BRPI0210903B1 - método de diagnóstico ou prognóstico de principais patógenos bacterianos respiratórios em um indivíduo - Google Patents

Abstract

"método de diagnóstico ou prognóstico de principais patógenos bacterianos respiratórios em um indivíduo". um método de diagnóstico e/ou prognóstico de infecções bacterianas respiratórias em um indivíduo compreendendo as etapas de (a) realizar in vitro uma medição do nível de um ou mais marcadores na forma de (i) receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase (upar), (ii) receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase solúvel (supar), e/ou (iii) um ou mais produtos de degradação de (i) ou (ii), em uma amostra de fluido biológico oriundo de um indivíduo, e (b) usar o valor de medição obtido para avaliar o estado do indivíduo. especialmente infecções por streptococcus pneumoniae e mycobacterium tuberculosis podem ser diagnosticadas e/ou prognosticadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO OU PROGNÓSTICO DE PRINCIPAIS PATÓGENOS BAC-TERIANOS RESPIRATÓRIOS EM UM INDIVÍDUO".

Campo da Técnico da Invenção A presente invenção refere-se a diagnóstico e/ou prognóstico de principais patógenos bacterianos respiratórios. Em particular, refere-se a Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis. Mais particularmente, refere-se a medições da concentração de receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase solúvel (suPAR) em fluidos biológicos humanos (esputo, fluido cístico, ascite, soro, plasma, urina) como uma ferramenta de diagnóstico de infecção bacteriana respiratória bem como o prognóstico da progressão de doença.

Fundamentos da Invenção O receptor celular para uroquinase (uPAR, CD87) desempenha múltiplas funções em migração celular, adesão celular, proteólise pericelular e remodelação de tecidos. uPAR é expresso pela maioria de leucócitos incluindo, monócitos, macrófagos, neutrófilos e plaquetas. uPAR é um antíge-no de ativação em monócitos e céiuias T e células T oriundas de indivíduos infectados por HIV-1 expressam níveis elevados de uPAR1, 1994. Infecção por HIV-1 de leucócitos in vitro causa regulação para cima de expressão de superfície de célula de uPAR em um processo que parece ser coordenado temporariamente com o início de replicação viral2· uPAR pode ser desprendido da superfície celular que gera uma forma solúvel do receptor (suPAR) que carece da âncora de GPI. O mecanismo de desprendimento é pobremente entendido mas pode ocorrer por divagem hidrolítica catalisada por fosfolipase D específica de GPI da âncora de GPI. Formas solúveis de uPAR (suPAR) foram identificadas em sobrena-dantes de cultura de célula e em diversos fluidos biológicos tais como ascite de tumor, fluido cístico, soro, plasma e recentemente também em urina3.

Níveis de soro, plasma e urina de suPAR são elevados em pacientes que sofrem de diferentes tipos de câncer4, a síndrome de hemoglobi-núria noturna paroxismal5 (PNH), e em pacientes com artrite reumatóide6. O nível de plasma de suPAR é além do mais um marcador de diagnóstico para sobrevivência global em pacientes que sofrem de infecção por HIV-17. A origem celular de suPAR circulante não é conhecida. Muitas, se não a totalidade de células que expressam uPAR também desprenderam formas do receptor quando cultivadas in vitro. A fonte de suPAR de soro em excesso em pacientes com câncer foi sugerida derivar das células de câncer e/ou de macrófagos de infiltração de tumor como estas células freqüente-mente expressam altos níveis de uPAR e experiências usando-se camun-dongos xenoenxertados que portam tumores humanos demonstraram de fato que o tecido de tumor libera suPAR para a circulação e urina8.

Sumário da Invenção O problema técnico tratado pela presente invenção é prover um novo marcador para o diagnóstico e prognóstico de principais patógenos bacterianos respiratórios, em particular Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis. Um outro problema técnico tratado pela presente invenção é prover um marcador do dito tipo, que é simples e disponível para medir. A presente invenção proveu uma solução para os problemas técnicos acima, a invenção é destinada a um método de diagnóstico ou prognóstico de principais patógenos bacterianos respiratórios, tais como Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis em um indivíduo compreendendo as etapas de (a) realizar in vitro uma medição do nível de um ou mais marcadores na forma de (i) receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase (uPAR), (ii) receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase solúvel (suPAR), e/ou (iii) um ou mais produtos de degradação de (i) ou (ii), em uma amostra de fluido biológico oriundo de um indivíduo, e (b) usar o valor de medição obtido para avaliar o estado do indivíduo. A invenção é com base na supreendente descoberta que uPAR solúvel (suPAR) está presente em níveis elevados no soro, no plasma e na urina de pacientes com dois principais patógenos bacterianos respiratórios, Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis, e que o nível de suPAR é útil como um marcador de diagnóstico. Também, o nível de suPAR em indivíduos com dois principais patógenos bacterianos respiratórios, Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis é prognóstico para o desenvolvimento da doença e morte. O nível de suPAR é um fator novo e altamente diagnóstico e prognóstico, mesmo no contexto de outros fatores prognósticos conhecidos relacionados com infecção por Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis do pulmão.

Além do mais, a presente invenção é com base no reconhecimento que a quantidade de suPAR está relacionada com a quantidade de uPAR e que, portanto, as quantidades de uPAR são igualmente adequadas como indicadores de diagnóstico e de prognóstico de infecção por tuberculose.

Uma outra vantagem da invenção é que a medição de suPAR pode ser realizada usando-se, por exemplo, uma simples técnica de ELISA ou ainda um bastão e pode, portanto, prover um suplemento muito econômico, simples e rápido para as ferramentas de prognósticos atualmente usadas para pessoas infectadas com tuberculose. Assim, em países em desenvolvimento sem a possibilidade financeira para realizar os ensaios dispendiosos usados no mundo ocidental, níveis de suPAR poderíam ser usados 1) para determinar o estado de tuberculose (diagnóstico), 2) para selecionar pacientes para o tratamento (prognóstico), e 3) monitorar o progresso do tratamento.

Além do mais, a presente invenção envolve a vantagem de que enquanto níveis de suPAR podem ser medidos muito simplismente, usando-se, por exemplo, uma amostra de urina ou uma amostra de esputo, que é fácil de se obter, testes de diagnóstico e de prognóstico convencinais para, por exemplo, tuberculose são incertos, complexos e envolvem, por exemplo, crescimento em cultura de esputo, testagem clínica e raios X do tórax. A invenção ulteriormente refere-se a um método de avaliação da progressão do estado de um indivíduo que sofre de um principal patógeno bacteriano respiratório, tal como tuberculose ou Streptococcus pneumoniae compreendendo as etapas (a) realizar in vitro uma medição do nível de um ou mais marcadores na forma de (i) receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase (uPAR), (ii) receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase solúvel (suPAR), e/ou (iii) um ou mais produtos de degradação de (i) ou (ii), em cada uma de numerosas amostras de fluido biológico oriundas de indivíduos, em que as amostras são obtidas em diferentes pontos de tempo, e (b) usar os valores medidos obtidos para avaliar a progressão do estado do indivíduo.

Este método pode ser usado continuamente para monitorar o estado, por exemplo, a eficácia de tratamento do paciente.

Finalmente, a presente invenção refere-se a um kit de bastão e kit ELISA utilizando-se o conhecimento acima.

Breve Descrição dos Desenhos A fig. 1. Níveis de suPAR entre esputo positivo de TB (SP), cultura positiva de TB (CP), TB presumida (PTB). TB positiva que recebe tratamento na admissão (TAE), e TB negativa (NEG). O gráfico de caixa mostra a média (linha preta na caixa), quartis (caixa) e os que estão de fora (casos com valores entre 1,5 e 3 comprimentos de caixa a partir da extremidade superior ou inferior da caixa), mas não-extremas (casos com valores mais do que 3 comprimentos de caixa a partir da extremidade superior ou inferior da caixa). A fig. 2a mostra a relação entre valores de suPAR e a probabilidade de ser diagnosticada TB positiva. Os 16 pacientes que estavam em tratamento para TB na hora de inclusão não estavam incluídos na análise. Assim, incluídos na análise são os indivíduos de TB positiva (esputo de TB e cultura positiva e TB presumida) e os indivíduos de TB negativa. Pacientes com aumento de suPAR têm probabilidade superior de serem diagnosticados com TB ativa (P= 0,0001). Pacientes com valores de suPAR acima de 8,3 ng/ml (n=8) não são mostrados. As linhas azuis no fundo indicam os valores de suPAR de paciente individual e a linha alta é o valor médio. As linhas pontilhadas são 95% de intervalos de codifidência. A fig. 2b. Probabilidade de ser diagnosticado com TB quando excluindo o esputo positivo de TB. Pacientes incluídos na análise de probabilidade são as 35 culturas positivas, as 63 TB presumidas e as 64 TB negativas. Assim, prevê-se a probabilidade de todos os suspeitos de TB incluindo o positivo microscópico e os 16 pacientes em tratamento na admissão. Oito amostras tinham valores de suPAR acima de 8,5 ng/ml e não são mostradas. A figura mostra que a probabilidade de ser TB positiva apesar de uma análise microcópica de esputo de TB negativa aumenta com níveis de suPAR aumentados (p = 0,001). As linhas azuis no fundo indicam os valores de suPAR de paciente individual e a linha alta é o valor médio. As linhas pontilhadas são 95% de intervalos de confidência. A fig. 2c. A figura é idêntica à figura 2b, exceto quanto à exclusão de indivíduos infectados por HIV-1. Houve uma relação significativa entre suPAR crescente e probabilidade de ser diagnosticada como cultura de TB presumida ou positiva (p = 0,02). As linhas azuis no fundo indicam os valores de suPAR de paciente individual e a linha alta é o valor médio. As linhas pontilhadas são 95% de intervalos de confidência. A fig. 2d mostra a probabilidade de ser TB positiva entre HIV-1 positiva de acordo com o valor de suPAR p = 0,08. Houve uma tendência em direção a uma relação entre suPAR crescente e a probabilidade de ser diagnosticado como TB de cultura positiva ou presumida (p = 0,08). As linhas azuis no fundo indicam valores de suPAR de paciente individual e a linha alta é o valor médio. As linhas pontilhadas são 95% de intervalos de confidência. A fig. 3. Curvas de sobrevivência de Kaplan Meier que mostram sobrevivência entre os 182 pacientes com TB ativa. A linha fina indica pacientes com baixo suPAR e linha em negrito pacientes com alto suPAR. A figura A: não houve nenhuma diferença significativa quando da estratificação de pacientes de acordo com o valor médio. A figura B: Pacientes com valores de suPAR acima de 2 vezes o valor médio (isto é, > 4,2 ng/ml, n=38), morreram significativamente mais rápido que pacientes com suPAR abaixo de 2 vezes o valor médio (n=144), p=0,007, teste log de classificação ("log ranktest"). A fig. 4. Depois do tratamento, soros estavam disponíveis de 101 indivíduos. O gráfico de caixa mostra os níveis pré- e pós-suPAR (pós marcado com -P) destes 101 indivíduos. A: esputo positivo de TB (SP), B: cultura positiva de TB (CP), C: TB presumida (PTB), D: TB positiva recebendo tratamento na admissão (TAE), e E: TB negativa (NEG). Para simplicidade, um gráfico de caixa mostra a média (linha preta na caixa) e quartis (caixas), mas os que estão fora e extremos (casos com valores mais do que 1,5 comprimentos de caixa a partir da extremidade superior ou inferior da caixa). A fig. 5. Gráficos de caixa com base na média, quartis e valores extremos de níveis de suPAR no plasma. A: grupo de controle (média = 2,6 ng/ml) e pacientes bacterêmicos pneumocócicos (média = 5,5 ng/ml). suPAR era significativamente elevado em pacientes em comparação com controles (p = 0,001). B: Pacients que sobrevivem a infecção (média = 50 ng/ml) e paciente que morrem da infecção (média = 9,4 ng/ml). O nível aumentado de suPAR no grupo de pacientes mortos era estatisticamente significativo (p = 0,0001). As caixas representam a faixa interquatis que contém 50% de valores e "extensões" que se prolongam das caixas a valores mais altos e mais baixos, excluindo os que estão fora e extremos. Círculos (o) representam os que estão fora (1,5 e 3 comprimentos de caixa) e estréias (*) representam extremos (valores mais do que 3 comprimentos de caixa). A fig. 6. Níveis de suPAR em indivíduos com TB suspeita de acordo com se os pacientes eram positivos ou negativos para AFB em mi-croscopia direta. A fig. 7. Níveis de suPAR em pacientes de TB tratados e não- tratados. A fig. 8. O eixo Y à esquerda mostra o nível de soro de suPAR (ng/ml). O eixo Y à direita mostra a percentagem de células que expressa o receptor de uPAR (células positivas de CD87).

Descrição Detalhada da Invenção A seguir, a invenção é explicada em particular com referência a suPAR por razões de simplicidade. Isto não deve ser entendido como uma limitação do escopo da presente invenção a suPAR. Além do mais, extrapo- lações adequadas para uPAR e os produtos de degradação das ditas duas substâncias estão bem dentro da habilidade de uma pessoa versada na técnica.

Os inventores surpreendentemente verificaram que a concentração de suPAR, uma molécula que é, em geral, conhecida como estando envolvida em adesão e migração celular, é aumentada no soro e/ou no esputo de dois principais patógenos bacterianos respiratórios, pessoas com Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis em comparação com controles saudáveis.

Principais patógenos bacterianos respiratórios podem ser selecionados de Streptococcus pneumoniae (incluindo S. pneumoniae resistente à droga) Chlamydia pneumoniae e Chlamydia psittaci Legionella spp. Coxiella burnetii Vírus Respiratório de Haemophilus influenzae Bacilos Gram-negativos entéricos (especialmente Klebsiella spp.) Fungos endêmicos (coccidioidomycosis, histoplasmosis, blastomycosis) Staphylococcus aureus Streptoroccus pyogenes Mycoplasma pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Pseudomonas aeruginosaa Pneumocystis carniib A amostra de fluido biológico pode ser qualquer fluido que pode ser obtido a partir de seres humanos, isto é, esputo, fluido cístico, ascite, sangue, soro, plasma e urina. Urina é preferida devido ao fato de que ela é fácil de se obter. Quando urina é usada como a amostra de fluido biológico, a medição do marcador estaria correlacionada com o nível de concentração total da amostra, por exemplo, por correlação da medição do marcador com o teor de creatinina na amostra.

De preferência, a amostra de fluido biológico é armazenada em uma temperatura abaixo de 0°C, mais de preferência de -20°C a -80°C, até a medição. A medição do marcador na amostra de fluido biológico pode ser realizada usando-se qualquer método/dispositivo disponível para os mesmos. Exemplos de tais métodos/dispositivos de medição são ELISA, RIA (radioimunoensaio), western blotting, TR-FIA (Ensaios Imunofluorométricos de Tempo Resolvido), Análise de FACS, bastões etc. Métodos/dispositivos de medição preferidos são ELISA e bastões.

Um ELISA pode ser realizado em numerosas concretizações diferentes, muitas das quais são aplicáveis na presente invenção. Uma concretização de ELISA, que é particularmente adequada para o uso na presente invenção, é aquela descrita por8 e 9 que estão incluídas aqui por esta referência. A medição do marcador pode ser realizada usando-se qualquer bastão. De preferência, o bastão é um bastão compreendendo um anticorpo para o marcador como um agente de captura.

De preferência, a medição de uPAR na amostra de fluido biológico é realizada por análise de FACS, western blotting ou ELISA.

De preferência, a mediação de produtos de degradação de uPAR/suPAR é realizada usando-se western blotting ou TR-FIA (Ensaios Imunofluorométricos de Tempo Resolvido). A medição de uPAR é realizada em amostras de fluido biológico contendo células que expressam uPAR, isto é amostras de sangue. O valor de medição do nível de marcador obtido na etapa (a) pode ser usado para avaliar o estado do indivíduo por comparação do valor medido com o nível do marcador em indivíduos não tendo uma infecção de pulmão bacteriana com Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis.

Como mencionado acima, um aspecto da presente invenção refere-se a um método de avaliar a progressão do estado de um indivíduo que sofre de infecção por Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis.

Os valores de medição do nível de marcador obtido na etapa (a) podem ser usados para avaliar a progresssão do estado do indivíduo por comparação dos valores medidos com o nível do marcador em indivíduos não-infectados com tuberculose ou Streptococcus pneumoniae e/ou por comparação do curso temporal de valores medidos com aquele de indivíduos não-infectados com tuberculose ou Streptococcus pneumoniae. A invenção ulteriormente refere-se a kit ELISA para avaliação do estado físico de um indivíduo que sofre de infecção por tuberculose compreendendo a) um agente de captura imobilizado capaz de capturar um ou mais marcadores na forma de (i) receptor de ativador de plasminogênio de uro-quinase (uPAR), (ii) receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase solúvel (suPAR), e/ou (iii) um ou mais produtos de degradação de (i) ou (ii), e b) um par de ligação capaz de se ligar ao marcador, o par de ligação compreendendo c) um sistema de rótulo. O agente de captura pode ser um anticorpo para o marcador. O par de ligação pode ser um anticorpo para o marcador.

De preferência, o sistema de rótulo é conjugado ao par de ligação. O sistema de rótulo pode ser qualquer sistema de rótulo convencionalmente usado, tal como anticorpo ao agente de ligação conjugado a uma enzima, por exemplo, um conjugado de fosfatase alcalina-imunoglobulina.

Além do mais, a invenção refere-se a um bastão para avaliação do estado físico de um indivíduo que sofre de infecção por tuberculose ou Streptococcus pneumoniae compreendendo a) um agente de captura imobilizado capaz de capturar um/ou mais marcadores na forma de (i) receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase (uPAR), (ii) receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase solúvel (suPAR), e/ou (iii) um ou mais produtos de degradação de (i) ou (ii) e b) um par de ligação capaz de se ligar ao dito marcador, o par de ligação compreendendo c) um sistema de rótulo. O agente de captura pode ser um anticorpo para o marcador. O par de ligação pode ser um anticorpo para o marcador.

De preferência, o sistema de rótulo é conjugado ao par de ligação. O sistema de rótulo pode ser qualquer sistema convencionalmente usado, tal como anticorpo ao agente de ligação conjugado a uma enzima, por exemplo, um conjugado de fosfatase alcalina-imunoglobulina.

Definições Com relação à presente invenção "uPAR" é definido como qualquer forma de uPAR (igual a CD87) presente sobre a superfície de células que expressam uPAR em fluidos biológicos. A expressão "células que expressam uPAR" refere-se a todas as células que expressam uPAR (CD87) tais como monócitos, leucócitos, ma-crófagos e neutrófilos.

Com relação à presente invenção "suPAR" (uPAR solúvel) é definido como qualquer forma de uPAR (igual a CD87) presente em fluidos biológicos em uma forma não-ligada de célula. "Fluidos biológicos" são definidos como qualquer fluido que pode ser obtido a partir de seres humanos, isto é, esputo, fluido cístico, ascite, sangue, soro, plasma e urina. A expressão "produto de degradação de suPAR ou uPAR como usada aqui significa todos os seus fragmentos observados usando-se western blotting ou anticorpos contra suPAR ou uPAR. Em particular, a dita expressão inclui os fragmentos D1, D2 e D3 de suPAR.

Exemplos Exemplo 1: Diagnóstico de TB ativa por medição de suPAR no soro Objetivo: Para determinar se pacientes suspeitos de terem TB ativa têm níveis elevados de suPAR no soro, isto é, se níveis de suPAR podem ser usados para diagnosticar TB ativa.

Descrição da Experiência: Mycobacterium Tuberculosis é um patógeno extracelular que reside predominantemente dentro de macrófagos. O receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase (uPAR) está principalmente localizado em monócitos e macrófagos. uPAR é uma proteína glicosilada de três domínios (D1-D3) que liga uroquinase com alta afinidade através de seu domínio D1. O complexo uPAR/uPA está envolvido na ativação de plasminogênio, pro-teólise pericelular e remodelação de tecido bem como ativação de integrina, migração e adesão de célula. O uPAR está ligado à superfície de célula por uma âncora de GPI, que pode ser clivada, resultando em uma forma solúvel do receptor (suPAR). Formas solúveis de uPAR (suPAR) incluem o receptor de comprimento total (D1-D3) bem como um fragmento de D2D3 com propriedades quimiotáticas10 e um fragmento D1 com função desconhecida. suPAR foi identificado em sobrenadantes de cultura de célula e em fluidos biológicos tais como fluido cístico, soro, plasma e urina11.

Devido às dificuldades de diagnóstico de infecção por tuberculose em países em desenvolvimento e a alta mortalidade causada pela infecção, investigaram-se níveis de suPAR entre os indivíduos suspeitos de ter tuberculose ativa em um grupo em Guinea-Bissau. Aqui mostrou-se que suPAR porta tanto informação de diagnóstico quanto de prognóstico em pacientes que sofrem de tuberculose ativa.

População e Vigilância de TB

Quatro áreas suburbanas em Bissau, a capital de Guinea-Bissau, e ao redor 46.000 habitantes são seguidos através de um sistema de vigilância demográfica desde 1978. Em maio de 1996, um sistema de vigilância de TB foi implementado na área em co-operação com o Hospital de TB nacional, Hospital Raoul Follereau (HRF). Todos os adultos permanentemente ou temporariamente vivendo na área de estudo, apresentando-se em qualquer um dos 2 centros de saúde com sintomas ou sinais de tuberculose ativa foram encaminhados ao hospital para ulterior investigação. Duas efermeiras de TB realizaram visitas a cada três meses em casas onde casos de TB tinham sido encontrados, exame e intervenção dos membros domésticos a fim de encontrar casos secundários. Casos suspeitos foram encaminhados ao hospital de TB para outros exames médicos. Pacientes que moram na área, mas com tratamento de TB iniciado em outro lugar, foram também encaminhados para outra investigação e inclusão se identificados pelas enfermeiras que distribuem remédio dentro o programa de TB nacional.

Critérios de Inclusão Critérios para inclusão no estudo eram um ou mais dos seguin- tes sintomas e sinais sem outra doença explanatória: tosse >1 mês sem melhora com antibióticos, febre constantemente e periodicamente por mais do que 1 mês, perda de peso, dispnéia, hemoptise, suores noturnos ou linfa-denopatia. Pessoas com <15 anos de idade e mulheres grávidas não foram incluídas. Pacientes que consentiram foram investigados clinicamente, foram entrevistados usando-se questionários padronizados referindo-se à história médica, fatores de risco comportamentais e sócio-demográficos, foram investigados com raios X do tórax, microscopia direta no esputo matutino em 3 dias consecutivos, cultura de esputo e teste de Mantoux (usando-se Multi-teste®, Bio-Merieux, França). Sangue foi retirado para testagem de infecção por HIV, parâmetros imunológicos ou hematológicos. Duzentos e sessenta e dois pacientes com suspeita de TB foram incluídos neste estudo. Os pacientes foram arrolados entre 1996 e 1998, 147 eram homens e 115 eram mulheres. Idade média foi de 41,4 anos (faixa 15-80). Com base nos exames, pacientes foram divididos em 4 grupos: 1) pacientes positivos para AFB em microscopia direta de esputo (Acid Fast Bacilli, AFB, e microscopia direta) eram indicados ter esputo positivo de TB. 2) pacientes negativos em microscopia mas positivos em cultura eram indicados ter cuitura positiva de TB. 3) pacientes com sinais clínicos, sintomas e mudanças no raios X compatíveis com TB intratoráxica ativa, mas sem confirmação bacteriológica em cultura ou microscopia direta de esputo, foram tratados com antibióticos (co-trimoxazol ou amoxicilina) e então foram reavaliados clínicamente e com raios X do tórax. Se não houvesse nenhuma melhora e suspeita remanescente, o paciente foi admitido ter TB e foi indicado TB presumida. 4) pacientes não-diagnosticados como tendo TB foram tratados de acordo com o diagnóstico (por exemplo, pneumonia). Estes pacientes são indicados ter TB negativa.

Tratamento de TB

Uma fase intesiva de 4 meses de Tratamento Diretamente Observado (DOT) diariamente com doses padrão de Etambutol, Isoniazid, Ri-fampicina, e pirazinamida foi seguida por uma fase de continuação de 4 meses com Etambutol e Isoniazid recebidos pelo paciente no centro de saúde duas vezes por mês. Este regime de tratamento foi recomendado para indivíduos infectados por HIV pelo programa de TB nacional em Guinea-Bissau quando o projeto de pesquisa foi iniciado em 1996; por razões de confidencialidade e comparabilidade indivíduos com HIV positivo e HIV negativo receberam o mesmo tratamento. Além disso, a todos os pacientes foram dados complexo de vitamina B e multivitaminas diárias. A pacientes que apresentaram doença severa foi oferecida hospitalização se leitos estivessem disponíveis. Na fase intensiva, pacientes que não conseguem comparacer para o tratamento foram visitados no mesmo dia por uma enfermeira e foram encorajados a continuar o tratamento.

Adesão ao tratamento foi verificada por contagem de pílula e um teste de urina de INH a 2, 5 e 8 meses de acompanhamento; informação foi observada nas formas e cartões de tratamento. Métodos de Laboratório Na inclusão, amostras de esputo matutina foram coletadas durante três dias consecutivos por um auxiliar de campo e foram transportadas em um recipiente selado a 4°C no mesmo dia para o National Public Health Laboratory (LNSP) em Bissau para cultura e microscopia direta. Antes da cultura, amostras foram digeridas e foram descontaminadas de microorganismos não-micobacterianos com o método de sulfato de laurila. Uma alíquota de 0,5 ml da espécime homogeneizada foi inoculada em tubo com meio de ovo de Lõwenstein-Jensen (LJ) convencional e em tubo contendo um LJ modificado com 0,6% de piruvato. Os tubos foram incubados a 37°C e foram examinados semanalmente por 7 semanas. Crescimento de mico-bactérias foi confirmado por microscopia de resistência a ácido ("acid-fast"). Isolados foram transportados congelados para o Swedish Institute for Infectious Disease Control (SMI) em Estocolmo para confirmação.

Testagem de HIV

Soros foram triados quanto HIV a LNSP usando-se Capillus® HIV-1/HIV-2 (Cambridge Diagnostics, Galway, Irlanda) e Enzygnost® Anti-HIV 1+2 Plus (Behring Diagnostics Gmbh, Marburg, Alemanha). Amostras positivas foram então confirmadas com Multispot® HIV-1/HIV-2 (Sanofi Dia- gnostics Pasteur. Marnes-la Coquette, França). Duas amostras reativas foram mandadas congelar para SMI em Estocolmo e foram confirmadas usando-se Immunocomb® II HIV-1&2 Bisport (Orgenics, Yavne, Israel). Contagens de células CD4 e CD8 foram medidas usando-se o método de fosfata-se Imunoalcalina13.

Medição de suPAR

Medições de suPAR foram realizadas retrospectivamente sobre amostras de soro congeladas usando-se um sanduíche ELISA. Imunoplacas (Maxisorb, Nunc. Dinamarca) foram incubadas de um dia para o outro a 4°C com um anticorpo monoclonal de murino contra suPAR humano, R2 (2 μg/ml), em tampão de revestimento (Na2C03 a 15,1 mM, NaHC03 a 35,7 mM, pH 9,6). Depois da incubação, as cavidades foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (PBS, 0,1% de Tween 20). Ligação não-específica foi bloqueada com 2% de albumina de soro bovino (BSA filtrado, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) em solução salina tamponada por fosfato (PBS) por 30 minutos a 37°C (agitação). Depois de se lavar três vezes, as placas foram incubadas com 10 ul de amostras de soro diluídas com 90 μΙ de tampão, pH 7,4 (KH2PO4 a 7,3 mM, Na2HP04 a 50,7 mM, NaCI a 0,1 M, 0,5% de fenol vermelho) por uma hora à temperatura ambiente. A camada de detecção consistia em suPAR de anti-humano de coelho policlonal (1 pg/ml) em tampão de diluição. O anticorpo secundário usado era um conjugado de imunoglobulina de anticoelho monoclonal com fosfatase alcalina (Sigma) diluído de 1:2000 em tampão de diluição. Trinta minutos depois da adição do substrato (1 comprimido de fosfato de p-nitrofenila, Sigma) em 12 ml de solução de substrato, pH 9,5 (base de Tris a 0,1 M, NaCI a 0,1 M, MgCI2 a 5 mM), as reações foram paradas usando-se 50 μΙ/cavidade de NaOH a 1 M e foram medidas a 405 nm. Três padrões de laboratório foram incluídos sobre todas as placas. Variações de inter-ensaio e de intraensaio eram menos do que 10%. O nível de detecção de suPAR foi de 0,03 ng/ml. Estatísticas . Todas as análises estatísticas foram realizadas usando-se o programa estatístico SSPS, Versão 10 ou SAS. Para comparações entre grupos, o teste de Mann Whitney U ou Teste T de students foram usados. A probabilidade de suPAR para prever TB ativa foi avaliada usando-se um modelo de regressão logística. Todos os testes de probabilidade foram realizados como testes de razão de probabilidade. Diferença entre curvas de Ka-plan-Meier foi analisada pelo teste log de classificação. A capacidade de suPAR no soro para prever mortalidade no contexto de outros marcadores de prognóstico conhecidos foi formalmente avaliada usando-se o modelo de riscos proporcionais de Cox. Todos os testes foram conduzidos como testes de razão de probabilidade parciais. O modelo estatístico permitiu relação que não linear de suPAR até a mortalidade. A relação linear foi suficiente. O nível de significância de 5% foi usado. Análise de regressão de Cox foi realizada a partir do tempo de inclusão e até o término do tratamento ou reprovação devido à morte (N=30), começando na guerra em Guinea Bissau (6 de junho de 1998) (N=50), ou perda para acompanhar porque o paciente se moveu de volta para as áreas rurais (N=23). Dezesseis pacientes, que estavam recebendo tratamento de TB no hora da admissão, não foram incluídos na análise de sobrevivência uma vez que o tratamento pode ter afetado seu nível de suPAR. Com referência ao estado de HIV, pacientes duplamente infectados (tanto positivos para HIV-1 quanto para HIV-2) foram incluídos nas análises como HIV-1 positivo uma vez que indivíduos duplamente infectados demonstraram ter o mesmo risco e severidade de infecção de TB que indivíduos de HIV-1. Ética Pré- e pós-aconselhamento tanto para resultado de HIV quanto doença de TB foram oferecidos a todos incluídos pelos doutores na carga do estudo. Os indivíduos foram informados por escrito em Português e verbalmente em sua própria linguagem antes de serem arrolados no estudo. Consentimento informado foi obtido a partir de todos os pacientes. O estudo foi aprovado pelo Ministério de Saúde Pública em Guinea-Bissau, e pelo Central Ethical Commitee da Dinamarca.

Resultados: Todos os 262 indivíduos tinham suPAR mensuráveis e o nível de suPAR médio foi de 2,1 ng/ml (faixa de 0,66-18,7 ng/ml) na admissão. Não houve nenhum correlação entre idade e suPAR (p = 0,9) e nenhuma diferença em níveis de suPAR entre homens e mulheres (p = 0,87) (tabela 1). Dos 262 indivíduos, 16 já eram conhecidos como tendo TB ativa e estavam sob tratamento apropriado no momento da admissão. Dos 244 indivíduos restantes, TB ativa foi diagnosticada em 182, que conseqüentemente entrou no regime de tratamento de 8 meses. Entre estes, 84 foram resultados positivos por microscopia direta de esputo (esputo positivo de TB) e 35 casos foram negativos em microscopia direta mas postivos em cultura (cultura positiva de TB) e 63 foram diagnosticados em dados radiológicos e clínicos (TB presumida). Os 64 restantes foram diagnosticados como tendo pneumonia ou broquite (TB negativa). suPAR é elevado em infecção por tuberculose Os níveis de suPAR eram significativamente mais altos entre os pacientes TB positiva (esputo positivo de TB, cultura positiva de TB e TB presumida, N = 182) em comparação com os pacientes de TB negativa (N = 64) (p<0,001) (figura 1). Os níves de suPAR foram elevados nos 84 esputos de TB positiva (p<0,001), e nas 35 culturas de TB positiva (p=0,005) em comparação com 64 TB negativas. Houve uma tendência em direção a níveis de suPAR elevados nas 63 TB presumidas diagnosticadas em comparação com TB negativa (p=0,06). Nenhuma diferença foi observada em níveis de suPAR entre os 16 pacientes que tinham recebido tratamento antes da inclusão no estudo e a TB negativa (p=0,72, teste t). Os níveis de suPAR são mostrados na figura 1. suPAR porta valor de diagnóstico para TB

Quando incluindo a totalidade arrolada no estudo, houve uma probabilidade significativamente mais alta de ser diagnosticada com TB com suPAR crescente. Isto é mostrado como uma diagrama de probabilidade na figura 2a. Devido às dificuldades de diagnóstico os indivíduos de esputo negativos, a análise mais interessante foi se suPAR portava valor de diagnóstico nos 162 indivíduos de esputo negativos, isto é excluindo os 84 esputos de TB positiva. Foi verificado que houve um risco crescente de ser diagnostica- do como cultura positiva de TB ou TB presumida com níveis de suPAR crescentes (p = 0,001, figura 2b). Uma vez que infecção por HIV-1 afeta o nível de suPAR, nós produziu-se a mesma análise para os 130 indivíduos de HIV-1 negativos (76 pacientes de HIV-1 negativos, cultura positiva de TB ou TB presumida e 54 pacientes de HIV-1 negativos, TB negativa) e encontraram a mesma associação entre probabilidade crescente de ser diagnosticada que TB positiva com níveis de suPAR crescentes (p=0,02, figura 2c). Nível de suPAR mais alto na inclusão entre os pacientes bacteriológicos de TB que morreram durante o acompanhamento Pacientes foram seguidos a partir da hora de inclusão e foram tratados por um período de 8 meses. Trinta morreram durante o acompanhamento com um nível de suPAR médio na inclusão de 3,26 (faixa de 1,0418,70), que foi significativamente mais alto do que entre os 232 sobreviventes (suPAR médio de 2,12, faixa de 0,66-16,22) (p=0,02). Entre os 119 pacientes de TB bacteriologicamente confirmados (esputo de TB e cultura positiva de TBs), dez morreram durante o acompanhamento. Aqueles que morreram tinham níveis de suPAR significativamente mais altos (média 5,98 ng/ml, faixa 1,3-18,3) do que os sobreviventes (média 3,04 ng/ml (Faixa de 0,9 -14,7)) (Mann Whitney, p=0,022). Entre as 63 TB presumidas, 13 morreram durante o período de tratamento. O nível de suPAR na inclusão dos 13 que morreram eram 2,35 ng/ml em média (faixa de 1,0-6,6) versus 2,12 mg/ml em média (faixa de 0,7-6,6) entre os sobreviventes (p=0,45). Entre as 64 TB negativas, 7 morreram durante o acompanhamento com suPAR médio de 3,32 (faixa de 1,43-18,70) e 57 estavam vivos no acompanhamento tendo um suPAR médio de 1,17 ng/ml (faixa de 0,81-16,22)(p=0,04). Quando dividindo os pacientes em quatro grupos de tamanho igual com base no nível de suPAR, houve uma tendência em direção à mortalidade mais alta entre pacientes no quartil de suPAR mais alto em comparação com o quartil de suPAR mais baixo (5/65 vs 13/65, p=0,07) (tabela 1).

Análise de Kaplan Meier em pacientes com TB ativa Não houve nenhuma diferença em sobrevivência entre pacientes com TB ativa (esputo de TB, cultura de TB ou TB presumida n=182) quando da divisão de pacientes por valor de suPAR médio (figura 3A). Pacientes com mais do que duas vezes o valor médio, isto é, pacientes tendo mais altos do que 4,2 ng de suPAR/ml de soro (n=38) estavam em risco aumentado de morte durante o acompanhamento em comparação com pacientes tendo valores de suPAR abaixo de 4,2 ng/ml (N=144)(MR=3,05 por ng de aumento de suPAR. p=0,007). Figura 3B.

Nível de suPAR como preditor para resultado de infecção por HIV 47 demonstraram ter HIV-1 ou duplamente infectados na hora da inclusão. O HIV-1 infectado tinha um nível de suPAR médio de 2,34 ng/ml (faixa de 0,92-18,7). Dos 47 pacientes, 13 morreram durante o acompanhamento (suPAR médio 3,43, faixa de 1,15-18,70). Estes pacientes tinham valor de suPAR significativamente mais alto do que os 34 pacientes vivos na reprovação de estudo (suPAR médio 2,05, faixa de 0,92-6,88) (p=0,015, Mann Whitney). Análise de regressão de Cox em infectado por HIV-1 mostrou que suPAR estava significativamente associado à sobrevivência nestes sub-grupos (p<0,001, MR=1,53). Houve uma diferença similar em níveis de suPAR entre os 66 indivíduos infectados por HIV-2 (suPAR médio 2,44, faixa de 0,91-18,30), dos quais 7 morreram durante o acompanhamento (suPAR médio 3,32, faixa de 1,04-18,3), 59 sobreviveram (suPAR médio 2,44, faixa de 0,91-14,71) através da diferença não era significativa devido a número menor de mortes (p=0,64). Não houve diferença significativa entre níveis de suPAR e pacientes com TB com ou sem infecção por HIV ou entre o número de infectados por HIV 1 ou 2 entre os grupos de diagnósticos de TB diferentes (tabela 2). Nível de soro de suPAR está correlacionado com sobrevivência em análise de regressão de Cox Excluindo os 16 pacientes que tinham recebido tratamento na admissão, 182 pacientes diagnosticados com TB ativa foram seguidos por um período de até 8 meses depois do início do tratamento e 23 morreram. Em análises de regressão de Cox univariadas, níveis de suPAR estavam significativamente associados à morte durante o tratamento (aumento na razão de taxa de mortalidade (MR) = 1,18 por ng de aumento de suPAR, p=0,01), como foi infecção por HIV (MR=2,66, p=0,023) e estado como TB positiva com base em dados radiológicos e clínicos (TB presumida) (p=0,03). Quando do tratamento todos os pacientes com TB positiva igualmente independentemente de seu estado de HIV não foi encontrado nenhum efeito de método de diagnóstico na hora de morrer quando levando em consideração o nível de suPAR (p=0,43). Nem positividade de HIV-2 (p=0,63), idade (p=0,72), sexo (p=0,19) ou log 10 de contagens de célula T de CD4 transformadas (p=0,42) demonstraram estar significativamente associadas à sobrevivência durante o período de acompanhamento.

Em uma análise de Cox multivariada incluindo todos os fatores significativos, todo o significativo restante do MR sendo 3,9 (p=0,003) para TB negativa bacteriológica (TB presumida) em comparação com os pacientes de TB positiva bacteriológica, MR = 2,1 (p=0,12) para positividade de HIV-1 em comparação com pacientes de TB negativa de HIV-1, e 1,28 (p<0,001) por ng de aumento de suPAR.

Quando excluindo os pacientes de HIV-1 positivo, 14 morreram entre os 149 pacientes de TB. Entre estes pacientes de HIV-1 negativos com TB ativa, suPAR ainda permaneceu poder de previsão (RR=1,14, p=0,05). Assim, foi observada a mesma relação de dose/resposta (suPAR/tempo até a morte) quando excluindo os pacientes de HIV-1 positivo.

Discussão Mycobacterium Tuberculosis afeta as vidas de milhões de pessoas pelo mundo inteiro e 3 milhões são calculados morrerem da doença a cada ano. Neste exemplo foi encontrado, pela primeira vez, que a molécula de suPAR mantém valor de diagnóstico e de prognóstico em infecção por TB.

Neste exemplo, 32 por cento dos 262 indivíduos suspeitos de estarem positivos a TB demonstraram estar positivos por microscopia direta. Estes esputos de TB postiva tinham níveis mais altos do que aqueles diagnosticados por cultura (cultura positiva de TB) ou dianosticados clínicos (TB presumida). Todos estes pacientes tinham níveis de suPAR mais altos do que os TB negativos.

Devido às dificuldades de diagnosticar TB ativa em pacientes negativos em microscopia, uma questão importante neste estudo foi se su-PAR pode ter valor de diagnóstico em indivíduos em que suspeita de TB permanece. Foi verificado que houve uma probabilidade crescente de pacientes sendo diagnosticados como tendo TB ativa por cultura (cultura positiva) ou por investigação clínica (TB presumida) com nível de suPAR crescente. Os TB negativos foram incluídos no estudo com suspeita de TB devido a sintomas relacionados e foram considerados como tendo pneumonia depois de testes negativos e exame clínico e foram tratados com antibióticos pós-ingresso. Não conheceu-se se o nível de suPAR pode ser mais alto entre os TB negativos em comparação um grupo de controle de indivíduos saudáveis. No entanto, houve uma diferença marcada entre os TB negativos e os grupos diagnosticados como tendo TB ativa indicando que a pneumonia não causaria um maior aumento em suPAR.

Dezesseis pacientes estavam recebendo tratamento de TB apropriado na hora da inclusão. O nível de soro de suPAR nestes paciente era significativamente mais baixo do que nos pacientes diagnosticados com TB depois da inclusão, e comparáveis com os TB negativos. Isto indica que o nível de suPAR pode cair após o tratamento e que suPAR pode ser usado para monitorar o efeito do tratamento. suPAR era prognóstico para sobrevivência neste coorte. Entre o esputo de TB e cultura positiva, 10 morreram durante o acompanhamento, e estes indivíduos tinham valores de suPAR significativamente mais altos na inclusão. Usando-se análise de regressão de Cox, suPAR estava significativamente associado a sobrevivência entre os 182 pacientes diagnosticados com TB. Foi anteriormente mostrado que suPAR é prognóstico para progressão de doença de HIV-1 e esta observação foi confirmada neste estudo. Quando excluindo o HIV-1 e duplamente positivos, suPAR ainda permaneceu significativamente associado à sobrevivência entre os pacientes com TB ativa. Um outro fator significativamente associado com a sobrevivência em análise de regressão de Cox é tipo de diagnóstico de TB. Pacientes diagnosticados de TB ativa por apenas exame clínico (TB presumida) estavam em risco maior de morrer durante o acompanhamento o que provavelmente é devido ao tratamento atrasado. A observação de nível de suPAR mais alto no esputo positivo de TB seguido por cultura positiva de TB e indivíduos de TB negativos em ensaios bacteriológicos (TB presumida) indicou que suPAR poderia estar correlacionada com a carga bacteriana de tuberculose. Como níveis de suPAR aumentados são prováveis de refletir aumento de expressão de uPAR sobre superfície de célula Mustjoki nossas constatações sugerem que ou suPAR e/ou uPAR podem estar envolvidos na patogênese de infecção por tuberculose. A interação inicial entre M. Tuberculosis e macró-fagos hospedeiros são uma primeira etapa importante na patogenêse de tuberculose. Esta etapa é mediada por ligantes e receptores de monóci-to/macrófago específicos presentes na superfície de TB. Vários receptores de macrófagos foram relatados mediar a ligação a M. Tuberculosis, incluindo receptores complementares CR1, CR3 e CR4, receptor de glucano, receptor de manose, receptor de lipopolissacarídeo e receptores de tipo "toll". No entanto, nenhum destes receptores demonstraram ser essenciais para a interação de macrófago/M. tuberculosis. O envolvimento de CR3 na entrada de tuberculose foi ulteriormente esclarecido pelo uso de modeios de camun-dongo de inativação de CD11b que mostraram uma redução de 60% em in-fectividade de tuberculose mas nenhum efeito sobre replicação intracelular. uPAR demonstrou complexar com CR3 (mac-1, CD11b/CD18). uPAR liga CR3 através de CD11b (revisto em 14) resultando na ativação do complexo. Assim, uma razão possível para o papel de diagnóstico e prognóstico de suPAR em TB poderia ser devido ao envolvimento e melhoramento de entrada de célula de tuberculose de CD11b/uPAR. Uma outra possibilidade é que uPAR se torna regulado para cima por replicação de TB intracelular e desse modo reflete o número de células infectadas. Apesar de HIV e agora infecção por tuberculose, o nível de soro de suPAR é também um marcador de prognóstico para sobrevivência total em pacientes que sofrem de câncer ovariano e de colorretal e para a resposta à terapia em leucemia15,11. Um outro possível elevador de suPAR é borrelia burgodorferi, como um estudo in vitro recente mostrou níveis aumentados de uPAR sobre células monocíticas após a infecção. Capaz de comparar dados entre estudos individuais em câncer, infecção por HIV e TB, é necessário desenvolver um ensaio de su-PAR comercialmente disponível e reproduzível. O ensaio usado neste estudo é comparável com o ensaio usado no estudo anterior de suPAR como fator de prognóstico em progressão de HIV7 e descrito no estudo por Stephens e outros16.

Finalmente, foi demonstrado que suPAR está elevado em pacientes com TB ativa e que pacientes com alto nível de suPAR têm um risco maior de morrer durante o período de tratamento.

Tabela 1. Pacientes divididos em quatro grupos de tamanho igual de acordo com o seu nível de suPAR. Parênteses mostram número de pacientes que morreram durante o acompanhamento.

Tabela 2. A tabela ilustra o número (e percentagem de grupo de diagnóstico de TB) e suPAR (média, faixa) de infectados por HIV entre os pacientes agrupados de acordo com o diagnóstico de TB.

Exemplo 2 O nível de soro de receptor de uroquinase solúvel é elevado em pacientes com tuberculose, prediz mortalidade durante o tratamento e pode ser usado para monitorar eficácia de tratamento de TB.

Objetivo: Para investigar se o nível de soro de receptor de ativador de plaminogênio de uroquinase solúvel (suPAR) porta informação de prognóstico em indivíduos infectados com Mycobacterium tuberculosis durante o período de tratamento e se ele pode ser usado para monitorar eficácia de tratamento de TB.

Projeto: suPAR foi medido por ELISA em 262 indivíduos na hora da ad- missão em uma coorte com base na suspeita de tuberculose ativa e em 101 indivíduos depois de 8 meses de acompanhamento. Os 262 indivíduos são os mesmos que investigados no exemplo 1.

Resultados: Os níveis de suPAR foram elevados em pacientes com TB ativa em comparação com indivíduos de TB negativa (p,0,001). Níveis de suPAR eram mais altos em pacientes positivos para TB em microscopia direta (N-84, suPAR médio de 3,17 ng/ml, p<0,001), seguidos por pacientes negativos em microscopia direta mas cultura positiva (N=35, suPAR médio de 2,41 ng/ml, p=0,005) e por pacientes diagnosticados sobre bases clínicas (N=63, suPAR médio de 2,13 ng/ml, p=0,06) em comparação com 64 indivíduos TB negativos (suPAR médio de 1,73 ng/ml). Durante o período de tratamento de 8 meses, 23 casos de TB morreram. Em um modelo de Cox multivariado controlando quanto a estado de HIV, idade, seco, contagem de CD4 e tipo de diagnóstico de TB, o aumento de mortalidade por ng de suPAR foi de 1,25 (95% de Cl 1,12-1,40). Depois do tratamento, níveis de suPAR diminuiram até os níveis de indivíduos TB negativos.

Conclusões: níveis de suPAR são elevados em pacientes com TB e associados à mortalidade. Além do mais, suPAR é um marcador de eficácia de tratamento. Métodos e população de estudo: Critérios de inclusão e métodos de laboratório Os indivíduos incluídos neste estudo são os mesmos que no exemplo 1. A diferença entre o estudo descrito aqui e aquele no exemplo 1, é que este estudo investiga o papel de suPAR como marcador durante os 8 meses de terapia.

Além do mais, durante o período de tratamento, 30 pacientes morreram. Depois de 8 meses de acompanhamento, uma segunda amostra de sangue foi retirada. Dos 262 indivíduos incluídos neste estudo, 101 indivíduos estavam disponíveis para um segundo sangramento.

Estatística Para comparações entre grupos, o teste U de Mann-Whitney foi usado exceto para comparações entre níveis de suPAR pré- e pós-tratamento de TB, casos esses em que testes t de amostras emparelhadas foram usados. A diferença entre curvas de Kaplan-Meier foi analisada pelo teste log de classificação. A capacidade de suPAR no soro prever mortalidade, explicando outros marcadores de prognósticos conhecidos, foi formalmente analisada usando-se modelo de riscos proporcionais de Cox que permite relações não-lineares entre suPAR e mortalidade. Todos os testes foram conduzidos como testes de razão de probabilidade parciais. A análise de tempo de morte foi realizada a partir do tempo de inclusão para o primeiro dos eventos: terminação de tratamento, 8 meses de acompanhamento, morte (N=30), início da guerra em Guinea Bissau que influenciou o tratamento (N=50), ou perda de acompanhamento uma vez que o paciente se moveu de volta para as áreas rurais (N=23). Os dezesseis pacientes que estavam recebendo tratamento de TB na inclusão não estavam incluídos na análise de sobrevivência uma vez que o tratamento pode ter afetado seu nível de suPAR. Com referência a estado de HIV, pacientes duplamente in-fectadados (tanto HIV-1 quanto HIV-2 positivos, N=19) estavam incluídos nas análises como HIV-1 positivo uma vez que indivíduos dupiamente infectados demonstraram ter o mesmo risco e severidade de infecção por TB como indivíduos com HIV-1. Análises estatísticas foram realizadas usando-se o programa SSPS, versão 10 ou SAS versão 8.1. Um nível de 5% foi usado para significância. Ética Todos os indivíduos receberam informação por escrito em português e informação verbal dadas em sua liguagem étnica local, antes da admissão. Consentimento informado foi obtido a partir de todos os pacientes. O estudo foi aprovado pelo Ministério de Saúde Pública em Guinea-Bissau, e pela Central Ethical Committee da Dinamarca.

Resultados: Todos os 262 indivíduos tinham suPAR mensurável e o nível de suPAR médio foi de 2,1 mg/ml (faixa de 0,66-18,7 ng/ml) na admissão. Não houve nenhuma correlação entre idade e suPAR (p0,9) ou em níveis de su- PAR entre homens e mulheres (p=0,87)(tabela 1). Dos 262 indivíduos, 16 já eram conhecidos como tendo TB ativa e estavam sob tratamento apropriado na hora da admissão. Dos 246 indivíduos restantes, TB ativa foi diagnosticada em 182, que conseqüentemente entraram no regime de tratamento de 8 meses. Entre estes, 84 eram esputo positivo de TB, 35 casos eram cultura positiva de TB, e 63 eram diagnosticados como TB presumida. Os 64 restantes foram diagnosticados como negativos a TB. Durante o período de tratamento 30 casos morreram, destes 7 negativos a TB (tabela 1). suPAR é elevado em infecção por tuberculose Os níveis de suPAR eram significativamente mais altos entre os pacientes de TB positiva (esputo positivo de TB, cultura positiva de TB e TB presumida, N=182) em comparação com os pacientes de TB negativa (N=64, p<0,001). O nível de suPAR parece se correlacionar com o número de mycobacterium em esputo como os níveis de suPAR mais altos foram encontrados entre os 84 de esputo positivo de TB (p<0,001), seguido pela cultura positiva de TB (p<0,001), e a TB presumida (p=0,06) quando da comparação com os níveis de suPAR encontrados nos 64 negativos a TB como mostrados na figura 1. Nenhuma diferença foi observada em níveis de suPAR entre os 16 pacientes que recebem tratamento de TB na hora da admissão e o negativo a TB (p=0,72). Agrupamento de pacientes em quartis de acordo com o nível de suPAR é mostrado na tabela 1.

Análise de Kaplan Meier em pacientes com TB ativa Não houve nenhuma diferença significativa na taxa de sobrevivência entre pacientes com TB ativa (esputo de TB, cultura de TB ou TB presumida, n=182), quando da divisão de pacientes por valor de suPAR médio (figura 3A). Pacientes com suPAR alto (mais do que duas vezes o valor médio, isto é, pacientes tendo mais altos do que 4,2 ng de suPAR/ml de soro (N=38)) morreram significativamente mais rápido após a admissão, em comparação com pacientes abaixo de 4,2 ng/ml (N=144, p=0,007), figura 3B. Nível de soro desuPAR está correlacionado com sobrevivência em análise de regressão de Cox Excluindo os 16 pacientes que já tinham iniciado o tratamento na hora da admissão, 182 pacientes diagnosticados com TB ativa foram seguidos por um período de até 8 meses depois do início de tratamento, 23 destes morreram. Em análise de regressão de Cox univariada, níveis de suPAR estavam significativamente associados à morte durante o tratamento, o aumento na razão de taxa de mortalidade (MR) sendo de 1,18 por ng de aumento de suPAR (95% de Cl 1,06-1,30), como era infecção por HIV-1 (MR=2,71, 95% de Cl, 1,16-6,29) e etado como TB positiva diagnosticada em dados clínicos e radiológicos (TB presumida) (MR = 2,48, 95% de Cl, 1,09-5,66). Quando do tratamento todos os pacientes com TB positiva igualmente independentemente de seu estado de HIV e ajuste para o nível de suPAR foi encontrado nenhum efeito de método de diagnóstico sobre mortalidade (p=0,43). Nem positividade de HIV-2 (p=0,63), idade (p=0,72), sexo (p=0,19) ou log 10 de contagens de célula de CD4 transformada (p=0,42) demonstraram estar significativamente associada à sobrevivência.

Todos os fatores que mostram ser significativos em análises uni-variadas permaneceram significativos na análise de Cox multivariada. Controle para diagnóstico de TB (TB presumida em comparação com casos de TB positiva em cultura ou microscopia direta, MR = 3,5 (95% de Cl: 1,398,67)), e estado de HIV (HIV-1 positivo em comparação com pacientes de TB HIV-1 negativos, MR = 2,5 (95% de Cl: 1,07-5,99)), o aumento em mortalidade por ng de suPAR era MR = 1,25 (95% de Cl: 1,12-1,40).

Quando excluindo indivíduos HVI-1 positivos, 14 morreram entre os 149 pacientes de TB restantes durante acompanhamento. Estre estes 149 pacientes com TB, suPAR ainda retinha poder preditivo (MR = 1,14, 95% de Cl: 1,00-1,31). Assim, a associação positiva entre suPAR e morte era similar em indivíduos HIV-1 positivos e HlV-negativos. Nível de suPAR como previsor para resultado entre os indivíduos infectados por HIV-1 ou 2 Foi anteriormente verificado que suPAR é um forte fator de prognóstico para progressão de HIV-1. No presente estudo, 47 dos 262 indivíduos suspeitos de ter TB demonstraram ter HIV-1 positivo na hora da inclusão e 13 morreram. Análise de regressão de Cox univariada sobre o in- fectado por HIV-1 mostrou que suPAR era significativamente negativamente associado à sobrevivência (n=47, MR=1,53 por ng de aumento de suPAR, 95% de Cl: 1,22-1,92). Nenhum outro parâmetro (idade, sexo, diagnóstico de TB ou contagem de CD4) era significativamente associado à sobrevivência neste sub-grupo. Sessenta e sei dos 262 indivíduos eram HIV-2 positivos na inclusão (não incluindo o duplamente infectado) dos quais sete morreram durante o acompanhamento. Houve um efeito similar de suPAR na sobrevivência (n=66, MR=1,13. 95% de Cl: 0,97-1,32) embora a diferença não fosse significativa devido ao número menor de mortes. Nem idade, sexo, diagnóstico de TB nem contagens de CD4 eram significativamente associados à sobrevivência no grupo de HIV-2. Não houve diferença significativa em níveis de suPAR em pacientes com TB ou sem infecção por HIV, ou entre indivíduos infectados por HIV-1 ou 2 nos diferentes grupos de diagnósticos de TB. Tratamento associado a uma diminuição em níveis de suPAR

Dos 262 indivíduos incluídos neste estudo, amostras de soro estavam disponíveis de 101 pacientes depois de 8 meses de tratamento. Na inclusão, 45 foram diagnosticados como esputo positivo de TB, 15 como cultura positiva de TB, 22 como TB presumida, 6 receberam tratamento na admissão, e 13 como negativos a TB. Os níveis de suPAR pré- e pós-tratamento para estes indivíduos são mostrados na figura 3. Tratamento foi associado a uma diminuição significativa em suPAR entre os 45 de esputo positivo de TB (95% de Cl: -2,07 - -0,56 ng/ml) e uma diminuição não significativa para as 15 culturas de TB positiva (95% de Cl: -2,12 - 0,24 ng/ml). Nenhuma diferença em valores de suPAR de pré- e pós-tratamento foi observada para TB presumida (95% de Cl: -0,81-0,84) ou para pacientes que recebem tratamento na admissão (95% de Cl: -3,3-3,1). Um aumento em suPAR foi observado depois do tratamento entre os 13 negativos a TB (3 HIV-2 positivos e 10 HIV negativos (p=0,041,95% de Cl: 3,31-1,33 ng/ml). O aumento foi mais proeminente entre os três HIV-2 positivos. Os níveis de suPAR de pós-tratamento não diferiram entre os diferentes grupos de diagnóstico (figura 3).

Discussão Mycobacterium Tuberculosis afeta a vida de milhões de pessoas pelo mundo todo e 2 milhões são estimados morrerem da doença a cada ano. No presente exemplo, foi verificado que os níveis de suPAR eram elevados em pacientes com TB, se correlacionam com tipo de diagnóstico de TB e portam valor de prognóstico. Além do mais, o tratamento foi associado a níveis de suPAR no soro diminuídos. suPAR demonstrou ser significativamente mais alto entre os casos de TB em comparação com os casos de não TB. Além do mais, os níveis de suPAR mais altos foram encontrados em casos de TB positiva em microscopia direta, seguido por casos negativos em microscopia direta mas positivo em cultura, e então os casos de TB negativa tanto em microscopia direta quanto cultura. Dado que cultura é um método mais sensível do que microscopia direta em diagnóstico da presença de AFB no esputo, estes resultados podem indicar que o nível de suPAR no sangue está correlacionado com o número de bactérias no esputo e consquentemente a carga bacteria-na nos brônquios. Os níveis de suPAR aumentados podem ser um resultado da mobilização dos macrófagos para dentro dos brônquios. Adesão e migração de monócitos envolvem uma interação funcional entre uPAR e integrinas como também suportada por estudos em camundongos de inativação de uPAR (May, Kanse, e outros, 1998 MAY 1998/id). A interação de uPAR/inte-grina melhor descrita está entre uPAR e CD11b/CD18 (receptor de complemento 3 ou MAC-1) (Simon, Rao, e outros, 1996, 14/id). Depois que esta patente foi depositada, Juffermans e colaboradores mostraram regulação para cima concorrente de uPAR e CD11b durante endotoxemia experimental usando-se LAM, uma componente de parede celular de M. Tuberculosis17. De modo interessante, CD11b/CD18 também demonstrou mediar ligação de M. tuberculosis a macrófagos18 que sugere que TB pode explorar esta regulação para cima para aderir e infectar macrófagos recrutados. Assim, foi proposto que isto pode ser um novo alvo para interação de M. tuberculosis.

Usando-se análise de regressão de Cox, suPAR demonstrou ser significativamente associado à sobrevivência entre 182 pacientes diagnosticados com TB. Em Guinea-Bissau, a prevalência de HIV é mais alta entre casos de TB em comparação com controles saudáveis. Foi anteriormente verificado que suPAR é um forte marcador de prognóstico para progressão de doença de HIV-111, e esta observação foi confirmada no presente estudo. No entanto, mesmo quando excluindo os HIV-1 infectados, suPAR ainda permaneceu significativamente associado à sobrevivência entre os pacientes com TB ativa.

Oito meses de tratamento levam a uma diminuição significativa em níveis de suPAR, resultando em níveis similares entre aqueles diagnosticados com ou sem TB na inclusão. Também, dezesseis pacientes já estavam recebendo tratamento de TB apropriado na hora da inclusão. Os níveis de suPAR no soro nestes pacientes eram significativamente mais baixos do que nos pacientes diagnosticados com TB depois da inclusão, e comparáveis com o TB negativo. Estas observações mostram que medição de suPAR podem ser uma ferramenta útil para monitoração de resposta de tratamento em pacientes com TB. suPAR é elevado e prognóstico para resultado em infecção por HIV-1. Este estudo mostrou que o nível de soro de suPAR é elevado em pacientes com TB e que o nível de pré-tratamento é positivamente associado à mortalidade em pacientes que recebem tratamento para TB.

Conclusões: O nível de soro de receptor de uroquinase solúvel (suPAR) é elevado em pacientes com tuberculose ativa e mais alto em pacientes que têm esputo positivo em análise microscópica. suPAR mostrou estar positivamente associado à mortalidade em pacientes com TB durante o tratamento, mesmo quando excluindo o co-infectado por HIV para os quais suPAR é conhecido como sendo um marcador de prognóstico muito forte. Após o tratamento, pacientes de esputo positivo tinham significativamente níveis de suPAR mais baixos que sugerindo que suPAR poderia ser usado para monitorar eficácia de tratamento de TB.

Exemplo 3 O nível de plasma de receptor de ativador de plasminogênio de uroquinase solúvel é elevado em pacientes com bacteremia de Strepto- coccus pneumoniae e porta forte valor de prognóstico Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) é o agente primário de pneumonia adquirido na comunidade e a um alto grau associado à bacteremia. A incidência anual de pneumonia é estimada de 1 a 12 por população de 1000 em países em desenvolvimento. Bacteremia pneumocócica varia de 9 a 18 por 100.000 por ano. Mortalidade de bacteremia pneumocócica varia de 17% a 36% com mortalidade mais alta na idade madura. O receptor de ativador de plaminogênio de tipo uroquinase (uPAR/CD87) é expresso sobre diferentes tipos de célula incluindo neutrófi-los, linfócitos, macrófagos, células endoteliais e malignas. É bem-conhecido que uPAR está implicado em numerosas funções bioquímicas. uPAR e seu ativador de plasminogênio de tipo uroquinase de ligante (uPA) estão envolvidos na conversão de plasminogênio em plas-mina. Além disso, uPAR liga beta integrinas bem como sinaliza o recrutamento de células inflamatórias10. Na patogênese de câncer, uPA e uPAR desempenham um papel chave em invasão de tecido pela degradação de matriz extracelular. uPAR pode ser clivado da superfície de célula por numerosas proteases, tais como quimiotripsina, fosfoiipase C e uPA19. A divagem proteolítica de uPAR da superfície de célula libera uma forma ativa quimiotá-tica de suPAR. Alternativamente, uPAR é liberado/sercretado a partir da superfície de célula sem proteólise.

Recentemente, foi relatada uma forte correlação entre o avanço do estado da doença de infecção por HIV-1 e suPAR elevado sugerindo o uso de suPAR como um marcador de prognóstico. Finalmente, como mostrado neste pedido de patente, pacientes com tuberculose pulmonar têm níveis de soro aumentados de suPAR. A papel possível de suPAR e uPA em respostas imunes em relação a outras doenças infecciosas permanece incerto. Camundongos de inativação de gene que carece de uPAR mostraram recrutamento de neutró-filo pulmonar reduzido e mortalidade aumentada para infecção com S. pneumoniae em comparação com camundongos de tipo selvagem20. Ácido lipotecóico oriundo de Streptococcus pyogenes facilita regulação para cima de uPAR de monócito in vitro. Regulação para cima de uPAR por monócitos induzidos por proteínas de superfície de Borrelia burgdorferi também foi relatada21. O nível de soro da proteína YKL-40 foi descrito elevado durante a pneumonia e como um fator de prognóstico independente em pacientes bacterêmicos pneumocócicos. Aqui foi investigado se bacteremia de S. pneumoniae afeta o nível de suPAR no plasma. Foi relatado, pela primeira vez, que suPAR é elevada e porta valor de prognóstico em pacientes com bacteremia de S. pneumoniae.

Indivíduos e métodos Pacientes. Entre outubro de 1999 e junho de 2001, adultos (18 anos ou mais velhos) com bacteremia de S. pneumoniae admitidos em um dos cinco hospitais universitários (Aalborg, Aarhus, Odense, Hvidovre ou Rigshospitalet) na Dinamarca foram incluídos. Amostras de sangue foram retiradas na inclusão (admissão no hospital) e dados clínicos durante o tempo de admissão foram coletados previdentemente, como descrito (G. Kronborg, N. Weis, Η. O. Madsen, S. S. Pedersen, C. Wejse, H. Nielsen, P. Skinhoj, P. Garred, submetido para publicação). Sangue foi retirado de um grupo de 30 indivíduos saudáveis (trabalhadores de laboratório) para comparação (grupo de controle).

Um total de 141 pacientes, 77 fêmeas e 64 machos estavam incluídos. A idade média dos pacientes foi de 64 anos com uma faixa de 20 -99 anos. Sessenta e seis por cento dos pacientes tinham uma doença subjacente e pneumonia era o foco mais comum de infecção (n = 116). Vinte e quatro pacientes morreram no hospital (taxa de caso-fatalidade = 17%). Características de linha de base dos pacientes são dados na tabela 3. Todos os pacientes receberam tratamento com antibiótico apropriado a partir da admissão ou quando a cultura de sangue tornou-se positiva. O estudo foi aprovado pelos comitês éticos locais. ELISA Placas de Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas e foram incubadas de um dia para o outro a 4°C com 100 μΙ de 2 μg/ml de anticorpo de anti-suPAR monoclonal de camundongo contra su- PAR humano, diluídos em tampão de revestimento (Na2C03 a 15,1 mM, NaHC3 a 35,7mM, pH 9,6). Placas foram lavadas com tampão (PBS, 0,1% de Tween 20) e foram bloqueadas usando-se SuperBIock (Pierce Chemicals) foram diluídas de 1:1 em PBS. Amostras de plasma diluídas em tampão de diluição (KH2P04 a 7,3 mM, Na2HP04 a 50,7 mM, NaCI a 0,1 M, 0,5% de fenol vermelho, pH 7,4) foram adicionados e placas foram incubadas de um dia para a noite a 4°C. suPAR ligado foi detectado usando-se 100 μΙ de 1,0 pg/ml de conjugado de ab policlonal de suPAR anti-humano de coelho (uma espécie de doação de dr. Gunilla Hoyer-Hansen) e conjugado de ab policlonal de anticoelho de camundongo com fosfatase alcalina (Sigma, St. Louis, MO. USA), diluídos de 1:2000. Cada etapa precedida por lavagem 6 vezes com tampão de lavagem, os anticorpos foram diluídos em tampão de diluição e placas foram incubadas 1 h a 37°C. Substrato (1 comprimido de fosfato de p-nitrofenila (Sigma, St. Louis, MO, USA) em 12 ml de base de Tris a 0,1, NaCI a 0,1 M, MgCI2 a 5 mM, pH 9,5) foi adicionado às cavidades e foi incubado à temperatura ambiente por 30 minutos. As reações foram paradas por adição de 50 μΙ de NaOH a 1 M por cavidade e absorbância foi lida a 405 nm. Todas as medições de ELISA foram realizadas em duplicatas. YKL-40 foi medido por ELISA.

Estatísticas. Comparações entre grupos foram feitas com teste U de Mann Whitney. suPAR como marcador de prognóstico foi analisado usando-se análise de regressão logística. Um valor de p abaixo de 0,05 foi considerado como significativo. Todas as análises foram realizadas usando-se software SPSS (SPSS, Chicago, II, USA).

Resultados suPAR é elevado em pacientes bacterêmicos pneumocócicos. O nível de plasma de suPAR foi mensurável em todas as 141 amostras com um valor médio de 5,5 ng/ml (faixa de 2,4-21,0 ng/ml). O nível médio de suPAR no grupo de controle foi de 2,6 ng/ml (faixa de 1,5-4,0 ng/ml). Os níveis de suPAR nos pacientes bacterêmicos pneumocócicos eram significativamente mais altos do que nos controles saudáveis (fig. 5A, p=0,001). suPAR prevê o restulado da infecção. Divisão dos pacientes em um grupo que sobrevive a infecção (n = 117) e um grupo de pacientes onde a infecção terminou com morte (n=24) mostrou níveis de suPAR significativamente mais altos no último grupo (fig. 5B: p=0,0001). Dos pacientes mortos, 79% (n=19) tinham níveis de suPAR acima da média de 5,5 ng/ml.

Os parâmetros clínicos de importância de prognóstico em termos de morte devido à infecção eram, como descritos (G. Kronborg e outros, submetidos para publicação): sintomas cerebrais (confusão, inconsciência) na hora de admissão (p=0,03), hipotensão (p=0,047) e falha de rim (p=0,002); ver a tabela 1. O nível de suPAR era significativamente elevado em pacientes com hipotensão (p=0,0001) e falha renal (p=0,0001). suPAR era também elevado no grupo de abusadores de álcool crônicos (p=0,0001). Doenças subjacentes não estavam significativamente associadas a um resultado fatal de bacteremia pneumocócica, exceto quanto a alcoolismo (p=0,04). suPAR está correlacionado com YKL-40, mas não CRP. YKL-40 é uma lectina secretada a partir de neutrófilos e macrófagos (25). Quando em comparação com níveis de suPAR com os níveis de YKL-40 (n=89), é encontrada uma forte correlação entre suPAR e YKL-40 (coeficiente de correlação de classe de Spearman: 0,70, p=0,0001). A maioria dos pacientes tinham medido seu nível de CRP. Não houve nenhuma correlação entre níveis de suPAR e níveis de CRP (n=131). Níveis de CRP altos não eram prognóstico de morte. suPAR é um marcador de prognóstico independente. Em uma análise de regressão multivariada logística (Tabela 3) incluindo todos os parâmetros demonstraram ser significativo em análise univariada (sintomas cerebrais, ventilação mecânica, tratamento de hipotensão, falha renal, abuso de álcool e YKL-40) apenas suPAR permaneceu significativamente associado a morte. Pacientes com suPAR no plasma acima de 10 ng/ml tinham uma taxa de mortalidade (MR) de 13 (p=0,04) e um aumento de 1,31 por ng de suPAR (95% de Cl: 1,10-1,57). suPAR variou de 2,4 a 21 ng/ml.

Discussão Neste estudo, foi demonstrado pela primeira vez que níveis de suPAR são altamente elevados em pacientes com bacteremia pneumocóci-ca. Níveis de suPAR elevados foram anteriormente detectados em pacientes com várias formas de doenças malignas bem como em infecção por HIV-1 e em doenças de pulmão relacionadas, por exemplo, pacientes com tuberculose ativa não-tratada. suPAR no plasma é um forte preditor de morte com uma taxa de mortalidade de 1,31 por ng de aumento de suPAR (suPAR variou entre 2,4 e 21,0 ng/ml) em bacteremia pneumocócica. A partir deste estudo pode-se apenas tirar conclusões sobre o valor de prognóstico de suPAR para pacientes com bacteremia pneumocócica. Hipotensão, falha de rim, sintomas cerebrais, abuso de álcool crônico e YKL-40 no plasma elevado tinham todos eles valor de prognóstico, mas apenas níveis de suPAR elevados eram um preditor independente de morte em análise de regressão logística multi-variada. Foi sugerido suPAR no plasma como um novo marcador de prognóstico para pacientes com infecções pneumocócicas. É difícil comparar os valores de suPAR dos diferentes estudos por causa de variações de interensaio bem como diferenças nas condições clínicas dos pacientes incluídos. No entanto, suPAR parece estar altamente elevado em pacientes com bacteremia pneumocócica em comparação com controle saudáveis. Em um estudo por Riisbro e outros, 53 pacientes com câncer ovariano tinham um nível de suPAR médio de 1,3 ng/ml e indivíduos saudáveis tinham um nível médio de 0,9 ng/ml dando um aumento de 44% nos pacientes com câncer. Pacientes pneumocócicos tinham um aumento marcadamente mais alto em suPAR médio de 112% em comparação com controles saudáveis.

Foi encontrada uma correlação próxima entre suPAR e YKL-40. Na análise multivariada YKL-40 acima de 500 ng/ml, sintomas cerebrais e hemodiálise estavam associados a MR elevado, mas eles não eram de si-gnificância. suPAR no plasma elevado foi relatado a partir de um grupo (n=13) de pacientes de sépsis de ICU22, levando a especulações que a secreção de suPAR é aumentada durante a inflamação aguda. Foram compa- rados níveis de suPAR com CRP e não foi encontrada correlação. Esta constatação é suportada por Slot e outros6 que não encontraram nenhuma correlação entre suPAR e CRP em pacientes com doenças reumáticas. Assim, este estudo encontra evidência substancial para excluir a possibilidade de suPAR ser um reagente de fase agudo.

Evidência da orgiem de suPAR no plasma permanece rara. No entanto, é conhecido que uPAR consite de três domínio e divagem proteolí-tica entre domínio 1 (D1) e 2 + 3 (D2D3) torna o domínio D2D3 ativo quimi-otático10. Clivagem proteolítica é mediada tanto por seu próprio ligante, uPA, quanto por proteases diferentes, por exemplo, quimiotripsina. Foi usado um anticorpo de captura de anti-uPAR monoclonal dirigido contra o domínio 3 em nosso ELISA. Isto significa que tanto suPAR intacto quanto o domínio D2D3 quimiotático foram deletados no ensaio. O suPAR no plasma elevado visto em bacteremia pneumocócica pode ser elevado por secreção aumentada a partir de leucócitos. Durante pneumonia pneumocócica, citocinas e quimiotáticos são liberados e mortalidade aumentada está associada a um alto nível de interleucina-6 pulmonar. uPAR desempenha um papel importante tanto na imunidade inata quanto na adquirida. Em camundongos transgênicos que carecem de uPAR May23 e outros mostraram que a presença de uPAR era crucial para leucócitos para aderir ao endotélio. Camundongos de inativação que carecem de uPAR mostram uma resposta imune diminuída a S. pneumoniae com recrutamento de neutrófilo diminuído para o pulmão e camundongos que carecem de uPA tinham uma resposta imune aumentada a S. pneumoniae20. Estas observações sugerem que uPAR é necessário para recrutamento de neutrófilo mas o mecanismo é independente da capacidade proteolítica. Além da ativação de plasmina, acredita-se que uPAR medie interação de célula a célula através de integrinas e desse modo está envolvido em transdução de sinal. É bem-descrito que bactérias invasivas usam o sitema de plasmina do hospedeiro para degradar matriz celular, por exemplo, streptococos de grupo A ativam plasminogênio por estreptoquinase. O papel proteolítico possível de uPAR/uPA em migração de monócito e de neutrófilo contra Tuberculosis e Streptococcus pneumoniae necessita ainda ser investigado.

Elevações relatadas de suPAR no plasma durante a bacteremia pode refletir regulação para cima de uPAR sobre neutrófilos, monócitos ou células vasculares e indicam atividade de neutrófilo e monócito aumentada. Finalmente, similar a pacientes com tuberculose, suPAR no plasma é elevado e um preditor independente de morte em pacientes com bacteremia pneumocócica.

Tabela 3 Tabela 3 Distribuição de idade e sexo dos 141 pacientes incluídos e fatores de prognóstico em bacteremia de S. pneumoniae. A tabela mostra a taxa de mortalidade (MR) prevista pelos diferentes fatores de prognóstico. Todos os fatores na análise de regressão logística univariada eram significativos (p<0,05). Na análise de multivariada apenas níveis de suPAR acima de 10 ng/ml permaneceream significativos. Sintomas cerebrais são como definidos como inconsciência ou confusão severa na admissão. # dados estavam apenas disponíveis para 139 pacientes. Cl: intervalo de confidência.

Exemplo 4 Correlação entre positividade de cobertura para nível de suPAR e TB Objetivo: Para determinar se suPAR tem valor de diagnóstico em infecção por TB por comparação com análise microscópica.

Material e indivíduos 69 pacientes oriundos de áreas suburbanas em Bissau, a capital de Guinea Bissau foram incluídos no estudo. Critério para inclusão no estudo foi de um ou mais dos seguintes sintomas e sinais sem outra doença ex-planatória: tosse persistente (>1 mês) sem melhora com antibióticos, febre constante ou periódica por mais do que 1 mês, perda de peso, dispnéia, hemoptise, suores noturnos ou linfadenopatia. suPAR foi medido no esputo a partir de 69 pacientes. Todos os pacientes foram testados quanto a Bacilos resistentes a ácido (AFB) na microscopia de esputo. suPAR foi medido usando-se ELISA.

Resultados Todos os 69 indivíduos tinham suPAR mensurável no esputo. suPAR médio era de 24,9 ng/ml no esputo (faixa de 3,1-50,0). Nove pacientes eram positivos para AFB na microscopia direta, e estes pacientes tinham um suPAR médio de 50 ng/ml (max no ensaio, faixa de 9,73-50). Isto era significativamente mais alto entre 60 pacientes negativos para AFB em microscopia direta (suPAR médio 20,3 ng/ml; faixa de 3,1-50 ng/ml), p=0,002 teste de Mann Whitney (figura 6).

Discussão Este estudo mostra que pacientes postivos para AFB têm níveis de suPAR significativamente mais altos do que indivíduos negativos para AFB em microscopia direta. Assim suPAR porta informação de diagnóstico sobre positividade esputo de TB em pacientes com TB.

Exemplo 5 Pacientes com TB ativa têm suPAR mais alto no esputo Objetivo: Para determinar se suPAR é mensurável no esputo e se pacientes que recebem terapia tem níveis de suPAR mais baixos do que pacientes que são positivos a TB mas não recebem terapia.

Materais e indivíduos 25 pacientes oriundos de quatro áreas surbubanas em Bissau, a capital de Guinea Bissau foram incluídos no estudo. Critério para inclusão no estudo foi um ou mais dos seguintes sintomas e sinais sem outra doença explanatória: tosse persistente (>1 mês) sem melhora com antibióticos, febre constante ou periódica por mais do que 1 mês, perda de peso, dispnéia, hemoptise, suores noturnos ou linfadenopatia. suPAR foi medido no esputo a partir de 25 pacientes. Todos os pacientes tinham sinais, sintomas e mudanças de raio X compatíveis com TB ativa no tórax e com constatações de Bacilos resistentes a ácido (AFB) na microscopia direta de esputo. Sete dos pacientes receberam terapia na hora da amostragem de esputo e 18 pacientes receberam terapia depois que a amostra de esputo foi tirada. O tratamento consistia em uma fase intensiva de 4 meses de tratamento diretamente observado diário com Etambutol, Isoniazida, rifampicina e pirazinami-da foi seguido por uma fase de continuação de 4 meses com isoniazida e etambutol recebeu no centro de saúde duas vezes por mês pelo paciente. Este regime de tratamento foi recomendado para indivíduos infectados por HIV pelo programa de tuberculose nacional em Guinea-Bissau quando o projeto de pesquisa foi iniciado em 1996. Por razões de confidencialidade e comparabilidade indivíduos infectados por HIV e não-infectados receberam o mesmo tratamento. Além disso, a todos os pacientes foram dados complexo de vitamina B e multivitaminas diárias. Adesão a tratamento foi verificada por contagem de pílula e um teste de urina de INH a 2, 5 e 8 meses de acompanhamento. Pacientes ausentes foram visitados pela enfermeira e estimulados a continuar o tratamento. Drogas específicas de HIV ou tratamento pro-filático para doenças relacionadas com HIV não estavam disponíveis em Guinea-Bissau, que é um dos países mais pobres do mundo.

Resultados 18 pacientes positivos a AFB e 7 pacientes positivos a AFB mas recebendo tratamento. Houve níveis significativamente mais altos no esputo para os pacientes que não receberam terapia em comparação com os 7 pacientes com TB que receberam terapia (p=0,024) (figura 7).

Discussão Neste estudo, foi verificado que suPAR é mensurável no esputo. Mais importantemente, foi mostrado que pacientes com TB não recebendo terapia tinham níveis de suPAR significativamente mais altos em comparação com pacientes com TB depois que a terapia foi iniciada. Assim, iniciação de terapia resulta em um diminuição em suPAR no esputo e medição de suPAR no esputo pode, portanto, ser usada para monitorar eficácia de tratamento de TB.

Exemplo 6 Objetivo Para determinar se suPAR é mensurável em fluido espinhal Materiais e métodos Fluido espinhal foi obtido a partir de 23 pacientes com doença pneumocócica e a partir de 1 controle. suPAR foi medido usando-se ELISA. Resultados suPAR foi mensurável em fluido espinhal a partir de todos os 24 indivíduos incluídos no estudo. O suPAR médio foi 3,49 ng/ml de fluido espinhal. O paciente de controle tinha um valor de suPAR de 0,69 ng/ml. Discussão Aqui foi mostrado que suPAR é mensurável no fluido espinhal. Assim, a medição de suPAR em fluido espinhal pode ser usada para finalidades de diagnóstico e de prognóstico.

Exemplo 7 O nível de suPAR, não é influenciado por infecção por HCV ou por terapia de ribavirina ou alfa-interferon Fundamentos Foi mostrado que o nível de suPAR (receptor de uroquinase solúvel) aumenta em pacientes com infecção por HIV, por Tuberculosis ou por S. pneumococcal e que suPAR é um marcador de prognóstico altamente independente para estas doenças. O objetivo deste estudo era determinar se nível de suPAR está alterado por infecção por HCV e tratamento. Se suPAR for modulado por infecção por HCV, isto pode influenciar sobre o valor de prognóstico de suPAR em pacientes infectados por HIV, Tuberculosis ou S. pneumococcal co-infectados com HCV.

Indivíduos e métodos: Quarenta e sete pacientes postivos a HCV foram tratados com alfa-interferon e ribavirina por 12 meses. Todos os pacientes eram negativos a HIV e HBV. Amostras de sangue foram tiradas imediatamente antes da terapia (TO), e no fim do tratamento (T12) e 6 meses mais tarde (T18). Amostras de plasma oriundas de 30 controles saudáveis foram incluídas para comparações, suPAR foi medido usando-se ELISA e carga viral de HCV por RT-PCR.

Resultados: Houve um queda significativa em carga viral de HCV depois da terapia (amostras emparelhadas teste t, p=0,033). Não houve nenhuma diferença em níveis de suPAR entre pacientes antes do tratamento (suPAR médio: 2,58 ng/ml (faixa de 1,15-6,01), depois do tratamento (suPAR médio: 2,52 ng/ml (faixa de 1,24-6,26) e a 6 meses de acompanhamento (suPAR médio 2,43 ng/ml (faixa de 1,21-4,98). Nenhuma diferença em suPAR foi observada entre pacientes e controles (p=0,68). suPAR estava altamente correlacionado em todos os pontos de tempo (T0-T12, T0-T18 e T12-T18, todos p<0,001, todos r>0,67, correlação de Pearson). Além disso, não houve nenhuma diferença em suPAR entre os 30 respondentes e 19 não-respondentes (p=0,39).

Conclusão: O nível de plasma de suPAR permaneceu estável durante um tempo indicando o possível uso de suPAR como um marcador sorológico. O nível de suPAR no soro não é influenciado por infecções por HCV, título de HCV, por introdução de terapia de ribavirina e alfa-interferon, ou por resposta a terapia. Estes dados sugerem que co-infecção por HCV/HIV não inlfluencia suPAR como um marcador de prognóstico em indivíduos pacientes infectados por HIV, Tuberculosis ou S. pneumococcal.

Exemplo 8 A expressão de uPAR e PBMC se correlaciona com nível de soro de suPAR.

Fundamentos Para determinar se há uma relação significativa entre expressão de superfície de uPAR e nível de soro de suPAR. Métodos: Sangue foi coletado a partir 10 doadores de sangue saudáveis que atendem à clínica doadora no Hvidovre Hospital. O soro foi coletado e concentração de suPAR foi medida usando-se ELISA. PBMC foi coletado usando-se centrifugação de gradiente de Histopaq, e a expressão de CD87 foi medida usando-se anticorpo de R2, e um anticorpo conjugado com FITC secundário contra anticorpo de camundongo usando-se análise de FACS. Um anticorpo de controle negativo idiotípico foi incluído como controle de especificidade.

Resultados: Todos os doadores de sangue tinham receptor de uPAR mensurável sobre o PBMC e suPAR mensurável no soro. O níveis de suPAR no soro significativamente se correlacionaram com a expressão de superfície de uPAR (correlação de Pearson, p<0,05) (figura 8).

Discussão Aqui foi mostrada uma relação significativa de expressão de superfície de PBMC de uPAR (CD87) e o nível de soro de suPAR. Isto está de acordo com as observações de outros11 que também verificaram que uPAR em células circulantes se correlacionam significativamente com o nível de suPAR no soro/plasma. Assim, é portanto razoável admitir que a expressão de superfície de uPAR pode ser um forte fator de prognóstico em pacientes com infecção por Streptococcus pneumoniae ou por Mycobacterium tuberculosis. O CD87 (uPAR) poderia ser medido usando-se FACS e desse modo adicionar informação valiosas com referência a diagnóstico bem como o status de progressão dos pacientes.

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REIVINDICAÇÕES

Claims (11)

1. Método para avaliação da progressão do estado de um indivíduo que sofre de uma infecção bacteriana respiratória ou de bacteremia pneumocócica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) realizar in vitro uma medição do nível de um ou mais marcadores selecionados do grupo consistindo em (i) receptor de ativador de plasminogênio de uro-quinase (uPAR), (ii) receptor de ativador de plas-minogênio de uroquinase solúvel (suPAR), e (iii) um ou mais produtos de degradação de (i) ou (ii), em cada uma de um número de amostras de fluido biológico oriunda de um indivíduo, sendo que as ditas amostras são obtidas em pontos de tempo diferentes, e (b) comparar os valores de medição obtidos, sendo que a diminuição nos níveis em relação ao tempo indica uma melhora no estado do indivíduo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana respiratória é uma infeção por Streptococcus pneumoniae.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana respiratória é uma infecção por Mycobacterium tuberculosis.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo avaliado está em um regime de tratamento.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico é uma amostra de urina.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico é uma amostra de soro ou sangue.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é efetuada por meio de um bastão.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é efetuada usando-se ELISA.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador é um receptor de ativador de plasminogênio de uro- quinase solúvel (suPAR).

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de simultaneamente confirmar in vitro a infecção por uma bactéria pneumocócica, sendo que uma diminuição nos níveis em relação ao tempo, em indivíduos infectados, indica uma melhoria no estado do indivíduo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de simultaneamente confirmar in vitro a infecção por um patógeno bacteriano respiratório, sendo que uma diminuição nos níveis em relação ao tempo, em indivíduos infectados, indica uma melhoria no estado do indivíduo.