CN1720259A

CN1720259A - 肿瘤靶向剂及其应用

Info

Publication number: CN1720259A
Application number: CNA2003801048991A
Authority: CN
Inventors: 马蒂亚斯·贝里曼; 梅里亚·奥维宁; 汉努·埃洛
Original assignee: KARYON Oy
Current assignee: KARYON Oy
Priority date: 2002-10-03
Filing date: 2003-10-03
Publication date: 2006-01-11
Anticipated expiration: 2023-10-03
Also published as: US20060263294A1; WO2004031219A1; JP2006516242A; CA2500830A1; CN100365014C; EP1549668A1; FI20021761A0; AU2003267474A1

Abstract

本发明涉及新的肿瘤靶向基序、单元和试剂，同时还涉及肿瘤靶向肽及其类似物。靶向剂典型地包含至少一个靶向基序Aa－Bb－Cc和至少一个效应器单元。本发明还涉及特定的肿瘤靶向肽、包含该肿瘤靶向肽的药物和诊断组合物。本发明同时还公开了诊断或治疗癌症的方法。

Description

肿瘤靶向剂及其应用

技术领域

本发明涉及包含至少一个靶向单元和至少一个效应器单元的肿瘤靶向剂，并且还涉及肿瘤靶向单元和基序。另外，本发明涉及包含该靶向剂或靶向单元的药物和诊断组合物，及该靶向剂和靶向单元作为药物或诊断工具的应用。本发明还涉及该靶向剂和靶向单元在制备药物和诊断组合物中及在制备用于诊断或研究的试剂中的应用。此外，本发明涉及用于诊断或治疗癌症及转移灶的试剂盒。更进一步地，本发明涉及去除、选择、分选和富集细胞的方法，并涉及在这些方法中使用的材料和试剂盒。

背景技术

恶性肿瘤是人与动物的最大健康问题之一，其为最常见的死因之一，在年轻个体中同样是如此。尽管在几十年中进行了深入的研究尝试，但是可用的治疗癌症方法仍然相当有限。虽然有时治疗(通常是外科手术结合化学疗法和/或放射疗法)可能有效，恶性肿瘤(癌症)仍然是人类最可怕的疾病之一，每年夺去大量生命。事实上，如果疾病没有在早期诊断出来的话，则很少能够获得有效治疗。另外，某些肿瘤类型几乎不能，如果有过的话，被有效治疗。

产生这种不希望的情况有多种原因，但最重要的一种是以下的明显事实：几乎所有(如果不是全部)的治疗计划(除外科手术之外)都缺乏足够的选择性。通常使用的化疗剂，例如烷化剂、铂化合物(例如顺铂)、博莱霉素类试剂、其他的生物碱和其他细胞生长抑制剂，通常对快速分裂的细胞类型例如造血细胞和上皮细胞具有特异性毒性，一般而言并不单独作用于肿瘤组织的恶性细胞，而是对其他细胞也有很大的毒性。放射疗法也是如此。

除上述复杂因素外，还有两个主要问题困扰着恶性实体瘤的非外科手术治疗。首先，肿瘤组织内的生理屏障阻碍了有效浓度的治疗物质向所有癌症细胞的输送。第二，由遗传或外遗传机制产生的获得性药物抗性降低了可用药物的有效性。

用现在可用的、很大程度上非选择性的、化疗剂或放射疗法治疗癌症患者经常产生不良的副反应。为了改善化疗剂的效果并减少副反应，对能够靶向特定器官或组织或靶向肿瘤组织并将所需的细胞毒或其他药物特异性地传送至这些器官或组织的试剂进行鉴别是非常重要的。

同样情况还适用于肿瘤治疗的一个特殊领域，即中子俘获治疗，在该方法中非放射性原子核(例如¹⁰B、¹⁵⁷Gd或⁶Li)在外部来源的热(慢)中子的帮助下在患者体内转变成放射性原子核。在这种情况下，虽然一些现有技术的试剂据称对于至少一些类型的肿瘤具有大约2～3倍的选择性，但所获得的结果大部分是令人失望的和否定的。特异性的靶向剂在该领域也将提供显著的优势。

同样，在癌症及转移灶的诊断，包括对病人的跟踪调查和对肿瘤及转移灶的治疗效果的研究中，更可靠、更灵敏和更具选择性的方法和试剂也将具有巨大的优势。这对于所有目前正在使用的方法都是正确的，所述目前使用的方法例如核磁共振成像(NMR、MRI)、X-射线法、组织学染色法(用于光学显微镜术和电子显微镜术及相关方法，以及将来也可能用于NMR、红外线、电子自旋共振及相关方法)和一般而言，本领域技术人员已知的任何成像及实验室方法(组织学、细胞学、细胞分选、血液研究、FACS(荧光激活细胞分选法)等等)。这里，能够靶向检测用单位的试剂(自旋标记物、放射性物质、NMR的顺磁性造影剂或X-射线成像或断层照相术的造影剂、中子俘获用的硼原子等等)将是巨大的优势，所述检测用单位对肿瘤组织、转移灶或肿瘤细胞和/或对肿瘤内皮具有特异性或选择性。

实体瘤的生长具有血管生成依赖性，并且肿瘤为了持续生长必须不断地刺激新的毛细血管的生长。肿瘤的血管在结构和功能上都区别于其正常的静息对应物。特别是内皮细胞内层的新生血管，其形状是非正常的，它们互相重叠地生长并突出于血管腔中。这种新生血管的异质性取决于肿瘤的类型以及肿瘤生长的宿主器官。因此血管的渗透性和血管的生成在每个不同的器官以及来自该器官的肿瘤组织中是独特的。

许多出版物公开了导向不同细胞和组织类型的肽。据称其中的一些可用作癌症靶向肽。在最早鉴定出的归巢肽中，是在例如美国专利号6,180,084中由Ruoslahti等人描述的整联蛋白和NGR-受体靶向肽。这些肽导向血管原性的脉管系统并结合于NGR-受体。

当肿瘤转向血管生成素表型并生成新的血管时，这些血管中的内皮细胞在管腔表面表达在正常的静息血管内皮不产生的蛋白质。一种这样的蛋白质是αvβ3整联蛋白。美国专利公开号US 6,177,542公开了可特异性结合于αvβ3整联蛋白的肽。所描述的肿瘤血管特异性靶点是介导内皮细胞与血管基底膜结合的粘附分子。这种肽是9个残基组成的环肽，其包含Arg Gly Asp(RGD)序列。Pasqualini等人(1997)披露当静脉注射时，该肽能够导向鼠和人的肿瘤血管，并且在小鼠中比导向那些对照器官的有效率高40～80倍。这提示RGD肽也许是肿瘤靶向中的合适工具以用于诊断和治疗目的。但是，整联蛋白结合肽通常可能会干扰细胞附着，因此不适合选择性肿瘤靶向的临床应用。

国际专利公开号WO 00/67771中给出了包含氨基酸序列RLQD、RAD、DGK/R的内皮抑制素。其他导向血管原性的脉管系统的肽的例子描述于美国专利5,817,750和5,955,572中。这些肽识别RGD。

美国专利5,628,979中描述了用于体内肿瘤成像和治疗的寡肽。该寡肽含有4至50个氨基酸，其中包含特征性的三联体氨基酸序列Leu-Asp-Val(LDV)。据报道该三联体为寡肽提供了对于肿瘤和其他组织上的LDV结合位点的体内结合亲和力。

国际专利公开号WO 99/47550中描述了包含HWGF基序的环肽，其是MMP-2和MMP-9的特异性抑制剂。他们同时也发现环十肽CTTHWGFTLC特异性地抑制这些酶的活性，在体外抑制肿瘤细胞和内皮细胞的转移，在体内导向肿瘤的脉管系统，并阻碍小鼠中肿瘤的生长和侵袭。但是，充当MMP抑制剂的肽同时也表现出与非肿瘤组织的背景结合。在全身正常组织中也表达MMP的事实使得将所述肽施用给人类或动物是危险甚至是致命的，因为这些酶的活性是正常组织的功能所需的(Hidalgo和Eckhardt，2001)。

美国专利公开号US 2002/0102265 A1中描述了一种肽TSPLNIHNGQKL，该肽靶向鳞状上皮细胞癌细胞系，并在体外发生内化而进入细胞。该肽同时也靶向裸鼠体内实验性鳞状癌。

美国专利号5,622,699和6,068,829中公开了包含有SRL基序的肽家族，其选择性导向脑。

国际专利公开号WO 02/20769中公开了通过噬菌体展示和生物淘选来鉴别组织特异性肽的方法。据认为一些被鉴别的肽具有肿瘤特异性。

虽然有已知的结合于肿瘤脉管系统的归巢肽，但对于在体内实际靶向肿瘤细胞和组织的靶向剂的报道仍然很少。多数以前报道所描述的靶向肽都是脉管系统特异性的。因此，对于选择性靶向肿瘤组织、肿瘤脉管系统或两者的新试剂仍然有明确的需求。

为应用于治疗，已将靶向肽与阿霉素以不受控制的方式进行偶联，该方式很明显产生了产物的混合物或至少为不明确的结构并且也可能造成作用效率低下，尤其是给试剂的鉴定、纯化、质量控制和定量分析造成困难，甚至每个肽分子所连接的阿霉素的数量仍然是不清楚的(例如，Arap等，1998)。这种非特异性的偶联过程也可能损害肽的靶向功能。

现有技术的另一种非常严重的缺点是多数已有描述的靶向肽似乎仅靶向肿瘤内皮，而并不靶向肿瘤团本身。例如，Nicklin等(2000)所用的靶向肽在难以应用于体内的条件下指导针对体外静息内皮细胞的腺病毒DNA转染。

本发明所述的靶向单元由于它们既靶向肿瘤内皮又靶向肿瘤细胞团，因此具有优于现有技术的优势。该事实提供靶向并破坏支持肿瘤生长的肿瘤内皮及肿瘤块本身的可能。这种方法的主要优点来自于以下事实：内皮是遗传上稳定的组织，不会获得药物抗性但却可以被不可逆的消除。

现有的靶向肽在能够靶向任何类型的恶性肿瘤方面是否具有普遍性还未知。因此它们作为针对某一特定肿瘤的靶向治疗试剂的用途可能就是完全无益的，与单独的治疗试剂本身相比没有显示治疗优势或效果。甚至更严重的一个缺点是在诊断操作中使用该靶向剂可能不能揭示所有已存在的肿瘤，恶性的过程仍然未被发现。

由于发现本发明所述的靶向剂靶向所有被检测的多种肿瘤类型，因此本发明相对于现有技术具有重大进步。它们显著地靶向，例如，肉瘤，诸如卡波西肉瘤；鸟氨酸脱羧酶(ODC)过度表达；高度血管原性的肿瘤；癌以及靶向人的原发性的和转移的黑色素瘤。

发明内容

本发明的一个目的是提供新的针对肿瘤和血管原性组织的靶向剂，其包含至少一个靶向单元并选择性的包含至少一个效应器单元。本发明特别提供靶向单元，该靶向单元包含至少一个既能靶向肿瘤内皮又能靶向肿瘤细胞团的基序。该靶向单元选择性地与至少一个效应器单元偶联，该靶向剂在治疗和诊断方面是有用的，尤其是在癌症，包括转移灶的治疗和诊断方面是有用的。并且本发明所述的靶向剂对于细胞的去除、选择、分选和富集是有用的。

本发明的第二个目的是提供药物和诊断组合物，该药物和诊断组合物包含至少一种靶向剂或至少一个靶向单元，所述靶向剂或靶向单元包含至少一个能特异性靶向肿瘤、肿瘤细胞和肿瘤内皮的基序。

更进一步地，本发明的第三个目的是提供用于治疗和诊断癌症的新的诊断和治疗方法及试剂盒。

本发明是基于以下发现：一组具有特定氨基酸序列或基序的肽能够在体内选择性靶向肿瘤以及在体外选择性靶向肿瘤细胞。因此当将本发明的肽施用于人类或动物受试者时，本发明所述的肽能够选择性地结合于肿瘤而不是机体中的正常组织。

本发明还涉及靶向剂及其类似物在制备治疗或诊断癌症的药物或诊断组合物中的用途。

本发明的靶向单元可被单独地或与至少一个效应器单元偶联使用。这些物质能够破坏肿瘤或抑制它们的生长。本发明的靶向单元和靶向剂也能够靶向转移灶，因此它们也可被用于破坏或抑制转移灶的生长。由于转移灶的早期诊断对于癌症的成功治疗很重要，因此本发明的靶向单元和靶向剂的一个重要的用途就是用于肿瘤转移的早期诊断。

本发明还包括本文中所描述的靶向单元和靶向剂的盐、衍生物和类似物，同时也包括它们的用途。

本发明更进一步的目的是提供包含本发明所述靶向剂的诊断和药物组合物，以及利用本发明所述的靶向剂来治疗和诊断癌症的治疗和诊断方法。同时还提供用于所述方法和研究目的以及用于细胞分选或去除的试剂盒。

本发明特别优选的实施例涉及一组小的环状肿瘤靶向肽，所述肿瘤靶向肽包含基序LRS或SRL，任选地与效应器单元或其他额外的单元偶联，在本文中对其有更详细的描述。

附图说明

图1是显示包含阿霉素的靶向剂的治疗效果的图表。

具体实施方式

从本发明的目的来说，文中所用的术语“癌症”取其最广泛的含义，包括任何涉及转化细胞或恶性细胞的疾病或状况。在本领域，癌症依照它们的组织来源(组织学类型)分为5个主要种类：实体瘤类型的癌、肉瘤、骨髓瘤和淋巴瘤、以及“液体癌症”白血病。如本发明所用的术语“癌症”意指主要包括所有种类以实体瘤为特征的疾病，包括没有可检测到的实体瘤或恶性细胞或转化细胞，即“癌症细胞”，作为扩散的浸润物出现或在健康组织其他细胞中零星出现的疾病状态。

术语“氨基酸”和“氨基醇”在本文中被认为也包括二氨基酸及二氨基酸醇、三氨基酸及三氨基酸醇、寡氨基酸及寡氨基酸醇、聚氨基酸及聚氨基酸醇；二羧基、三羧基、寡羧基和多羧基氨基酸；二羟基、三羟基、寡羟基和多羟基氨基醇；及包含多于一个羧基或羟基和一个或多个氨基的类似化合物。

按照已确定的术语，术语“肽”是指通过肽键将氨基酸(肽单元)连接在一起而形成的氨基酸链。肽可以像下文中所描述的一样是环状的。从本发明的目的来说，术语“肽”包括含有一个或多个D-氨基酸，β-氨基酸和/或其他非天然氨基酸(例如带有非天然侧链的氨基酸)的化合物。从本发明的目的来说，术语“肽”意指包括，含有经修饰的氨基酸的肽基类似物。这些修饰可以包括在环或链中引入或出现取代；引入或出现“额外的”官能团例如氨基、肼基、羧基、甲酰基(醛)或酮基，或另外的单元；以及官能团或其他部分的缺失或去除。该术语同样也包括在氨基和/或羧基末端进行修饰的类似物，例如肽酰胺和N-取代的酰胺、肽酰肼、N-取代的酰肼、肽酯及其类似物，以及不包含氨基末端-NH₂基或包括例如经修饰的氨基末端氨基基团或替代氨基末端氨基基团的亚氨基或肼基的肽，及不包含羧基末端羧基基团或包含对其进行替代的修饰基团的肽等等。

一些可被用于修饰肽以形成“肽基类似物”的可行的反应类型的例子有，例如，环加成作用、缩合作用和亲核加成反应以及酯化作用、酰胺的形成、取代的酰胺的形成、N-烷基化作用、酰肼的形成、盐形成。盐形成可以是任何类型的盐例如碱金属盐或其他金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、酸加成盐等的形成。肽基类似物既可从相应的肽进行合成也可以直接进行合成(通过其他的途径)。

与本发明所述的肽在结构或功能上类似的化合物可以不是或不仅是由氨基酸组成的化合物，或其中某些或全部构造单元是经修饰的氨基酸的化合物。本领域技术人员非常理解，不同类型的构造单元能够用于这样的目的。这些化合物在生物系统中的功能基本上与肽的功能相似。因此这些化合物与原始的肽之间的相似处是基于结构和功能上的相似性。由于这些化合物模仿原始的肽的功能、构象和/或结构，因此他们被称为肽模拟类似物，并且从本发明的目的来说，它们包括在术语“肽”的范围内。

本发明所述的肽的功能类似物以结合于肿瘤、肿瘤组织、肿瘤细胞或肿瘤内皮的结合能力为特点，该特点与它们所模仿的肽的特点基本类似。

例如，可使用包含基于原始肽一级序列的类似物的化合物例如苯并内酰胺或哌嗪(Adams等，1999；Nakanishi和Kahn，1996；Houghten等，1999；Nargund等，1998)。很多种类型的肽模拟物质在科学或专利文献中已被报道并被本领域技术人员所熟知。肽模拟物质(类似物)可包含例如一种或多种下述结构部分：还原的酰胺、羟乙烯和/或羟乙胺等构物、N-甲基氨基酸、脲衍生物、硫脲衍生物、环脲和/或硫脲衍生物、聚(酯酰亚胺)、聚酯、酯、胍衍生物、环胍、咪唑基(imidazoyl)化合物、咪唑啉基化合物、咪唑烷基化合物、内酰胺、内酯、芳香环、二环系统、乙内酰脲和/或乙内酰硫脲及多种其他结构。用于合成肽模拟物质的多种类型的化合物可由许多商业来源获得(例如Peptide and PeptidomimeticSynthesis，Reagents for Drug Discovery，Fluka ChemieGmbH，Buchs，Switzerland，2000 and Novabiochem 2000 Catalog，Calbiochem-Novabiochem AG，Lufelfingen，瑞士，2000)。肽模拟化合物与原始肽之间的相似性是基于结构和/或功能上的相似性。因此，肽模拟化合物模拟原始肽的特性，从本发明的目的来说，它们的结合活性类似于它们所模仿的肽的结合活性。肽模拟化合物可由例如，不出现在原始肽中的非天然氨基酸(例如D-氨基酸或包含非天然侧链的氨基酸，或β-氨基酸等)组成，或它们可被认为包含其他化合物或结构单元，或可由其他化合物或结构单元制备而成。合成的肽模拟化合物的例子包括N-烷基氨基环脲、硫脲、聚酯、聚酯酰亚胺、二环胍、乙内酰脲、乙内酰硫脲和咪唑-吡啶并-inoles(Houghten等，1999和Nargund等，1998)。这些肽模拟化合物可被表征为本发明的肽的“结构或功能类似物”。

从本发明的目的来说，术语“靶向单元”代表能选择性靶向和选择性结合肿瘤，优选地，也能选择性靶向和选择性结合肿瘤基质、肿瘤实质和/或肿瘤胞外基质的化合物、肽。在现有技术中用于表述这种特殊关系的另一术语是“导向”。肿瘤靶向意味着当施用至人体或动物体时肿瘤靶向单元特异性地与肿瘤结合。更具体地，靶向单元可结合于细胞表面、结合于细胞表面上或细胞内的特定的分子或结构、或者它们可与细胞间的胞外基质相结合。靶向单元也可以结合于肿瘤脉管系统的内皮细胞或胞外基质。靶向单元同样也可以与肿瘤团、肿瘤细胞和转移灶的胞外基质结合。

一般地，术语“靶向”或“结合”代表本发明的靶向单元与肿瘤、肿瘤细胞和/或肿瘤组织粘附、附着、亲和或结合至一定程度以至于结合可以通过例如在体外肿瘤活组织上进行的肽的体内或离体(ex vivo)竞争试验或通过原位免疫学染色，或通过本领域技术人员已知的其他方法被客观地测量和确定。本发明所述的靶向单元的结合的确切机制并不知晓。当结合强到足以抵抗正常的样品处理，例如用生理盐水或其他处于生理pH的生理学可接受的盐或缓冲液进行洗涤或冲洗，或当结合于体内肿瘤靶点的时间长到足以使效应器单元在靶点上显示其功能时，本发明认为所述的靶向肽结合至“体外”的肿瘤靶点上。

本发明的靶向剂或靶向单元与肿瘤的结合是“选择性的”是指它们不与正常的细胞和器官结合，或与肿瘤细胞和器官的结合相比该结合程度非常低。

本发明的靶向单元和试剂的药学或诊断上可接受的的盐包括其盐、酯、酰胺、酰肼、N-取代酰胺、N-取代酰肼、羟氨酸衍生物、及脱羧基的和N-取代的衍生物。合适的药学可接受的盐是本领域技术人员所公认的。

本发明所述的靶向基序

现在意外地发现由3个氨基酸组成的基序Dd-Ee-Ff靶向并选择性地结合于肿瘤、癌、肿瘤细胞和癌细胞，其中Dd-Ee-Ff是Aa-Bb-Cc或Cc-Bb-Aa，并且Aa是异亮氨酸、亮氨酸或叔亮氨酸，或它们的结构或功能类似物；Bb是精氨酸、高精氨酸或刀豆氨酸，或它们的结构或功能类似物；Cc是丝氨酸或高丝氨酸，或它们的结构或功能的类似物。

本发明所述的Aa其侧链可包括有分支、无分支或脂环结构，具有至少两个相似或不同的原子，所述原子选自碳、硅、结合于碳的卤素、醚-氧或硫醚-硫。类似物可选自包括有分支、无分支或环状非芳香族的、亲脂的和疏水的氨基酸或氨基酸类似物或衍生物或其结构和/或功能类似物；具有一个或多个亲脂的碳硼烷型或其他亲脂的含硼侧链或其他亲脂的笼型结构的氨基酸或羧酸或氨基酸类似物或衍生物或羧酸类似物或衍生物。

Aa可选自：

1)α-氨基酸，其侧链是下述中的一种：

-乙基

-丙基

-1-甲基丙基(异亮氨酸的侧链)

-2-甲基丙基(亮氨酸的侧链)

-2，2-二甲基丙基

-1-乙基丙基

-叔丁基

-叔戊基

-3-甲基丁基

-2-甲基丁基

-甲基丁基

-乙基丁基

-2-乙基丁基

-环己基

-2-甲基环己基

-环戊基

-2-甲基环戊基

-3-甲基环己基

-环丁基

-环丙基

-2-甲基环丙基

-甲氧基乙基

-甲氧基甲基

-乙氧基甲基

-2-乙氧基乙基

-1-乙氧基乙基

-2-甲氧基丙基

-2，2-二甲氧基丙基

-1-甲基丙基

-1-甲基丁基

-1-甲基戊基

-1，1-二甲基丙基

-1，1-二甲基丁基

-1，1-二甲基戊基

-1，2-二甲基丙基

-1-环丙基乙基

-2-环丙基乙基

-环丙基甲基

-1-环丙基乙基

-1-环丙基丙基

-2-环丙基丙基

-3-环丙基丙基

-任何环丁基烷基

-1-乙基丙基

-1-甲基乙基

-其他单烷基-、二烷基-、三烷基-、或寡烷基-烷基

-其他环烷基、或取代的环烷基、或以一个或多个取代或未取代的环烷基并任选被一个或多个烷基取代的烷基

-烯丙基

-乙烯基

-1-甲基烯丙基

-1-乙基烯丙基

-1-乙基乙烯基

-1-丙烯基

-1-甲基-1-丙烯基

-甲基-1-丙烯基

-1-乙基-1-丙烯基

-乙基-1-丙烯基

-1-甲基-1-丁烯基

-甲基-1-丁烯基

-1-乙基-1-丁烯基

-2-乙基-1-丁烯基

-乙基-2-丁烯基

-乙基-3-丁烯基

2)任何下述的羧酸，包括其任何光学异构体：

-4-甲基戊酸

-3-甲基戊酸

-4，4-二甲基戊酸

-3，4-二甲基戊酸

-3，3-二甲基戊酸

-3-甲基己酸

-4-甲基己酸

-5-甲基己酸

-2-乙基戊酸

-3-乙基戊酸

-4-乙基戊酸

-2-环丙基戊酸

-3-环丙基戊酸

-4-环丙基戊酸

-2-甲基丁酸

-3-甲基丁酸

-4-甲基丁酸

-2-环丙基丁酸

-3-环丙基丁酸

-4-环丙基丁酸

3)下述任意化合物的任何光学和几何异构体：

-2-氨基-4-甲基-3-戊酸

-2-氨基-4-甲基-4-戊酸

-2-氨基-5-甲基-3-己酸

-2-氨基-5-甲基-4-己酸

-2-氨基-5-甲基-5-己酸

和

4)第1点和第3点中包含氨基的化合物的氨基取代的(N-取代的)类似物，其在氨基基团处具有

-一个甲基、乙基、丙基、异丙基或其他烷基

-一个环烷基

-一个9-芴基甲氧基羰基(FMOC)

-一个苄氧基羰基(Cbz)

-一个叔丁氧羰基(BOC)

-选自本点(第4点)上面提到的基团中的两个相同、相似和/或不同的基团。

Aa也可以是通式R¹-CR²(NH₂)-COOH所定义的α-氨基酸(L-或D-氨基酸)，其中侧链R¹选自上面所列举的侧链，侧链R²选自氢、甲基、乙基或丙基。

本发明所述的Bb可选自包含一个或多个鸟嘌呤基、aminodino基或它们的类似物和衍生物及结构或功能等价物的氨基酸或其结构或功能类似物；每个基团包含至少两个氮原子并且具有或可获得离域正电荷的一个或多个基团。

Bb可选自具有下式结构的一组化合物：

其中R1-R5是氢或甲基，R2和R3可形成-CH2-CH2-，并且n为1～6。

优选地，Bb是L-或D-构型的

精氨酸，

高精氨酸，

刀豆氨酸，

2-氨基-8-胍基-辛酸，

2-氨基-7-胍基-辛酸，

2-氨基-6-胍基-辛酸，

2-氨基-5-胍基-辛酸，

2-氨基-7-胍基-庚酸，

2-氨基-6-胍基-庚酸，

2-氨基-5-胍基-庚酸，

2-氨基-4-胍基-庚酸，

2-氨基-5-胍基-己酸，

2-氨基-4-胍基-己酸，

2-氨基-3-胍基-己酸，

2-氨基-4-胍基-戊酸，

2-氨基-3-胍基-戊酸。

本发明所述的Cc可选自含有一个或多个羟基、酯化的羟基、甲氧基和/或其他醚化的羟基(醚)基团的氨基酸、氨基醇、二氨基醇、三氨基醇、寡氨基醇和多氨基醇及氨基酸类似物、衍生物及其结构或功能类似物。

按照上述定义，Cc可为含有至少一个羟基的丝氨酸或高丝氨酸或它们的结构或功能类似物；或可选自：

含有至少一个醇羟基的任何其他单氨基羧酸

含有至少一个醇羟基的任何羧酸

包含脂肪族或其他侧链的任何其他氨基羧酸，所述脂肪族或其他侧链含有一个或多个醇羟基(OH)官能团和/或酯化的羟基官能团。

优选地，Cc是L-或D-构型的

丝氨酸，

高丝氨酸，

2-氨基-7-羟基庚酸，

2-氨基-5-羟基戊酸，

2-氨基-6-羟基己酸，

2-氨基-8-羟基辛酸，

或任何其他的羟基-2-氨基羧酸。

替换性地，本发明所述的基序Aa-Bb-Cc，作为一个整体，是Aa、Bb和Cc具有上述定义结构的结构或功能类似物。

本发明优选的实施方案包括选自表1所示的肿瘤靶向基序Aa-Bb-Cc及其结构和功能类似物。

表1

	Aa	Bb	Cc
	Aa	Bb	Cc	123456789101112131415161718192021222324	L-异亮氨酸″D-异亮氨酸″L-亮氨酸″D-亮氨酸″L-异亮氨酸″D-异亮氨酸″L-亮氨酸″D-亮氨酸″L-2-氨基戊酸D-2-氨基戊酸L-2-氨基戊酸D-2-氨基戊酸L-2-氨基己酸D-2-氨基己酸L-2-氨基己酸D-2-氨基己酸	L-精氨酸″D-精氨酸″L-精氨酸″D-精氨酸″L-高精氨酸″D-高精氨酸″L-高精氨酸″D-高精氨酸″L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸	L-丝氨酸L-高丝氨酸D-丝氨酸D-高丝氨酸L-丝氨酸L-高丝氨酸D-丝氨酸D-高丝氨酸L-丝氨酸L-高丝氨酸D-丝氨酸D-高丝氨酸L-丝氨酸L-高丝氨酸D-丝氨酸D-高丝氨酸L-丝氨酸D-丝氨酸L-高丝氨酸D-高丝氨酸L-丝氨酸D-丝氨酸L-高丝氨酸D-高丝氨酸

2526272829303132333435363738394041424344454647484950515253

L-2-氨基庚酸D-2-氨基庚酸L-2-氨基庚酸D-2-氨基庚酸L-2-氨基-2-乙基丁酸D-2-氨基-2-乙基丁酸L-2-氨基-2-乙基丁酸D-2-氨基-2-乙基丁酸L-异亮氨酸D-异亮氨酸L-亮氨酸D-亮氨酸L-异亮氨酸D-异亮氨酸L-亮氨酸D-亮氨酸L-异亮氨酸D-异亮氨酸L-亮氨酸D-亮氨酸L-2-氨基戊酸D-2-氨基戊酸L-2-氨基戊酸D-2-氨基戊酸L-2-氨基己酸D-2-氨基己酸L-2-氨基己酸D-2-氨基己酸L-2-氨基庚酸

L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸D-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸L-精氨酸D-精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸

L-丝氨酸D-丝氨酸L-高丝氨酸D-高丝氨酸L-丝氨酸D-丝氨酸L-高丝氨酸D-高丝氨酸2-氨基-7-羟基庚酸2-氨基-7-羟基庚酸2-氨基-7-羟基庚酸2-氨基-7-羟基庚酸L-2-氨基-5-羟基戊酸D-2-氨基-5-羟基戊酸L-2-氨基-5-羟基戊酸D-2-氨基-5-羟基戊酸L-2-氨基-6-羟基己酸D-2-氨基-6-羟基己酸L-2-氨基-6-羟基己酸D-2-氨基-6-羟基己酸L-丝氨酸D-丝氨酸L-高丝氨酸D-高丝氨酸L-丝氨酸D-丝氨酸L-高丝氨酸D-高丝氨酸L-丝氨酸

54555657585960616263646566676869707172

D-2-氨基庚酸L-2-氨基庚酸D-2-氨基庚酸L-2-氨基-2-乙基丁酸D-2-氨基-2-乙基丁酸L-2-氨基-2-乙基丁酸D-2-氨基-2-乙基丁酸L-异亮氨酸D-异亮氨酸L-亮氨酸D-亮氨酸L-异亮氨酸D-异亮氨酸L-亮氨酸D-亮氨酸L-异亮氨酸D-异亮氨酸L-亮氨酸D-亮氨酸

D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸D-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸L-高精氨酸D-高精氨酸

D-丝氨酸L-高丝氨酸D-高丝氨酸L-丝氨酸D-丝氨酸L-高丝氨酸D-高丝氨酸2-氨基-7-羟基庚酸2-氨基-7-羟基庚酸2-氨基-7-羟基庚酸2-氨基-7-羟基庚酸L-2-氨基-5-羟基戊酸D-2-氨基-5-羟基戊酸L-2-氨基-5-羟基戊酸D-2-氨基-5-羟基戊酸L-2-氨基-6-羟基己酸D-2-氨基-6-羟基己酸L-2-氨基-6-羟基己酸D-2-氨基-6-羟基己酸

因此，Aa的典型和优选的特征包括在至少一条侧链具有亲脂性、疏水性和脂肪族特性，而Bb包括离域正电荷，Cc具有参与OH结合的能力。

本发明所述的特别优选的基序Dd-Ee-Ff是亮氨酸-精氨酸-丝氨酸(LRS)和丝氨酸-精氨酸-亮氨酸(SRL)。

本发明所述的基序Dd-Ee-Ff可以形成较大的结构，例如肽或一些其他结构的一部分。当主题中的化合物或结构包含多于一个的基序Dd-Ee-Ff时，该基序的定位和方向可以不同。

本发明所述的靶向单元

还发现包含本发明所述的肿瘤靶向基序的肽及其结构和功能类似物靶向肿瘤细胞和组织，并显示与肿瘤细胞和组织的选择性结合。包含本发明所述的肿瘤靶向基序并最多有4个额外的氨基酸残基的肽或其类似物，同样显示这种靶向性和选择结合性，是本发明特别优选的实施方案。

这些肽用作本发明所述的靶向单元是非常有利的，例如，原因在于它们分子小并且其合成容易、可靠和便宜。由于本发明所述的肽分子小，所以纯化、分析和质量控制都是容易的和商业上有益的。

本发明优选的肿瘤靶向单元包含如上定义的肿瘤靶向基序Dd-Ee-Ff，和额外的残基，该额外的残基选自：

天然氨基酸；

非天然氨基酸；

氨基酸类似物，其包含最多30个非氢原子以及无数量限制的氢原子；和

分子量和/或化学式量最大为270的其他结构单元和残基；

其中

所述额外残基的数量范围为0至4，优选2至4，更优选是2。

本领域已知，环肽在体内及许多其他生物系统中一般比它们的非环状对应物更稳定。然而，现在意外地发现当靶向单元是环状或包含于环状结构中时，本发明所述小肽的靶向特性更显著。

本发明所述的优选靶向单元可包含序列

Cy-Rr_n-Dd-Ee-Ff-Rr_m-Cyy

其中，

Dd-Ee-Ff是肿瘤靶向基序Aa-Bb-Cc或Cc-Bb-Aa；

Rr是氨基酸残基或其结构或功能类似物；

n和m是0、1或2，并且n和m的和不超过2；

并且

Cy和Cyy是能形成环状结构的单位。

优选的靶向单元是这样的靶向单元，其中Rr是除组氨酸、赖氨酸或色氨酸之外的任何氨基酸残基。特别优选Rr是R或G的靶向单元。

优选的结构是这样的结构：其中Cy和Cyy是包含巯基的氨基酸或其类似物，例如高半胱氨酸或半胱氨酸或它们的类似物；或分子量不超过270并包含巯基或氧化巯基的其他结构。一种优选的环状结构类型是以二硫键(例如，在半胱氨酸成分之间形成)的存在为特征。环状结构的非限制性例子是，例如具有下式的化合物：

其中Cy-S-S-Cyy表示胱氨酸。由于半胱氨酸的易获得性和低价格，这种类型的结构是优选的一种结构。

但-S-S-桥不是必须在半胱氨酸单元之间形成，也可以存在于含有-SH基团的其他氨基酸或其他成分之间。上述结构可在半胱氨酸单元之间包含多于一个的Dd-Ee-Ff基序，并可以在环状结构之外包含额外的氨基酸及其结构或功能类似物。

本发明所述的由于二硫桥而具有环状结构的高度优选的靶向单元是CLRSC(SEQ ID NO.1)和CSRLC(SEQ ID NO.2)。

形成环状结构的其他优选的可能性是形成酰胺键以提供内酰胺或形成酯键以提供内酯键。

因此优选的结构是如上所定义的通式化合物

Cy-Rr_n-Dd-Ee-Ff-Rr_m-Cyy

其中Cy和Cyy是能形成内酰胺键的残基，例如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、鸟氨酸(O)或它们的包含不多于12个碳原子的类似物。

内酰胺可以是几种亚型，例如“首到尾”(羧基末端加氨基末端)、“首到侧链”和“侧链到首”(羧基或氨基末端加一个侧链氨基或羧基)和“侧链到侧链”(一个侧链的氨基和另一侧链的羧基)。

本发明所述的由于内酰胺桥而具有环状结构的特别优选的靶向单元是DLRSK(SEQ ID NO.3)、DLRSGRK(SEQ ID NO.4)和DRGLRSK(SEQ ID NO.5)、OLRSE(SEQ ID NO.6)、KLRSD(SEQ ID NO.7)。

本发明所述的靶向剂

还发现包含至少一个本发明所述的肿瘤靶向单元和至少一个效应器单元的靶向剂靶向肿瘤细胞和组织及内皮细胞，并显示与肿瘤细胞和组织及内皮细胞的选择性结合。

本发明所述的肿瘤靶向剂可任选地包含以下单元，例如接头、溶解度调节剂、稳定剂、电荷调节剂、间隔区、溶解或反应或反应性调节剂、内化单元或内化促进剂或膜相互作用单元或其他12局部途径、附着、结合和分布影响单元。这些本发明所述的肿瘤靶向剂的额外单元可通过任何适合连接目的的方法互相连接。

许多连接主题类型或相关类型的结构、分子、基团等的可能方法是本领域技术人员已知的。不同的单元可直接或者在一个或多个相同、相似和/或不同的接头单元的帮助下进行连接。本发明的肿瘤靶向剂可具有不同的结构，例如下述以示意图的方式给出的任何非限制类型：

1.EU-TU

2.(EU)_n-(TU)_m

3.(EU)_n-(TU)_m-(EU)_k

其中EU表示“效应器单元”，TU表示“靶向单元”，n、m和k各自是除0以外的任意整数。

在本发明所述的靶向剂中，就像在其他许多药物和其他物质中一样，包含间隔区或接头，像氨基酸及其类似物，例如长链ω-氨基酸，以防止靶向单元被效应器单元或靶向剂的其他单元“干扰”、或者空间地、电子地或以别的方式妨碍或“隐藏”，这也许是明智的。

在本发明所述的靶向剂中，采用分支或环状结构以提供在每个靶向单元上结合多个效应器单元或额外的单元的可能性来提高活性也许是有用的。

本发明所述的优选的靶向剂包含以下结构：

Ef-TU-Eff，其中

TU是如上文中定义的本发明所述的靶向单元；并且

Ef和Eff选自包含以下物质的组：效应器单元、接头单元、溶解度调节剂单元、稳定剂单元、电荷调节剂单元、间隔区单元、溶解和/或反应和/或反应性调节剂单元、内化和/或内化促进剂和/或膜相互作用单元和/或其他局部途径和/或局部附着/局部结合和/或分布影响单元、吸附增强剂单元和其他相关的单元；和

包含至少一个所述单元的肽序列及其他结构；及包含不多于20个，优选不多于12个，更优选不多于6个，天然和/或非天然氨基酸的肽序列；及包含不多于25个非氢原子和数量不受限制的氢原子的天然和非天然氨基酸；

及它们的盐、酯、衍生物和类似物。

效应器单元

从本发明的目的来说，术语“效应器单元”是指分子或基团或其他化学单位以及例如胶体颗粒等大颗粒；脂质体或微粒。合适的效应器单元也可以组成纳米元件或纳米芯片等；或这些的任意组合，及用于将效应器单元的构成成分与每个或部分靶向剂进行结合的选择性的化学结构。效应器单元也可以包含影响效应器单元的稳定性或溶解度提高的成分。

本发明所述的效应器单元提供的优选效果是对目标肿瘤的治疗(生物的、化学的或物理的)效果、为诊断目的允许对肿瘤或肿瘤细胞进行检测或成像的特性、或与靶向剂在不同应用中的用途相关的结合能力。

本发明所述效应器单元的优选(生物学的)活性是治疗效果。该治疗活性的例子有，例如，细胞毒性、抑制细胞生长的作用、引起细胞分化或增加它们的分化程度或引起表型改变或代谢改变的能力、趋化活性、调节免疫的活性、减轻疼痛的活性、放射性、影响细胞周期的能力、引起细胞调亡的能力、激素活性、酶活性、转染细胞的能力、基因转移的活性、介导一个或多个基因的“敲除”的能力、引起基因置换或“敲入”的能力、抗血管生成活性、从外部辐射或电场或磁场收集热量或其他能量的能力、影响细胞的遗传信息或外部相关信息的转录、翻译或复制的能力、及影响转录后和/或翻译后的事件。

通过本发明所述的效应器单元实现的其他优选的治疗途径可以为基于热(慢)中子用(以通过中子俘获产生合适的核放射性)的途径，或施用能够水解例如酯键或其他键的酶或施用本发明所述的靶向酶。

本发明所述效应器单元的适合检测的优选功能的例子是放射性、顺磁性、铁磁性、亚铁磁性、或任何类型的磁性、或通过NMR波谱来检测的能力、或通过EPR(ESR)波谱来检测的能力、或对PET和/或SPECT成像的适应性、或存在免疫原性结构、或存在抗体或抗体片段或抗体类结构、或存在金颗粒、或存在生物素或抗生物素蛋白或其他蛋白、和/或发光和/或荧光和/或磷光活性或增强肿瘤、肿瘤细胞、内皮细胞和转移灶在电子显微镜、光学显微镜(UTV和/或可见光)、红外线显微镜、原子能显微镜或隧道显微镜中被检出的能力、等等。

本发明所述效应器单元的优选结合能力包括，如：

a)结合到诸如组氨酸或其他标记物等物质或结构的能力，

b)结合到生物素或其类似物的能力，

c)结合到抗生物素蛋白或其类似物的能力，

d)结合到酶或经修饰的酶的能力，

e)例如通过螯合作用结合到金属离子的能力，

f)结合到以下物质的能力：细胞毒性物质、细胞调亡物质、或代谢影响素(affectin)物质或能够在原位转换成所述物质的物质，

g)结合到整联蛋白或其他参与细胞粘附、迁移或胞内信号传导的物质的能力，

h)结合到噬菌体的能力，

i)结合到淋巴细胞或其他血细胞的能力，

j)结合到由于存在抗体或结构而预选定的物质上的能力，所述抗体或结构是通过生物淘选所选择的，

k)结合到用于信号产生或放大的物质上的能力，

l)结合到治疗性物质上的能力。

这样的结合可以是如螯合作用、共价键形成、抗体-抗原类型的亲和、离子配对或离子结合的形成、抗生物素蛋白-生物素类型的特殊相互作用的结果，或其他任何类型或方式的结合或亲和的结果。

一个或多个效应器单元或它们的一部分也可以是靶向单元本身的一部分。因此，效应器单元例如可以是靶向单元的一个或多个原子或原子核，如放射性原子或能够使之具有放射性的原子，或顺磁性原子或容易用MRI或NMR波谱进行检测的原子(例如碳-13)。进一步的例子有，诸如碳硼烷型的亲脂性侧链等含硼的结构。

效应器单元可通过任何类型的键或结构或它们的组合与靶向单元连接，这些键或结构或它们的组合强到足以使靶向剂上的多数、或优选全部、或基本上全部的效应器单元在主要的(必需的)靶向过程中，例如在被研究或治疗的人或动物受试者中或生物样品中，与靶向单元保持连接。

效应器单元或它们的一部分可以保持与靶向单元的连接；或通过自发的化学反应或平衡状态或通过自发的酶促过程或其他生物学过程，或作为有意操作如施用水解酶或其他化学物质的结果，它们可以从靶向单元上部分或全部被水解或以另外的方式被解离。通过施用本发明所述的靶向物质例如酶来产生或增强酶促过程或其他反应也是可能的。

一种可能性是效应器单元或其部分在存在于肿瘤(例如细胞内，细胞膜中或胞外基质中)或肿瘤附近的一种或多种不同水解酶的作用下，从靶向剂上被水解下来和/或被水解成更小的单元。

正如本领域技术人员所熟知的那样，考虑到本发明所述的靶向可能非常迅速，即使机体内到处发生的非特异性水解对于一种或多种效应器单元的有意水解也可以是可接受的和可用的，但由于这种水解在适当场合(例如，空间位阻、或者甚至没有任何这种阻碍效应)时如此慢以至于虽然机体中存在着水解酶，靶向剂也能稳定地进行靶向。不溶的产物和/或被迅速吸收入细胞的产物和/或水解后结合至它们表面的产物的生成也可有益于靶向效应器单元和/或它们的片段等保留在肿瘤中或与其最靠近的周围区域。

在本发明的一个优选的实施方案中，效应器单元可以包含可能使以下情况“放大”或直接或间接引起以下情况“放大”的结构、特征、片段、分子或其类似物，所述情况为：治疗或其他效果、信号检测、预选物质包括生物材料、分子、离子、微生物或细胞的结合。

这种“放大”可以例如是基于一种或多种下述非限制性类型：

-通过效应器单元结合其他材料，该材料可进一步结合其他物质(例如，抗体、荧光抗体、其他“标记”物质、像抗生物素蛋白一样的物质、优选其他材料上的一些分子或“单元”能与每个效应器单元结合；

-效应器单元包含不止一个能结合例如蛋白质的单元，从而使直接放大成为可能；

-在不止一个步骤中进行放大。

优选本发明所述的效应器单元可选自下述组：

-抑制细胞生长剂或细胞毒性剂

-细胞调亡引起或增强剂

-酶或酶的抑制剂

-抗代谢物

-能够干扰膜功能的试剂

-放射性或顺磁性物质

-包含一个或多个金属离子的物质

-包含硼、钆、litium(锂)的物质

-适合中子俘获治疗的物质

-标记物质

-嵌入剂及包含它们的物质

-氧化剂或还原剂

-核苷酸及其类似物

-金属螯合物或螯合剂

在本发明的一个高度优选的实施方案中，效应器单元包含α发射体。

在本发明进一步优选的实施方案中，效应器单元可包含铜螯合物如反式-双(水杨基醛肟)铜(II)(trans-bis(salicylaldoximaro)copper(II))及其类似物，或铂化合物如顺铂、卡铂。

可用于引起或增强例如内化至细胞的不同类型的结构、物质和基团是已知的，包括如RQIKIWFQNRRMKWKK、Penetratin(Prochiantz，1996)、及硬脂酰衍生物(Promega Notes Magazine，2000)。

作为一种诱导细胞调亡的结构，例如，可以包括与细胞内的线粒体膜发生作用的肽序列KLAKLAK，(Ellerby等(1999))。

为在本发明包括细胞分选和任何相关应用的实施方案中使用，本发明的靶向单元和试剂可以，例如用于

a)与磁性颗粒偶联或连接，

b)吸附、偶联、连接或结合至塑料、玻璃或其他固体的、多孔的、纤维性材料类型或其他表面等上，

c)吸附、共价键或以其他方式连接、偶联或结合至一种或多种能用于柱或相关系统中的物质或材料之内或之上，

d)吸附、共价键或以其他方式连接、偶联或结合至一种或多种能被沉淀、离心或以其他方式分离或去除的物质或材料之内或之上。

本发明所述靶向剂的选择性单元

本发明的靶向剂和靶向单元可选择性地包括更多的单元，例如：

将本发明的靶向单元、效应器单元或其他选择性单元互相偶联的接头单元；

对靶向剂或它们水解产物的溶解度进行调节的溶解度调节单元；

在体内或体外的合成、修饰、加工、储存或使用过程中稳定靶向单元或试剂的结构的稳定剂单元；

对靶向单元或试剂或它们的起始原料的电荷进行调节的电荷调节单元；

增加靶向剂或它们的起始原料的特定单元之间的距离的间隔区单元，以释放或减少产物的空间位阻或结构张力；

反应性调节剂单元；

内化单元或增强靶向剂的靶向和摄取的增强剂单元；

吸附增强剂单元，如增强体内靶向剂的吸附的可溶于脂肪或水的结构；或

其他相关单元。

大量合适的接头单元是本领域已知的。合适接头的例子有：

1.用于连接包含氨基的单元的接头：环酐、二羧基的或多价的，任选有活性的或衍生的羧酸、具有两个或多个反应性卤素的化合物或具有至少一个反应性卤原子和至少一个羧基的化合物；

2.用于连接包含羧基或其衍生物的单元的接头：具有至少两个相似或不同的基团如氨基、取代的氨基、羟基、-NHNH₂或其取代形式、其他用于此目的的已知基团(可使用激活剂)的化合物；

3.用于连接氨基和羧基的接头：例如氨基酸及其被激活或被保护的形式或衍生物；

4.用于将甲酰基或酮基连接至另一基团的接头：包含例如至少一个-N-NH₂或-O-NH₂或＝N-NH₂或它们的类似物的化合物；

5.用于连接几个包含氨基的单元的接头：聚羧基物质如EDTA、DTPA和聚羧酸、酐、酯及酰基卤化物；

6.用于将包含氨基的物质连接至包含甲酰基或羧基的物质的接头：肼基羧酸或它们的类似物，优选使肼基部分或羧基被保护或被活化，例如4-(FMOC-肼基)苯甲酸；

7.用于将有机结构连接至金属离子的接头：能与有机结构(例如依靠它们的COOH或NH₂基团)或是其整体部分偶联以及额外包含多聚羧基部分如类似EDTA-或DTPA-结构的物质，包含几个组氨酸或其类似物的肽，包含几个亮氨酸或其他每个部分都包含-SH基的成分的肽，及其他包含能用于将它们与有机结构连接的官能团的螯合剂。

许多上述物质和其他类型的合适的连接剂在本领域是已知的。

大量合适的溶解度调节剂单元是本领域已知的。合适的溶解度调节剂单元包括，例如：

-用于提高水溶度的溶解度调节剂单元：包含SO₃ ^-、O-SO₃ ^-、COOH、COO^-、NH₂、NH₃ ⁺、OH基、胍基或氨基或其他的离子和可电离的基团及糖类型结构的分子；

-使脂溶度或在有机溶剂中的溶解度提高的溶解度调节剂单元：包含(长)脂肪族分支或无分支的烷基和链烯基、环状非芳香族基团如环己基、芳香环和甾族结构的单元。

大量本领域已知的单元可用作稳定剂单元，例如提高空间位阻的大的结构(如叔丁基、萘基和金刚烷基及相关的基团等)，和防止或阻碍酶水解的D-氨基酸及其他非天然氨基酸(包括β-氨基酸、ω-氨基酸、具有很大侧链的氨基酸等)。

包含正电荷、负电荷或两种电荷的单元可用作电荷调节剂单元，被转化成或能被转化成具有正电荷、负电荷或两种电荷的单元的结构也可用作电荷调节剂单元。

间隔区单元可以是非常重要的，是否需要使用该单元取决于结构的其他成分(例如所用的生物活性剂的类型，及它们的作用机制)和所用的合成方法。

合适的间隔区单元可包含例如长的脂肪族链或糖类型结构(以避免过高的亲脂性)，或大环。合适的化合物可由现有技术中获得。一个间隔区单元的优选基团是具有长链的ω-氨基酸。这些化合物也可以(同时)被用作连接包含氨基的单元和包含羧基的单元的接头单元。多数这类化合物及其不同的被保护的衍生物都是商业上可得到的。

易被水解(自发的化学水解或通过机体自身的酶或施用给患者的酶产生的酶水解)的单元在某些情况下可能是非常有利的，这些情况包括希望效应器单元从靶向剂释放出来以进行例如内化、胞内或胞外DNA或受体结合。适合进行这一目的的单元包括，例如，包含一个或多个酯或缩醛官能团的结构，不同的蛋白酶也可以被用于上述目的。许多用于制造前体药物的基团也可以适用于提高或引起水解、溶解反应或其他分解作用的目的。

本发明所述的效应器单元、靶向单元及任选的单元可同时具有多于一种的功能。因此，例如，靶向单元可同时是效应器单元或包含几个效应器单元；间隔区单元可同时是接头单元或电荷调节剂单元或两者都是；稳定剂单元可以是具有与另一效应器单元不同性质的效应器单元，等等。效应器单元可以，例如，具有几种相似或甚至完全不同的功能。

在本发明的一个优选实施方案中，肿瘤靶向剂包含多于一个不同的效应器单元。这样的话，效应器单元可以是，例如，诊断和治疗单元。因此，例如，硼中子俘获治疗中，优选使用以下试剂，该试剂的效应器单元，除含有硼原子外，为了能够探知该试剂在待治疗的肿瘤内充分聚集或为了优化中子治疗时机等等，还能在施用试剂后在患者体内被检测或定量。这个目标例如可以例如通过使用本发明所述的包含效应器单元的靶向剂来达到，该效应器单元含有硼原子(优选同位素强化的硼)和可检测基团，例如可被NMRI检测的基团。同样，多于一种类型的治疗上有用的效应器单元的存在也是优选的。另外，靶向单元和靶向剂可以，如果希望的话，与一种或多种“经典的”或其他的肿瘤治疗方法如外科手术、化学疗法、其他靶向方法、放射疗法、免疫疗法等联合使用。

本发明所述的靶向单元和靶向剂的制备

本发明所述的靶向单元优选是合成肽。肽可通过多种已知的技术进行合成，例如固相合成方法(FMOC、BOC及其他保护方案，多种树脂类型)、液相合成方法(FMOC、BOC和其他不同变型)及它们的组合。甚至为此目的，自动合成装置/设备是商业上可获得的，常规的合成和纯化服务也是商业上可获得的。这些方法都是本领域技术人员熟知的。一些方法和材料被描述于例如下述参考文献中：

Bachem AG，SASRIN^TM(1999)，The BACHEM Practise of SPPS(2000)，Bachem 2001 catalogue(2001)，Novabiochem 2000 Catalog(2000)，Peptide and Peptidomimetic Synthesis(2000)和The CombinatorialChemistry Catalog&Solid Phase Organic Chemistry(SPOC)Handbook98/99。肽的合成在实施例中也有举例说明。

正如本领域所公知的，使用一个或多个保护基团往往是可取的、重要的和/或必需的，大量保护基团是本领域公知的，例如FMOC、BOC、和三苯甲基及实施例中所提到的其他保护基团。保护基团经常用于保护氨基、羧基、羟基、鸟嘌呤基和-SH基、及任何活性基团/官能团。

正如本领域技术人员所熟知的，活化经常涉及羧基官能团的活化和/或氨基的活化。

保护也可以是正交的(orthogonal)和/或半/准/拟正交的。保护和活化基团、物质及其使用在实施例中有举例说明并且在这里引用的参考文献中也有描述，同时也描述于大量书籍和本领域公知的其他信息来源中(例如Protective Groups in Organic Synthesis，1999)。

用于固相合成的树脂也是本领域公知的，并被描述于实施例和上述引用的文献中。

本发明所述的环状结构例如可通过基于使用正交保护的氨基酸的方法来合成。因此，例如，一个包含正交保护的“额外的”COOH官能团的氨基酸(例如(N-(-FMOC-L-谷氨酸的烯丙基酯，即“FMOC-Glu-Oall”)，或(N-(-FMOC-L-谷氨酸的叔丁基酯(“FMOC-Glu-OtBu”)，或N-(-FMOC-L-谷氨酸的4{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚己基)-3-甲基丁基]-氨基}苄基酯(“FMOC-Glu-Odmab”)或N-(-FMOC-L-谷氨酸的2-苯基异丙基酯(“FMOC-Glu(O-2-PhiPr)-OH”，或其他双羧基氨基酸例如天冬氨酸的相关衍生物；或任何前面提到的物质的树脂结合形式)，及一个具有正交保护的“额外的”氨基基团的氨基酸(例如N-(-FMOC-N-(-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸(“FMOC-Lys(Mtt)-OH”)或鸟氨酸的相应衍生物或一些其他双氨基羧酸或一种所述物质的树脂结合形式；但是树脂结合形式不是具有“额外的”COOH的正交保护的氨基酸同时具有的树脂结合形式)，可以加入所述结构中，并且去保护后，羧基和氨基可以进行反应，通常使用活化剂。这种类型的方法学是众所周知的并被描述于例如下述参考文献Novabiochem Catalog(2000)，第19～21页和第33页特别是第B9～B15页，及本文的参考文献Bachem 2001catalogue(2001)，第31～32页，Chan等(1995)，Yue等(1993)和Hirschmann等(1998)中。

合适的起始合成原料是商业上可获得的，进一步的原料可以通过本领域已知的方法制备。D-氨基酸衍生物也可用于该方法学中。正如本领域技术人员所知道的，准正交/半正交/拟正交的保护基团也可代替“真正的”正交保护基团被使用。

按照上述方法制备的环状产物通常在生物学环境中是特别稳定的，因此该结构是优选的。这种类型的结构可通过任何生产该结构的方法(化学的、酶促的或生物学的)进行制备。多数这些方法是本领域技术人员所熟知的。就像本领域技术人员所熟知的那样，这种类型的环状结构可在固相合成的帮助下进行化学合成，但它们同样也可以使用液相方法或固相和液相的结合方法来进行合成。具有“额外的”羧基或氨基官能团的氨基酸适于环化目的(当被充分保护后)，这些氨基酸包括(为非限制性的可能性)，例如，具有下述结构的氨基酸：

正如本领域技术人员所熟知的那样，在任何类型的液相环化中，稀释的液相一般是有利的。

本发明所述的靶向单元和靶向剂也可制成融合蛋白或通过本领域已知的其他适当的重组DNA方法进行制备。尤其是当效应器单元和/或其他选择性的单元是肽或蛋白质时，制备本发明所述的肽的所述方法是优选的。有益的蛋白质效应器单元的一个例子是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。

本发明的靶向单元和靶向剂的优势

对于打算用于诊断或治疗用途的肽存在公认的问题。这些问题中的一个源自于序列的长度：序列越长，合成期望的产物就变得越困难，尤其是如果还存在其他的合成问题，如存在要求保护-去保护和/或产生侧链反应的操作困难的残基。产生侧链反应的趋势，和可能的合成终止(这不仅会降低期望产物的产量，如果完全形成这种情况话，而且会产生肽链长度发生错误的产物)及产生大量有害副产物。如果期望的序列中包含需要进行侧链保护(例如赖氨酸、组氨酸和色氨酸等的碱性侧链)和去保护的氨基酸，这种问题就会急剧增长。这些问题也使期望肽的纯化变得更加困难并且可能使产生充分纯化的材料变得不可能。

与包含合成困难的长序列的已知产物相比，所述长序列具有难以操作的氨基酸残基，本发明的肽就像下文中所详细描述的一样，具有明显的优势。因此本发明的产品和方法及其用途相对于现有技术，提供非常显著并且是非常重要的优势。

本发明的靶向单元能够容易并且可靠地被合成。与许多现有技术的肽相比，优势在于本发明的靶向单元和基序不包含操作困难的碱性氨基酸赖氨酸和组氨酸，也不包含色氨酸，其中上述所有这些氨基酸都可以在肽合成中产生严重的侧链反应，并且，由于该原因，期望产物的产量可能会根本上降低或者甚至不可能获得足够量或具有足够品质的产物。

当组氨酸、赖氨酸和色氨酸存在时，必须使用适当的保护基团进行充分保护，所述保护基团在合成过程中保持完整。这可能是非常困难的，至少增加了成本和技术难题。试剂和工作量也显著地增加成本，其他去保护步骤的费用和每单元期望产品的费用也会增加。

由于本发明的肽分子小并因此显著减少了合成步骤，因此其生产比现有技术中靶向肽的生产更容易并且更便宜。

由于本发明的产物中不需要组氨酸，因此其外消旋的危险是不需考虑的。

不用考虑组氨酸的任何外消旋作用不仅对于本发明产物的经济有效的合成具有巨大的优势，而且对于纯化、分析及质量控制也具有巨大的优势。这也使得对于人和动物的任何给药变得更加安全和更加直接。

由于本发明的肽分子小，其还可以被更可靠和更容易地纯化，而且使用更少的劳动和设备时间，并且因此使用显著更低的成本。整体费用因此急剧降低并且能够得到更好的产品及以更大的量得到更好的产品。此外，由于纯化的可靠性更好，所以对治疗及诊断应用中的毒性残留物和致命的或其他严重的副作用的担心更少。

具有相对较少步骤的更短的合成方案产生更少的杂质，这使得本发明的肽具有更大的优势。有毒的甚至是致命的杂质、变应原等等的风险被显著地降低，此外，纯化也更加容易。

相对于那些更长及更“难于操作”的肽序列，本发明产品更容易进行分析及进行质量控制并且费用更低。这提高了分析和质量控制的可靠性。

由于像赖氨酸这样的残基不存在于靶向单元中，因此就不存在效应器单元与这些残基不恰当连接的风险。这是一个显著的优点。

使用(在靶向基序之外)例如被保护的赖氨酸或鸟氨酸可以很容易将效应器单元与本发明的肽和肽基类似物及肽模拟物质连接，因为不存在靶向基序中的任何赖氨酸残基同时进行反应的危险。

为对本发明的肽进行环化，可使用被保护的赖氨酸或鸟氨酸，这是因为靶向基序和单元中不含这些氨基酸。这是一个巨大的优势。

在本发明所述靶向剂的固相合成中，当效应器单元和任选的额外单元仍与树脂相连时即可被连接至靶向肽，而不存在保护基的去除将导致额外单元被破坏的危险。类似的优势也适用于液相合成。

本发明及本发明所述的产物、方法和用途的另一重要的优势是产物的高度选择性和有效的靶向性。

与使用抗体和抗体片段的靶向疗法相比，本发明的产物和方法由于几种原因是非常有利的。当为大的生物分子的情况下，潜在的免疫学的及相关的风险也是很明显的。与小的合成分子如本发明的靶向剂、单元和基序相反，这些大分子产物的过敏反应也是非常令人担心的。

与靶向抗体和抗体片段相比，本发明所述的产物和方法是非常有利的，因为如果需要或希望的话它们的结构能够被很容易地进行改变。特定的氨基酸如组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苏氨酸如果希望的话可被省略，并且几乎没有必需的官能基团。另一方面，在不干扰靶向效果的情况下，包括不同的结构单元，以在特定用途中具有特殊价值的所需的特定特性，是可能的。

本发明所述靶向剂的应用

由于本发明所述的靶向单元和靶向剂在体内选择性地靶向肿瘤，就像实施例中所显示的那样，本发明所述的靶向单元和靶向剂在癌症的诊断和治疗中是有用的。可以根据所需的效果、检测或疗法来选择效应器单元。通过在上述靶向单元中包含效应器也能获得期望的效果。为用于放射疗法，靶向单元自身可以是例如被放射性标记的。

本发明还涉及诊断组合物，该诊断组合物包含有效量的至少一种本发明所述靶向剂。除靶向剂以外，本发明所述的诊断组合物可以，任选地，包含载体、溶剂、赋形剂、悬浮剂、标记剂和其他通常用于诊断组合物的添加剂。该诊断组合物在诊断肿瘤、肿瘤细胞和转移中是有效的。

本发明所述的诊断组合物可制成液体、凝胶或固体剂型，优选是包含本发明所述靶向剂的水性液体，所述靶向剂的浓度在大约0.00001μg/l至25×10⁷μg/l范围。该组合物可进一步包含稳定剂、去污剂，如聚山梨醇酯和Tween(吐温)，以及其他的添加剂。根据所使用的剂型，这些成分的浓度可以有较大的变化。诊断组合物可在体内或体外使用。

本发明还包括靶向剂和靶向单元在制备治疗癌症的药物组合物中的应用。

本发明还涉及药物组合物，该药物药物组合物包含治疗有效量的至少一种本发明所述的靶向剂。通过施用治疗有效剂量的药物组合物，药物组合物可以用于治疗、预防或改善癌症，所述药物组合物包含本发明所述的靶向剂或靶向单元或治疗上可接受的盐、酯或其他衍生物。这些组合物也可包含靶向剂和靶向单元与标记试剂、成像剂、药物和其他添加剂的不同组合。

本发明所述的靶向剂的治疗有效量视药物组合物的剂型而变化。优选地，本发明所述的组合物可包含浓度变化区间在大约0.00001μg/l至250g/l的靶向剂，更优选大约0.001μg/l至50g/l，最优选0.01μg/l至20g/l。

本发明所述的药物组合物对于本发明所述靶向剂的给药是有用的。特别优选适于口服、静脉或局部注射、或输注的药物组合物。这些药物组合物可以在体内或离体使用。

可以将制剂冻干并在给药前恢复原状或可以储存为例如一种溶液、多种溶液、悬浮液、悬浮液-溶液等适宜给药的形式或可以为任何形态或形状，一般包括粉末、浓缩物、冷冻的液体和任何其他类型。它们也可以由分离的单位组成，在使用前进行混合或者可能的话，进行另外的加工和/或处理。液体剂型提供的好处是它们无需恢复原状就可以进行给药。溶液产物的pH在大约1至大约12的范围，优选接近生理pH。溶液的渗透度可以使用例如氯化钠和/或糖类、多元醇和/或氨基酸和/或类似的成分调至优选的值。组合物可进一步包含药学可接受的赋形剂和/或稳定剂，例如白蛋白、糖类和不同的多元醇，以及任何可接受的添加剂，或其他活性成分如化疗剂。

本发明还涉及通过给需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明所述的药物组合物来治疗癌症，尤其实体瘤的方法。

治疗剂量可以通过在可行的体外或体内测试系统中检测靶向剂和靶向单元来凭经验决定。实施例中给出了上述测试的例子。然后从这些实验中可以估算出合适的治疗有效量。

对于口服来说，重要的是靶向单元和靶向剂是稳定的并且从肠道系统充分吸收。

本发明所述的药物组合物可以通过系统给药、非系统给药、局部或表面给药、肠胃外及非肠胃外给药等方式进行给药，例如通过皮下、静脉内、肌肉内、口服、鼻内、通过肺部气雾剂、通过注射或输注至特定的器官或区域、口腔、颅内或腹膜内等方式。

那些治疗癌症的临床领域的一般技术人员能够很容易决定本发明所述肿瘤靶向剂的给药剂量和方式。一般地，剂量依据以下因素的不同而不同：如所使用的靶向剂的种类、年龄、健康状况、正在治疗的医学病症、同时进行治疗的种类，如果有的话，治疗的频率及所期望的效果的性质、性别、症状持续时间、和禁忌症，如果有的话，以及其他被个人医生调节的变量。对于人类患者，本发明所述的靶向单元或试剂优选的给药剂量在大约0.000001μg/公斤至约40mg/公斤体重之间变化，可采用整体剂量或重复剂量例如每日剂量的方式进行给药。

本发明的靶向单元和靶向剂及药物组合物也可以用作将DNA或RNA或它们的结构和功能类似物如硫代磷酸酯或肽核酸(PNA)递送至肿瘤及其转移灶中或递送至体外的分离细胞和器官的靶向设备，例如用作体内和体外基因治疗的工具。在这些情况下，靶向剂或靶向单元可以是病毒衣壳或包膜的部分、脂质体或其他DNA/RNA或相关物质的“容器”的部分、或直接与DNA/RNA或上述其他分子偶联。

本发明同样还包含在体内和体外诊断、检测或分析癌症或癌细胞的试剂盒和试剂盒的组分。这样的试剂盒至少包含本发明的靶向剂或靶向单元和使检测能够进行的诊断单位。该试剂盒可包含例如与用于检测的单元相偶联的靶向剂和/或靶向单元，所述检测例如通过免疫学方法、放射或酶促方法或其他本领域已知的方法进行。

此外，本发明的靶向单元和试剂以及靶向基序和序列可用作对上述任何目的的肽模拟物进行设计的提示化合物。

更进一步，本发明的靶向单元和靶向剂及靶向基序和序列本身、和/或偶联到其他材料上的本发明的靶向单元和靶向剂及靶向基序和序列，可用于细胞、分子和相关生物目标的分离、纯化和鉴定。

下述非限制性的实施例是对本发明的进一步举例说明。

实施例

在最后一个实施例后给出下面实施例中所使用的试剂及试剂供应商的列表。

实施例1

靶向单元(肽)LRS的合成

用实施例2描述的方法合成包含靶向基序LRS、用官能团保护的、树脂结合的靶向单元(被保护的肽)。

将下述试剂用作起始原料(按所给出的顺序)：

Fmoc-Ser(tBu)树脂，Applied Biosystems产品目录号401429，0.64mmol/g

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，CAS号154445-77-9，Applied Biosystems产品目录号GEN911097，分子量：648.8g/mol

Fmoc-L-Leu-OH，CAS号35661-60-0，Applied Biosystems产品目录号GEN911048，分子量：353.4g/mol

在偶联过程的最后一轮循环后，将少量树脂结合肽的样品进行Fmoc去除(实施例2中的步骤1～10)，然后如实施例2中所描述的那样，用切除混合物处理3小时将肽从树脂上切下，并分离。产物(LRS)在其阳离子模式MALDI-TOF质谱的帮助下被识别，其中LRS的M+1离子明显占优势。

MALDI-TOF数据(LRS)：

计算分子量＝374.44

观察到的信号：

375.30M+H

397.22M+Na

实施例2

对用于实施例中所述合成肽的人工固相肽合成及质谱测量的一般描述

所有的合成过程在一个可密封的玻璃漏斗中进行，该玻璃漏斗配备有孔隙度等级在2至4之间的烧结玻璃滤盘，并且顶端具有聚丙烯或酚醛塑料螺旋盖(为了进行密封)，以及两个PTFE按钮活塞：一个位于滤盘下方(用于排水)，另一个位于螺旋盖管颈肩部上的倾斜角(用于氩气进入)。

在漏斗中装入适当的每次处理用的固相合成树脂和溶液，在摇瓶摇动器(Gallenkamp^TM)“腕部运动”的帮助下剧烈地摇动适当的一段时间，然后在适度氩气压的作用下进行过滤。

一个合成循环(＝一个氨基酸单位的添加)的一般过程如下：

将加载有包含两个或多个氨基酸单位的大约1mmol的Fmoc-肽(＝氨基末端的氨基被9-芴基甲氧基羰基保护的肽)，或加载有大约1mmol合适的Fmoc-氨基酸(即，带有上述保护基团的氨基酸；大约2g树脂，0.5mmol/g)的适当的Wang或Rink(Rink酰胺)树脂，用下述方式进行处理，每个处理步骤包括用30ml指定溶液或溶剂摇动2.5分钟并且如果没提及别的方式的话，进行过滤。

“DCM”指用二氯甲烷进行摇动，“DMF”指用N，N-二甲基甲酰胺进行摇动(DMF可用NMP代替，NMP为N-甲基吡咯烷酮)。

处理步骤为：

1.DCM，摇动10～20分钟

2.DMF

3.溶于DMF中的20％(体积比)的哌啶，5分钟

4.溶于DMF中的20％(体积比)的哌啶，10分钟

5.至7.DMF

8.至10.DCM

11.DMF

12.含有3mmol活化氨基酸(其制备在下文中描述)的DMF溶液，摇动2小时

13.至15.DMF

16.至18.DCM

在最后一步处理(18)后，将氩气贯穿树脂大约15分钟并将树脂储存于氩气中(如果将继续进行下一个单元的合成，在密封的反应漏斗中进行)。

利用下面列出的试剂，在处理步骤12之前在独立的容器中对要加到与树脂相连的氨基酸或肽链上的9-芴基甲氧基羰基-N-保护的氨基酸(Fmoc-氨基酸)进行活化。例如，将Fmoc-氨基酸(3mmol)溶于大约10ml的DMF中，用3mmol的HBTU溶液处理1分钟，所述HBTU溶解于6ml的以DMF为溶剂的0.5M的HOBt中，然后立刻用3ml的2.0M的DIPEA溶液处理5分钟。

用于活化Fmoc-氨基酸的活化试剂如下：

HBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸，CAS号[94790-37-1]，Applied Biosystems产品目录号401091，分子量为379.3g/mol

HOBt＝1-羟基苯并三唑，以DMF为溶剂的0.5M的溶液，AppliedBiosystems产品目录号400934

DIPEA＝N，N-二异丙基乙胺，以N-甲基吡咯烷酮为溶剂的2.0M的溶液，Applied Biosystems产品目录号401517

使用带有合适保护基团的适当的不同Fmoc-氨基酸，在几个循环中重复进行上述程序，以生产适当肽的树脂结合的来源(即“树脂结合的”肽)。该程序也提供了将某些效应器和/或间隔区和/或接头单元等例如生物素或Fmoc-Ahx(＝6-(Fmoc-氨基)-己酰基)部分与树脂结合的肽进行连接的一种实用方法。

从树脂上进行切除是采用下述试剂混合物进行的：

三氟乙酸(TFA)：92.5体积％

水：5.0体积％

乙二硫醇：2.5体积％。

通过步骤1.至10.(如上述一般程序中的描述)去除Fmoc保护基团后，将树脂用三份上述试剂混合物(对于1g树脂，每份约为15ml)分别进行处理，每次处理一小时。处理以上文描述的方式在氩气环境中进行。通过过滤所得的TFA溶液然后使用旋转蒸发器进行减压浓缩，并再充入氩气。加入一些二乙醚并再次浓缩。将浓缩残余物在二乙醚和氩气条件下于冰箱中沉淀过夜。弃去上层醚溶液，并用二乙醚漂洗沉淀。为进行质谱(MALDI-TOF+)测定，将沉淀样品溶于适合波谱方法的溶剂中，然后进行过滤，如果需要的话，对滤过液进行稀释。进一步纯化采用反相高效液相色谱(HPLC)法来进行，借助于使用粒径为10微米的C-18类型柱的“Waters 600”泵装置并在30分钟过程中线性洗脱梯度的组成由99.9％的水/0.1％的TFA变成99.9％的乙腈/0.1％的TFA。HPLC柱的尺寸是25cm×21.2mm(Supelco产品目录号567212-U)和15cm×10mm(Supelco产品目录号567208-U)。基于218nm处的吸光度并使用“Waters 2487”仪器进行检测。

上述切除混合物同时也去除下列保护基团：用于半胱氨酸-SH保护的三苯甲基(Trt)；用于精氨酸侧链保护的2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)；用于谷氨酸和/或天冬氨酸的侧链羧基保护的叔丁基(作为羧基官能团上的酯基；OtBu)，并且通常也能用于去除在类似结构(硫醇、鸟嘌呤基、羧基)上的这些保护基团。它不引起Fmoc的去除。

上述切除步骤也可在未去除Fmoc基团的情况下进行，以产生肽的氨基末端的N-Fmoc-衍生物，或用于与效应器单位(不包含Fomc)连接的肽。

所使用的质谱法：基质辅助激光解析电离-飞行时间(MALDI-TOF)

设备类型：Bruker Biflex MALDI TOF质谱仪

设备供应商：Bruker Daltonik GmbH，Fahrenheitstrasse 4，D-28359Bremen，德国

MALDI-TOF阳离子反射器模式：外部标准：血管紧张素II和ACTH(促肾上腺皮质激素，18～39)

基质：α-氰基-4-羟基肉桂酸(以含有0.1％三氟乙酸的50％乙腈水溶液为溶剂的饱和溶液)。

将样品与基质一起在轻柔的暖气流条件下干燥于目标板上。

MALDI-TOF阴离子反射器模式：外部标准：缩胆囊素和胰高血糖素

基质：2，4，6-三羟苯乙酮(以3mg/ml的浓度溶于以50％乙腈为溶剂的10mM柠檬酸铵中)。

将与基质混合的样品立即在真空中干燥于目标板上。

样品制备：将样品以10皮摩尔/微升～100皮摩尔/微升的浓度与上述基质溶液混合。

“发射”是通过波长为337nm的氮激光。探针板的电压在阳离子反射器模式中是19kV，在阴离子反射器模式中是-19kV。

关于波谱(仅涉及阳离子模式)的一般性说明：在所有情况下，基于同位素伴随物，具有典型精细结构的M+1(即一个质子的加合物M+H+)信号明显占优势。在几乎所有情况下，M+1信号模式伴随着一个类似但明显较弱的位于M+23处(Na+加合物)的峰带。除M+1和M+23处的谱带外，在很多情况下也能观测到M+39(K+加合物)或M+56(Fe+加合物)处的谱带。

当物质的分子量低时，“基质信号”(由基质组分/“电离环境”产生的信号)被忽略(即，在294和380Da的信号被忽略)。

在合成实施例中给出的计算分子量数值相当于每个元件的丰度最高的同位素，即，“准确的质量”。对于信号所给出的解释仅是试验性的。

实施例3

实施例中所描述的包含半胱氨酸的肽的I2-促进的环化的一般程序

将树脂(1g)在CH₂Cl₂(15ml)中膨胀并搅拌20分钟。通过过滤除去溶剂，将树脂用DMF(15ml)处理一次，处理时间为3分钟。过滤后，将树脂结合的肽(或靶向剂)用溶于DMF(10ml)中的碘(5摩尔当量)处理1小时。

将DMF-碘溶液通过过滤去除，并将剩余物用DMF(15ml)洗涤3次，再以CH₂Cl₂(15ml)洗涤3次，每次3分钟。

当要制备“简单的”肽(没有Fmoc基团)时，依据实施例2中所描述的一般程序去除Fmoc基团并将肽从树脂上释放下来，通过反相HPLC对其进行纯化。当靶向剂不包含Fmoc基团时，将产物通过类似的方式从树脂上释放下来并纯化。

所用的原料：

碘，CAS号7553-56-2，分子量：253.81，Merck Art.号4760

实施例4

靶向单元(肽)DLRSK的合成

通过上面实施例2中所描述的人工合成方式合成官能团被保护的、树脂结合的靶向单元(被保护的肽)，其包含靶向基序LRS。

将下述试剂用作起始原料(按所给出的顺序)：

Fmoc-Lys(Mtt)-树脂，0.68mmol/g，Bachem产品目录号D-2565.0005

Fmoc-L-Ser(tBu)-OH，CAS号71989-33-8，Perseptive Biosystems产品目录号GEN911062，分子量：383.4g/mol

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-L-Leu-OH

Fmoc-Asp(2-苯基异丙基酯)-OH，分子量：473.53g/mol，Bachem产品目录号B-2475.0005

在偶联过程的最后一个循环后，对仍与树脂结合的靶向单元进行如实施例21中所述的环化处理，在环化过程中形成额外的酰胺键。环化过程后(形成大环内酰胺)，将少量树脂样品(包含仍被完全保护的环化肽)进行实施例2中所述的Fmoc去除处理(实施例2中的步骤1～10)，此后将肽的样品通过用实施例2中所述的切除混合物处理3小时而由树脂上切除下来，并用相同实施例中所述的方法进行分离。

然后，将产物(DLRSK大环内酰胺)在其阳离子模式MALDI-TOF质谱的帮助下进行鉴定，其中环状DLRSK的M+1离子明显占优势。

MALDI-TOF数据(环状DLRSK)：

计算分子量＝599.34

观察到的信号：

600.42M+H

622.40M+Na

638.29M+K

Fmoc-DLRSK大环内酰胺

环状Fmoc-DLRSK采用与环状DLRSK类似的方法进行制备和鉴定，不同之处在于在这种情况下省略最后的Fmoc的去除。

MALDI-TOF数据(环状Fmoc-DLRSK)：

计算分子量＝821.41

观察到的信号：

822.60M+H

844.62M+Na

实施例5

靶向单元(肽)DLRSGRK的合成

将下述试剂用作起始原料(按所给出的顺序)：

Fmoc-Lys(Mtt)-树脂

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-Gly-OH，CAS号29022-11-5，Novabiochem产品目录号04-12-1001，分子量：297.3g/mol

Fmoc-L-Ser(tBu)-OH

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-L-Leu-OH

Fmoc-Asp(2-苯基异丙基酯)-OH

在偶联过程的最后一个循环后，将仍与树脂结合的靶向单元进行如实施例21中所述的环化处理，在环化过程中形成额外的酰胺键。环化过程后(形成大环内酰胺)，将少量树脂样品(包含仍被完全保护的环化肽并作为下一步合成例如生物素化的合适的起始原料)进行实施例2中所述的Fmoc去除处理(实施例2中的步骤1～10)，此后，将肽的样品通过用实施例2中所述的切除混合物处理3小时而由树脂上切除下来，并用相同实施例中所述的方法进行分离。

然后，将产物(环状DLRSGRK)在其阳离子模式MALDI-TOF质谱的帮助下进行鉴定，其中环状DLRSK的M+1离子明显占优势。

MALDI-TOF数据(环状DLRSGRK)：

计算分子量＝812.46

观察到的信号：

813.69M+H

实施例6

靶向单元(肽)DRGLRSK的合成(凭借内酰胺桥环化)

将下述试剂用作起始原料(按所给出的顺序)：

Fmoc-Lys(Mtt)树脂

Fmoc-L-Ser(tBu)-OH

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-L-Leu-OH

Fmoc-Gly-OH

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-Asp(2-苯基异丙基酯)-OH

在偶联过程的最后一个循环后，将仍与树脂结合的靶向单元进行如实施例21中所述的环化处理，在环化过程中形成额外的酰胺键。环化过程后(形成大环内酰胺)，将少量树脂样品(包含仍被完全保护的环化肽)进行实施例2中所述的Fmoc去除处理(实施例2中的步骤1～10)，此后将肽的样品通过用实施例2中所述的切除混合物处理3小时而由树脂上切除下来，并用相同实施例中所述的方法进行分离。

然后，将产物(DRGLRSK大环内酰胺)在其阳离子模式MALDI-TOF质谱的帮助下进行鉴定，其中环状DRGLRSK的M+1离子明显占优势。

MALDI-TOF数据(环状DRGLRSK)：

计算分子量＝812.46

观察到的信号：

813.34M+H

实施例7

靶向单元(肽)AHXDLRSK的合成，其凭借内酰胺桥成为环状

将下述试剂用作起始原料(按所给出的顺序)：

Fmoc-Lys(Mtt)树脂

Fmoc-L-Ser(tBu)-OH

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-L-Leu-OH

Fmoc-Asp(2-苯基异丙基酯)-OH

Fmoc-6-氨基己酸，(Fmoc-6-Ahx-OH)，CAS号88574-06-5，Novabiochem产品目录号04-12-1111 A22837，分子量：353.4g/mol

在偶联过程的最后一个循环后，将仍与树脂结合的靶向单元进行如实施例21中所述的环化处理，在环化过程中形成额外的酰胺键。环化过程后(形成大环内酰胺)，将少量树脂样品(包含仍被完全保护的环化肽)用实施例2中所述的切除混合物处理3小时。通过这种方式，将肽样品从树脂上切除，并且该样品的侧链保护基团也被去除，但不包括最后的Fmoc的去除，这里省略这一步骤。样品用同一实施例中所述的方法进行分离。然后，将产物(DLRSK大环内酰胺)在其阳离子模式MALDI-TOF质谱的帮助下进行鉴定，其中环状DLRSK的M+1离子明显占优势。

MALDI-TOF数据(环状Fmoc-AhxDLRSK)：

计算分子量＝938.50

观察到的信号：

939.50M+1

实施例8

靶向剂FMOC2DAP-DLRSK(DAP＝二氨基丙酰基)的合成，该靶向剂包含效应器单元二氨基丙酸，该效应器单元通过其羧基与肽DLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借内酰胺桥成为环状

该靶向剂使用上文实施例2中所述的人工合成方法(与上文实施例4中的合成方法类似，包括环化)进行合成。接下来，序列DLRSK采用实施例2中所述的一般偶联方法以DL-2，3-二(Fmoc-氨基)丙酸进行延伸。

DL-2，3-二(Fmoc-氨基)丙酸的制备：

将DL-2，3-二氨基丙酸单盐酸盐溶于15mL的10％的Na₂CO₃水溶液中。然后加入7mL的二噁烷并将反应混合物冷冻至+4℃。加入溶于20mL二噁烷中的Fmoc-氯化物，并将反应混合物在+4℃搅拌1小时。在室温中连续搅拌过夜后，用乙酸乙酯对反应混合物进行提取，随后将乙酸乙酯蒸发。将残留物用正己烷进行研磨并以少量热乙酸乙酯进行洗涤，获得白色固体，在真空中干燥过夜。

所用的试剂：

DL-2，3-二氨基丙酸单盐酸盐，CAS号54897-59-5，C₃H₈N₂O₂.HCl，Acros Organics，New Jersey USA；Ceel Belgium，产品目录号204670050

Fmoc-氯化物；9-芴基甲基氯甲酸酯98％；C.A.S.号：28920-43-6，Acros，产品目录号：170940250

MALDI-TOF数据(Fmoc2Dap-DLRSK，环状)：

计算分子量＝1129.53

观察到的信号：

1130.32M+H

实施例9

靶向单元(肽)(FMOC-LRS)2DAPA的合成。使用没有氨基酸残基预先与其偶联的肽合成树脂，以及用被保护的氨基酸衍生物(残基)对该树脂进行衍生

通过使用实施例2中具体描述的人工固相肽合成技术来进行靶向单元(肽)(Fmoc-LRS)2Dapa[2，3-二(Fmoc-亮氨酰-精氨酰-丝氨酰-氨基)丙酸]的合成。

第一个氨基酸单元(残基)与肽合成树脂(HM类型；具体见下文所给出的原料列表)的羟基基团的偶联(结合)是通过二氯苯甲酰氯的方法进行的，这与用于氨基官能团被9-芴基甲氧基羰基(＝Fmoc)基团保护(保护方法描述于实施例8中)的2，3-二氨基丙酸的衍生物的方法一样。所用程序如下：

将“空”树脂(没有氨基酸残基的树脂；见下文商品树脂的生产商和产品号)首先以N，N-二甲基甲酰胺(DMF；15ml DMF/1g树脂)在上述(实施例2中)摇动器中洗涤20分钟并排干。在添加五分子当量(与树脂的装载能力有关)的溶于DMF中的被保护的二-2，3-氨基丙酸后，再加入8当量的吡啶，接着在不排去溶液的情况下摇动大约3分钟。然后，加入5当量的2，6-二氯苯甲酰氯，并将混合物在室温摇动18个小时。

进行上述处理后，将树脂排干并用DMF和二氯甲烷按实施例2中所述的一般方案洗涤三次，接着在氩气流中进行干燥。至此本实施例中所用试剂为：

HMP树脂，装载能力：1.16mmol/g(根据商品生产商的报告)，Applied Biosystems产品目录号400957。

吡啶，Merck Art.号9728。

2，3-二-(Fmoc-氨基)丙酸，其制备描述于实施例8中。

从现在起，根据实施例2中所述的一般方法，使用相应于两分子当量的试剂量继续进行合成。上文或实施例2中没有提及的但在这个合成中使用的试剂有：

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-L-Leu-OH

将产物(Fmoc-LRS)2Dapa依据实施例2中所述的一般方法进行分离后，如实施例2的一般程序中所详细描述的那样，使用MALDI-TOF质谱分析(阳离子模式)进行鉴定。

MALDI-TOF数据[(Fmoc-LRS)2Dapa]：

计算分子量＝1260.63

观察到的信号：

1261.40M+H

实施例10

靶向剂Aoa-DLRSK(Aoa＝氨基-氧乙酰基＝NH₂OCH₂CO)的合成，该靶向剂包含效应器单元氨基-氧乙酸，该效应器单元通过其羧基与肽DLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借内酰胺桥成为环状

使用上文实施例2中所述的人工合成方法(与上文实施例4中的合成方法类似，包括环化)合成该靶向剂。接下来，序列DLRSK采用实施例2中所述的一般偶联方法以氨基-氧乙酸进行延伸。

所用的试剂：

Boc-氨基-氧乙酸；Boc-NH-OCH₂-COOH，分子量：191.2g/mol，CAS号，Novabiochem产品目录号01-63-0060

MALDI-TOF数据(Aoa-DLRSK，环状)：

计算分子量＝674.37

观察到的信号：

673.54M+H

实施例11

靶向剂Bio-LRS(Bio＝D-生物素＝维生素H)的合成，该靶向剂包括效应器单元D-生物素，该D-生物素通过其羧基与肽LRS的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)，该靶向剂同时包含靶向单元LRS

使用上文实施例2中所述的人工合成方法(与上文实施例1中的合成方法类似)合成该靶向剂，并用下面实施例13中所描述的生物素化过程作为最后的偶联步骤。在这个最后的偶联过程中，使用D-生物素来代替被保护的氨基酸。不对D-生物素进行保护而是使用其本身。该产物用实施例2中所给出的方法进行分离和纯化并用阳离子模式的MALDI-TOF波谱(M+1离子明显占优势)进行鉴定。

MALDI-TOF数据(Bio-LRS)：

计算分子量＝600.31

观察到的信号：

601.34M+H

623.23M+Na

639.25M+K

实施例12

靶向剂Bio-DLRSK(Bio＝D-生物素＝维生素H)的合成，该靶向剂包含效应器单元D-生物素，该D-生物素通过其羧基与肽DLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借该序列最外面成员的侧链间的酰胺键成为环状

使用上文实施例2中所述的人工合成方法(与上文实施例4中的合成方法类似，包括环化)合成该靶向剂，并用下面实施例13中所描述的生物素化过程作为最后的偶联步骤。在这个最后的偶联过程中，使用D-生物素来代替被保护的氨基酸。不对D-生物素进行保护而是使用其本身。该产物用实施例2中所给出的方法进行分离和纯化并用阳离子模式的MALDI-TOF波谱(M+1离子明显占优势)进行鉴定。

MALDI-TOF数据(Bio-DLRSK环状)：

计算分子量＝825.42

观察到的信号：

826.49M+H

848.35M+Na

实施例13

生物素化的化合物[包含作为效应器单元的一个D-生物素(维生素H)的靶向剂]的合成中所用的一般程序

采用实施例2描述的一般步骤中所述的固相合成方法合成适当的被保护的肽。未对肽去保护，也未将其从树脂上切除。将树脂结合的肽加入反应瓶中。将树脂用CH₂Cl₂(15ml)膨胀并搅拌20分钟。通过过滤除去溶剂，并将树脂用DMF处理一次，处理时间为3分钟。将肽用溶于DMF中的20％的哌啶溶液(20ml)去保护并随之摇动5分钟，重复该过程(现在摇动10分钟)。将树脂用DMF(15ml)洗涤3次，用CH₂Cl₂(15ml)洗涤三次，再用DMF(15ml)洗涤一次，每次3分钟。

将溶于DMF(10ml)中的D-生物素(3摩尔当量)(非均质悬浮液)在单独的容器中用溶于DMF中的0.5M的HBTU/HOBT溶液(3摩尔当量)处理1分钟。在容器中加入溶于NMP中的2M的二-异丙基乙胺(6摩尔当量)。加入上述物质后，反应混合物变成均质溶液。将混合物加入反应器中并摇动反应器2小时。

然后将反应混合物过滤，将残留物用DMF(15ml)洗涤三次，用CH₂Cl₂(15ml)洗涤三次，每次3分钟。

当肽既要像这里所描述的那样进行生物素化，又要像实施例3中所述的那样使用碘处理进行环化，则环化应在生物素化步骤后进行。

所用的原料

D-生物素(维生素H)，CAS号58-85-5，分子量：244.3，Sigma B-4501，99％

实施例14

靶向剂Bio-DLRSGRK(Bio＝D-生物素＝维生素H)的合成，该靶向剂包含效应器单元D-生物素，该D-生物素通过其羧基与肽DLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSGRK，其凭借天冬氨酸侧链和赖氨酸侧链之间的酰胺键成为环状

使用上文实施例2中所述的人工合成方法(与上文实施例5中的合成方法类似，包括环化)合成该靶向剂，并用上面实施例13中所描述的生物素化过程作为最后的偶联步骤。在这个最后的偶联过程中，使用D-生物素来代替被保护的氨基酸。不对D-生物素进行保护而是使用其本身。该产物用实施例2中所给出的方法进行分离和纯化并用阳离子模式的MALDI-TOF波谱(M+1离子明显占优势)进行鉴定。

MALDI-TOF数据(Bio-DLRSGRK，环状)：

计算分子量＝1038.54

观察到的信号：

1039.74M+H

1061.76M+Na

1077.60M+K

实施例15

靶向剂Bio-DRGLRSK(Bio＝D-生物素＝维生素H)的合成，该靶向剂包含效应器单元D-生物素，该D-生物素通过其羧基与肽DRGLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)，该靶向剂同时包含靶向单元DRGLRSK，其凭借冬氨酸侧链和赖氨酸侧链之间的酰胺键成为环状

使用上文实施例2中所述的人工合成方法(与上文实施例6中的合成方法类似，包括环化)合成该靶向剂，并用上面实施例13中所描述的生物素化过程作为最后的偶联步骤。在这个最后的偶联过程中，使用D-生物素来代替被保护的氨基酸。不对D-生物素进行保护而是使用其本身。该产物用实施例2中所给出的方法进行分离和纯化并用阳离子模式的MALDI-TOF波谱(M+1离子明显占优势)进行鉴定。

MALDI-TOF数据(Bio-DRGLRSK，环状)：

计算分子量＝1038.56

观察到的信号：

1039.59M+H

实施例16

靶向剂Bio-AhxDLRSK(Bio＝D-生物素＝维生素H)的合成，该靶向剂包含效应器单元D-生物素，该D-生物素通过其羧基与肽AhxDLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借该序列最外面成员的侧链间的酰胺键成为环状

使用上文实施例2中所述的人工合成方法(与上文实施例7中的合成方法类似，包括环化)合成该靶向剂，并用上面实施例13中所描述的生物素化过程作为最后的偶联步骤。在这个最后的偶联过程中，使用D-生物素用代替被保护的氨基酸。不对D-生物素进行保护而是使用其本身。该产物用实施例2中所给出的方法进行分离和纯化并用阳离子模式的MALDI-TOF波谱(M+1离子明显占优势)进行鉴定。

MALDI-TOF数据(Bio-AhxDLRSK，环状)：

计算分子量＝938.50

观察到的信号：

939.50M+H

实施例17

靶向剂Bio-K-AhxDLRSK(凭借天冬氨酸侧链和C-末端赖氨酸侧链之间的酰胺键成为环状；Bio＝D-生物素＝维生素H)的合成，该靶向剂包含一个效应器单元D-生物素(通过一加一的接头单元和/或间隔区单元和/或作为一个更大的间隔区和/或接头单元进行连接)，该效应器单元通过其羧基与赖氨酸残基(单元)的N-末端氨基偶联，而上述赖氨酸又凭借酰胺键与6-氨基己酸(＝Ahx)的氨基偶联，而6-氨基己酸再凭借酰胺键与肽DLRSK的氨基偶联，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK

该合成按照下述方法进行：按上述实施例7的描述制备完全保护的、树脂结合的环化的靶向单元(具有间隔区/接头单元的肽)AhxDLRSK。接着，用实施例2中所述的一般偶联方法用一个赖氨酸单元(以Fmoc-基团保护N-末端氨基并以Boc-基团保护侧链氨基)对序列AhxDLRSK进行延伸。用作起始原料的试剂：

Fmoc-L-Lys(tBoc)-OH

最后将仍与树脂结合的完全保护的K-AhxDLRSK依据实施例13所描述的一般方法进行生物素化。用HPLC进行纯化，总产量的理论值为30％。产物鉴定：

阳离子模式的MALDI-TOF质谱：M+1离子明显占优势

MALDI-TOF数据(Bio-K-AhxDLRSK，环状)：

计算分子量＝1066.60

观察到的信号：

1067.5M+H

实施例18

靶向剂Bio4-K3-K-AhxDLRSK(凭借天冬氨酸侧链和C-末端赖氨酸侧链之间的酰胺键成为环状；Bio＝D-生物素＝维生素H)的合成，该靶向剂包含四个相同的效应器单元D-生物素，每个D-生物素通过其羧基与赖氨酸残基(单元)的一个氨基(为N-末端氨基或侧链氨基)偶联(通过树状聚体结构进行连接，树状聚体结构可以认为是接头单元和/或间隔区单元的组合和/或作为一个更大的间隔区和/或接头单元)，和树状聚体结构(两个赖氨酸中的每个携带有两个效应器生物素单元，这些赖氨酸通过羧基官能团与另一个赖氨酸偶联，而该另一个赖氨酸又与一个赖氨酸(侧链未偶联)的N-末端氨基凭借酰胺键偶联，该侧链未偶联的赖氨酸又类似地与Ahx(6-氨基己酸)偶联，而Ahx再与肽DLRSK的氨基末端凭借酰胺键连接，该靶向剂还包含靶向单元DLRSK

产物如下式所示：

并能确定在K-AhxDLRSK的N-末端包含四倍生物素化的四分支接头/间隔区单元。

该合成按照下述方法进行：完全保护的、树脂结合的、“在树脂上”环化的靶向单元(具有两个间隔区/接头单元的肽)K-AhxDLRSK按上述实施例16的描述方法制备。包含四个生物素和三个赖氨酸的分支结构采用实施例2中所述的一般偶联方法进行构建，以使序列K-AhxDLRSK首先以一个赖氨酸单元(其两个氨基中的每个均用一个Fmoc基团进行保护)进行延伸。然后，使用双倍量的偶联试剂和双重保护(Fmoc基团)的赖氨酸重复该步骤(赖氨酸的添加)，以进一步偶联两个赖氨酸单元，其中一个偶联于第一个被偶联的赖氨酸的侧链氨基上，另一个偶联于第一个被偶联的赖氨酸的氨基末端的氨基上。所用的试剂(除所提及的实施例中所述的原料之外)：

Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH，CAS号78081-87-5，分子量：590.7g/mol，PerSeptive Biosystems产品目录号GEN911095，Hamburg，德国

按照实施例13中所述的一般方法进行生物素化，使用12分子当量的偶联试剂和生物素，使用树脂结合的分支肽，以提供包含四个生物素单元的结构。用HPLC进行纯化，总产量的理论值为44％。

产物鉴定：

阳离子模式的MALDI-TOF质谱：M+1离子明显占优势

MALDI-TOF数据(Bio₄-K₃-K-AhxDLRSK，环状)：

计算分子量＝2129.12

观察到的信号：

2129.89M+H(最强的同位素异构物是2130.9)

实施例19

靶向剂Bio₄-K₃-K(Dtpa)-AhxDLRSK(凭借天冬氨酸侧链和C-末端赖氨酸侧链之间的酰胺键成为环状；Bio＝D-生物素＝维生素H；Dtpa＝二乙烯三胺五乙酸减去一个OH)的合成，该靶向剂包含两种类型的效应器单元：四个相同的效应器单元D-生物素，每个D-生物素通过其羧基与赖氨酸残基(单元)的一个氨基(为N-末端氨基或侧链氨基)偶联(通过树状聚体结构进行连接，树状聚体结构可以认为是接头单元和/或间隔区单元的组合和/或作为一个更大的间隔区和/或接头单元)，和树状聚体结构(两个赖氨酸中的每个携带有两个效应器生物素单元，这些赖氨酸通过羧基官能团与另一个赖氨酸偶联，而该另一个赖氨酸凭借酰胺键与一个赖氨酸(侧链通过酰胺键与Dtpa偶联)的N-末端氨基凭借酰胺键连接，该侧链通过酰胺键与Dtpa偶联的赖氨酸类似地与Ahx(6-氨基己酸)连接，而Ahx凭借酰胺键与肽DLRSK的氨基末端连接，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK

产物如下式所示：

并能确定在肽AhxDLRSK的N-末端包含四倍生物素化的五分支接头/间隔区单元，在一个分支上带有Dtpa部分。

该合成按照下述方法进行：按上面实施例18所述的方法制备分离并纯化的靶向剂Bio₄K₃-K-AhxDLRSK。然后将如此得到的产物以溶解于DMF溶液中的10分子当量的二乙烯三胺五乙酸二酸酐(以生物素化的肽为基础进行计算为0.01M的溶液)处理18小时。进行此处理后，在DMF溶液中加入水，使体积变为双倍，将溶液储存备用并静置4小时。最后，将溶剂在真空中蒸发，并将所得残留物混于含有0.1％三氟乙酸的水中并将其过滤，滤出液通过反相HPLC进行纯化。产物用其MALDI-TOF质谱中的M+1峰进行鉴定。

产物鉴定：

阳离子模式的MALDI-TOF质谱：M+1离子明显占优势

MALDI-TOF数据(Bio₄-K₃-K(Dtpa)-AhxDLRSK，环状)：

计算分子量＝2504.24

观察到的信号：

2505.29M+H

实施例20

靶向剂Cbp-DLRSK[CBP＝5-(1-o-碳硼烷基)-戊酰]的合成，该靶向剂包含效应器单元5-(1-o-碳硼烷基)-戊酸，该效应器单元通过其羧基与肽DLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借该序列最外面的成员侧链间的内酰胺桥成为环状

使用上文实施例2中所述的人工合成方法(与上文实施例4中的合成方法类似，包括环化)合成该靶向剂。接着，以实施例2中所述的一般偶联方法，用5-(1-o-碳硼烷基)-戊酸对序列DLRSK进行延伸，不同之处在于，在实施例2的步骤12的处理中用PyAoP(代替HBTU)和HOAT(代替HOBt)及反应时间为4小时。

所用试剂：

5-(1-o-碳硼烷基)-戊酸，Katchem，Prague，Czech Republic，F.W.244.34g/mol

MALDI-TOF数据(Cbp-DLRSK，环状)：

计算分子量＝817.60(基于B10，丰度20％)，827.57(基于B11，丰度80％)

平均分子量＝826.01g/mol

观察到的信号：

最高峰在826.55和827.55的多重谱线：M+H

最高峰在848.45和849.50的多重谱线：M+Na

实施例21

以内酰胺的形式(如大环内酰胺；凭借位于“媒介”序列末端的序列中的赖氨酸侧链和天冬氨酸侧链间的酰胺键)对肽、靶向单元、靶向剂或靶向基序进行环化的一般方法

按上面实施例2中所述的一般方法人工制备未环化的、充分保护的树脂结合的肽。

在进行环化前，用稀释的TFA(4％，溶于二氯甲烷)进行选择性的一个步骤，即脱去赖氨酸和天冬氨酸的侧链保护基团[所述基团是：赖氨酸单元上的4-甲基三苯甲基和天冬氨酸单元上的2-苯基异丙基(酯)]。环化涉及天冬氨酸单元的侧链羧基与赖氨酸单元的6-氨基(侧链氨基)之间的缩合反应。通过PyAOP/HOAt/DIPEA试剂混合物进行活化(详细情况和缩写解释见下文)，或替换性地，通过PyAOP/DIPEA进行活化。所用的设备、常用溶剂和所用技术类似于实施例2中所描述的设备、溶剂和技术。

如下所示，将最初完全保护的树脂结合的肽(例如0.3mmol)在室温条件下的氩气环境中用不同溶液(大约10mL)摇动一段时间，然后进行过滤：

1.二氯甲烷，20分钟

2.溶于二氯甲烷中的4体积％的三氟乙酸，15分钟

3.溶于NMP与二氯甲烷的1∶10的混合物中的0.2M的DIPEA，3分钟

4.二氯甲烷，3分钟

5.二氯甲烷，3分钟

6.二氯甲烷，3分钟

7.DMF，3分钟

8.活化，4小时，按下面的描述进行：

将相对于树脂结合的肽为3分子当量的溶于DMF(7mL)的PyAOP和HOAt的混合物中的两个组分(或替换性地仅为PyAOP)(两者共0.9mmol)，在未过滤的条件下与树脂一起摇动1分钟，然后加入6分子当量的溶于NMP中的2M的DIPEA。

在上面的步骤8之后，程序如实施例2中所述的那样从实施例2中的步骤13开始继续往下进行。

该种类型环化中活化所用的试剂有：

PyAOP＝7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷酮基)膦六氟磷酸，CAS号156311-83-0，PE Biosystems产品目录号GEN076531，分子量：521.4g/mol

HOAt＝1-羟基-7-氮杂苯并三唑，以DMF为溶剂的0.5M的溶液，Applied Biosystems产品目录号4330631

对于在“HBTU和HOBt”替换方案中的原料，参见实施例2中所给出的原料。

对于有“额外的”肽键在两者中间形成的“特殊”氨基酸单元(天冬氨酸和赖氨酸)的起始原料：

Fmoc-Lys(Mtt)树脂，0.68mmol/g，Bachem产品目录号D-2565.0005

实施例22

靶向剂Amf-DLRSK(Amf＝4-氨基-10-甲基叶酰)的合成，该靶向剂包含效应器单元4-氨基-10-甲基叶酸，该效应器单元通过其羧基与肽DLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借该序列最外面的成员侧链间的内酰胺桥成为环状

使用上文实施例2中所述的人工合成方法(与上文实施例4中的合成方法类似，包括环化)合成该靶向剂。接着，以实施例2中所述的一般偶联技术的方式，用4-氨基-10-甲基叶酸对序列DLRSK进行延伸，不同之处在于，在实施例2的步骤12的处理中用PyAoP(代替HBTU)和HOAT(代替HOBt)，反应时间为5小时，及试剂与树脂结合肽为等摩尔比(肽/PyAOP/HOAT/DIPEA＝1∶1∶1∶2)。

使用的试剂：

4-氨基-10-甲基叶酸水合物；(+)氨甲喋呤；氨甲基叶酸CAS号59-05-2，分子式质量：454.4g/mol，Sigma产品目录号A-6770

MALDI-TOF数据(Amf-DLRSK，环状)：

计算分子量＝1035.50

观察到的信号：

1036.35M+H

实施例23

靶向剂Dnm-Aoa-DLRSK(Dnm＝道诺霉素，通过其外围羰基以丢失一个氧的方式来连接)的合成，该靶向剂包含效应器单元道诺霉素，该效应器单元通过其乙酰基部分的羰基以肟连接的方式与Aoa-DLRSK[包含接头(连接)单元氨基氧乙酸的靶向剂(肽衍生物)，该氨基氧乙酸通过其羧基与肽DLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)]的氨基氧基偶联，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借内酰胺桥成为环状

该靶向剂通过将上文实施例10中所述的Aoa-DLRSK与等摩尔量的道诺霉素盐酸盐的甲醇溶液(浓度为0.0025M)在暗处于室温搅拌三天进行合成。产物通过蒸发溶剂来进行分离，通过实施例2所述的反相HPLC进行纯化。

所用试剂：

道诺霉素盐酸盐，CAS号20830-81-3，分子量：564.0g/mol，ICNBiomedicals，Aurora，Ohio，美国，产品目录号44583

MALDI-TOF数据(Dnm-Aoa-DLRSK，环状)：

计算分子量＝1181.52

观察到的信号：

1182.41M+H

实施例24

靶向剂Dxrb-Aoa-DLRSK(Dxrb＝阿霉素，通过其外围羰基以丢失一个氧的方式来连接)的合成，该靶向剂包含效应器单元阿霉素，该效应器单元通过其羟乙酰基部分的羰基以肟连接的方式与Aoa-DLRSK[包含接头(连接)单元氨基氧乙酸的靶向剂(肽衍生物)，该氨基氧乙酸通过其羧基与肽DLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联(直接连接，不通过特定的接头单元)]的氨基氧基偶联，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借内酰胺桥成为环状

该靶向剂通过将上文实施例10中所述的Aoa-DLRSK与等摩尔量的阿霉素盐酸盐的甲醇溶液(浓度0.0025M)在暗处于室温搅拌三天进行合成。产物通过蒸发溶剂进行分离，通过实施例2所述的反相HPLC进行纯化。

所用试剂：

阿霉素盐酸盐，CAS号25316-40-9，分子量：580.0g/mol，Fluka产品目录号44583

MALDI-TOF数据(Dxrb-Aoa-DLRSK，环状)：

计算分子量＝1197.52

观察到的信号：

1198.17M+H

结构式：

实施例25

包含靶向单元的融合蛋白的制备

编码期望氨基酸序列的合成DNA序列是通过将两段互补的寡核苷酸(Genset SA)在65℃退火1分钟来制备，这两段互补的寡核苷酸在它们的5’末端含有EcoRI或BamHI的限制性位点，并在编码链的3’末端有一个终止密码子。为制备编码靶向肽的DNA，使用部分重叠的寡核苷酸，并在游离的dNTP存在下在72℃用30秒的时间合成双链产物。

将下述寡核苷酸用于制备编码不同靶向序列的DNA：

GCLRSC：

正向引物：

5′-CGGGATCCGGGTGTCTTCGGAGTTGTTGAGAATTCC-3′；

反向引物：

5′-GGAATTCTCAACAACTCCGAAGACACCCGGATCCCG-3′

CSRLC：

正向引物：

5′-CGGGATCCTGTAGTCGGCTTTGTTGAGAATTCC-3′；

反向引物：

5′-GGAATTCTCAACAAAGCCGACTACAGGATCCCG-3′

GLRS：

正向引物：5′-CGGGATCCGGTTTACGTTCTTGAGAATTCC-3′，

反向引物：5′-GGAATTCTCAAGAACGTAAACCGGATCCC-3′

LRS：

正向引物：5′-CGGGATCCTTACGTTCTTGAGAATTCC-3′，

反向引物：5-GGAATTCTCAAGAACGTAAGGATCCC-3

GSRL：

正向引物：5′-CGGGATCCGGTAGTCGGCTTTGAGAATTCC-3′，

反向引物：5′-GGAATTCTCAAAGCCGACTACCGGATCCC-3′

SRL：

正向引物：5′-CGGGATCCAGTCGGCTTTGAGAATTCC-3′，

反向引物：5′-GGAATTCTCAAAGCCGACTGGATCCC-3′

双链产物以BamHI和EcoRI进行消化，将所得片段连接到pGEX-2TK载体(AmershamPharmacia Biotech)相应的限制性位点中。将感受态大肠杆菌(E.coli)BL21用连接混合物进行转化，并将转化体用菌落PCR(PCR＝聚合酶链式反应)进行筛选。将特异性针对pGEX载体的插入序列侧翼区域的引物用于插入序列的鉴定(正向引物：5′-GCATGGCCTTTGCAGGG-3′；反向引物：5′-AGCTGCATGTGTCAGAGG-3′)。使用QIAprep Spin miniprep试剂盒(产品目录号27106；Qiagen)从阳性克隆中分离DNA。

构建体的DNA序列采用ALF自动DNA测序仪(AmershamPharmaciaBiotech)，使用与菌落PCR相同的引物进行确定。按照AmershamPharmacia的操作说明(GST detection module instructions，Technical document XY0460012-Rev.8.pdf；Uppsala，瑞典)进行GST和GST融合蛋白的大规模制备和纯化。GST融合蛋白的大小、数量和纯度通过SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行检测。

实施例26

对小鼠肿瘤的体内靶向

在该实施例中，前面实施例所制备的靶向单元表现出对四种不同类型的原发性肿瘤(纤维肉瘤、卡波西肉瘤、黑色素瘤、神经胶质母细胞瘤和腺癌)及黑色素瘤在肺部的转移灶有体内靶向作用。显示本发明所述的被检测的靶向单元在体内选择性地靶向原发性肿瘤和转移灶，而不靶向正常的组织或器官。

细胞系和携带肿瘤的小鼠

将下述肿瘤细胞系用于产生小鼠的试验用肿瘤：

“ODC肉瘤细胞”，(OS)，最初来自于裸鼠体内形成的肿瘤，该裸鼠已经被施用了由鸟氨酸脱羧酶(ODC)过表达所转化的NIH3T3小鼠成纤维细胞，并且早期已有描述(Auvinen等，1992)；

卡波西肉瘤细胞系，KS1767，(KS)，之前已被描述(Herndier等，1996)；

人黑色素瘤细胞系C8161(M)，由Welch等人描述(1991)；

神经胶质母细胞瘤细胞系U-87MG，ATCC HTB14，(GB)之前已被描述(Beckman等，1971，Fogh等，1977)；和

非小细胞肺癌系NCI-H23，ATCC号5800，(AC)之前已被描述(Mase等，2002)。

将细胞系在添加有5％～10％胎牛血清(FCS；Bio-Whittaker)、1％L-谷氨酰胺(Bio-Whittaker)和1％青霉素/链霉素(Bio-Whittaker)的Dulbecco的改良的Eagle培养基(DMEM；Bio-Whittaker)中进行培养。将U-87MG细胞系在含有2mM L-谷氨酰胺和Earle’sBSS的基本必需培养基Eagle中进行培养，所述培养基Eagle被调整到包含1.5g/l碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠和10％胎牛血清。将NC1-H23细胞系在含有2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中进行培养，所述培养基被调整到包含1.5g/l碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES和1.0mM丙酮酸钠，上述总共是90％，及胎牛血清，10％。

实验用肿瘤的产生

为产生实验用的肿瘤，将上面列出的细胞(OS、KS和黑色素瘤：0.5×10⁶个细胞，U-87MG：1×10⁶个细胞和NCI-H233×10⁶个细胞)皮下注射入Balb/c Ola Hsd-nude、NMRI/nu/nu或Athymic-nu品系裸鼠(两种品系的所用小鼠均来自于Harlan Laboratories)的两侧胁腹中。当肿瘤重量达到约0.4g时采集肿瘤。

通过将黑色素瘤细胞静脉(i.v.)注射入Balb/c Ola Hsd-nude小鼠来产生转移灶(主要在肺部形成)。将小鼠继续饲养4～6周，然后进行靶向实验。

携带有肿瘤或转移灶的小鼠通过腹膜内(i.p.)施用0.02ml/g体重的阿佛丁[10g的2，2，2-三溴乙醇(Fluka)溶于10ml的2-甲基2-丁醇(SigmaAldrich)中]来进行麻醉。体内靶向及靶向的检测

为了对靶向肽进行定位，将携带有KS、OS或黑色素瘤或携带有转移灶的NMRI裸鼠麻醉，并将溶于DMEM中的1mg或2mg实施例25中所制备的GST融合蛋白，或溶于DMEM中的仅GST作为对照，进行静脉注射或腹膜内注射。可替换地，将1mg或2mg生物素化的合成靶向肽(在实施例12中制备)进行静脉注射，静脉注射后5min～10min，使用翼状灌注25G针系统(Terumo)用50ml DMEM对小鼠进行心脏灌注。然后对其器官进行解剖并用液氮冷冻。在一些情况下，如上所述静脉注射GST融合蛋白，然后在不进行灌注的情况下，在30分钟、4小时、8小时或18小时后处死小鼠，对肿瘤和对照器官(肝、肾、脾、心脏、脑)进行解剖并在液氮中冷冻。腹膜内注射的小鼠在处死前饲养24小时，然后对肿瘤和对照器官进行解剖并按上述方法进行冷冻。

GST融合蛋白(以GST作为对照)通过山羊抗GST抗血清(AmershamPharmacia)在10微米的冷冻切片上进行检测。

生物素化的肽/肽模拟类似物/肽基类似物(靶向剂)使用包含抗生物素蛋白的AB(抗生物素蛋白-生物素)复合物、和生物素化的HRP(Vectastain ABC试剂盒，产品目录号PK6100；Vector Laboratories)及二氨基联苯胺(DAB底物试剂盒，产品目录号4100，Vector Laboratories)在10微米冷冻切片上进行检测。

实验结果在表2中给出。

表2

靶向剂剂量靶向肿瘤肿瘤肝肾脾心脑

时间类型脏

GST-GCLRSC 1mg i.v. 10min OS + - - - - -

GST-GCLRSC 2mg i.v. 24h KS + - - - - -

GST-GCLRSC 2mg i.p. 24h OS + - - - - -

GST-GCLRSC 2mg i.v. 8h M-met + - - - - -

GST-GCLRSC 2mg i.v. 18h M + - - - - -

GST-GCLRSC 1mg i.v. 10min AC + - - - - -

GST-GCLRSC 1mg i.v. 10min GB + - - - - -

GST-CSRLC 1mg i.v. 10min OS + - - - - -

GST-CSRLC 1mg i.v. 10min M + - - - - -

Bio-DLRSK 1mg i.v. 10min OS + - - - - -

Bio-DLRSK 1mg i.v. 10min M + - - - - -

实施例27

包含细胞毒性效应器单元的靶向剂的治疗作用

在该实验中，使用实施例24中制备的Dxrb-Aoa-DLRSK来证明对黑色素瘤的体内靶向和治疗作用，Dxrb-Aoa-DLRSK包含细胞毒性效应器单元阿霉素，该效应器单元通过肟连接的方式与包含靶向基序LRS的环状靶向单元DLRSK连接。

将1百万个C8161 M/T1黑色素瘤细胞皮下注射到8只Athymic-nu小鼠的胁腹，并允许肿瘤生长一周。然后将小鼠分成3组接受下述治疗：

-DMEM组：两只小鼠，仅用DMEM

-Dox组：两只小鼠，溶于DMEM中的1.43mg/kg的阿霉素

-pept+dox组：四只小鼠，溶于DMEM中的1.43mg/kg的Dxrb-Aoa-DLRSK(阿霉素与靶向基序LRS相连)(剂量摩尔数与Dox组的相同)

治疗方式是一周两次静脉给药(周二和周五)，共注射五剂。在每个注射的日子和动物被处死的日子用卡尺在两个垂直方向测量肿瘤。肿瘤体积通过椭圆体公式进行计算：

体积＝(长×宽²)×0.5

实验结果在图1中给出，并进一步证实本发明所述的靶向剂在体内选择性地靶向黑色素瘤，并显著地提高阿霉素的治疗效果。

所用试剂：

实施例28

肽或相关物质环化的一般方法，该环化凭借包含于“媒介”序列末端序列中的D-鸟氨酸和谷氨酸之间的酰胺键：形成“首到侧链的大环内酰胺”，即“Glu(D-Orn)-环”

按照上文中所述的一般方法人工制备未被环化、充分保护、树脂结合的肽。

在进行环化前，用四丁基氟化铵的DMF溶液进行选择性的一个步骤、即脱去鸟氨酸和谷氨酸的特定保护基团[所述基团是：鸟氨酸单元上的2-N-Fmoc和谷氨酸单元上的5-(2-三甲基甲硅烷基乙酯)]。环化涉及谷氨酸单元的侧链羧基与鸟氨酸单元的2-氨基(N-末端氨基)之间的缩合反应。通过PyAOP/DIPEA试剂混合物(详细资料和缩写解释见下文)代替实施例2中所述的HBTU/HOBt/DIPEA混合物进行活化。所用的设备、一般溶剂和所应用技术类似于实施例2中所描述的设备、溶剂和技术。

通过使用赖氨酸和天冬氨酸的各自衍生物，该方法可被改为适合于赖氨酸(代替鸟氨酸)和天冬氨酸(代替谷氨酸)。

如下所示，将最初完全保护的树脂结合的肽(0.3mmol)在室温于氩气环境中用不同溶液(大约10mL)摇动一段时间，然后进行过滤：

1.二氯甲烷，20分钟。

2.1M溶于DMF中的四丁基氟化铵，20分钟。

3.-5.DMF，1分钟(处理三次)。

6.-8.DCM，1分钟(处理三次)。

9.DMF，1分钟。

10.溶于DMF(7mL)中的0.9mmol的PyAOP(相对于树脂结合的肽的3分子当量)，在未过滤的条件下与树脂一起摇动1分钟。

11.加入6分子当量的溶于NMP中的2M的DIPEA(即，1.8mmol)，然后摇动4小时。

上述步骤后，将树脂按(人工)肽合成的一般程序中所描述的方法进行洗涤等等(添加活化的氨基酸后的步骤)。

用于环化前去保护的试剂有：

四丁基氟化铵三水合物，CAS号87749-50-6，分子量：315.51g/mol，Acros Organics产品目录号221080500。

该类型环化中的活化试剂有：

对于有“额外的”酰胺键在两者中间形成的“特殊”氨基酸单元(谷氨酸和鸟氨酸)的起始原料：

Fmoc-D-Orn(Mtt)-OH；2-N-Fmoc-5-N-(4-甲基三苯甲基)-D-鸟氨酸，分子量：610.8g/mol，Novabiochem产品目录号04-13-1012。

Fmoc-L-Glu(OTMSEt)-ONa；N-2-Fmoc-谷氨酸5-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯钠盐，分子量：468.60g/mol，Novabiochem产品目录号04-12-1231

实施例29

靶向单元(肽)D-OrnLRSE-酰胺的合成，凭借谷氨酸单元侧链和D-鸟氨酸的α-氨基之间的酰胺键成环

通过上文实施例2中所描述的人工合成方法合成包含靶向基序LRS的、官能团被保护的、树脂结合的靶向单元(被保护的肽)，在所述方法中，“空”树脂在第一个偶联步骤之前通过与用于预先装载的树脂相同的方式进行去保护(实施例2中的步骤1-11)。

将下述试剂用作起始原料(按所给出的顺序)：

Rink酰胺MBHA树脂

Fmoc-L-Glu(OTMSEt)-OH

Fmoc-L-Ser(tBu)-OH

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-L-Leu-OH

Fmoc-D-Orn(Mtt)-OH

在偶联过程的最后一个循环后，将仍与树脂结合的靶向单元进行如实施例28中所述的环化处理，在环化过程中形成额外的酰胺键。接着，将肽的样品通过用实施例2中所述的切除混合物处理三小时而由树脂上切下来，并用相同实施例中所述的方法进行分离。

然后，将产物在其阳离子模式MALDI-TOF质谱的帮助下进行鉴定，其中环状D-OrnLRSE-酰胺的M+1离子明显占优势。

MALDI-TOF数据(环状D-OrnLRSE-NH₂)：

计算分子量＝598.36

观察到的信号：

599.42M+1

实施例30

靶向剂Cptc-AhxDLRSK[Cptc＝(S)-(+)-喜树碱，其通过碳酰基，即(S)-(+)-喜树碱的羰基部分，在其羟基处形成酯来进行连接]的合成，该靶向剂包含效应器单元喜树碱碳酸盐，该效应器单元凭借酰胺键与肽AhxDLRSK的6-氨基己酰(＝Ahx)部分的氨基偶联(或效应器单元(S)-(+)-喜树碱通过间隔区单元6-(羰基氨基)-己酰与靶向单元DLRSK相连的靶向剂)，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借该序列最外面成员的侧链间的酰胺键成为环状

描述于本实施例结尾处的喜树碱对硝基苯基碳酸盐，以0.02M的浓度溶于DMF中，并与等摩尔量的实施例7中所述的环状靶向化合物AhxDLRSK在相同的溶剂中的浓度为0.04M的溶液混合。放置过夜后，加入过量10％(即等摩尔量乘1.1)的溶于NMP中的2M的DIPEA溶液。搅拌过夜后，将混合物用二乙醚进行稀释，离心后的固体沉淀以实施例2中所述的反相HPLC色谱法进行纯化，包括基于其M+1离子在阳离子模式MALDI-TOF质谱中的产物鉴定。

MALDI-TOF数据(Cptc-AhxDLRSK，环状)：

计算分子量＝1086.51

观察到的信号：

1087.26M+1

喜树碱对硝基苯基碳酸盐的合成：将0.29mmol的4-硝基苯基氯甲酸酯和0.10mmol(S)-(+)-喜树碱溶于12mL的二氯甲烷(DCM)中。然后，在冷水浴中将1.71mmol的4-(二甲基氨基)-吡啶(DMAP)加入DCM溶液中。将混合物摇动2小时，然后用30mL的DCM进行稀释。洗涤是以0.1％的盐酸洗两次，以饱和氯化钠水溶液洗一次，洗涤后，将DCM溶液用硫酸二钠进行干燥、过滤、并浓缩成小体积。产物通过加入二乙醚进行沉淀，并通过离心进行收集。

喜树碱对硝基苯基碳酸盐的合成中所用原料：

4-硝基苯基氯甲酸酯，CAS号7693-46-1，分子量：201.57g/mol，Fluka产品号23240。

(S)-(+)-喜树碱，CAS号7689-03-4，分子量348.36g/mol，Aldrich产品号36，563-7。

DMAP；4-(二甲基氨基)-吡啶，CAS号1122-58-3，分子量：122.17，Fluka产品号29224。

实施例31

靶向剂D-Orn(Dota)LRSE-酰胺(Dota＝1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸，通过其一个羧基来偶联)的合成，凭借谷氨酸单元的侧链和D-鸟氨酸的α-氨基之间的酰胺键成环

通过上文实施例29中所描述的人工合成方法合成包含靶向基序LRS的、官能团被保护的、树脂结合的，环化的靶向单元。接着，将树脂用稀释的TFA(溶于二氯甲烷，4％)以实施例21中所述的方式(步骤1～7)进行处理，以切除对鸟氨酸侧链进行保护的Mtt-基团。将仍与树脂连接的单元然后通过实施例2中所述的一般方法(步骤12～18)与DOTA-三-叔丁基酯进行偶联，使用HBTU/HOBt/DIPEA进行活化。所用试剂：

DOTA-三-(叔丁基酯)。

产物用实施例2所述的方法进行切除和分离，并在其阳离子模式MALDI-TOF质谱的帮助下进行鉴定，其中环状D-Orn(Dota)LRSE-酰胺的M+1离子明显占优势。

MALDI-TOF数据(环状D-Orn(Dota)LRSE-NH₂)：

计算分子量＝984.54

观察到的信号：

985.52M+1

实施例32

靶向单元(肽)KLRSD-酰胺的合成，凭借天冬氨酸单元的侧链和赖氨酸的α-氨基之间的酰胺键成环

通过上文实施例2中所描述的人工合成方法合成包含靶向基序LRS的、官能团被保护的、树脂结合的靶向单元(被保护的肽)，在所述方法中，将“空”树脂在第一个偶联步骤之前通过与用于预先装载的树脂相同的方式进行去保护(实施例2中的步骤1～11)。

将下述试剂用作起始原料(按所给出的顺序)：

Rink酰胺MBHA树脂

Fmoc-L-Asp(OTMSEt)-OH

Fmoc-L-Ser(tBu)-OH

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-L-Leu-OH

Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH

在偶联过程的最后一个循环后，将仍与树脂结合的靶向单元进行如实施例29中所述的环化处理，在环化过程中形成额外的酰胺键(修改之处在于以Asp替换Glu并以Orn替代Lys)。接下来，将肽的样品用实施例2中所述的切除混合物处理三小时而由树脂上切下来，并用同一实施例中所述的方法进行分离。

然后，将产物以M+1离子的方式在其阳离子模式MALDI-TOF质谱的帮助下进行鉴定。

MALDI-TOF数据(环状KLRSD-NH₂)：

计算分子量＝598.36

观察到的信号：

599.21M+1

实施例33

靶向剂K(dota)LRSD-酰胺(Dota＝1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸，通过其一个羧基来偶联)的合成，凭借天冬氨酸单元的侧链和赖氨酸的α-氨基之间的酰胺键成环

通过上文实施例32中所描述的人工合成方法合成包含靶向基序LRS的、官能团被保护的、树脂结合的、环化的靶向单元。接着，将树脂用稀释的TFA(溶于二氯甲烷，4％)以实施例21中所述的方式(步骤1～7)进行处理，以切除对赖氨酸侧链进行保护的Mtt基团。将仍与树脂连接的单元然后通过实施例2中所述的一般方法(步骤12～18)与DOTA-三-叔丁基酯进行偶联，使用HBTU/HOBt/DIPEA进行活化。

所用试剂：DOTA-三-(叔丁基酯)。

将产物用实施例2所述的方法进行切除和分离，并以M+1离子的方式在其阳离子模式MALDI-TOF质谱的帮助下进行鉴定。

MALDI-TOF数据(环状K(Dota)-LRSE-NH₂)：

计算分子量＝984.54

观察到的信号：

985.52M+1

实施例34

靶向单元Ac-DLRSK-Ahx的合成，通过天冬氨酸的侧链和赖氨酸的侧链成环

Ac-DLRSK-Ahx的制备采用实施例2中详细描述的人工固相肽合成技术进行。

第一个结构组分(部分)，氨基官能团被9-芴基甲氧基羰基(＝Fmoc基团)保护的6-氨基-己酸(＝Ahx)，与羟基官能团化的肽合成树脂的结合通过二氯苯甲酰氯的方式进行(下文的“当量”是相对于树脂的装载能力的分子或“摩尔”量)：

将未装载的(“空”)树脂首先通过与N，N-二甲基甲酰胺(＝DMF)一起摇动20分钟进行清洗并进行过滤。在向树脂上加入5当量的溶于DMF中的Fmoc-保护的6-氨基-己酸(Fmoc-Ahx-OH)(0.2M溶液)和8当量的吡啶后，摇动3分钟。接着加入5当量的2，6-二氯苯甲酰氯并将混合物摇动18个小时(过夜)。

在上述冗长的处理后，将树脂过滤并以DMF和二氯甲烷按实施例2中所述的方式(步骤13～18)洗涤数次，接着，将树脂与N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的乙酸酐(2M的溶液，94当量)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，1.6M的溶液，80当量)的混合物一起摇动2小时、过滤、并如上述步骤一样进行洗涤，以在氩气流进行干燥结束。

至此所用的试剂为：

HMP树脂，装载能力：1.16mmol/g，Applied Biosystems产品目录号400957。

2，6-二氯苯甲酰氯，CAS号225-102-4，分子量：209.46g/mol，Lancaster(Morecambe，英格兰)，产品目录号8922。

吡啶，Merck Art.号9728。

Fmoc-6-氨基-己酸(Fmoc-Ahx-OH)，CAS号88574-06-5，Novabiochem产品目录号04-12-1111，分子量：353.4g/mol。

从现在起，按照实施例2中所述的一般方法继续合成。该合成接下来所用的结构试剂按顺序如下：

Fmoc-Lys(Mtt)-OH

Fmoc-L-Ser(tBu)-OH

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-L-Leu-OH

Fmoc-Asp(2-苯基异丙基酯)-OH

将仍与树脂结合的产物接下来按照实施例21进行环化处理。最后，序列按下述方式用乙酸进行延伸(即在氨基末端进行末端加帽)：将氨基保护的Fmoc-基团按照实施例2所描述的方法(步骤1～10)来去除。然后将仍与树脂结合的产物以在NMP中的乙酸酐和DIPEA的混合物进行处理，就像在Ahx部分与树脂的起始结合后所做的那样。最后将产物如实施例2所述的从树脂上释放并纯化。鉴定是基于MALDI质谱的M+1离子。

MALDI-TOF数据(环状Ac-DLRSK-Ahx)：

计算分子量＝754.43

观察到的信号：755.60

实施例35

靶向剂Ac-DLRSK-Ahx-Dox(Dox＝阿霉素，通过其氨基来偶联)的合成，该靶向剂包含阿霉素，阿霉素凭借酰胺键与包含靶向基序LRS的N-末端加帽(Ac＝乙酰基)的环状靶向单元Ac-DLRSK-Ahx的C-末端间隔区部分(Ahx＝6-氨基己酰)的羧基连接

“靶向单元”化合物(肽衍生物)Ac-DLRSK-Ahx按照实施例34中的描述进行制备。阿霉素在N，N-二甲基甲酰胺(＝DMF)溶液中通过下述PyAOP/DIPEA活化的方式与纯化的Ac-DLRSK-Ahx进行连接：

将等摩尔量的Ac-DLRSK-Ahx和PyAOP以0.05M的溶液的形式混合于DMF中，混入两摩尔当量的DIPEA(溶于NMP中的2M的溶液)并在五分钟后加入等摩尔(相对于Ac-DLRSK-Ahx)量的阿霉素盐酸盐(溶于NMP中的0.05M的溶液)。在使反应于暗处(防止光照)进行一小时后，将混合物用二乙醚进行稀释。离心后的固体沉淀物以反相HPLC色谱法进行纯化，并如实施例2中所述的以阳离子模式的MALDI-TOF质谱进行鉴定。

Ac-DLRSK-Ahx-Dox的分子式：

使用的原料：

阿霉素盐酸盐，CAS号25316-40-9，分子量：580.0g/mol，Sigma产品目录号D-1515。

MALDI-TOF数据(Ac-DLRSK-Ahx-Dox，-DLRSK-部分为环状)：

计算分子量＝1279.60

观察到的信号：

1280.29M+1

实施例36

靶向剂Amf-AhxDLRSK(Amf＝4-氨基-10-甲基叶酰)的合成，该靶向剂包含效应器单元4-氨基-10-甲基叶酸，该效应器单元通过其羧基与肽AhxDLRSK的N-末端氨基凭借酰胺键偶联，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借该序列最外面成员的侧链间的内酰胺桥成为环状

树脂结合的、包含靶向单元(AhxDLRSK)的间隔区(＝Ahx)按上面实施例7中的描述进行制备，包括环化作用(按照实施例21所述进行)。接着，序列AhxDLRSK通过实施例2所述的一般偶联技术的方式以谷氨酸在树脂上进行延伸。作为最后一步偶联，该序列(现在是E-AhxDLRSK，其中E是“Amf”部分的一部分)以“减去E酸的Amf”即4-[N-(2，4-二氨基-6-蝶啶基-甲基)-N-甲基氨基]-苯甲酸半盐酸盐二水合物作为结束，该步偶联采用实施例2的一般的偶联技术方式进行，不同之处在于处理步骤12中作为活化试剂的是PyAOP(替代HBTU和HOBt)，反应时间为5小时，及试剂与树脂结合肽为接近相同的摩尔比率。

在该步骤中按化学计量的试剂比率为：

“树脂结合的肽”/“减去E酸的Amf”/PyAOP/DIPEA＝1∶1.2∶1.2∶2.4，(时间为5小时)。

在按照实施例2所述进行分离和纯化后，将产物基于M+1离子在阳离子模式MALDI质谱中进行鉴定。

所用试剂：

Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH，CAS号71989-18-9，Applied Biosystems产品目录号GEN911036，分子量：425.5g/mol。

4-[N-(2，4-二氨基-6-蝶啶基-甲基)-N-甲基氨基]-苯甲酸半盐酸盐二水合物，CAS号19741-14-1，Aldrich产品目录号86，155-3，分子量：379.59g/mol，称为“减去E酸的Amf”。

MALDI-TOF数据(Amf-AhxDLRSK，环状)：

计算分子量＝1148.58

观察到的信号：

1149.62M+H

实施例37

靶向剂PtxSuc-AhxDLRSK(PtxSuc＝紫杉醇单琥珀酸酯)的合成，该靶向剂包含效应器单元紫杉醇单琥珀酸酯，该效应器单元通过其琥珀酰(琥珀酸羰基)基团与肽AhxDLRSK的6-氨基己酰(＝Ahx)部分的氨基凭借酰胺键偶联(或效应器单元紫杉醇通过间隔区单元6-(琥珀酰氨基)己酰与靶向单元DLRSK进行连接的靶向剂)，该靶向剂同时包含靶向单元DLRSK，其凭借该序列最外面成员的侧链间的酰胺键成为环状

将描述于本实施例结尾处的紫杉醇琥珀酸酯溶于DMF中形成0.012M的溶液，加入等摩尔量的溶于DMF中的0.05M的PyAOP，然后再加入两倍摩尔量的溶于NMP中的2.0M的DIPEA。两分钟后，以溶于DMF中的0.015M的溶液的形式加入等摩尔量(每摩尔紫杉醇琥珀酸酯)的上面实施例7中所述的靶向化合物AhxDLRSK，该化合物AhxDLRSK以侧链到侧链的形式成环。放置过夜后，将混合物用二乙醚进行稀释。将离心后的固体沉淀物如实施例2中所述以反相HPLC色谱法进行纯化，包括基于其M+1离子在阳离子模式MALDI-TOF质谱中鉴定产物。

MALDI-TOF数据(PtxSuc-AhxDLRSK，环状)：

计算分子量＝1647.76

观察到的信号：

1648.57M+1

紫杉醇琥珀酸酯按下述文献中所给出的步骤进行合成：Chun-MingHuang，Ying-Ta Wu and Shui-Tein Chen(2000)，Targeting delivery ofpaclitaxel into tumor cells via somatostatin receptor endocytosis(通过生长激素抑制素受体内吞作用使紫杉醇靶向递送至肿瘤细胞)Chemistry&Biology 2000，第7卷，第7号，第453～461页。

用此方法，将溶于吡啶中的0.05M的紫杉醇与12倍过量的琥珀酸酐搅拌3小时。在溶剂被减压蒸发后，将残留物溶于水并冷冻干燥(冻干)。

紫杉醇琥珀酸酯的合成中所用的原料：

紫杉醇(来自Taxus yannesis)，CAS号33069-62-4，分子量：853.9g/mol，Sigma产品号T-1912。

琥珀酸酐，CAS号108-30-5，分子量：100.08g/mol，Fuka产品号14089。

试剂列表

乙酸酐，CAS号108-24-7，分子量：102.1g/mol，Fluka产品号45830

4-氨基-10-甲基叶酸；(+)氨甲喋呤；氨甲基叶酸水合物；分子式质量：454.4g/mol，CAS号59-05-2，Sigma A-6770

Boc-氨基-羟乙酸；Boc-NH-OCH₂-COOH，分子量：191.2g/mol，Novabiochem产品号01-63-0060

Boc-Cys(Trt)-OH，CAS号21947-98-8，Novabiochem，产品号04-12-0020

D-生物素(维生素H)，CAS号58-85-5，分子量：244.3g/mol，SigmaB-4501，99％

(S)-(+)-喜树碱，CAS号7689-03-4，分子量：34.36g/mol，Aldrich产品号36，563-7

5-(1-o-碳硼烷基)-戊酸，分子式质量(F.W.)：244.34g/mol，Katchem，Prague，捷克斯洛伐克共和国，

DL-2，3-二氨基丙酸单盐酸盐，C₃H₈N₂O₂.HCl，CAS号54897-59-5，Acros Organics(New Jersey，美国；Ceel Belgium)产品号204670050

4-[N-(2，4-二氨基-6-蝶啶基-甲基)-N-甲基氨基]-苯甲酸半盐酸盐二水合物，CAS号19741-14-1，Aldrich产品号86，155-3

2，6-二氯苯甲酰氯，CAS号225-102-4，分子量：209.46g/mol，Lancaster产品号8922

二乙烯三胺五乙酸二酸酐，CAS号23911-26-4，分子量：357.32g/mol，Aldrich产品号28，402-5

DMAP；N-二甲基氨基吡啶，CAS号1122-53-3，分子量：122.17g/mol，Fluka产品号29224

Dota-三(叔丁基酯)，大环的，分子量：572.74g/mol

阿霉素盐酸盐，CAS号25316-40-9，分子量：580.0g/mol，Sigma产品目录号D-1515

Fmoc-6-氨基己酸(Fmoc-6-Ahx-OH)，CAS号88574-06-5，分子量：353.4g/mol，Novabiochem产品号04-12-1111 A22837

Fmoc-Asp(2-苯基异丙基酯)-OH，分子量：473.53g/mol，Bachem产品号B-2475.0005

Fmoc-L-Asn-OH，CAS号71089-16-7，Applied Biosystems，产品号GEN 911018

Fmoc-Gly树脂，Applied Biosystems产品号401421，0.65mmol/g

Fmoc-Gly-OH，CAS号29022-11-5，Novabiochem产品号04-12-1001，分子量：297.3g/mol

Fmoc-L-Asn-OH，Applied Biosystems产品号Gen 911018，分子量：354.40g/mol

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，CAS号154445-77-9，Applied Biosystems产品号GEN911097，分子量：648.8g/mol

Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，CAS号103213-32-7，Applied Biosystems产品号GEN911027，分子量：585.7g/mol

Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH，CAS号71989-18-9，Applied Biosystems产品号GEN911036，分子量：425.5g/mol

Fmoc-L-Leu-OH，CAS号35661-60-0，Applied Biosystems产品号GEN911048，分子量：353.4g/mol

Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH，CAS号78081-87-5，分子量：590.7g/mol，PerSeptive Biosystems(Hamburg，德国)产品号GEN911095

Fmoc-Lys(Mtt)-OH，Novabiochem产品号04-12-1137，分子量：624.8g/mol

Fmoc-Lys(Mtt)树脂，0.68mmol/g，Bachem产品号D-2565.0005

Fmoc-L-Lys(tBoc)-OH，CAS号71989-26-9，分子量：468.6g/mol，Applied Biosystems产品号GEN911051

Fmoc-D-Orn(Mtt)-OH；2-N-Fmoc-5-N-(4-甲基三苯甲基)-D-鸟氨酸，分子量：610.8g/mol，Novabiochem产品目录号04-13-1012

Fmoc-Ser(tBu)树脂，Applied Biosystems产品号401429，0.64mmol/g

Fmoc-L-Ser(tBu)-OH，CAS号71989-33-8，Perseptive Biosystems产品号GEN911062，分子量：383.4g/mol

Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH，CAS号71989-38-3，分子量：459.5g/mol，Applied Biosystems产品号GEN911068

HOAt＝1-羟基-7-氮杂苯并三唑，溶于DMF中的0.5M的溶液，Applied Biosystems产品目录号4330631

HBTU＝2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯，CAS号[94790-37-1]，Applied Biosystems产品目录号401091，分子量：379.3g/mol

HOBt＝1-羟基苯并三唑，溶于DMF中的0.5M的溶液，AppliedBiosystems产品目录号400934

HMP树脂，装载能力：1.16mmol/g(根据商品生产商的报告)，Applied Biosystems产品目录号400957

碘，CAS号7553-56-2，分子量：253.81，Merck Art.号4760

4-硝基苯基氯甲酸酯，CAS号4693-46-1，分子量：201.57g/mol，Fluka产品号23240

紫杉醇，来自Tacsus yannesis，CAS号33069-62-4，分子量：853.9g/mol，Sigma产品号T-1912

PyBroP；溴代-三吡咯烷酮基膦六氟磷酸，CAS No.132705-51-2，分子量：466.2g/mol，Novabiochem产品号01-62-0017

Rink酰胺MBHA树脂，装载能力0.64mmol/g，Novabiochem产品号01-64-0037

琥珀酸酐，CAS号108-30-5，分子量：100.01g/mol，Fluka产品号140089

供应商列表

Acros Organics，New Jersey美国；Ceel Belgium

Applied Biosystems，Warrington，WA1 4SR，英国

Bachem AG，Hauptstrasse 144，CH-4416 Bubendorf，瑞士

Calbiochem-Novabiochem，CH-4448 Lufelfingen，瑞士

Katchem，Prague，捷克斯洛伐克共和国，

Lancaster，Morecambe，英格兰

Fluka Chemie GmbH，Buchs，瑞士

Macrocyclics，Dallas，Texas，美国

Merek KGaA，Darmstadt，德国

PE Biosystems，Warrington，英国

Perseptive Biosystems，Warrington，英国/Hamburg，德国

Sigma Aldrich Chemie，Steinheim，德国

(也可以为

Sigma-Genosys LTD，Pampisford，Cambridge，英国

Bio-Whittaker，Verviers，比利时

Harlan Laboratories，Horst，荷兰

Genset SA，Pauris，法国

AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，瑞典

Qiagen，Hilden，德国

Terumo，Leuven，比利时

Vector Laboratories，Burlingame，美国

参考文献

Adams，GP，Schier R.Generating improved single-chain Fv moleculesfor tumor targeting(产生用于肿瘤靶向的改良的单链可变区片段分子)，J Immunol Methods 1999；231：249-60。

Arap，W.，Pasqualini，R.和Ruoslahti，E.(1998).Chemotherapy targetedto tumor vasculature(靶向肿瘤脉管系统的化学疗法)，Curr.Op.Oncol.10：560-565。

Auvinen，M，Laine，A.，Paasinen-Sohns，A.，Kangas，A.，Saksela，O.，Andersson，L.C.和Hltt，E.(1997).Human ornithine decarboxylase-overproducing NIH3T3 cells induce rapidly growing，highly vascularizedtumors in nude mice(过度产生人鸟氨酸脱羧酶的NIH3T3细胞在裸鼠中诱导快速生长、高度血管化的肿瘤)，Cancer Res.57：3016-25。

Bachem AG，SASRIN^TM，A review of its manyfold applicationsincluding many useful procedures(SASRIN^TM，它的大量应用，其中包括许多有用的方案)，Mergler M.编撰，第二次扩增版，1999，1999年由BACHEM AG出版，CH-4416 Bubendorf，瑞士。

Bachem 2001，Peptides and Biochemicals，Immunochemicals(肽和生物化学品、免疫品)，新的2001年BACHEM产品目录，BACHEM AG，Hauptstrasse 144，CH-4416 Bubendorf，瑞士。

Beckman，G.；Beckman，L.；Ponten J.和Westermark B.(1971)G-6-PDand PGM phenotypes of 16 continuous human tumor cell lines.Evidenceagainst cross-contamination and contamination by HeLa cells(16个连续人肿瘤细胞系的G-6-PD和PGM的表型，被HeLa细胞交叉污染和污染的反证)，Hum.Hered.21：238-241。

Biosystems Solutions(Biosystems溶液)，2001年9月2日公布，第30页，AB Applied Biosystems。

Chan，W.C.Bycroft，B.W.，Evans，D.J.和White，P.D.A novel4-aminobenzyl ester-based carboxy-protecting group for synthesis of atypicalpeptides by Fmoc-But solid-phase chemistry(用于通过Fmoc-But固相化学法合成非典型肽的基于氨基苄基酯的羧基保护基团)，(1995)J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1995，第2209页。

Ellerby，H.M.，Arap，W.，Ellerby，L.M.，Kain，R.，Andrusiak，R.，Rio，G.D.，Krajewski，S.，Lombardo，C.R.，Rao，R.，Ruoslahti，E.，Bredesen，D.E.，和Pasqualini，R.1(1999)，Anti-cancer activity of targeted pro-apoptoticpeptides(靶向的促凋亡肽的抗癌活性)，Nat.Med.9：1032-1038。

Fluka Chemika，Peptide and Peptidomimetic Synthesis，Reagents forDrug Discovery(肽和肽模拟物的合成、用于发现药物的试剂)，2000 FlukaChemie GmbH，Buchs，Fluka，Speciality Chemicals and Analytical Reagents(特殊性化学品和分析试剂)。

Fogh J.；Fogh JM.和Orfeo T.(1977)One hundred and twenty-sevencutured human tumor cell lines producing tumors in nude mice(在裸鼠中产生肿瘤的127个培养的人肿瘤细胞系)，J.Natl.Cancer Inst.59：221-226。

Herndier BG，Werner A，Arnstein P，Abbey NW，Demartis F，Cohen RL，Shuman MA，Levy JA.(1994)，Characterization of a human Kaposi′s sarcomacell line that induces angiogenic tumors in animals(在动物中诱导血管原性肿瘤的人卡波西肉瘤细胞系的特征描述)，AIDS 8：575-81。

Hidalgo，M.，和Eckhardt，S.G.(2001)，Development of matrixmetalloproteinases inhibitors in cancer therapy(基质金属蛋白酶在癌症治疗中的进展)，J.Natl.Cancer Inst.93：178-193。

Hirschmann，R.，Yao，W.，Arison，B.，Maechler，L.，Rosegay，A.，Spengeler，P.A.，和Smith，A.B.(1998)，Synthesis of the first tricyclichomodetic peptide.Use of Coordinated Orthogonal Deprotection to AchieveDirected Ring Closure(第一个三环homodentic肽的合成，使用协同的正交去保护来获得直接的环闭合)，Tetrahedron 54(1998)7179-7202。

Houghten，R.A.，Pinilla C.，Appel J.R.，Bondelle S.E.，Dooley C.T.，Eichler J.，Nefzi A.，Ostresh J.M.Mixture-based synthetic combinatoriallibraries(基于混合物的合成组合库)，J.Med.Chem.1999；42：3743-78。

Mase K，lijima T，Nakamura N，Takeuchi T，Onizuka M，Mitsui T，Noguchi M.，Intrabrochial orthotopic propagation of human lungadenocarcinoma-characterizations on tumorigenicity，invasion and metastasis(人肺腺癌的支气管内常位增殖——在肿瘤原性、侵袭和转移方面的特征描述)，Lung cancer 36(3)：271-276，2002。

Mergler，M.和Durieux，J.P.，BACHEM AG，2000年由BACHEM AG出版，CH-4416 Bubendorf，瑞士。

Naknishi，H，和Kahn，M.(1996)，Design of peptidomimetics(肽模拟物的设计)，The practice of medical chemistry(医学化学实践)，第571～590页，Academic Press。

Nargund，R.P.，Patchett，A.A.，Bach，M.A.，Murphy，M.G.，Smith，R.G.(1998)Peptidomimetic growth hormone secretagogues.Design considerationsand therapeutic potential(肽模拟物生长激素促泌素，设计考虑因素和治疗潜力)，J.Med.Chem.1998；41：3103-27。

Nicklin，S.A.，White，S.J.，Watkins，S.J.，Hawkins，R.E.，Baker，A.H.(2000)，Selective targeting of gene transfer to vascular endothelial cells by useof peptides isolated by phage display(通过使用由噬菌体展示分离的肽进行基因转移来选择性靶向血管内皮细胞)，Circulation 102：231-237。

Novabiochem #1 for innovation，Novabiochem 2000年产品目录，Calbiochem-Novabiochem AG，Weidenmattweg 4 Lufelfingen，瑞士，2000。

Peptide and Peptidomimetic Synthesis，Reagents for Drug Discovery(肽和肽模拟物的合成，用于发现药物的试剂)，Fluka ChemieGmbH，Buchs，瑞士，2000。

Prochiantz，A.(1996)，Getting hydrophilic compounds into cells：lessonsfrom homeopeptides(使亲水性化合物进入细胞：从同源异型肽得到的经验)，Curr.Op.Neurobiol.6：629-634。

Promega Notes Magazine，Promega公司，第74号，InCELLect^TMCell-Permeable Peptides(InCELLect^TM细胞可渗透肽)，2000。

Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护性基团)，第三版，Theodora W.Greene，Peter G.M.Wuts，1999，JohnWiley&Sons，有限公司，ISBN：0-471-16019-9。

The BACHEM Practise of SPPS，(2000)Tips and tricks from the expertsat BACHEM(来自BACHEM的专家的小技巧和窍门)，Mergler，M.和Durieux，J.P.编辑，BACHEM AG，2000年由BACHEM AG出版，CH-4416Bubendorf，瑞士。

The Combinatorial Chemistry Catalog&Solid Phase Organic Chemistry(SPOC)Handbook(组合化学目录和固相有机化学(SPOC)手册)，Novabiochem #1 for innovation，瑞士，Calbiochem-Novebiochem AGWeidenmattweg 4，CH-4448 Lufellingen，瑞士，1998-1999。

Welch，D.R.，Bisi，J.E.，Miller，B.E.，Conaway，D.，Seftor，E.A.，Yohem，K.H.等(1991)，Characterization of a highly invasive and spontaneouslymetastatic human malignant melanoma cell line(高度侵袭和自发转移的人恶性黑色素瘤细胞系的特征描述)，Int.J.Cancer 47：227-237。

Yue，C.，Thierry，J.和Potier，P.(1993)2-phenyl isopropyl esters ascarboxyl terminus protecting groups in the fast synthesis of peptide fragments(在肽片段的快速合成中将2-苯基异丙基酯作为羧基末端的保护性基团)，Tetrahedron Letters 34(2)：323-326。

序列表

<110>卡尔扬公司

<120>肿瘤靶向剂及其应用

<130>FCI05FI0774

<150>FI20021761

<151>2002-10-03

<160>7

<170>Patentln version 3.2

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>半胱氨酸桥

<400>1

Cys Leu Arg Ser Cys

1 5

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>半胱氨酸桥

<400>2

Cys ser Arg Leu Cys

1 5

<210>3

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>内酰胺桥

<400>3

Asp Leu Arg Ser Lys

1 5

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(7)

<223>内酰胺桥

<400>4

Asp Leu Arg Ser Gly Arg LyS

1 5

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的

<220>

<221>MTSC_FEATURE

<222>(1)..(7)

<223>内酰胺桥

<400>5

Asp Arg Gly Leu Arg Ser Lys

1 5

<210>6

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>酰胺键

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>鸟氨酸

<400>6

Xaa Leu Arg Ser Glu

1 5

<210>7

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>内酰胺桥

<400>7

Lys Leu Arg Ser Asp

1 5

Claims

1.一种肿瘤靶向单元，该肿瘤靶向单元包含肽序列：

Cy-Rr_n-Dd-Ee-Ff-Rr_m-Cyy

或其药学或生理学可接受的盐，其中，

Dd-Ee-Ff是Aa-Bb-Cc或Cc-Bb-Aa，其中

Aa为异亮氨酸、亮氨酸或叔亮氨酸、或它们的结构或功能类似物；

Bb为精氨酸、高精氨酸或刀豆氨酸、或它们的结构或功能类似物；

Cc为丝氨酸或高丝氨酸、或它们的结构或功能类似物；

每个Rr均独立地为任何氨基酸残基或它们的结构或功能类似物；

n和m独立地为0、1或2，并且n和m的和不超过2；并且

Cy和Cyy是能形成环状结构的单位。

2.如权利要求1所述的肿瘤靶向单元，其中所述肽是环状的或形成环状结构的一部分。

3.如权利要求2所述的肿瘤靶向单元，其中所述环状结构是通过酰胺键、内酰胺键或二硫键形成的。

4.如权利要求3所述的肿瘤靶向单元，其中Cy和Cyy中的一个是天冬氨酸、谷氨酸或它们的结构或功能类似物，另一个是赖氨酸、鸟氨酸或它们的结构或功能类似物。

5.如权利要求3所述的肿瘤靶向单元，其中Cy和Cyy是半胱氨酸或其结构或功能类似物。

6.如权利要求1～5中任一项所述的肿瘤靶向单元，其中Rr是除组氨酸或赖氨酸之外的任何氨基酸残基。

7.如权利要求6所述的肿瘤靶向单元，其中Rr选自甘氨酸、精氨酸或它们的结构或功能类似物。

8.如权利要求5所述的肿瘤靶向单元，该肿瘤靶向单元选自CLRSC(SEQ ID NO.1)或CSRLC(SEQ ID NO.2)。

9.如权利要求4所述的肿瘤靶向单元，该肿瘤靶向单元选自DLRSK(SEQ ID NO.3)、DLRSGRK(SEQ ID NO.4)、DRGLRSK(SEQID NO.5)、OLRSE(SEQ ID NO.6)或KLRSD(SEQ ID NO.7)。

10.如前述任一项权利要求所述的肿瘤靶向单元，该肿瘤靶向单元是衍生的、活化的、被保护的、与树脂结合的或其他支持体结合的。

11.一种肿瘤靶向剂，该肿瘤靶向剂包含至少一个权利要求1～10中任一项所述的靶向单元，该靶向单元直接或间接地与至少一个效应器单元偶联。

12.如权利要求11所述的肿瘤靶向剂，其中所述的效应器单元是直接或间接的可检测剂或治疗剂。

13.如权利要求12所述的肿瘤靶向剂，其中所述的可检测剂包含亲和性标记物、荧光或放射性标记物、螯合剂、金属络合物、富集的同位素、放射性材料或顺磁性物质。

14.如权利要求13所述的肿瘤靶向剂，其中所述的可检测剂包含稀土金属。

15.如权利要求14所述的肿瘤靶向剂，其中所述的可检测剂包含钆。

16.如权利要求12所述的肿瘤靶向剂，其中所述治疗剂选自细胞毒性物质、抑制细胞生长的物质或发出辐射的物质。

17.如权利要求16所述的肿瘤靶向剂，其中所述治疗剂包含阿霉素、道诺红菌素、甲氨蝶呤或硼。

18.如权利要求11～17中任一项所述的肿瘤靶向剂，该肿瘤靶向剂还包含任选的单元。

19.一种诊断或药物组合物，该诊断或药物组合物包含至少一个权利要求1～10中任一项所述的靶向单元，或至少一个权利要求11～18中任一项所述的靶向剂。

20.权利要求1～10中任一项所述的靶向单元或权利要求11～18中任一项所述的靶向剂在制备用于治疗癌症或癌症相关疾病的药物中的应用。

21.如权利要求20所述的应用，其中所述癌症或癌症相关的疾病是实体瘤。

22.如权利要求21所述的应用，其中所述实体瘤选自癌、肉瘤、黑色素瘤或转移灶。

23.一种治疗癌症或癌症相关疾病的方法，该方法包括给需要这种治疗的患者提供治疗有效量的权利要求19所述的药物组合物。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述癌症或癌症相关的疾病是实体瘤。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述实体瘤选自癌、肉瘤、黑色素瘤或转移灶。