia demográfica, desde
1978. En mayo de 1996, se implementó en el área un sistema de
vigilancia de la TB, en cooperación con el hospital de TB nacional,
Hospital Raoul Follereau (HRF). Todos los adultos que viven
permanente o temporalmente en el área de estudio, que se presentan
en cualquiera de los 2 centros de salud con síntomas o signos de
tuberculosis activa, se enviaron al hospital para investigación
posterior. Dos enfermeras realizaron visitas cada tercer mes en los
domicilios en los que se habían encontrado casos de TB, examinando
y entrevistando a los miembros del hogar a fin de encontrar casos
secundarios. Los casos sospechosos se enviaron al hospital de TB
para exámenes médicos adicionales. Los pacientes que viven en el
área, pero que iniciaron el tratamiento contra TB en cualquier otra
parte, también se enviaron para una investigación posterior y su
inclusión si las enfermeras que distribuyen el medicamento en el
programa nacional contra TB los identificaba.
Los criterios para la inclusión en el estudio
fue uno o más de los siguientes síntomas y signos sin otra
enfermedad explicativa: tos >1 mes sin mejora con antibióticos,
fiebre constante o periódicamente durante más de 1 mes, pérdida de
peso, disnea, hemoptisis, sudoraciones nocturnas o linfadenopatía.
Las personas con edades <15 años y las mujeres embarazadas no se
incluyeron. Los pacientes que aceptaron se investigaron
clínicamente, se les entrevistó usando cuestionarios estandarizados
referentes a antecedentes personales, factores de riesgo
sociodemográfico y de comportamiento, se les investigó con
radiografía de rayos X del tórax, microscopía directa del esputo
matutino durante 3 días consecutivos, cultivo de esputo y prueba de
Mantoux (usando Multiteste®, Bio-Merieux, Francia).
Se extrajo sangre para ensayar infección por HIV, hematología y
parámetros inmunológicos. En este estudio se incluyeron doscientos
sesenta y dos pacientes sospechosos de estar infectados con TB. Los
pacientes entraron en el estudio entre 1996 y 1998. 147 fueron
hombres y 115 mujeres. La edad media fue 41,4 años (intervalo
15-80). Basándose en los exámenes, a los pacientes
se les dividió en 4 grupos: 1) a los pacientes positivos por AFB en
microscopía directa del esputo (bacilos ácido alcohol resistentes,
AFB, en microscopía directa) se les denominó esputo positivo a
TB. 2) A los pacientes negativos en microscopía pero positivos
en cultivo se les denominó cultivo positivo a TB. 3) A los
pacientes con signos clínicos, síntomas y cambios radiográficos
compatibles con TB intratorácica activa, pero sin confirmación
bacteriológica en microscopía directa del esputo o en cultivo, se
les trató con antibióticos (cotrimoxazol o amoxicilina) y después se
volvieron a evaluar clínicamente y radiográficamente. Si no había
mejora y continuaba la sospecha, se supuso que el paciente tiene TB
y se le denomina TB supuesta. 4) A los pacientes a los que no
se les diagnostiva TB se trataron según diagnóstico (por ejemplo
neumonía). A estos pacientes se les denominó negativos a
TB.
A una fase intensiva de 4 meses de Tratamiento
Observado Directamente (DOT) diario con dosis estándar de etambutol,
isoniazida, rifampicina, y pirazinamida, le siguió una fase de
continuación de 4 meses con etambutol e isoniazida recogidos por el
paciente en el centro de salud dos veces al mes. Este régimen de
tratamiento fue recomendado para individuos infectados por HIV por
el programa nacional contra TB en Guinea-Bissau
cuando el proyecto de investigación se inició en 1996; por razones
de confidencialidad y comparabilidad, los individuos positivos a
HIV y negativos a HIV recibieron el mismo tratamiento. Además, a
todos los pacientes se les dio complejo de vitamina B y
multivitaminas diariamente. A los pacientes que presentaron una
enfermedad grave se les ofreció hospiralización si había camas
disponibles. En la fase intensiva, a los pacientes que no se
presentaron para el tratamiento se les visitó el mismo día por una
enfermera y se les alentó a continuar el tratamiento. El
cumplimiento del tratamiento se verificó mediante recuento de las
pastillas y un ensayo de orina mediante INH a los 2, 5 y 8 meses de
seguimiento; la información se anotó en tarjetas y formularios de
tratamiento.
En la inclusión, se recogieron muestras de
esputo matutino durante tres días consecutivos mediante un auxiliar
de campo, y se transportaron en un recipiente cerrado herméticamente
a 4ºC el mismo día National Public Health Laboratory (LNSP) en
Bissau para microscopía directa y cultivo. Antes del cultivo, las
muestras se digirieron y se descontaminaron de microorganismos no
micobacterianos con el método de sulfato de laurilo. Una alícuota
de 0,5 ml del espécimen homogeneizado se inoculó en un tubo con
medio de huevo de Löwenstein-Jensen (LJ)
convencional y en uno que contiene LJ modificado con 0,6% de
piruvato. Los tubos se inocularon a 37ºC y se examinaron
semanalmente durante 7 semanas. El crecimiento de las micobacterias
se confirmó mediante microscopía de bacilos ácido alcohol
resistentes. Los aislados se transportaron congelados al Swedish
Institute for Infectious Disease Control (SMI) en Estocolmo, para
confirmación.
Los sueros se cribaron en busca de HIV en LNSP
usando Capillus® HIV-1/HIV-2
(Cambridge Diagnostics, Galway, Irlanda) y Enzygnost®
Anti-HIV 1+2 Plus (Behring Diagnostics Gmbh,
Marburg, Alemania). Las muestras positivas se confirmaron entonces
con Multispot® HIV-1/HIV-2 (Sanofi
Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, Francia).
Las muestras reactivas duales se enviaron congeladas al SMI en
Estocolmo, y se confirmaron usando Immunocomb® II
Hiv-1&2 Bispot (Orgenics, Yavne, Israel). Los
recuentos de células CD4 y CD8 se midieron usando el método de
inmuno-fosfatasa alcalina^{13}.
Las medidas de suPAR se llevaron a cabo
retrospectivamente sobre muestras de suero congeladas, usando un
ELISA de sándwich. Se incubaron inmunoplacas (Maxisorb, Nunc,
Dinamarca) toda la noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal murino
frente a suPAR humano, R2 (2 \mug/ml), en tampón de revestimiento
(15,1 mM de Na_{2}CO_{3}, 35,7 mM de NaHCO_{3}, pH 9,6). Tras
incubar, los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado
(PBS, 0,1% de Tween 20). La unión no específica se bloqueó con 2%
de seroalbúmina bovina (BSA filtrada, Sigma Chemical Co., St Louis,
MO, USA) en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), durante
30 minutos a 37ºC (agitación). Después de lavar tres veces, las
placas se incubaron con 10 ul de muestras de suero diluidas con 90
\mul de tampón, pH 7,4 (7,3 mM de KH_{2}PO_{4}, 50,7 mM de
Na_{2}HPO_{4}, 0,1 M de NaCl, 0,5% de rojo fenol), durante una
hora a temperatura ambiente. La capa detectora consistió en
anticuerpo policlonal de conejo anti-suPAR humano
(1 \mug/ml) en tampón de dilución. El anticuerpo secundario usado
fue un anticuerpo anti-inmunoglobulina de conejo
monoclonal, conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma), diluido 1:2000
en tampón de dilución. Treinta minutos después de añadir el
sustrato (1 comprimido de fosfato de p-nitrofenilo,
Sigma) en 12 ml de disolución de sustrato, pH 9,5 (0,1 M de base
Tris, 0,1 M de NaCl, 5 mM de MgCl_{2}), las reacciones se
detuvieron usando 50 \mul/pocillo de NaOH 1 M, y se midieron a
405 nm. En todas las placas se incluyeron tres patrones de
laboratorio. Las variaciones entre ensayos e intraensayos fueron
menores que 10%. El nivel de detección de suPAR fue 0,03 ng/ml.
Todos los análisis estadísticos se llevaron a
cabo usando el programa estadístico SSPS, Versión 10, o SAS. Para
comparaciones entre grupos, se usó la prueba de la U de
Mann-Whithey o la prueba de la t de Student. Se
evaluó la probabilidad de que suPAR prediga TB activa usando un
modelo de regresión logística. Todos los ensayos de probabilidad se
llevaron a cabo como ensayos de relación de probabilidad. La
diferencia entre las curvas de Kaplan-Meier se
analizó mediante la prueba de rangos logarítmicos. La capacidad de
suPAR sérico para predecir la mortalidad en el contexto de otros
marcadores de pronóstico conocidos se evaluó formalmente usando el
modelo de peligros proporcionales de Cox. Todos los ensayos se
llevaron a cabo como ensayos de relación de probabilidad parcial.
El modelo estadístico permitió la relación distinta de lineal de
suPAR con la mortalidad. La relación lineal fue suficiente. Se usó
un nivel de significancia de 5%. El análisis de regresión de Cox se
llevó a cabo desde el tiempo de la inclusión hasta la terminación
del tratamiento o la eliminación debido a muerte (N = 30),
comenzando desde la guerra de Guinea Bissau (6 de junio de 1998) (N
= 50), o pérdida de seguimiento debido a que el paciente se mudó
nuevamente a las áreas rurales (N = 23). Los dieciséis pacientes
que recibieron tratamiento contra TB en el momento del alistamiento
no se incluyeron en el análisis de supervivencia, puesto que el
tratamiento puede haber afectado a su nivel de suPAR.
Independientemente del estado del HIV, los pacientes infectados de
forma dual (positivos tanto a HIV-1 como a
HIV-2) se incluyeron en los análisis como positivos
a HIV-1, puesto que se ha encontrado que los
individuos infectados en forma dual tienen el mismo riesgo y
gravedad de infección a TB que los individuos infectados con
HIV-1.
A todas las personas incluidas por los doctores
a cargo del estudio se les ofreció asistencia psicológica previa y
posterior para tanto el resultado de HIV como la enfermedad de TB. A
los sujetos se les informó por escrito en portugués y verbalmente
en su propia lengua antes de ser alistados en el estudio. Se obtuvo
una autorización por escrito de todos los pacientes. El estudio fue
aprobado por el Ministry of Public Health en
Guinea-Bissau, y por el Central Ethical Committee de
Dinamarca.
Los 262 individuos tuvieron un suPAR medible, y
el nivel de la mediana de suPAR fue 2,1 ng/ml (intervalo
0,66-18,7 ng/ml) en el alistamiento. No hubo
ninguna correlación entre la edad y suPAR (p = 0,9), y ninguna
diferencia en los niveles de suPAR entre hombres y mujeres (p =
0,87) (tabla 1). De los 262 individuos, ya se sabía que 16 tenían
TB activa y estaban bajo tratamiento apropiado en el momento del
alistamiento. De los 244 individuos restantes, la TB activa se
diagnosticó en 182, que entraron consiguientemente en el régimen de
tratamiento de 8 meses. Entre estos, se encontraron positivos a 84
mediante microscopía directa de esputo (esputo positivo a
TB), y 35 casos fueron negativos en microscopía directa pero
positivos en cultivo (cultivo positivo a TB), y 63 fueron
diagnosticados en los terrenos clínico y radiológico (TB
supuesta). A los 64 restantes se diagnosticó neumonía o
bronquitis (negativo a TB).
Los niveles de suPAR fueron significativamente
mayores entre los pacientes positivos a TB (esputo positivo a
TB, cultivo positivo a TB, y TB supuesta, N = 182) en
comparación con los pacientes negativos a TB (N = 64) (p
< 0,001) (Figura 1). Los niveles de suPAR fueron elevados en los
84 esputos positivos a TB (p < 0,001), y en los 35
cultivos positivos a TB (p = 0,005), en comparación con los
64 negativos a TB. No hubo ninguna tendencia respecto a
niveles de suPAR elevados en los 63 casos de TB supuesta
diagnosticados, en comparación con los negativos a TB (p =
0,06). No se observó ninguna diferencia en los niveles de suPAR
entre los 16 pacientes que recibieron tratamiento antes de la
inclusión en el estudio y los negativos a TB (p = 0,72,
prueba de la t). En la figura 1 se muestran los niveles de
suPAR.
Cuando se incluyen a todos los alistados en el
estudio, hubo una probabilidad significativamente mayor de ser
diagnosticado con TB al aumentar suPAR. Esto se muestra como una
gráfica de probabilidad en la Figura 2a. Debido a las dificultades
para diagnosticar los individuos con esputo negativo, el análisis
más interesante fue si suPAR posee valor de diagnóstico en los 162
individuos con esputo negativo, es decir, cuando se excluyen los 84
esputos positivos a TB. Se encontró que hubo un mayor riesgo
de ser diagnosticado como cultivo positivo a TB o TB
supuesta al aumentar los niveles de suPAR (p = 0,001, Figura
2b). Debido a que la infección por HIV-1 afecta al
nivel de suPAR, se realizó el mismo análisis para los 130 individuos
negativos a HIV-1 (76 pacientes con cultivo
positivo a TB o También supuesta negativos a
HIV-1 y 54 pacientes negativos a TB
negativos a HIV-1), y se encontró la misma
asociación entre la proba-
bilidad creciente de ser diagnosticado como positivo a TB al aumentar los niveles de suPAR (p = 0,02, Figura 2c).
bilidad creciente de ser diagnosticado como positivo a TB al aumentar los niveles de suPAR (p = 0,02, Figura 2c).
A los pacientes se les siguió desde el momento
de la inclusión, y se trataron durante un período de 8 meses.
Treinta murieron durante el seguimiento con un nivel de la mediana
de suPAR en la inclusión de 3,26 (intervalo
1,04-18,70), que fue significativamente mayor que
entre los 232 supervivientes (mediana de suPAR de 2,12, intervalo
0,66-16,22) (p = 0,02). Entre los 119 pacientes con
TB bacteriológicamente confirmados (esputo positivo a TB y
cultivo positivo a TB), diez murieron durante el seguimiento.
Aquellos que murieron tuvieron niveles de suPAR significativamente
mayores (mediana 5,98 ng/ml, intervalo 1,3-18,3) que
los supervivientes (mediana 3,04 ng/ml (intervalo
0,9-14,7)) (Mann Whitney, p = 0,022). Entre los 63
pacientes con TB supuesta, 13 murieron durante el período de
tratamiento. El nivel de suPAR en la inclusión de los 13 que
murieron tuvo una mediana de 2,35 ng/ml (intervalo
1,0-6,6) frente a una mediana de 2,12 ng/ml
(intervalo 0,7-6,6) entre los supervivientes (p =
0,45). Entre los 64 pacientes negativos a TB, 7 murieron
durante el seguimiento, con una mediana de suPAR de 3,32 (intervalo
1,43-18,70), y 57 estaban vivos en el seguimiento,
teniendo una mediana de suPAR de 1,17 ng/ml (intervalo
0,81-16,22) (p = 0,04). Cuando se dividen los
pacientes en 4 grupos de igual tamaño basándose en el nivel de
suPAR, hubo una tendencia hacia una mayor mortalidad entre pacientes
en el cuartil de suPAR más elevado, en comparación con el cuartil
de suPAR más bajo (5/65 frente a 13165, p = 0,07) (tabla 1).
No hubo ninguna diferencia en la supervivencia
entre pacientes con TB activa (esputo con TB, cultivo con
TB o TB supuesta, n = 182) cuando se divide a los
pacientes por el valor de la mediana de suPAR (Figura 3A). Los
pacientes con más de dos veces el valor de la mediana, es decir,
pacientes que tienen un suero con una cantidad mayor de 4,2 ng de
suPAR/ml (n = 38) tuvieron un mayor riesgo de morir durante el
seguimiento, en comparación con los pacientes que tuvieron valores
de suPAR por debajo de 4,2 ng/ml (N = 144) (MR = incremento de 3,05
por ng de suPAR, p = 0,007), Figura 3B.
Se encontró que 47 estaban infectados por
HIV-1 o estaban infectados de forma dual en el
momento de la inclusión. Los infectados por HIV-1
tuvieron un nivel de mediana de suPAR de 2,34 ng/ml (intervalo
0,92-18,7). De los 47 pacientes, 13 murieron
durante el seguimiento (suPAR de mediana 3,43, intervalo
1,15-18,70). Estos pacientes tuvieron un valor de
suPAR significativamente mayor que los 34 pacientes vivos al
abandonar el estudio (mediana de suPAR de 2,05, intervalo
0,92-6,88) (p = 0,015, Mann Whitney). El análisis de
regresión de Cox en los infectados con HIV-1 mostró
que suPAR estaba significativamente asociado con la supervivencia en
este grupo (p < 0,001, MR = 1,53). Hubo una diferencia similar
en los niveles de suPAR entre los 66 individuos infectados por
HIV-2 (mediana de suPAR de 2,44, intervalo
0,91-18,30), de los cuales 7 murieron durante el
seguimiento (mediana de suPAR de 3,32, intervalo
1,04-18,3), 59 sobrevivieron (mediana de suPAR de
2,44, intervalo 0,91-14,71), aunque la diferencia
no fue significativa debido al número más pequeño de muertes (p =
0,64). No hubo ninguna diferencia significativa entre los niveles
de suPAR en pacientes con TB con o sin infección por HIV, o entre
el número de infectados por HIV-1 ó 2 entre los
diferentes grupos de diagnóstico de TB (Tabla 2).
Excluyendo los 16 pacientes que recibieron
tratamiento en el alistamiento, se siguió a 182 pacientes
diagnosticados con TB activa durante un período de 8 meses después
del inicio del tratamiento, y 23 murieron. En los análisis de
regresión de Cox univariados, los niveles de suPAR estaban
significativamente asociados con la muerte durante el tratamiento
(incremento en la relación de la tasa de mortalidad (MR) = 1,18 por
incremento de ng de suPAR, p = 0,01), como lo estaba la infección
por HIV-1 (MR = 2,66, p = 0,023) y el estado como
positivo a TB basado en los campos clínico y radiológico (TB
supuesta) (p = 0,03). Cuando se tratan a todos los pacientes
positivos a TB de forma igual independientemente de su estado de
HIV, no se encontró ningún efecto del método de diagnóstico en el
tiempo hasta la muerte cuando se tiene en cuenta el nivel de suPAR
(p = 0,43). No se encontró que ni la positividad a
HIV-2 (p = 0,63), edad (p = 0,72), sexo (p = 0,19) o
el logaritmo decimal de los recuentos de células T CD4
transformadas (p = 0,42) estaban significativamente asociados con la
supervivencia durante el período de seguimiento.
En un análisis de Cox multivariado que incluye
todos los factores significativos, todos permanecieron
significativos siendo la MR 3,9 (p = 0,003) para TB negativa
bacteriológica (TB supuesta) en comparación con los pacientes
positivos bacteriológicos a TB, MR = 2,1 (p = 0,12) para la
positividad a HIV-1 en comparación con pacientes
con TB negativos a HIV-1, y 1,28 (p < 0,001) por
incremento de ng de suPAR.
Cuando se excluyen los pacientes positivos a
HIV-1, 14 murieron entre los 149 pacientes con TB
restantes. Entre estos pacientes negativos a HIV-1
con TB activa, suPAR todavía retuvo su poder predictivo (RR = 1,14,
p = 0,05). De este modo, se observó la misma relación de
dosis/respuesta (suPAR/tiempo hasta la muerte) cuando se excluyen
los pacientes positivos a HIV-1.
Mycobacterium tuberculosis afecta las
vidas de millones de personas en el mundo, y se estima que 3
millones mueren cada año por la enfermedad. En este ejemplo se
encuentra, por primera vez, que la molécula de suPAR tiene un valor
de diagnóstico y de pronóstico en la infección por TB.
En este ejemplo, 32 por ciento de los 262
individuos que se sospecha que son positivos a TB se encontraron
positivos mediante microscopía directa. Estos esputos positivos a
TB tuvieron niveles mayores que los diagnosticados por el
cultivo (cultivo positivo a TB) o diagnosticados clínicamente
(TB supuesta). Todos estos pacientes tuvieron niveles de
suPAR mayores que los negativos a TB.
Debido a las dificultades par diagnosticar TB
activa en pacientes negativos en microscopía, una cuestión
importante en este estudio fue si suPAR puede tener valor de
diagnóstico en individuos en los cuales se sospecha que sigue
habiendo TB. Se encontró que hubo una probabilidad creciente de
pacientes de ser diagnosticados con TB activa mediante cultivo
(cultivo positivo) o mediante investigación clínica (TB supuesta)
con un nivel creciente de suPAR. Los negativos a TB se incluyeron
en el estudio en la sospecha de TB debido a síntomas relacionados,
y se consideró que tenían neumonía tras los ensayos negativos en el
examen del cultivo y clínico y se trataron con antibióticos después
de la entrada. No se sabe si el nivel de suPAR puede ser mayor entre
los negativos a TB, en comparación con un grupo de control de
individuos sanos. Sin embargo, hubo una notable diferencia entre
los negativos a TB y los grupos diagnosticados como TB activos,
indicando que la neumonía no provocaría un incrmento importante en
suPAR.
Dieciséis pacientes recibieron tratamiento
apropiado contra TB en el momento de la inclusión. El nivel sérico
de suPAR en estos pacientes fue significativamente menor que en los
pacientes diagnosticados con TB tras la inclusión, y comparable a
los negativos a TB. Esto indica que el nivel de suPAR puede caer
tras el tratamiento, y que suPAR se puede usar para monitorizar el
efecto del tratamiento.
suPAR sirvió de pronóstico para la supervivencia
en esta cohorte. Entre los esputos positivos a TB y
cultivos positivos a TB, 10 murieron durante el seguimiento,
y estos individuos tuvieron valores de suPAR significativamente
mayores en la inclusión. Usando el análisis de regresión de Cox,
suPAR estaba significativamente asociado con la supervivencia entre
los 182 pacientes a los que se les diagnosticó TB. Se ha demostrado
previamente que suPAR sirve de pronóstico para la progresión de la
enfermedad por HIV-1, y esta observación se confirmó
en este estudio. Cuando se excluyen los positivos a
HIV-1 y los positivos de forma dual, suPAR todavía
siguió asociado significativamente con la supervivencia entre los
pacientes con TB activa. Otro factor significativamente asociado
con la supervivencia en el análisis de regresión de Cox es el tipo
de diagnóstico de TB. Los pacientes diagnosticados con TB activa
mediante examen clínico solamente (TB supuesta) tuvieron un mayor
riesgo de morir durante el seguimiento, lo que probablemente es
debido al tratamiento retrasado. La observación del nivel más
elevado de suPAR en los esputos positivos a TB seguidos de
los cultivos positivos a TB y los individuos negativos a TB
en los ensayos bacteriológicos (TB supuesta) indicó que suPAR
puede correlacionarse con la carga bacteriana de la tuberculosis.
Puesto que es probable que niveles incrementados de suPAR reflejen
un incremento de la expresión de uPAR sobre la superficie celular,
los hallazgos sugieren que suPAR y/o uPAR pueden estar implicados
en la patogénesis de la infección por tuberculosis. La interacción
inicial entre M. tuberculosis y macrófagos hospedantes es
una primera etapa importante en la patogénesis de la tuberculosis.
Esta etapa está mediada por receptores de monocitos/macrófagos
específicos y ligandos presentes en la superficie de TB. Se ha dado
a conocer que varios receptores de macrófagos median la unión a M.
tuberculosis, incluyendo los receptores del complemento CR1, CR3 y
CR4, el receptor de glucano, el receptor de manosa, el receptor de
lipopolisacáridos, y los receptores de tipo toll. Sin embargo, no se
ha demostrado que ninguno de estos receptores sea esencial para la
interacción macrófago/M. tuberculosis. La implicación de CR3 en la
entrada de la tuberculosis se ha aclarado además por el uso de
modelos de ratones carentes de CD11b, que muestran una reducción de
60% en la infecciosidad de la tuberculosis pero ningún efecto sobre
la replicación intracelular. Se ha demostrado que uPAR se compleja
con CR3 (mac-1, CD11b/CD18). uPAR se une a CR3 a
través de CD11b (revisado en ^{14}), dando como resultado la
activación del complejo. De este modo, una posible razón para el
papel de diagnóstico y de pronóstico de suPAR en TB podría ser
debida a la implicación y potenciación de la entrada de la
tuberculosis en la célula uPAR/CD11b. Otra posibilidad es que uPAR
aumente por la replicación intracelular de TB y refleje de ese modo
el número de células infectadas. Aparte de la infección por HIV y
ahora por la tuberculosis, el nivel sérico de suPAR es también un
marcador de pronóstico para la supervivencia global en pacientes
que sufren cáncer ovárico y colorrectal, y para la respuesta a
terapia en leucemia^{15, 11}. Otro posible elevador de suPAR es
Borrelia burgdorferi, puesto que un reciente estudio in
vitro mostró niveles incrementados de uPAR en células
monocíticas tras la infección. Para ser capaces de comparar datos
entre estudios individuales en cáncer, infección por TB y por HIV,
es necesario desarrollar un ensayo de suPAR reproducible y
comercialmente disponible. El ensayo usado en este estudio es
comparable al ensayo usado en un estudio previo de suPAR como
factor de pronóstico en la progresión de HIV^{7} y descrito en el
estudio de Stephens et al.^{16}.
En conclusión, se encuentra que suPAR es elevado
en pacientes con TB activa, y que los pacientes con un nivel
elevado de suPAR tienen un mayor riesgo de morir durante el período
de tratamiento.
El nivel sérico de receptor de urocinasa soluble
es elevado en pacientes con tuberculosis, predice la mortalidad
durante el tratamiento y se puede usar para monitorizar la eficacia
del tratamiento contra TB.
Investigar si el nivel sérico del receptor del
activador de plasminógeno de tipo urocinasa soluble (suPAR) posee
información de pronóstico en individuos infectados con
Mycobacterium tuberculosis durante el período de
tratamiento, y si se puede usar para monitorizar la eficacia del
tratamiento contra TB.
suPAR se midió mediante ELISA en 262 individuos
en el momento del alistamiento en una cohorte basada en la sospecha
de tuberculosis activa, y en 101 individuos tras 8 meses de
seguimiento. Los 262 individuos son los mismos que los investigados
en el Ejemplo 1.
Los niveles de suPAR fueron elevados en
pacientes con TB activa en comparación con individuos negativos a
TB (p < 0,001). Los niveles de suPAR fueron los más elevados en
pacientes positivos para TB en microscopía directa (N = 84, mediana
de suPAR de 3,17 ng/ml, p > 0,001), seguido de los pacientes
negativos en microscopía directa pero positivos en cultivo (N = 35,
mediana de suPAR de 2,41 ng/ml, p = 0,005) y por pacientes
diagnosticados en terrenos clínicos (N = 63, mediana de suPAR de
2,13, p = 0,06), en comparación con 64 individuos negativos a TB
(mediana de suPAR de 1,73 ng/ml). Durante el período de tratamiento
de 8 meses, 23 casos de TB murieron. En un modelo de Cox
multivariado que controla el estado de HIV, edad, sexo, recuento de
CD4 y tipo de diagnóstico de TB, el incremento de mortalidad por ng
de suPAR fue 1,25 (95% Cl, 1,12-1,40). Después del
tratamiento, los niveles de suPAR habían disminuido hasta los
niveles de individuos negativos a TB.
Conclusiones: los niveles de suPAR son elevados
en pacientes con TB y están asociados con la mortalidad. Además,
suPAR es un marcador de la eficacia del tratamiento.
Los sujetos incluidos en este estudio son los
mismos que en el ejemplo 1. La diferencia entre el estudio descrito
aquí y el del ejemplo 1 es que este estudio investiga el papel de
suPAR como marcador durante los 8 meses de terapia.
Además, durante el período de tratamiento, 30
pacientes murieron. Después de 8 meses de seguimiento, se extrajo
una segunda muestra de sangre. De los 262 individuos incluidos en
este estudio, 101 individuos estaban disponibles para una segunda
toma de muestra.
Para comparaciones entre grupos, se usó la
prueba de la U de Mann-Whithey, excepto para
comparaciones entre niveles de suPAR pre- y
post-tratamiento frente a TB, en cuyos casos se
usaron las pruebas de la t de muestras pareadas. La
diferencia entre las curvas de Kaplan-Meier se
analizó mediante la prueba de rangos logarítmicos. La capacidad de
suPAR sérico para predecir la mortalidad, dando cuenta de otros
marcadores de pronóstico conocidos, se evaluó formalmente usando un
modelo de peligros proporcionales de Cox, que permite relaciones no
lineales entre suPAR y la mortalidad. Todos los ensayos se
realizaron como ensayos de relación de probabilidad parcial. El
análisis de tiempo hasta la muerte se llevó a cabo desde el momento
de la inclusión hasta el primero de los sucesos: terminación del
tratamiento, 8 meses de seguimiento, muerte (N = 30), comenzando
desde la guerra en Guinea Bissau que influyó en el tratamiento (N =
50), o pérdida de seguimiento debido a que el paciente se mudó
nuevamente a las áreas rurales (N = 23). Los dieciséis pacientes que
recibieron tratamiento contra TB en la inclusión no se incluyeron
en el análisis de supervivencia puesto que el tratamiento puede
haber afectado a su nivel de suPAR. En cuanto al estado del HIV, los
pacientes infectados dualmente (tanto positivos a
HIV-1 como a HIV-2, N = 19) se
incluyeron en los análisis como positivos a HIV-1,
puesto que se ha encontrado que los individuos infectados en forma
dual tienen el mismo riesgo y gravedad de infección por TB que los
individuos infectados con HIV-1. Se llevaron a cabo
análisis estadísticos usando el programa SSPS, Versión 10, o SAS
versión 8.1. Para la significancia, se usó un nivel de 5%.
Todos los sujetos recibieron información escrita
en portugués e información verbal dada en su lengua étnica local,
antes del alistamiento. Se obtuvo una autorización por escrito de
todos los pacientes. El estudio fue aprobado por el Ministry of
Public Health en Guinea-Bissau, y por el Central
Ethical Committee de Dinamarca.
Los 262 individuos tuvieron suPAR medible, y el
nivel de la mediana de suPAR fue 2,1 ng/ml (intervalo
0,66-18,7 ng/ml) en el alistamiento. No hubo
ninguna correlación entre la edad y suPAR (p = 0,9), o en los
niveles de suPAR entre hombres y mujeres (p = 0,87) (tabla 1). De
los 262 individuos, ya se sabía que 16 tenían TB activa y estaban
bajo tratamiento apropiado en el momento del alistamiento. De los
246 individuos restantes, se diagnosticó TB activa en 182, los
cuales entraron consiguientemente en el régimen de tratamiento de 8
meses. Entre estos, 84 fueron esputos positivos a TB, 35
casos fueron cultivos positivos a TB, y 63 fueron
diagnosticados TB supuesta. A los 64 restantes se les
diagnosticó como negativos a TB. Durante el período de
tratamiento, 30 casos murieron, y de estos 7 fueron negativos a TB
(Tabla 1).
Los niveles de suPAR fueron significativamente
mayores entre los pacientes positivos a TB (esputo positivo a
TB, cultivo positivo a TB y TB supuesta, N = 182)
en comparación con los pacientes negativos a TB (N = 64, p
< 0,001). Parece que el nivel de suPAR se correlaciona con el
número de micobacterias en el esputo, puesto que se encontraron los
niveles más elevados de suPAR entre los 84 pacientes con esputo
positivo a TB (p < 0,001), seguido de los pacientes con
cultivo positivo a TB (p < 0,001), y los pacientes con
TB supuesta (p = 0,06), cuando se compara con los niveles de
suPAR encontrados en los 64 negativos a TB como se muestra
en la figura 1. No se observó ninguna diferencia en los niveles de
suPAR entre los 16 pacientes que recibieron tratamiento contra TB
en el momento del alistamiento y los negativos a TB (p =
0,72). En la tabla 1 se muestra el agrupamiento de pacientes en
cuartiles según el nivel de suPAR.
No hubo ninguna diferencia significativa en la
tasa de supervivencia entre pacientes con TB activa (esputo de
TB, cultivo de TB, o TB supuesta, n = 182) cuando
se divide a los pacientes por el valor de la mediana de suPAR
(Figura 3A). Los pacientes con suPAR elevado (más de dos veces el
valor de la mediana, es decir, los pacientes que tienen más de 4,2
ng de suPAR/ml de suero (n = 38)) murieron de forma
significativamente más rápida tras el alistamiento, en comparación
con los pacientes por debajo de 4,2 ng/ml (N = 144, p = 0,007),
Figura 3B.
Excluyendo los 16 pacientes que ya habían
comenzado el tratamiento en el momento del alistamiento, se siguió
a 182 pacientes diagnosticados con TB activa durante un período de
hasta 8 meses después del inicio de tratamiento; 23 de estos
murieron. En los análisis de regresión de Cox univariados, los
niveles de suPAR estaban significativamente asociados con la muerte
durante el tratamiento, siendo el incremento en la relación de la
tasa de mortalidad (MR) 1,18 por incremento de ng de suPAR (95% Cl:
1,06-1,30), como lo estaba la infección por
HIV-1 (MR = 2,71, 95% Cl 1,16-6,29)
y el estado como positivo a TB diagnosticado en los campos clínico y
radiológico (TB supuesta) (MR = 2,48, 95% Cl:
1,09-5,66). Cuando se trató a todos los pacientes
positivos a TB por igual independientemente de su estado del HIV, y
ajustando el nivel de suPAR, no se encontró ningún efecto del método
diagnóstico sobre la mortalidad (p = 0,43). No se encontró que
ninguno de la positividad a HIV-2 (p = 0,63), edad
(p = 0,72), sexo (p = 0,19) o el logaritmo decimal de los recuentos
de células CD4 transformadas (p = 0,42) estaban significativamente
asociados con la supervivencia.
Todos los factores que se encontró que eran
significativos en los análisis univariados siguieron siendo
significativos en el análisis de Cox multivariado. Controlando para
el diagnóstico de TB (TB supuesta en comparación con los
casos de TB positivos en microscopía directa o en cultivo, MR = 3,5
(95% Cl: 1,39-8,67)), y el estado de HIV (positivo
a HIV-1 en comparación con pacientes con TB
negativos a HIV-1, MR = 2,5 (95% Cl:
1,07-5,99)), el incremento en la mortalidad por ng
de suPAR fue MR = 1,25 (95% Cl: 1,12-1,40).
Cuando se excluye a los individuos positivos a
HIV-1, 14 murieron entre los 149 paciente con TB que
quedan durante el seguimiento. Entre estos 149 pacientes con TB,
suPAR siguió reteniendo poder predictivo (MR = 1,14, 95% Cl:
1,00-1,31). De este modo, la asociación positiva
entre suPAR y la muerte fue similar en sujetos positivos a
HIV-1 y negativos a HIV-1.
Se ha demostrado previamente que suPAR es un
factor de pronóstico potente para la progresión del
HIV-1. En el presente estudio, se encontró que 47
de los 262 individuos sospechosos de tener TB eran
HIV-1 positivos en el momento de la inclusión, y 13
murieron. El análisis de regresión de Cox univariado en los
infectados por HIV-1 mostró que suPAR estaba
asociado de forma significativamente negativa con la supervivencia
(n = 47, MR = 1,53 por ng de incremento de suPAR, 95% Cl:
1,22-1,92). Ningún otro parámetro (edad, sexo,
diagnóstico de TB o recuento de CD4) estaba significativamente
asociado con la supervivencia en este subgrupo. Sesenta y seis de
los 262 individuos fueron positivos a HIV-2 en la
inclusión (sin incluir los infectados de forma dual), de los cuales
siete murieron durante el seguimiento. Hubo un efecto similar de
suPAR sobre la supervivencia (n = 66, MR = 1,13, 95% Cl:
0,97-1,32), aunque la diferencia no fue
significativa debido al número más pequeño de muertes. Ni la edad,
sexo, diagnóstico de TB o recuentos de CD4 estaban
significativamente asociados con la supervivencia en el grupo de
HIV-2. No hubo diferencias significativas en los
niveles de suPAR en pacientes con TB con o sin infección por HIV, o
entre individuos infectados por HIV-1 y -2 en los
diferentes grupos de diagnóstico de TB.
De los 262 individuos incluidos en este estudio,
estuvieron disponibles muestras de suero procedentes de 101
pacientes después de 8 meses de tratamiento. En la inclusión, a 45
se les diagnosticó como esputo positivo a TB, 15 como
cultivo positivo a TB, 22 como TB supuesta, 6
recibieron tratamiento en el alistamiento, y 13 como negativos a
TB. En la figura 3 se muestran los niveles de suPAR previos a y
posteriores al tratamiento para estos individuos. El tratamiento
estaba asociado con una disminución significativa en suPAR entre los
45 esputo positivo a TB (95% Cl: -2,07 - -0,56 ng/ml) y una
disminución no significativa para los 15 cultivo positivo a
TB (95% Cl: -2,12 - 0,24 ng/ml). No se observó ninguna
diferencia en los valores de suPAR previos a y posteriores al
tratamiento para TB supuesta (95% Cl: -0,81 - 0,84) o para
pacientes que recibieron tratamiento en el alistamiento (95% Cl:
-3,3 - 3,1). Se observó un incremento en suPAR tras el tratamiento
entre los 13 negativos a TB (3 positivos a
HIV-2 y 10 negativos a HIV (p = 0,041, 95% Cl:
3,31-1,33 ng/ml). El incremento fue más prominente
entre los tres positivos a HIV-2. Los niveles de
suPAR posteriores al tratamiento no difirieron entre los diferentes
grupos de diagnóstico (figura 3).
Mycobacterium tuberculosis afecta a las
vidas de millones de personas en el mundo, y se estima que 2
millones mueren por la enfermedad cada día. En el presente ejemplo,
se encontró que los niveles de suPAR eran elevados en pacientes con
TB, se correlacionan con el tipo de diagnóstico de TB, y posee un
valor de pronóstico. Además, el tratamiento estaba asociado con
niveles reducidos de suPAR en suero.
Se encontró que suPAR era significativamente
mayor entre los casos de TB en comparación con los casos que no
eran de TB. Además, los niveles más elevados de suPAR se encontraron
en los casos de TB positivos en microscopía directa, seguido de los
casos negativos en microscopía directa pero positivos en cultivo, y
después los casos de TB negativos tanto en microscopía directa como
en cultivo. Dado que el cultivo es un método más sensible que la
microscopía directa diagnosticando la presencia de AFB en esputo,
estos resultados pueden indicar que el nivel de suPAR en sangre se
correlaciona con el número de bacterias en esputo y
consiguientemente la carga bacteriana en los bronquios. Los niveles
aumentados de suPAR pueden ser un resultado de la movilización de
macrófagos en los bronquios. La adherencia y migración de monocitos
implica una interacción funcional entre uPAR e integrinas, como
también es apoyado por estudios en ratones carentes de uPAR {May,
Kanse, et al. 1998 mayo 1998/id} La interacción
uPAR/integrina mejor descrita es aquella entre uPAR y CD11b/CD18
(receptor 3 de complemento o MAC-1) {Simon, Rao,
et al. 1996 14/id}. Después de que se presentó esta patente,
Juffermans y colaboradores mostraron el aumento concurrente de uPAR
y CD11b durante endotoxemia experimental usando LAM, un componente
de la pared celular de M. tuberculosis^{17}. De forma
interesante, también se ha mostrado que CD11b/CD18 media la
adhesión de M. tuberculosis a macrófagos^{18}, sugiriendo
que TB puede explotar este aumento para adherirse e infectar a
macrófagos reclutados. De este modo, se propone que esto puede ser
una nueva diana para la interacción con M. tuberculosis.
Usando el análisis de regresión de Cox, se
encontró que suPAR está significativamente asociado con la
supervivencia entre los 182 pacientes diagnosticados con TB. En
Guinea-Bissau, la prevalencia del HIV es mayor entre
los casos de TB en comparación con controles sanos. Se ha mostrado
previamente que suPAR es un potente marcador de pronóstico para la
progresión de la enfermedad por HIV-1^{11}, y esta
observación se confirmó en le presente estudio. Sin embargo,
incluso cuando se excluyen los infectados por HIV-1,
suPAR todavía siguió estando significativamente asociado con la
supervivencia entre los pacientes con TB activa.
Ocho meses de tratamiento condujeron a una
disminución significativa de los niveles de suPAR, dando como
resultado resultados similares entre aquellos diagnosticados con o
sin TB en la inclusión. También, dieciséis pacientes ya estaban
recibiendo tratamiento apropiado contra TB en el momento de la
inclusión. Los niveles séricos de suPAR en estos pacientes fueron
significativamente menores que en los pacientes diagnosticados con
TB tras la inclusión, y comparables con los negativos a TB.
Estas observaciones muestran que la medida de suPAR puede ser una
herramienta útil para monitorizar la respuesta al tratamiento en
pacientes con TB.
suPAR es elevado y de valor de pronóstico para
el resultado en la infección por HIV-1. Este estudio
ha mostrado que el nivel sérico de suPAR es elevado en pacientes
con TB, y que el nivel previo al tratamiento está positivamente
asociado con la mortalidad en pacientes que reciben tratamiento para
TB.
El nivel sérico de receptor de urocinasa soluble
(suPAR) es elevado en pacientes con tuberculosis activa y el más
alto en pacientes que tienen esputo positivo en análisis
microscópico. Se encontró que el suPAR estaba positivamente
asociado con la mortalidad en pacientes con TB durante el
tratamiento, incluso cuando se excluyen los coinfectados por
HIV-1, para los cuales se sabe que suPAR es un
marcador de pronóstico muy potente. Tras el tratamiento, los
pacientes con esputo positivo tuvieron niveles de suPAR
significativamente menores, sugiriendo que suPAR se podría usar
para monitorizar la eficacia del tratamiento contra TB.
\vskip1.000000\baselineskip
El nivel plasmático del receptor del activador
de plasminógeno de tipo urocinasa soluble es elevado en pacientes
con bacteriemia por Streptococcus pneumoniae, y posee un
potente valor de pronóstico.
Streptococcus pneumoniae (S.
pneumoniae) es el agente principal de la neumonía adquirida en
comunidad, y en alto grado está asociado con bacteriemia. La
incidencia anual de neumonía se estima que es de 1 a 12 por 1000 en
la población de países desarrollados. La bacteriemia neumocócica
oscila de 9 a 18 por 100.000 por año. La mortalidad de la
bacteriemia neumocócica oscila desde 17% hasta 36%, con la mayor
mortalidad en los ancianos.
El receptor del activador de plasminógeno de
tipo urocinasa (uPAR/CD87) es expresado en diferentes tipos
celulares, incluyendo neutrófilos, linfocitos, macrófagos, células
endoteliales y células malignas.
Es bien conocido que uPAR está implicado en
numerosas funciones biológicas. uPAR y su ligando el activador de
plasminógeno de tipo urocinasa (uPA) están implicados en la
conversión de plasminógeno en plasmina. Además, uPAR se une a
\beta-integrinas, así como señala el reclutamiento
de células inflamatorias^{10}. En la patogénesis del cáncer, uPA
y uPAR juegan un papel clave en la invasión tisular por la
degradación de la matriz extracelular. uPAR se puede escindir de la
superficie celular mediante un número de proteasas, tales como
quimiotripsina, fosfolipasa C y uPA^{19}. La escisión proteolítica
de uPAR a partir de la superficie celular libera una forma activa
quimiotáctica de suPAR. Como alternativa, uPAR es liberado/segregado
desde la superficie celular sin proteolisis.
Recientemente, se ha dado a conocer una fuerte
correlación entre el estado mórbido progresivo de la infección por
HIV-1 y suPAR elevado, sugiriendo el uso de suPAR
como un marcador de pronóstico. Finalmente, como se muestra en esta
solicitud de patente, los pacientes con tuberculosis pulmonar tienen
niveles séricos incrementados de suPAR.
El posible papel de suPAR y uPA en las
respuestas inmunitarias frente a otras enfermedades infecciosas
sigue siendo incierto. Los ratones carentes de genes que carecen de
uPAR han mostrado un reclutamiento reducido de neutrófilos
pulmonares y una mortalidad incrementada frente a la infección con
S. pneumoniae, en comparación con ratones de tipo
salvaje^{20}. El ácido lipotecoico de Streptococcus
pyogenes facilita el aumento de uPAR monocítico in
vitro. También se ha dado a conocer el aumento de uPAR por
monocitos inducidos por proteínas de la superficie de Borrelia
burgdorferi^{21}.
El nivel sérico de la prt YKL-40
se ha descrito como elevado durante la neumonía, y como un factor de
pronóstico independiente en pacientes bacteriémicos neumocócicos.
Aquí se investiga si la bacteriemia por S. pneumoniae afecta
al nivel plasmático de suPAR. Por primera vez, se da a conocer que
suPAR es elevado y posee un valor de pronóstico en pacientes con
bacteriemia por S. pneumoniae.
Pacientes. Entre octubre de 1999 y junio de
2001, se incluyeron adultos (18 años o mayores) con bacteriemia por
S. pneumoniae admitidos en uno de cinco hospitales
universitarios Aalborg, Aarhus, Odense, Hvidovre o Rigshospitalet)
en Dinamarca. En la inclusión (admisión hospitalaria) se extrajeron
muestras de sangre, y se recogieron de forma prospectiva datos
clínicos durante el tiempo de admisión, como se describe (G.
Kronborg, N. Weis, H. O. Madsen, S. S. Pedersen, C. Wejse, H.
Nielsen, P. Skinhøj, P. Garred, presentado para publicación). Se
extrajo sangre de un grupo de 30 individuos sanos (trabajadores del
laboratorio) para comparación (grupo de control).
Se incluyó un total de 141 pacientes, 77 mujeres
y 64 varones. La edad media de los pacientes fue 64 años, con un
intervalo de 20-99 años. Sesenta y seis por ciento
de los pacientes tuvieron una enfermedad subyacente, y la neumonía
fue el foco más habitual de infección (n = 116). Veinticuatro
pacientes murieron en el hospital (tasa de mortalidad de casos =
17%). En la Tabla 3 se dan las características de referencia de los
pacientes. Todos los pacientes recibieron un tratamiento
antibiótico apropiado desde su admisión o cuando el cultivo de
sangre se hizo positivo. El estudio fue aprobado por los comités
éticos locales.
ELISA. Placas Maxisorb (Nunc, Roskilde,
Dinamarca) se revistieron e incubaron toda la noche a 4ºC con 100
\mul de anticuerpo monoclonal murino anti-suPAR 2
\mug/ml frente a suPAR humano, diluido en tampón de revestimiento
(15,1 mM de Na_{2}CO_{3}, 35,7 mM de NaHCO_{3}, pH 9,6). Las
placas se lavaron con tampón (PBS, Tween 20 al 0,1%) y se
bloquearon usando SuperBlock (Pierce Chemicals) diluido 1:1 en PBS.
Se añadieron muestras de plasma diluidas en tampón de dilución (7,3
mM de KH_{2}PO_{4}, 50,7 mM de Na_{2}HPO_{4}, 0,1 M de
NaCl, 0,5% de rojo fenol, pH 7,4), y las placas se incubaron toda la
noche a 4ºC. El suPAR unido se detectó usando 100 \mul de
anticuerpo policlonal de conejo anti-suPAR humano
1,0 \mug/ml (un regalo generoso de la doctora Gunilla
Hoyer-Hansen) y anticuerpo policlonal
anti-conejo de ratón conjugado con fosfatasa
alcalina (Sigma, St. Louis, MO, USA), diluido 1:2000. Cada etapa
estuvo precedida por un lavado de 6 veces con tampón de lavado, los
anticuerpos se diluyeron en tampón de dilución y las placas se
incubaron 1 h a 37ºC. El sustrato (1 comprimido de fosfato de
p-nitrofenilo (Sigma, St. Louis, MO, USA), en 12 ml
de 0,1 M de base Tris, 0,1 M de NaCl, 5 mM de MgCl_{2}, pH 9,5)
se añadió a los pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante
30 min. Las reacciones se detuvieron añadiendo 50 \mul de NaOH 1 M
por pocillo, y la absorbancia se leyó a 405 nm. Todas las medidas
de ELISA se llevaron a cabo por duplicado. YKL-40 se
midió mediante ELISA.
Estadística. Las comparaciones entre grupos se
realizaron con la prueba de la U de Mann Whitney. suPAR como
marcador de pronóstico se analizó usando análisis de regresión
logística. Un valor de p por debajo de 0,05 se consideró como
significativo. Todos los análisis se llevaron a cabo usando el
software SPSS (SPSS, Chicago, II, USA).
suPAR es elevado en pacientes bacteriémicos
neumocócicos. El nivel plasmático de suPAR fue medible en las 141
muestras, con un valor de la mediana de 5,5 ng/ml (intervalo
2,4-21,0 ng/ml). El nivel de la mediana de suPAR en
el grupo de control fue 2,6 ng/ml (intervalo 1,5-4,0
ng/ml). Los niveles de suPAR en los pacientes baceriémicos
neumocócicos fue significativamente mayor que en los controles sanos
(Fig. 5A, p = 0,001).
suPAR predice el resultado de la infección. La
división de los pacientes en un grupo que sobrevive a la infección
(n = 117) y un grupo de pacientes en los que la infección terminó
con muerte (n = 24) mostró niveles de suPAR significativamente
mayores en el último grupo (Fig. 5B; p = 0,0001). De los pacientes
muertos, el 79% (n = 19) tuvo niveles de suPAR por encima de la
mediana de 5,5 ng/ml.
Los parámetros clínicos de importancia de
pronóstico en términos de muerte debido a la infección fueron, como
se describe (G. Kronborg et al., presentado para
publicación): síntomas cerebrales (confusión, inconsciencia) en el
momento de la admisión (p = 0,03), hipotensión (p = 0,047) e
insuficiencia renal (p = 0,002); véase la Tabla 1. El nivel de
suPAR fue significativamente elevado en pacientes con hipotensión (p
= 0,0001) e insuficiencia renal (p = 0,0001). suPAR también fue
elevado en el grupo de alcohólicos crónicos (p = 0,0001). Las
enfermedades subyacentes no estuvieron significativamente asociadas
con un resultado mortal de bacteriemia neumocócica, excepto por el
alcoholismo (p = 0,04).
suPAR está correlacionado con
YKL-40, pero no con CRP. YKL-40 es
una lectina segregada desde neutrófilos y macrófagos (25). Cuando
se comparan los niveles de suPAR con los niveles de
YKL-40 (n = 89), se encuentra una fuerte
correlación entre suPAR e YKL-40 (coeficiente de
correlación de rangos de Spearman: 0,70, p=0,0001).
La mayoría de los pacientes midieron su nivel de
CRP. No hubo ninguna correlación entre los niveles de suPAR y los
niveles de CRP (n = 131). Los niveles elevados de CRP no fueron un
pronóstico de muerte.
suPAR es un marcador de pronóstico
independiente. En un análisis multivariado de regresión logística
(Tabla 3) que incluye todos los parámetros que se encuentra que son
significativos en el análisis univariado (síntomas cerebrales,
ventilación mecánica, tratamiento de hipotensión, insuficiencia
renal, abuso de alcohol e YKL-40), sólo suPAR
siguió estando significativamente asociado con la muerte. Los
pacientes con suPAR plasmático por encima de 10 ng/ml tuvieron una
tasa de mortalidad (MR) de 13 (p = 0,04) y un incremento de 1,31 por
ng de suPAR (95% CI: 1,10-1,57), oscilando suPAR
desde 2,4 hasta 21 ng/ml.
En este estudio, se demuestra por primera vez
que los niveles de suPAR son muy elevados en pacientes con
bacteriemia neumocócica. Niveles elevados de suPAR se han detectado
previamente en pacientes con diversas formas de enfermedades
neoplásicas, así como en infección por HIV-1 y en
enfermedades pulmonares relacionadas, por ejemplo pacientes con
tuberculosis activa no tratada.
suPAR plasmático es un fuerte predictor de
muerte, con una tasa de mortalidad de incremento de 1,31 por ng de
suPAR (suPAR varió entre 2,4 y 21,0 ng/ml) en bacteriemia
neumocócica. A partir de este estudio sólo se pueden sacar
conclusiones sobre el valor de pronóstico de suPAR para pacientes
con bacteriemia neumocócica. La hipotensión, insuficiencia renal,
síntomas cerebrales, abuso crónico de alcohol e
YKL-40 plasmática elevada fueron todos de valor
pronóstico, pero sólo los niveles elevados de suPAR fueron un
predictor independiente de muerte en el análisis de regresión
logística multivariado. Se sugiere que suPAR plasmático es un nuevo
marcador de pronóstico para pacientes con infecciones
neumocócicas.
Es difícil de comparar los valores de suPAR de
los diferentes estudios debido a variaciones entre ensayos así como
también a diferencias en las condiciones clínicas de los pacientes
incluidos. Sin embargo, parece que suPAR es muy elevado en
pacientes con bacteriemia neumocócica, en comparación con controles
sanos. En un estudio de Riisbro et al., 53 pacientes con
cáncer ovárico tuvieron un nivel de mediana de suPAR de 1,3 ng/ml,
y los sujetos sanos tuvieron un nivel de mediana de 0,9 ng/ml, dando
una elevación de 44% en pacientes con cáncer. Los pacientes
neumocócicos tuvieron un incremento notablemente mayor en la mediana
de suPAR de 112% en comparación con controles sanos.
Se encuentra una estrecha correlación entre
suPAR e YKL-40. En el análisis multivariado,
YKL-40 por encima de 500 ng/ml, los síntomas
cerebrales y la hemodiálisis estuvieron asociados con MR elevada,
pero no tuvieron significancia.
Se ha dado a conocer un suPAR plasmático elevado
a partir de un grupo (n = 13) de pacientes con septicemia en la
UCI^{22}, conduciendo a especulaciones de que la secreción de
suPAR incrementa durante la inflamación aguda. Se compararon los
niveles de suPAR frente a CRP, y no se encontró ninguna relación.
Este hallazgo está apoyado por Slot et al.^{6}, quienes no
encontraron ninguna relación entre suPAR y CRP en pacientes con
enfermedades reumáticas. De este modo, este estudio encuentra una
prueba sustancial para descartar la posibilidad de que suPAR sea un
agente reaccionante de fase aguda.
La prueba del origen de suPAR plasmático sigue
siendo escasa. Sin embargo, se sabe que uPAR consiste en tres
dominios y que la escisión proteolítica entre el dominio 1 (D1) y 2
+ 3 (D2D3) crea el dominio activo quimiotáctico D2D3^{10}. La
escisión proteolítica está mediada tanto por su propio ligando, uPA,
como por diferentes proteasas, por ejemplo quimiotripsina. Se ha
usado un anticuerpo de captura de anti-uPAR
monoclonal dirigido contra el dominio 3 en los ELISA. Esto
significa que en el ensayo se detectó tanto suPAR intacto como el
dominio quimiotáctico D2D3. El suPAR plasmático elevado observado
en beteriemia neumocócica puede estar provocado por secreción
incrementada desde leucocitos. Durante la neumonía neumocócica, se
liberan citocinas y diferentes agentes quimiotácticos, y la
mortalidad incrementada está asociada con un nivel de
interleucina-6 pulmonar elevado.
\newpage
uPAR desempeña un papel importante en la
inmunidad tanto innata como adquirida. En ratones transgénicos que
carecen de uPAR, May et al.^{23} mostraron que la presencia
de uPAR es crucial para que los leucocitos se adhieran al
endotelio. Los ratones que carecen de uPAR muestran una respuesta
inmunitaria reducida frente a S. pneumoniae, con un
reclutamiento disminuido de neutrófilos al pulmón, y los ratones que
carecen de uPA tienen una respuesta inmunitaria incrementada frente
a S. pneumoniae^{20}. Estas observaciones sugieren que
uPAR es necesario para el reclutamiento de neutrófilos, pero el
mecanismo es independiente de la capacidad proteolítica. Además de
la activación de plasmina, se cree que uPAR media la interacción
célula con célula a través de integrinas, y de ese modo está
implicado en la transducción de señales. Está bien descrito que las
bacterias invasivas usan el sistema de plasmina del hospedante para
degradar la matriz extracelular, por ejemplo los estreptococos del
grupo A activan plasminógeno mediante estreptocinasa. Todavía es
necesario investigar el posible papel proteolítico de uPAR/uPA en
la migración de neutrófilos y monocitos frente a tuberculosis
y Streptococcus pneumoniae.
Las elevaciones dadas a conocer de suPAR
plasmático durante la bacteriemia pueden reflejar el aumento de uPAR
en neutrófilos, monocitos y células vasculares, e indican una mayor
actividad de neutrófilos y monocitos. En conclusión, similar a
pacientes con tuberculosis, suPAR plasmático es elevado y un
predictor independiente de muerte en pacientes con bacteriemia
neumocócica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla 3. Distribución de edades y sexo de los
141 pacientes incluidos y factores de pronóstico en bacteriemia por
S. pneumoniae. La tabla muestra la tasa de mortalidad (MR)
predicha por los diferentes factores de pronóstico. Todos los
factores en el análisis univariado de regresión logística fueron
significativos (p < 0,05). En el análisis multivariado, sólo los
niveles de suPAR por encima de 10 ng/ml siguieron siendo
significativos. Los síntomas cerebrales se definen como
inconsciencia o confusión grave en la admisión. # Los datos sólo
estuvieron disponibles para 139 pacientes. CI: Intervalo de
confianza.
\vskip1.000000\baselineskip
Determinar si suPAR tiene valor de diagnóstico
en la infección por TB, comparándolo con el análisis
microscópico.
En el estudio se incluyeron 69 pacientes
procedentes de cuatro áreas suburbanas en Bissau, la capital de
Guinea Bissau. Los criterios para la inclusión en el estudio fueron
uno o más de los siguientes síntomas y signos sin otra enfermedad
explicativa: tos persistente (> 1 mes) sin mejora con
antibióticos, fiebre constante o periódica durante más de 1 mes,
pérdida de peso, disnea, hemoptisis, sudoraciones nocturnas o
linfadenopatía. suPAR se midió en esputo procedente de 69
pacientes. Todos los pacientes se ensayaron para determinar bacilos
ácido alcohol resistentes (AFB) en microscopía directa de esputo.
suPAR se midió usando ELISA.
Los 69 individuos tuvieron suPAR medible en
esputo. La mediana de suPAR fue 24,9 ng/ml de esputo (intervalo
3,1-50,0). Nueve pacientes fueron positivos par AFB
en microscopía directa, y estos pacientes tuvieron una mediana de
suPAR de 50 ng/ml (máximo en ensayo, intervalo
9,73-50). Esto fue significativamente mayor que
entre 60 pacientes negativos para AFP en microscopía directa
(mediana de suPAR 20,3 ng/ml; intervalo 3,1-50
ng/ml), p = 0,002 prueba de Mann Whitney (Figura 6).
Este estudio muestra que pacientes positivos
para AFB tienen niveles de suPAR significativamente mayores que los
individuos negativos para AFB en microscopía directa. De este modo,
suPAR posee información de diagnóstico sobre positividad de esputo
a TB en pacientes con TB.
\vskip1.000000\baselineskip
Determinar si suPAR es medible en esputo, y si
los pacientes que reciben terapia tienen niveles de suPAR menores
que los pacientes que son positivos a TB pero no reciben
terapia.
En el estudio se incluyeron veinticinco
pacientes procedentes de cuatro áreas suburbanas en Bissau, la
capital de Guinea Bissau. Los criterios para la inclusión en el
estudio fueron uno o más de los siguientes síntomas y signos sin
otra enfermedad explicativa: tos persistente (> 1 mes) sin mejora
con antibióticos, fiebre constante o periódica durante más de 1
mes, pérdida de peso, disnea, hemoptisis, sudoraciones nocturnas o
linfadenopatía. suPAR se midió en esputo procedente de 25 pacientes.
Todos los pacientes tuvieron signos, síntomas y cambios
radiológicos compatibles con TB activa en el tórax y con hallazgos
de bacilos ácido alcohol resistentes (AFB) en microscopía directa
de esputo. Siete de los pacientes recibieron terapia en el momento
de la toma de muestras de esputo, y 18 pacientes recibieron terapia
después de que se tomó la muestra de esputo. El tratamiento
consistió en una fase intensa de 4 meses de Tratamiento Observado
Directamente diariamente con etambutol, isoniazida, rifampicina, y
pirazinamida, seguido de una fase de continuación durante 4 meses
con isoniazida y etambutol recogidos en el centro de salud dos veces
al mes por el paciente. Este régimen de tratamiento se recomendó
para individuos infectados con HIV por el programa de tuberculosis
nacional en Guinea-Bissau cuando se inició el
proyecto de investigación en 1996. Por razones de confidencialidad y
capacidad de comparación, los individuos infectados y no infectados
por HIV recibieron el mismo tratamiento. Además, a todos los
pacientes se les dio diariamente complejo de Vitamina B y
multivitaminas. La adhesión al tratamiento se verificó mediante
recuento de pastillas y un ensayo de orina mediante INH a los 2, 5 y
8 meses de seguimiento. Los pacientes que abandonan fueron
visitados por una enfermera y se les alentó a continuar el
tratamiento. Los fármacos específicos contra el HIV o el
tratamiento profiláctico para enfermedades relacionadas con el HIV
no estaban disponibles en Guinea-Bissau, que es uno
de los países más pobres del mundo.
18 pacientes positivos para AFB y 7 pacientes
positivos para AFB pero que reciben tratamiento. Hubo niveles de
suPAR significativamente mayores en esputo para los pacientes que no
recibieron terapia en comparación con los 7 pacientes con TB que
recibieron terapia (p = 0,024) (Figura 7).
En este estudio, se encuentra que suPAR es
medible en esputo. De forma muy importante, se muestra que los
pacientes con TB que no reciben terapia tienen niveles de suPAR
significativamente mayores, en comparación con pacientes con TB
después de que se ha iniciado la terapia. De este modo, el inicio de
la terapia da como resultado una disminución de suPAR de esputo, y
por lo tanto la medida de suPAR en esputo se puede usar para
monitorizar la eficacia del tratamiento contra TB.
\vskip1.000000\baselineskip
Determinar si suPAR es medible en el líquido
espinal.
Se obtuvo líquido espinal de 23 pacientes con
enfermedad neumocócica, y de 1 control. suPAR se midió usando
ELISA.
suPAR fue medible en líquido espinal procedente
de 24 individuos incluidos en el estudio. La mediana de suPAR fue
3,49 ng/ml de líquido espinal. El paciente de control tuvo un valor
de suPAR de 0,69 ng/ml.
Se muestra aquí que suPAR es medible en líquido
espinal. De este modo, la medida de suPAR en líquido espinal se
puede usar con fines de diagnóstico y de pronóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
El nivel de suPAR no está influido por la
infección por HCV o por terapia con alfa-interferón
y ribavirina.
Se ha mostrado que el nivel de suPAR (receptor
de urocinasa soluble) aumenta en pacientes con infección por HIV,
tuberculosis o S. pneumocócica, y que suPAR es un
marcador de pronóstico independiente muy significativo para estas
enfermedades. El objetivo de este estudio fue determinar si el nivel
de suPAR se altera por infección por HCV y su tratamiento. Si suPAR
está modulado por la infección por HCV, esto puede influir en el
valor de pronóstico de suPAR en pacientes infectados con HIV,
Tuberculosis o S. pneumocócica coinfectados con
HCV.
Se trataron cuarenta y siete pacientes positivos
a HCV con alfa-interferón y ribavirina durante 12
meses. Todos los pacientes fueron negativos a HIV y HBV. Se
extrajeron muestras de sangre inmediatamente antes de la terapia
(T0), y al final del tratamiento (T12) y 6 meses más tarde (T18).
Para comparación, se incluyeron muestras de plasma procedentes de
30 controles sanos. suPAR se midió usando ELISA, y la carga viral de
HCV mediante
RT-PCR.
RT-PCR.
Hubo una caída significativa en la carga viral
de HCV después de la terapia (prueba de la t de muestras
emparejadas, p=0,033). No hubo ninguna diferencia en los niveles de
suPAR entre pacientes antes del tratamiento (mediana de suPAR: 2,58
ng/ml (intervalo 1,15-6,01), después del tratamiento
(mediana de suPAR: 2,52 ng/ml (intervalo 1,24-6,26)
y a los 6 meses del seguimiento (mediana de suPAR de 2,43 ng/ml
(intervalo 1,21-4,98). No se observó ninguna
diferencia en suPAR entre pacientes y los controles (p=0,68). suPAR
se correlacionaba mucho en todos los puntos de tiempo
(T0-T12, T0-T18, y
T12-T18, todos p<0,001, todos r>0,67,
correlación de Pearson). Además, no hubo ninguna diferencia en
suPAR entre los 30 pacientes que responden y los 19 pacientes que no
responden
(p=0,39).
(p=0,39).
El nivel plasmático de suPAR siguió siendo
estable a lo largo del tiempo, indicando el uso posible de suPAR
como marcador serológico. El nivel de suPAR sérico no está influido
por la infección por HCV, título de HCV, por la introducción de
terapia con alfa-interferón y ribavirina, o por la
respuesta a la terapia. Estos datos sugieren que la coinfección de
HCV/HIV no influye en suPAR como marcador de pronóstico en pacientes
infectados por HIV, tuberculosis o S.
pneumocócica.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de uPAR en PBMC se correlaciona con
el nivel sérico de suPAR.
Determinar si hay una relación significativa
entre la expresión de uPAR en la superficie y el nivel sérico de
suPAR.
Se recogió sangre de 10 donantes de sangre sanos
que acuden al hospital de donaciones en Hvidovre Hospital. Se
recogió el suero, y la concentración de suPAR se midió usando ELISA.
Se recogió PBMC usando una centrifugación en gradiente Histopaq, y
se midió la expresión de CD87 usando anticuerpo R2, y un anticuerpo
secundario conjugado con FITC frente a anticuerpo de ratón, usando
análisis de FACS. Como control de la especificidad, se incluyó un
anticuerpo de control negativo idiotípico.
Todos los donantes de sangre tuvieron receptor
de uPAR medible en la PBMC, y suPAR medible en suero. Los niveles
séricos de suPAR se correlacionan significativamente con la
expresión de uPAR en la superficie (correlación de Pearson, p <
0,05) (Figura 8).
Se ha mostrado aquí una relación significativa
entre la expresión de uPAR en la superficie de las PBMC (CD87) y el
nivel sérico de suPAR. Esto está de acuerdo con las observaciones de
otros^{11}, que también encuentran que uPAR en células
circulantes se correlaciona significativamente con el nivel
plasmático/sérico de suPAR. De este modo, por lo tanto, es
razonable suponer que la expresión de uPAR en la superficie puede
ser un potente factor de pronóstico en pacientes con infección por
Streptococcus pneumoniae o Mycobacterium tuberculosis.
El CD87 (uPAR) se pudo medir usando FACS, y de ese modo añadir
información valiosa en cuanto al diagnóstico así como al estado de
progresión de los pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (15)
1. Un método de diagnóstico y/o de pronóstico de
infecciones respiratorias bacterianas en un sujeto, que comprende
las etapas de:
- (a)
- llevar a cabo una medida in vitro del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR); (ii) un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR); y/o (iii) uno o más productos de degradación de (i) o (ii), en una muestra de fluido biológico que procede de un sujeto; y
- (b)
- usar el valor obtenido de la medida para evaluar el estado del sujeto.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que la infección respiratoria bacteriana está provocada por los
patógenos Streptococcus pneumoniae o Micobacterium
tuberculosis.
3. Un método de pronóstico de infecciones
respiratorias bacterianas en un sujeto según la reivindicación 2,
en el que la infección respiratoria bacteriana es una bacteriemia
por Streptococcus pneumoniae, en el que la etapa a) se
efectúa usando ELISA, el marcador es suPAR, y la muestra de fluido
biológico es plasma.
4. Un método según la reivindicación 1 o 2, en
el que la muestra de fluido biológico es una muestra de orina, y en
el que la medida del marcador se correlaciona con la concentración
total de la muestra.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que la etapa a) se efectúa por
medio de una barrita.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que la etapa a) se efectúa usando
ELISA.
7. Un método de evaluación de la progresión del
estado de un sujeto que padece una infección respiratoria
bacteriana, que comprende las etapas de:
- (a)
- llevar a cabo una medida in vitro del nivel de uno o más marcadores en forma de (i) un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR); (ii) un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR); y/o (iii) uno o más productos de degradación de (i) o (ii), en cada una de un conjunto de muestras de fluidos biológicos que proceden de un sujeto, en el que las muestras se obtienen en diferentes puntos de tiempo; y
- (b)
- usar los valores de medida obtenidos para evaluar la progresión del estado del sujeto.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un método según la reivindicación 7, en el
que la infección respiratoria bacteriana está provocada por los
patógenos Streptococcus pneumoniae o Micobacterium
tuberculosis.
9. Un método según la reivindicación 8, en el
que el sujeto evaluado está en tratamiento.
10. Uso de un kit de ELISA para evaluar el
estado físico de un sujeto que padece una infección respiratoria
bacteriana, comprendiendo el kit: a) un agente de captura
inmovilizado capaz de capturar uno o más marcadores en forma de (i)
un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR);
y/o (ii) un receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo
urocinasa (suPAR); y/o (iii) de uno o más productos de degradación
de (i) o (ii), y b) una pareja de unión capaz de unirse a dicho
marcador, comprendiendo la pareja de unión c) un sistema de
marcado.
marcado.
11. Uso de un kit de barrita para evaluar el
estado físico de un sujeto que padece una infección respiratoria
bacteriana, que comprende: a) un agente de captura inmovilizado
capaz de capturar uno o más marcadores en forma de (i) un receptor
del activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPAR); y/o (ii) un
receptor soluble del activador del plasminógeno de tipo urocinasa
(suPAR); y/o (iii) de uno o más productos de degradación de (i) o
(ii), y b) una pareja de unión capaz de unirse a dicho marcador,
comprendiendo la pareja de unión c) un sistema de marcado.
12. Uso según las reivindicaciones 10 u 11, en
el que la infección respiratoria bacteriana está provocada por los
microorganismos patógenos Streptococcus pneumoniae o
Micobacterium tuberculosis.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
10 a 12, en el que el agente de captura es un anticuerpo
anti-marcador.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
10 a 13, en el que la pareja de unión es un anticuerpo
anti-marcador.
15. Uso según la reivindicación 10, en el que la
infección respiratoria bacteriana es una bacteriemia a
Streptococcus pneumoniae, en el que el agente de captura
inmovilizado es un anticuerpo monoclonal murino dirigido contra un
suPAR humano capaz de capturar un receptor soluble del activador del
plasminógeno de tipo urocinasa (suPAR), la pareja de unión es un
anticuerpo policlonal de conejo anti-suPAR humano, y
el sistema de marcado es un anticuerpo policlonal de ratón
anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina.
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