CN1289409A - PAI－2和t－PA作为牙周病的诊断指标 - Google Patents

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Abstract

通过测定龈缝液(GCF)中纤溶酶原激活剂抑制剂2(PAI－2)和/或组织型纤溶酶原激活剂(t－PA)可以诊断牙周病的存在和程度。在牙周病情况下,GCF中PAI－2和t－PA水平显著升高,这些变化也与同一病人不同部位牙周病的严重程度相关。

Description

PAI-2和t-PA作为牙周病的诊断指标
本发明背景
牙周病可能是已知的人最常见的疾病，据说，四分之三的成年人群受该病困扰。由于牙周病引起的牙周组织的丢失是成年期牙齿丧失的主要原因。牙周组织丢失可因感染性疾病(例如，细菌引起的牙龈炎)，营养性疾病(例如，坏血病)或肿瘤引起。一般而言，牙周组织丢失伴随有炎症，出血和溃疡。如果不作治疗，牙周组织丢失可使牙齿松动，最终可引起牙齿和牙槽骨组织的丧失(牙周炎)。
牙龈炎和牙周炎引起受影响的牙周袋(牙龈沟)的肿胀。在患病牙龈中所观察到的牙龈袋比正常的牙龈沟深得多。这种肿胀的牙龈袋难以用牙刷或细棉线清洁干净，因此，细菌和菌斑易在此袋中蓄积，进一步加重此袋的肿胀，牙周线和起支持作用的牙槽骨最终遭受破坏，导致牙齿丧失。
为了能有效地治疗牙周炎，鉴定牙周袋内活动性牙周炎的存在及其严重程度是必要的。即使深的牙周袋也未必与活动性牙周病的存在相关，因此，测量牙周袋深度的传统方法并不是确定牙周炎程度的准确指标。显然，确定活动性牙周病存在及其程度的更准确的方法是迫切期望的。
本发明概述
所以，本发明的目的之一是提供诊断牙周病的方法。本发明的另一目的则是提供诊断牙周炎的检测试剂盒。
在完成前述的目的方面，根据本发明的一个目的，业已提出了诊断牙周病的方法，该法包括以下步骤：(a)测定取自患者不同牙龈部位的一个部位的单个龈缝液(GCF)样品中的一种蛋白水平，其中该蛋白选自由以下蛋白之一组：(ⅰ)组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和(ⅱ)纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)；(b)、求得GCF中该蛋白的平均水平，并利用该平均水平诊断牙周病。
根据本发明的一个目的，提供诊断牙周病的方法，该法包括以下步骤：(a)测定单个龈缝液(GCF)样品中的蛋白水平，每个样品取自患者众部位中的一个部位，该蛋白选自由以下二种蛋白组成的一组蛋白：(ⅰ)组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和(ⅱ)纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)；(b)比较取自不同部位样品中的蛋白水平，不同部位之间蛋白水平的统计学显著差异表明牙周炎的诊断成立。
还是根据本发明的一个目的，提供诊断牙周病的方法，该法包括以下步骤：
(a)测定取自患者多部位的单个龈缝液(GCF)样品中的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的水平；(b)求得GCF样品中t-PA的平均水平，并以此平均水平用于诊断牙周病。在一个实施方案中，该法可进一步包括患者GCF样品中平均t-PA水平与预先测定的健康人GCF样品中平均t-PA水平的比较，其中GCF中平均t-PA水平的统计学显著升高指示牙周病的存在。
此外还根据本发明的另一个方面，提供一种诊断牙周病的方法，该法包括以下步骤：(a)测定取自患者多部位的单个龈缝液(GCF)样品中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)水平；(b)比较不同部位GCF样品中的t-PA水平，其中不同部位之间t-PA水平的统计学显著差异指示牙周病的存在。
还是根据本发明的一个目的，提供一种诊断牙周病的方法，该法包括以下步骤：(a)测定取自患者多个部位的单个龈缝液(GCF)样品中纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)水平；(b)求得GCF中PAI-2的平均水平，并应用该平均水平来诊断牙周病。在一个实施方案中，步骤(b)可以进一步包含患者GCF样品中PAI-2平均水平与预先测定的健康人GCF样品中PAI-2平均水平的比较，其中GCF样品中PAI-2平均水平的统计学显著增加指示牙周病的存在。
仍然根据本发明的一个目的，提供一种诊断牙周病的方法，该法包括以下步骤：(a)测定单个龈缝液(GCF)中纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)的水平，每一样品取自患者不同部位中的一个部位；(b)比较不同部位GCF样品中PAI-2水平，其中不同部位之间PAI-2水平的统计学显著差异指示牙周病的存在。
根据本发明的一个深一层的目的，提供一种诊断牙周病的方法，该法包括以下步骤：(a)测定取自患者多个不同部位的单个龈缝液(GCF)样品中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)水平和纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)水平；(b)求得GCF样品中t-PA水平和PAI-2的各自均值，利用该均值来诊断牙周病。
在一实施方案中，将患者GCF中t-PA和PAI-2水平的各自均值与预先测定的健康个体GCF中t-PA和PAI-2水平的均值分别加以比较，其中GCF中两种蛋白平均水平的统计学显著增高指示牙周病的存在。
根据本发明的一个深一层的目的，提供一种诊断牙周病的方法，该法包括以下步骤：(a)测定取自患者多个部位的单个龈缝液(GCF)样品中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)的各自水平；(b)相互比较不同部位的t-PA水平，相互比较不同部位的PAI-2水平，凡是不同部位之间t-PA水平和PAI-2水平都显示统计学显著升高的，表明有牙周病存在。
上述本发明每个方面的特定实施方案中，从患者二个或二个以上部位，局部地收集GCF样品。在另一种实施方案中，GCF样品局部地采自若干部位，这些部位选自下牙上正中部位，颊部位和唇部位所组成的一组部位。在深入的实施方案中，步骤(b)还进一步包括患者GCF中蛋白平均水平与预先测定的健康人GCF中蛋白平均水平的比较，凡是GCF中平均蛋白水平显示统计学上显著增高的，表明有牙周病存在。
还根据本发明的另一目的，提供一种用于检查牙周病的诊断试剂盒，其组成包括：(a)至少一种抗体，它能与选自以下一组抗原的一种抗原选择性地结合；(ⅰ)组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和(ⅱ)纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)；(b)至少一种抗原浓度已知的对照标准品；(c)一种适宜的容器。在一实施方案中，这种试剂盒包括能用该抗体定量测定抗原浓度的检验方案。在另一实施方案中，这种试剂盒的检验方案是酶联免疫吸附试验。在又一个实施方案中，该试剂盒进一步包括一种局部收集龈缝液的方法。在进一步的实施方案中，这种龈缝液采集法使用一种吸附材料，优选的是滤纸。
从下面的详细说明中，本发明的其他目的，特征和优点将是显而易见的。但是，应该了解，这种详细说明和这些专门举例，尽管表明是本发明的优选实施方案，只是以说明的方式加以介绍，因为本领域的技术人员从这种详细说明中会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
图的简要说明
图1，健康的，牙龈炎和牙周炎牙部位GCF中t-PA和PAI-2(ng/ml/min)的绝对量。
图2，牙周病的牙部位GCF中t-PA和PAI-2水平与临床参数之间的关系(GCF=龈缝液体积，PD=袋深度，GI=牙龈指数)。
图3,GCF中t-PA和PAI-2之间的关系。
图4，健康，牙龈炎和牙周炎组的相同病人在相同疾病状态下不同部位的GCF中t-PA和PAI-2水平。
图5，健康、牙龈炎和牙周炎组的相同病人在相同疾病状态下不同部位GCF中t-PA和PAI-2水平差异出现率。
图6，牙周治疗后二周GCF中t-PA和PAI-2水平。
图7，牙周治疗前和治疗后二周GCF中t-PA和PAI-2水平的变化。
优选实施方案的详细说明
本发明提供通过测定龈缝液(GCF)中PAI-2和/或t-PA水平来诊断牙周病的方法。
本发明基于这样一种发现：牙周病的GCF中PAI-2和t-PA水平显著升高，该病治疗后则降低，并与牙周状况的严重程度相关。因此，牙周病的存在及其严重程度可以通过测定病人的GCF中PAI-2和t-PA水平，加以诊断。牙龈炎症，牙周结缔组织破坏以及最终牙槽骨的吸收可能是由中性蛋白水解酶所介导的。白细胞，成纤维细胞和细菌都已被涉及是这种蛋白水解酶的可能来源。Uitto,J.Periodontol,54:740-745(1983)。
在许多炎症介导的情况下，PA-纤维蛋白溶酶蛋白水解系统一直受到相当大的重视，因为在各种生物活性以及包括组织破坏在内的病理条件下都有它的参与。在控制细胞外基质的蛋白水解方面，纤溶酶原活化的调节是一个关键因素，而这种调节是通过特异性纤溶酶原激活剂抑制剂的作用得以完成的。在炎症部位，细胞迁移和组织重建过程中都有纤溶酶原激活剂/抑制剂系统参与。Vassalli et.al.临床研究杂志，88:1067-1072(1991)。尤其是，活化基质金属蛋白酶的纤维蛋白溶酶依赖的通路对于诱导基质降解，被认为是一种有意义的机制。Birkedal-Hansen et al.Grit.Rev,Oral biol Med.4:197-250(1993)。
纤溶酶原激活剂(PA)是丝氨酸蛋白酶，它使纤溶酶原转化为纤维蛋白溶酶，这是一种胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶，不仅司纤维蛋白的降解，而且通过将潜伏胶原酶转化为活性胶原酶，对细胞外基质的降解和更新，直接或间接地发挥作用。kruithof，酶40:113-121(1988)。事实上，纤维蛋白溶酶依赖的通路，对于由基质金属蛋白酶引发的细胞外基质降解而言，被认为是一条有意义的补充通路。见前述Birkedal-Hansen等。
借助循环于血浆和间隙液的无活性的纤维蛋白溶酶前体纤溶酶原的有限蛋白水解作用，纤维蛋白溶酶也能在炎症部位局部地形成。Deutsch等，科学170:1095-1096(1970)。纤溶酶原被尿激酶型样纤溶酶原激活剂(u-PA)或组织型样纤溶酶原激活剂(t-PA)所激活。这些催化反应通常发生在血膜上(u-PA)或纤维蛋白表面(t-PA)。这些有活化作用的酶由大量的间质细胞，上皮细胞和内皮细胞随各种细胞因子和生长因子而产生。因此，在炎症部位，纤溶酶原活化系统向上调控的潜力是大的。作为结果形成的活化纤维蛋白溶酶能降解大量的底物，包括细胞外基质大分子(胶原除外)和纤维蛋白。在细胞外，纤维蛋白溶酶及其具有活化作用的蛋白酶的活性通过多种蛋白酶抑制剂，包括α2-巨球蛋白，α1-蛋白酶抑制剂，α2-抗纤维蛋白溶酶，纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)和纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)而受到调控。通过PA抑制剂(PAI)来实现的这种PA活性调控方式也受激素调控。
Andreasen等分子细胞内分泌杂志，68:1-19(1990)
PAI依其活性形式，由内皮细胞和巨噬细胞所产生，它特异地抑制u-PA和t-PA活性。Andreason等，见前述；Simpson等临床病理学杂志44:139-143(1991)。而且业已证明PAI-1是一种细胞外基质成份。Knudsen等，生物化学杂志263:9476-9480(1988)。这种抑制剂可以保护ECM成份以免遭细胞蛋白酶水解。从而影响在发育，炎症和肿瘤转移期间出现的细胞迁移和组织破坏。培养细胞中PAI-1的活性受多种激素和细胞因子的调节，包括地塞米松(Lund等：分子细胞内分泌杂志，60:43-53(1988)),IL-1(Emeis等，实验医学杂志163:1260-1266(1986)),TNF-α(Sawdey等，临床研究杂志，88:1346-1353(1991))和TNF-β(Laiho等，细胞生物学杂志103:2403-2410(1986))以及LPS(Ogura等，J.Periodont Res.30:132-140(1995)；Riedo等免疫学杂志144:3506-3512(1990))。这些炎性介导物增强细胞纤维蛋白溶酶活性，后者可能依赖于其对PAI-1的作用。
Kruithof等在血液86:4007(1995)发表的论文中详述PAI-2的性质，现特此引入作为参考。简言之，PAI-2是一系统的一种成份，该系统在各种生理过程中，例如组织重建，细胞迁移，伤口愈合和血管生成过程中，它调节细胞外的蛋白水解作用。见前述Kruithof。
PAI-2在胎盘中以及由巨噬细胞生成，妊娠妇女血浆中能检出PAI-2，但男性和未妊娠妇女血浆中能检出的罕见。Lecander等，纤维蛋白溶解3:27-30(1989)。新近的研究证明，PAI-2的组织分布广泛。业已证明，PAI-2由培养物中多种细胞产生，包括单核细胞/巨噬细胞系，成纤维细胞，以及成纤维样细胞，包括胎儿肺细胞，包皮，人滑液移出物以及骨髓基质。在大部分这些细胞系中，已广泛研究PAI-2的表达。基础的PAI-2表达是低的，或是不可检出的，但是，在适当的刺激后，PAI-2可能成为细胞提取物中的一种主要蛋白。见前述Kruithof等。PAI-2的表达受多种因子的调控，包括LPS(Whawell等，组织病理学)27:75-78(1995)；Saksela等，细胞生理学杂志，122:125-132(1985)),TNF(Kumar等，生物化学杂志266:20960-20964(1991))，白细胞介素-1(Michel等，免疫学杂志，143:890-895(1989))；Hamilton等，免疫学杂志151:5154-5161(1993))以及其他细胞因子和生长因子(Hamilton等，免疫学杂志151:5154-5161(1993))。
在人组织中，u-PA以几种不同的形式存在，包括单链u-PA(Scu-PA)，高分子量u-PA(HMWu-PA)，低分子量u-PA(LMWu-PA),u-PA/纤溶酶原激活剂抑制剂复合物以及作为一种u-PA/u-PA受体复合物。Naitoh等，日本癌症研究杂志，86:48-56(1995)；Moller等，血液凝集和纤维蛋白溶解4:293-303(1993)。
纤溶酶原激活剂系统的局部总活性高低取决于激活剂，纤溶酶原和抑制剂之间的相互作用。不同化合物的相互作用取决于它们的相对拓扑图定位。令人惊奇的是，相当少的研究探索发炎牙周组织中纤溶酶原激活剂系统的存在和活性。
牙龈组织中纤溶酶原及其抑制剂的分布
本发明人已研究了人牙龈成纤维细胞以及健康的和发炎的牙龈流出物中纤溶酶原及其抑制剂PAI-1和PAI-2的分布。结果显示，正常人牙龈成纤维细胞能表达t-PA,u-PA和PAI-1。此外，观察了存在于健康组织和发炎组织中的纤溶酶原激活剂类型的变化。例如，在结缔组织中t-PA显著增高，在发炎的细胞中，u-PA得到广泛的表达。从正常组织到发炎组织纤溶酶原激活剂抑制剂的变化这一事实表明，PAI-1和PAI-2受到发炎细胞广泛表达，并且还证明，部分但不是全部成纤维细胞可表达PAI-2。
纤溶酶原激活剂可能参与牙周炎的发病机理，t-PA活性也可能是一种牙周结缔组织的内环境稳定的调制器。先前的研究已证明，高浓度的t-PA存在于发炎牙龈组织中的龈缝液中，牙周治疗后则t-PA的浓度降低。见kinnby等，斯堪的纳维亚牙科学研究杂志(scand.J.DentRes)102:334-341(1994)；Kinnby等，牙周病学研究杂志(31:271-277(1996),Brown等，Arch Oral Biol.40:839-845(1995)。但是，缺乏下述资料：同一牙周病病人部位特异的t-PA和PAI-2活性；健康组、牙龈炎组和牙周炎组之间t-PA和PAI-2水平的比较；牙周炎治疗前后t-PA和PAI-2水平的比较。
而且，从牙龈卟啉单胞菌和牙髓卟啉单胞菌提取的蛋白酶可刺激牙龈成纤维细胞，使分泌人培养介质中的胶原酶和纤溶酶原激活剂的量增高。Uitto等，传染病免疫杂志1989:57:213-218；Oikawa等，国际生物化学杂志1993:25:1227-1231。此外，有人已提出，活化后的纤维蛋白溶酶通过活化基质金属蛋白酶，在牙周组织炎症形成过程中起作用。见前述Birkedal-Hansen等。
体外试验已证明，巨噬细胞可刺激成纤维细胞以活化纤溶酶原，IL-1可刺激牙龈成纤维细胞以产生PA活性。Mochan等。牙周病学研究杂志23:28-32(1988)。而且，内皮细胞在其可以接触IL-1的腔侧，能分泌t-PA。Van Hinsbergh等，国际放射生物学杂志60:261-272(1991)。本发明人采用免疫细胞化学染色技术证明，t-PA定位于正常人牙龈成纤维细胞的胞浆中。这表明牙龈成纤维细胞可能是炎症期间结缔组织中t-PA的来源。致炎的牙龈结缔组织中t-PA的显著增加这一事实表明，来自革兰氏阴性细菌的毒性因子，如脂多糖，也可以诱导结缔组织中t-PA的表达，后者接着再引起牙周组织的破坏。
值得注意的是，业已证明，龈缝液中存在相当大的u-PA量，但指出发炎的和健康的状态之间并没有显著差别。Kinnby等，斯堪的纳维亚牙科学研究杂志102:334-341(1994)。牙周组织中u-PA的可能来源包括有增殖能力的内皮细胞和巨噬细胞。体外试验已证明，这些细胞在适当活化后，可以使u-PA的生成量增加。Manchanda等，免疫学杂志145:4174-4180(1990)。而且，接触直肠弯曲杆菌LPS的牙龈成纤维细胞释放入培养介质中的u-PA量增加。Ogura等，牙周病学研究杂志30:132-140(1995)。本发明人已证明，正常人牙龈成纤维细胞具有细胞内u-PA高表达。研究发现，健康的和发炎的牙龈组织之间结缔组织表达u-PA并没有差别。
本发明人还证明，正常牙龈成纤维细胞对PAI-1呈强染色，健康的和发炎的牙龈组织之间结缔组织中PAI-1的表达没有差别。PAI-1广泛分布于整个牙龈组织这一点表明，PAI-代表t-PA和u-PA的主要生理性抑制剂。
根据本研究，在龈缝液中发现的PAI-2看来至少有二个可能的来源：牙龈成纤维细胞和巨噬细胞。此外，巨噬细胞的活化也可能导致PAI-2生成量增高。Wohlwend等，实验医学杂志165:320-339(1987)。本发明人已鉴定发炎的牙龈组织中PAI-2的定位，像某些成纤维细胞克隆表达的一样，也是在炎性部位内。这可以解释慢性炎症期间纤维蛋白的沉积。
在发炎的牙龈组织中的炎性细胞区域能检出PA/PAI，这表明贮存在单核细胞和巨噬细胞细胞浆中的PA/PAI可能是在炎症反应的某些阶段能得以释放出来的PA/PAI活性的储备库。看来这种细胞内贮存形式的存在使得有可能利用免疫组织化学技术检测牙周组织中的PA/PAI。
所以，本发明人已证明，纤溶酶原激活剂系统在与进行性牙周炎症相关的结缔组织破坏方面，起重要作用。
GCF中t-PA和PAI-2水平的测定
本发明人还证明，GCF中PAI-2和/或t-PA浓度的升高，对活动性牙周病具有诊断价值，PAI-2和/或t-PA的相对水平与该病的严重程度相关。
GCF的取样方法是本领域的技术人员所熟知的，能可靠提供大体上不受唾液污染的GCF样品的任何采样方法都可应用于本发明。一种方便的方法是，可以用一种无菌吸附材料，例如滤纸，采集GCF样品，即把滤纸置于牙龈袋中一定时间。吸附在吸附材料上的GCF体积可以用本领域的技术人员所熟悉的方法测定，例如，可以用Periotron6000(Pro Flow公司，纽约)。用缓冲提取法可以将GCF从吸附材料上洗脱下来，然后测定t-PA和PAI-2浓度。
测定特种蛋白浓度的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，酶联免疫吸附试验(ELISA)可以优先采用。本领域技术人员也知道用别的方法测定t-PA和PAI-2浓度。例如，t-PA是一种在基质特异性，催化速率等生化特性已知的丝氨酸蛋白酶，因此，t-PA浓度可以用标准酶试验测定。适宜的测定方法是本领域技术人员熟知的。
一种有好处的方法是，从同一病人多个牙龈组织部位采集GCF样品，这样使得有可能比较不同部位间的t-PA和PAI-2水平。有代表性的方法是，在GCF采集前，用以探针深度(PD)和牙龈指数(GI)为基础的标准临床诊断指标，评定牙龈部位状态。用这些标准诊断指标就可以比较外观显示相似疾病程度的部位。发现t-PA和PAI-2水平升高与活动性牙周病的存在相关。此外还发现由几个部位采集的GCF样品PAI-2和t-PA平均浓度的显著升高与活动性牙周病的存在高度相关。
GCF可从任何适当的牙龈部位采集，尽管一般采用中间诸部位，因为该部位比远端部位易于接近。在下牙，与舌部位相比，后牙和前牙更可取些，因为在采样期间，这些部位的GCF样品较少受唾液污染。一种有助的方法是，通过用刮匙(举例)除去牙龈上的明显斑点，清洁样品采集部位，接着用适宜的物理载体，例如棉花卷，小心地把这些部位与唾液隔离开。
通过简单地比较不同部位t-PA和/或PAI-2浓度，可以作出同一病人不同部位之间活动性牙周炎程度的诊断。t-PA和/或PAI-2水平升高表明有活动性牙周炎存在。一种有助的方法是，可以与从同一病人临床上外观正常的部位所采集的GCF中的t-PA和PAI-2水平作比较。另一个办法是，可以测定若干部位之间的t-PA和PAI-2平均水平，并与标准值加以比较。一般而言，临床上(牙周)健康病人的t-PA和/或PAI-2水平为约2-3ng/ml，患牙龈炎病人为约4-5ng/ml。通过比较，患牙周炎病人的t-PA和PAI-2水平显著增高，例如7-10ng/ml。在本发明的上下文中，如t-PA和/或PAI-2水平达约7ng/ml或以上，考虑诊断为有活动性牙周病存在。
上面一般性地阐述的本发明，通过参考下面的实施例，会更易理解，这些实施例是以说明的方式加以介绍，意图并不是用来限制本发明。
实施例1：牙龈组织中t-PA、u-PA和PAI-2表达的分析
A．细胞培养和免疫细胞化学染色
按Bartold等，生物化学与生物物理学档案253:399-412(1987)报告的方法，通过取自健康供者的正常牙龈组织的移出培养，获得人牙龈成纤维细胞。在补充10％胎牛血清(FCS)、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、和非必需氨基酸的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中，在5％CO2和95％空气的湿环境和37℃条件下，培养细胞。使用第5和第8次传代之间的细胞。
细胞培养用的盖玻片经高压锅消毒过，置于4孔平板中(Nunclon,Roskilde，丹麦)。以每孔20 000个细胞的初始密度，将细胞接种到4孔平板中，让其在含10％FCS的DMEM培养基中在盖玻片上附着和扩散24-48小时。移去培养基，细胞用磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤二次，每次5min，在无FCS的DMEM中，存在或缺乏4ng/ml IL-1β(ImmunexCorporntion,Seattle WA)温育10小时后，移去培养液，用PBS洗涤细胞2次，每次5分钟。所有细胞在4％多聚甲醛溶液中固定20min，然后用PBS洗涤二次，每次5min。细胞膜用含0.2％曲拉通X-100的PBS渗透12min，接着用PBS洗涤二次，每次5min。
免疫细胞化学染色用5μg/ml稀释度的t-PA,u-PA,PAI-1和PAI-2原始抗体，按如下方法进行。
B．组织制备
本研究包括4个病人(16块发炎牙龈组织)和2个健康人(6块健康的牙龈组织)。在每种情况中，都根据临床和组织学指标，将发炎的和健康的牙龈组织作出诊断。临床的选择标准是基于以治疗为基础的判断，包括为了处理袋深大于6mm，探针探查时持续出血，x线照相显示骨破坏以及对牙周保守治疗(发炎部位)无反应的部位而行牙周外科手术所获取的样品。临床非发炎的组织样品在对附着物丧失最小，探针探查时无出血、x线照片上显示的骨丧失最轻的部位作牙冠延长术后获得。还进行了组织样品的组织学评价，并根据多形核白细胞和淋巴细胞的存在情况，判断是否存在明显的炎症。虽然所有样品都显示某些炎性细胞侵润的证据，但发炎的样品的选择是以50％以上的组织显示炎性细胞侵润为基础的，而正常的组织样品的选择是以小于5％的组织被这些细胞侵润为基础的。所有样品都包埋于OCT-Tissue-Tek Ⅱ(Miles Laboratories,Napierville,U.S.A)中，在液氮中急速冻结，并在液氮中保存。用冷冻恒温器制备切片(5μm)，在丙酮中固定，空气干燥，并用于免疫细胞化学染色。
C．免疫组织学所用的抗体
下述的单克隆抗体用于免疫组织学。单克隆小鼠抗t-PA IgG(no.104201；Biopool,Umea，瑞典)，它与人组织纤溶酶原激活剂的A链结合。该抗体与人单链组织纤溶酶原激活剂和蛋白水解修饰的双链组织纤溶酶原激活剂起中等度反应。单克隆小鼠抗u-PA IgG(No3689；American Diagnostic)对准人尿激酶靠近催化部位的B链抗原决定部位。该抗体与游离的和与受体结合的单链和双链尿激酶及B链片段反应。抗由人黑素瘤细胞株分泌的纯化活性PAI-1的单克隆的小鼠抗PAI-1IgG(No.3785；American Diagnostic)已有生产。使用单克隆的小鼠抗-PAI-2IgG(Biopool,Vmea，瑞典)，该抗体与存在于妊娠妇女血浆中的高分子量(60kDa)的PAI-2形式以及存在于胎盘中的低分子量(48kDa)的PAI-2都起反应。该抗体也能与2-链t-PA/PAI-2和u-PA/PAI-2复合物起反应，但亲和力较低。
D．免疫组织化学方法
全部免疫染色操作步骤均在室温条件下进行。在免疫过氧化酶染色前，先将组织切片与0.3％H2O2温育20min，消除内源性过氧化物酶活性。所有组织切片都用含2％猪血清的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭。抗t-PA,u-PA,PAI-1和PAI-2的单克隆抗体以10μg/ml的稀释度(用PBS作稀释剂)加入到组织切片中，温育60min。在与原始抗体温育后，用PBS溶液淋洗切片。然后将切片与生物素化的猪抗小鼠，兔和山羊抗体(DAKO Multilink CA,USA)温育15min，接着与辣根过氧化物酶结合的亲合素-生物素复合物(ABC)温育15min。加入缓冲的二氨基联苯(DAB)后4min，肉眼可见抗体复合物。将切片用PBS浸泡和淋洗，使反应终止。切片然后用Mayer氏苏木精和Scott氏蓝轻微地复染，每种染色各40秒钟，其间用流水冲洗3min。然后切片用浓度递增的乙醇脱水，用二甲苯透明，再用DePeX封固剂(英国BDHLaboratory Supplies)滴入切片，加上盖玻片封固。
进行该免疫染色操作的对照包括下面二种情况：省略初级抗体或次级(抗小鼠IgG)抗体，以及采用抗一种蛋白的无关抗体(膜表面抗体CD15)作为对照，该抗体不应存在于试验切片中。
为了保证方法本身不引起非特异染色，采取了各种安全措施。这些措施包括在其他染色步骤都存在下取消原级抗体的温育步骤；正常的原级抗体温育后取消加次级抗体这一步骤，或者取消其他后续检查步骤中的一个步骤。
E．免疫组织学染色玻片制备物的评价
用奥林巴斯系统显微镜(BX50型，日本东京)观察切片并用照相形式记录。对发炎的样品，观察了16张顺序编排的切片，并用图像分析法加以扫描，对于非发炎的样品，6张顺序编排的切片接受分析。结缔组织中各种组织成份的相对染色强度用图像分析(仪)(ComputerImage System,NIH vesion1.57)测量。对每张切片，结缔组织内(60μm2)的三个单独的部位加以扫描，并表达为每单位面积一读数。健康组和发炎组之间的差别用学生t-检验作分析。显著性水平设定为P＜0.05。
F．结果
(ⅰ)前纤维蛋白激活剂/抑制剂在培养的牙龈成纤维细胞中的表达。
在培养的牙龈成纤维细胞中，发现t-PA,u-PA和PAI-1表达于细胞浆中，并集中在核周围。尤其是，u-PA和PAI-1在这些细胞中的染色深。在这些细胞中也可看到t-PA的免疫染色，但是染色强度弱。用上面介绍的检查方法，正常牙龈成纤维细胞中的PAI-2染色不能检出。细胞经IL-1β处理后，t-PA的染色增强，在部分单个细胞中，PAI-2得到强表达。在IL-1β处理过的细胞中，u-PA和PAI-1的染色强度无明显差别。
(ⅱ)健康和发炎牙龈组织中t-PA和u-PA的染色
在健康组织，结缔组织中t-PA的染色弱。成纤维细胞和细胞基质呈轻度染色。在发炎的牙龈组织中，结缔组织中t-PA的表达比健康牙龈组织强得多。所有成纤维细胞和细胞基质都呈强染色。还观察巨噬细胞/单核细胞中细胞浆的t-PA染色，但与结缔组织中的染色相比，发炎细胞区域中t-PA的分布较弱。在血管周围，t-PA抗原得到非常强的表达。在正常的和发炎的牙龈上皮中的t-PA染色未观察到。
观察到上皮和结缔组织中u-PA的广泛分布。在健康牙龈组织中，成纤维细胞和细胞基质u-PA染色弱。在发炎组织中，结缔组织u-PA染色稍加重些。在大多数巨噬细胞/单核细胞细胞浆的颗粒型中可观察到u-PA抗原。在健康结缔组织和发炎区域，其染色强度相似。用密度计对切片扫描证实这种肉眼观察评价，表明与健康组织相比，炎症组织中结缔组织基质的t-PA染色强度显著增高(P＜0.01)。炎症组织中结缔组织基质的u-PA染色强度轻微增高，但无(统计学)显著差别(P＞0.05)。从健康组织到发炎组织纤溶酶原激活剂染色强度的相对变化见表1。
表1健康的和发炎的牙龈组织
中纤溶酶原激活剂/抑制剂的分布
健康组织
      上皮    结缔组织
t-PA     -    +
u-PA     +    +
PAI-1    +    +
PAI-2    +    -
发炎组织
        上皮  结缔组织    巨噬细胞
t-PA     -         +++    +
u-PA     +         +++    ++
PAI-1    +         +++    ++
PAI-2    +++       -      +++
注：-：无反应性
+：轻微或轻度的反应
++：显著的反应
+++：极显著的反应
(ⅲ)健康的和发炎的牙龈组织中PAI-1和PAI-2染色
用免疫组织化学技术，在健康的和发炎的牙龈结缔组织中都可检查出PAI-1。在健康组织中，其结缔组织的细胞外基质和成纤维细胞中PAI-1染色弱。在发炎的组织中，结缔组织中的PAI-1染色强度轻微增加，巨噬细胞/单核细胞中的(PAI-1)表达较广些。
在健康组织，结缔组织中未观察到PAI-2染色，而在发炎组织中，PAI-2显著地定位于巨噬细胞/单核细胞以及某些成纤维细胞。在结缔组织细胞基质中未观察到明显的(PAI-2)染色。健康的和发炎的牙龈组织中上皮细胞染色无差别。见表1
一般而言，炎性细胞广泛地显示出PAI-1和PAI-2染色，而某些成纤维细胞显示PAI-2表达增高。染色切片的密度计扫描表明，结缔组织基质中PAI-1染色强度轻微增加，但与发炎组织相比，这种变化并无统计学意义(P＞0.05)。未观察到健康的和发炎的结缔组织基质中PAI-2存在差别。
实施例2:GCF中t-PA和PAI-2水平的分析
A．病人选择标准
33个有不同牙周情况的病人被选用，其中男性14例，女性19例，年龄为20-55岁。在过去半年中，所有病人都未接受过牙周治疗或抗菌素治疗。本研究得到伦理上的准许，所有病人都表示同意参加本研究。以综合的X线照片和临床诊断标准为基础，将病人分配到三个组(健康组，牙龈炎组和牙周炎组)。临床检查包括探针探测的深度(PD)，牙龈指数(GI)以及X线检查所发现的牙槽丧失的证据。GI得分系以牙龈外观(红色和肿胀)和探针探测时牙龈袋出血为根据，分为0-3分，0分表示牙龈无炎症；1分表示牙龈轻微红斑，探针探测时无出血现象；2分表示中等度红斑，探针探测时有出血；3分表示显著的红斑和有自发的出血倾向。探针探查在GCF取样后进行。临床健康组外观牙龈无炎症指征，或无病史证据，并规定PD＜2mm,GI＜1以及无骨丧失征候；牙龈炎组规定为PD＜3,GI=1-2，以及无骨丧失征候；牙周炎组规定为PD＞3,GI＞2以及明显的骨丧失证据。在健康组中，从6例健康病人选择20个部位作GCF采样；在牙龈炎组中，从7例牙龈炎病人选取17个部位采集GCF样品；在牙周炎组中，从20例牙周炎病人中选取45个部位采集GCF样品。此外，从11例牙周炎病人中，根据牙周炎的严重程度(PD＞6mm；GI＞2)，在牙周治疗观察后选取24个部位作进一步的GCF分析。
B．龈缝液(GCF)采集
在每个病人，根据具有相同的临床表现(相同的GI,PD和X线检查)，选取2-4个部位作GCF采集。就部位选择来说，选择的是中间诸部位，因为与远端部位相比，它们较易够得着。在下牙上，正中/唇部位比舌部位是优选的，因为(在采样期间)这些部位的GCF样品较少受唾液污染。用刮匙除去牙龈上的明显斑点，以清洁采样部位，用棉花卷小心地把采样区域与唾液隔离开，慢慢地空气干燥。将无菌的2×10mm大小的whatman 1号滤纸(whatman international Ltd,Springfield Mill,Maidstone,Kent英国)缓慢地插入牙龈缝1min。操作要小心以避免组织的机械损伤。滤纸条上GCF体积用Periotron6000(RPO FLOW Incorporated，纽约)测量，剪下含液体样品的纸条部分，并将其置于50μl Tris缓冲液(12mM Tris,0.1M NaCl,0.05％TWeen20)的微型离心管中。将样品涡旋混合，并在室温贮放1小时。弃滤纸条，分析前样品溶液置-20℃冻结保存。Periotron6000用测量范围为0.1μl-1.0μl的1μl Hamilton注射器，用蒸馏水每次0.1μl作校准。每一数值测量3次，每一体积的平均值用于直线回归分析，后者的斜率和截距用于测量所采集的GCF样品的体积。
C．酶免疫试验
分析前，GCF样品置室温融化，并涡旋混合。分析每个样品的t-PA和PAI-2水平。
用设计用于定量测定人组织型纤溶酶原激活剂抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(IMUBIND total t-PA stripwell ELISA，American Diagnostics Inc.，英国格林威治)检测t-PA抗原水平。与非复合物的t-PA相比，复合物中单链和双链t-PA与α2-AP,PAI-1和PAI-2的免疫反应性为85％。样品作双份分析，其平均吸光度值用于校准t-PA浓度。
取20μl样品，用澳大利亚生物技术公司(Biotech Australia)研制的标准夹心ELISA试剂盒测定PAI-2抗原水平。该试验采用兔多克隆抗体，检测糖苷化和非糖苷化的PAI-2以及与u-PA或t-PA形成复合物的PAI-2。用酵母重组人PAI-2制作标准曲线，在PAI-2浓度为1ng/ml-30ng/ml范围内，标准曲线成线性。
结果以ng/ml/min样品表示。为了计算本底结合，每块反应板都设不加样品或标准抗原的对照孔。
D．统计学分析
计算出t-PA和PAI-2的浓度，求出诊断为健康、牙龈炎或牙周炎的每个部位的平均值和标准差。用ANOVA试验比较临床参数。每个组内的比较采用F检验。Pearson氏相关系数法用于t-PA和PAI-2水平与临床参数GCF体积、PD和GI的比较。配对t检验用于比较牙周治疗前后t-PA和PAI-2水平的差别。统计学显著的差异水平设定为P＜0.05。
E．结果
研究了从33例病人106个部位采集的样品，这些样品包括：6例健康病人的20个部位，7例牙龈炎病人的17个部位，20例牙周炎病人的45个部位，以及从11例作为牙周治疗观察的病人中所选择的24个部位。图1示健康的部位，牙龈炎部位和牙周炎部位的GCF样品中t-PA和PAI-2浓度(ng/ml/1min)。与健康的部位相比，牙龈炎部位和牙周炎部位的GCF中t-PA平均浓度显著增高。与健康的部位和牙龈炎部位相比，牙周炎部位的GCF中PAI-2浓度统计学上显著增高；与健康组相比，牙龈炎组的GCF中PAI-2浓度也显著增高。
图2示牙周病部位GCF中t-PA和PAI-2水平与临床参数如GCF体积，PD和GI之间的关系。回归分析显示，GCF中t-PA和PAI-2水平与临床指标如GCF体积，PD和GI之间存在显著的相关关系。从图2可以看出，GCF中t-PA水平随GCF体积量(r=0.33,P＜0.05),PD值(r=0.473,P＜0.05)和GI(r=0.425,P＜0.05)增大而增高。GCF中PAI-2水平与GCF体积(r=0.549,P＜0.05)、PD(r=0.549,P＜0.05)和GI(r=0.592,P＜0.05)之间也存在相似的相关关系，但PAI-2的相关系数略高于t-PA。
图3显示GCF中t-PA和PAI-2之间的相关关系。结果表明，GCF中t-PA和PAI-2水平之间存在明显的相关关系(r=0.89,P＜0.01)。
图4和图5显示健康组，牙龈炎组和牙周炎组同一病人在不同的部位疾病状态下，GCF中t-PA和PAI-2水平的高低(图4)及其变化出现率(图5)。注意到在临床健康的部位，同一病人各健康部位之间GCF中t-PA和PAI-2水平无明显差别。在健康组中，约70％的部位在高活性部位和低活性部位之间t-PA和PAI-2水平显示轻微的变化(＜1ng/每部位差别)。在牙龈炎和牙周炎病人中，同一病人不同部位的GCF中t-PA和PAI-2水平存在相当大的变异。在牙龈炎组中，50％病人高活性部位和低活性部位之间显示大于2ng/每部位的差别，而在牙周炎组，60％病人在高活性部位和低活性部位之间存在大于2ng/每部位的差别。在24个经过选择的，接着得到治疗的牙周炎部位中，牙周治疗后二周GCF中PAI-2水平显著降低(图6)。在19个部位(约79％),GCF中PAI-2水平是降低的。平均降低量为10+7.55ng/ml，降低范围从2.25ng/ml到最大的27.73ng/ml(图7)。3个部位(12.5％)GCF中PAI-2水平增高，另外2个部位(7.5％)GCF中PAI-2水平无变化(图7)。
至于GCF中t-PA水平，治疗后2周有降低趋势，但这种降低无统计学意义(图6)。在24个经过选释的牙周炎部位中，14个部位(59％)GCF中t-PA降低，10个部位(41％)未显示变化或在牙周治疗2周后甚至增高(图7)。
本发明已广泛公开，并根据前述有代表性的实施例加以说明。本领域的技术人员会理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对其作各种修改。

Claims (30)

1．诊断牙周病的方法，包括以下步骤：
(a)测定单个龈缝液(GCF)样品中一种蛋白质水平，每个样品采集自一病人不同部位中的一个部位，其中该蛋白选自由(ⅰ)组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和(ⅱ)纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)组成的这样一组蛋白；
(b)求得GCF中该蛋白的平均水平，并利用该平均水平诊断牙周病。
2．权利要求1中的方法，其中GCF样品从病人的二个或二个以上部位局部地采集。
3．权利要求1中的方法，其中GCF局部地采自下牙上从正中部位、颊部位和唇部位组成的一组部位中所选择的部位。
4．权利要求1中的方法，其中该化合物水平用酶联免疫吸附试验测定。
5．权利要求1中的方法，其中步骤(b)还包括病人GCF中该蛋白平均水平与预先确定的健康个体GCF中该蛋白平均水平的比较，其中GCF中该蛋白平均水平的统计学上的显著增高指示牙周病的存在。
6．诊断牙周病的方法，包括以下步骤：
(a)测定单个龈缝液(GCF)样品中蛋白水平，每个样品采自病人不同部位中的一个部位，该蛋白选自由(ⅰ)组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和(ⅱ)纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)所组成的一组蛋白；和
(b)不同部位样品中该蛋白水平的比较，不同部位之间中该蛋白水平的统计学显著差异表示牙周病的诊断成立。
7．诊断牙周病的方法，该法包括：
(a)测定从病人多个部位采集的单个龈缝液(GCF)样品中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)水平；和
(b)求得GCF中t-PA的平均水平，并利用此平均水平诊断牙周病。
8．权利要求7中的方法，其中GCF局部地采自病人的2-4个部位。
9．权利要求7中的方法，其中GCF局部地采集自下牙上从由中间部位，后部位和前部位所组成的一组部位中选取的部位。
10．权利要求7中的方法，其中该蛋白水平用酶联免疫吸附试验测定。
11．权利要求7中的方法，其中步骤(b)还包括病人GCF中t-PA平均水平与预先测定的健康个体GCF中t-PA平均水平的比较，其中GCF中t-PA平均水平的统计学上的显著增高表明有牙周病存在。
12．诊断牙周病的方法，包括以下步骤：
(a)测定从病人多个部位采集的单个龈缝液(GCF)样品中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)水平；和
(b)比较采集自不同部位的GCF样品中t-PA水平，其中不同部位间具有统计学显著性的t-PA水平变异表明有牙周炎存在。
13．诊断牙周病的方法，该方法包括：
(a)测定从病人多个不同部位采集的单个龈缝液(GCF)样品中纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)水平；和
(b)求得GCF中PAI-2的平均水平，并利用此平均水平诊断牙周病。
14．权利要求13中的方法，其中GCF局部地采集自病人的2-4个部位。
15．权利要求13中的方法，其中GCF局部地采集自下牙上从由中间部位、后部位和前部位组成的一组部位中所选取的部位。
16．权利要求13中的方法，其中PAI-2水平用酶联免疫吸附试验测定。
17．权利要求13中的方法，其中步骤(b)还包括病人GCF中PAI-2平均水平与预先测定的健康个体(GCF)中PAI-2平均水平的比较，其中GCF中PAI-2平均水平具有统计学显著性的增高表明有牙周病存在。
18．诊断牙周病的方法，包括以下步骤：
(a)测定单个龈缝液(GCF)中纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)水平，每个样品采自病人不同部位中的一个部位；和
(b)比较采集自不同部位的GCF样品中PAI-2水平，其中不同部位间具有统计学显著性的PAI-2水平变异表明有牙周病存在。
19．诊断牙周病的方法，包括以下步骤：
(a)测定从病人多个不同部位采集的单个GCF样品中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)水平和纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)水平；和
(b)求得GCF中t-PA和PAI-2水平的各自平均值，并利用该平均值诊断牙周病。
20．权利要求19中的方法，其中GCF样品局部地采自病人的2-4个部位。
21．权利要求19中的方法，其中GCF样品局部地采自下牙上从由中间部位、后部位和前部位组成的一组部位中所选取的部位。
22．权利要求19中的方法，其中各自的t-PA和PAI-2水平用酶联免疫吸附试验测定。
23．权利要求19中的方法，其中病人GCF中各自的t-PA平均水平和PAI-2平均水平分别与预先测定的健康个体GCF样品中t-PA平均水平和PAI-2平均水平作比较，其中GCF中两种蛋白平均水平具有统计学显著性的增高指示有牙周病存在。
24．诊断牙周病的方法，包括以下步骤：
(a)测定从病人多个不同部位采集的单个GCF样品中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)水平；和
(b)相互比较不同部位的t-PA水平，相互比较不同部位的PAI-2水平，其中不同部位间t-PA和PAI-2水平都具有统计学显著性的升高指示有牙周病存在。
25．检查牙周病的诊断试剂盒，包括：
(a)至少一种抗体，该抗体选择性地与选自以下一组抗原中的一种抗原结合；(ⅰ)组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和(ⅱ)纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)；
(b)至少一种抗原浓度已知的校准标准品；
(c)一种适宜的容器。
26．权利要求25的诊断试剂盒进一步包括一种能够用这种抗体定量测定这种抗原浓度的检验方案。
27．权利要求26中的诊断试剂盒，其中试验格式是酶联免疫吸附试验方案。
28．权利要求25中的诊断试剂盒，其中这种试剂盒进一步包括一种局部收集龈缝液的方法。
29．权利要求28中的诊断试剂盒，其中收集龈缝液的方法利用一种吸附材料。
30．根据权利要求29中的诊断试剂盒，其中该吸附材料是滤纸。
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