CN1703248A - 用于听觉损害的药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于听觉损害的药物制剂，其适合于听觉损害的基因治疗，所述药物制剂是一种用于听觉损害的包括一种包囊化肝细胞生长因子(HGF)基因或其质粒的病毒包膜载体作为活性成分的药物制剂。具体而言，其适合用作药物制剂用于以预防和治疗耳聋为目的基因治疗。

Description

用于听觉损害的药物制剂
技术领域
本发明涉及一种用于听觉损害的药物制剂，优选地它是一种在基因治疗等中所用的用于预防、治疗或改善听觉损害例如耳聋的药物。
背景技术
听觉损害是人类最普遍的感觉缺失，据说至少有十分之一的人发生听觉损害。多种因素都可以造成听觉损害，包括耳毒性物质，例如氨基糖甙类抗生素或顺铂(CDDP)、噪音和衰老。
这些因素影响柯替器中的内耳毛细胞，毛细胞的作用是作为收集并将听觉信号通过听神经元传导到脑的感受细胞。此外，感受毛细胞的丢失所继发发生的听神经的退行性变还会加重听觉功能的减退。
一般地说，哺乳脊椎动物的毛细胞和听神经元没有进行胚胎后细胞有丝分裂以生成新的毛细胞和神经元的能力。在哺乳动物的平衡听觉上皮中，体内前庭感受器的低水平再生是有可能的。但是，体内没有观察到听觉感受上皮的再生，除了在新生鼠的耳蜗中体外观察到非常少量的再生。
对于严重耳聋的治疗，耳蜗植入物已经给患者带来了极大的好处，并提供了有效的治疗方法。但是，人工耳蜗的好处依赖于听神经群的质量和数量，它们的缺失将严重地损害人工耳蜗所带来的好处。
过去的研究提示了能被有效刺激的活性听神经元的总数目与接受耳蜗植入的患者的听觉功能之间的明确关系。这说明植入并不都能产生满意的结果。
因此，发展保护或再生听神经元以增加植入有效性的治疗策略是必须的。最近的研究发现多种神经营养因子例如神经生长因子(NGF)、神经胶质细胞株源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3或NT-4/5对内耳听神经元的存活都有作用，包括螺旋神经节细胞(SGCs)。
与本发明相关的现有技术即US-A6,136,785阐述了一种保护内耳的感觉毛细胞避免耳毒性物质例如氨基糖甙所造成的损害的方法，它包括给脊椎动物施用一种生长因子或其混合物。与它相关的现有技术WO-A98/00014、US-A6,017,886、JP-A2002-503687也是已知的。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于听觉损害的药物制剂，它可以通过保护或再生听神经元来预防或治疗听觉损害。
本发明人集中关注于一个事实，那就是肝细胞生长因子(HGF)基因是一种能有效地治愈听觉损害的治疗性物质，并且本发明人进行了广泛的研究以完成本发明。
作为解决问题的一种方法，权利要求1的发明提供了一种用于听觉损害的药物制剂，它包括作为活性成分的肝细胞生长因子(HGF)基因。
作为解决问题的另一种方法，权利要求2的发明提供了一种用于听觉损害的药物制剂，它包括作为活性成分的肝细胞生长因子(HGF)基因的质粒。
作为解决问题的另一种方法，权利要求3的发明提供了一种用于听觉损害的药物制剂，它包括作为活性成分的包囊化肝细胞生长因子(HGF)基因或其质粒的病毒包膜载体。
作为解决问题的另一种方法，权利要求4的发明提供了权利要求3的一种用于听觉损害的药物制剂，其中病毒是一种选自由仙台病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒和流感病毒所构成的组的病毒。
本发明的用于听觉损害的药物制剂是适合作为用于预防听觉损害的药物或作为治疗或改善听觉损害的药物，并且特别适合作为用于对耳聋进行基因治疗的药物制剂。
本发明提供了肝细胞生长因子(HGF)基因或肝细胞生长因子(HGF)基因的质粒在生产用于听觉损害的药物制剂中的用途，以及治疗听觉损害的方法，它包括将治疗有效量的肝细胞生长因子(HGF)基因或肝细胞生长因子(HGF)基因的质粒施用于听觉损害的患者。
“肝细胞生长因子(HGF)”在此是一种呈现出多种药学作用的生理活性肽，用序列表中的SEQ ID NO：1表示，在例如“Jikken Igaku”(Experimental Medicine)，Vol.10，No.3(extra issue)330-339(1992)中描述了它的药学作用，现有技术WO-A97/7824描述了它的各种应用，但是它对听觉损害的药学作用还是未知的。
具体实施方案
在本发明的用于听觉损害的药物制剂中所含的作为活性成分的肝细胞生长因子(HGF)基因指的是能表达HGF的基因，并用序列表中的SEQ ID NO：2具体表示。该基因也包括由除序列被部分缺失或被其他碱基部分取代、序列中插入有另外的核苷酸序列、或在序列的5’和/或3’末端添加有一个碱基以外与上述的基因序列相同的基因序列所构成的基因，条件是它们所表达的多肽具有与HGF基本相同的作用。
在Nature342，440(1989)、JP-A5-111383、WO-A90/10651、Biochem.Biophys.Res.Commun.163，967(1989)等中所描述的HGF基因也可以被用作为HGF基因，。
可以使用适宜载体中的HGF，优选地是结合于质粒中的形式。
包囊化于已经去除RNA的病毒包膜内的HGF基因，或包囊化含有HGF基因的质粒的病毒包膜载体也可以被用作为HGF基因。
在此所用的病毒可以是野生型病毒或重组病毒。病毒优选地是选自由仙台病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒和流感病毒所构成的组。在这些病毒中，HVJ是更优选的，以及灭活的HVJ是特别优选的。名词“灭活的”意思是病毒的基因组是被灭活的。
具体而言，可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可购买到仙台病毒例如VR-105、VR-907，电话为1-703-365-2700，地址是Box1549，Manassas，VA20108，USA。
http：//www.atcc.org/SearchCatalogs/longview.cfm？view＝av，152376，VR-105&text＝Sendai&max＝20
http：//www.atcc.org/SearchCatalogs/longview.cfm？view＝av，1375478.VR-907&text＝Sendai&max＝20
在WO-A01/57204中所阐述的HVJ包膜载体可被用作为病毒包膜载体。
根据施用方法决定本发明的用于听觉损害的药物制剂的形式，但是在本发明中，药物制剂优选地被制成一种注射剂中。
当本发明的用于听觉损害的药物制剂被制成一种注射剂时，通过将HGF基因、HGF基因的质粒、或包囊化肝细胞生长因子(HGF)基因或质粒的病毒包膜载体与可药用载体(无菌水、生理盐水、磷酸缓冲的生理盐水、缓冲溶液等等)混合可以制成该注射剂。
如果需要，载体可以含有非常少量的添加剂，例如增加渗透压和化学稳定性的物质。所使用的这些物质的量和浓度对于患者将是无毒的。
这些物质包括缓冲试剂例如磷酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸和其他有机酸或其盐；抗氧化剂例如抗坏血酸；低分子量的多肽(少于约10个残基)(例如聚精氨酸或三肽)；蛋白(例如，血白蛋白、明胶、免疫球蛋白)；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯酮)；氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、精氨酸)；单糖、双糖和其他碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精、纤维素或其衍生物)；螯合剂(例如EDTA)；糖醇(例如甘露醇、山梨醇)；平衡离子(例如钠离子)；非离子型表面活性剂(例如聚山醇酯、聚二醇醚共聚物(Poloxamers))；聚乙二醇等等。
当本发明的用于听觉损害的药物制剂被制成一种注射剂时，分别以干燥产物和稀释剂、或以水溶液的形式将药物制剂储存于密封的安瓿和小瓶中。
当以例如注射到人体的形式施用本发明的用于听觉损害的药物制剂时，可以采用通过耳蜗直接注射到内耳的方法、通过半规管直接注射到内耳的方法、将其注射到脑脊液并将其运送到内耳的方法、将其注射到中耳并渗透到内耳的方法、通过所粘附的装置直接将其注射到内耳或逐步地将其释放到所插入的电极的方法，其中经过植入耳蜗移植物的手术将所插入的电极整合到内耳中。
结合每个患者的临床情况(例如所预防或治疗的病变)、施用方法、施用部位、施用方案和其他本领域人员已知的因素，以医疗实施标准的方法制造并施用本发明的用于听觉损害的药物制剂。因此，参考这些因素确定出本发明的用于听觉损害的药物制剂的有效剂量和适宜的施用剂量。
当以病毒包膜载体的形式施用本发明的用于听觉损害的药物制剂时，所施用的病毒包膜载体的量通常是每公斤患者体重0.001μg到1g、优选地是0.01μg到500mg、更优选地是0.1μg到100mg。
所施用的病毒包膜载体中的HGF基因的量通常是每公斤患者体重0.01μg到500mg、优选地是0.1μg到10mg、更优选地是1μg到1mg。
本发明的用于听觉损害的药物制剂可以被用作为基因治疗听觉损害的药物，可适合用作为预防、治疗或改善听觉损害的药物，以及可适合用作为预防、治疗或改善听觉损害特别是耳聋的药物。
本发明人在研究中发现注射到蛛网膜下腔脑脊液中的包囊化人HGF的HVJ-E通过抑制凋亡预防了毛细胞和螺旋神经节细胞的丢失。
就是说，在即将用卡那霉素治疗之前施用HGF基因可以预防听觉损害，并且甚至可以在卡那霉素诱发听觉损害之后恢复听觉功能。
这些结果说明了应用HVJ-E载体的HGF基因治疗的显著杰出的有效性。
对于将基因转移到内耳内，主要是通过以下的外科技术：
i)切开耳蜗，直接注射到耳蜗内。
ii)经圆窗膜施用，通过经膜的注射或通过放置于完整膜上的含有载体的胶的渗入。
iii)通过切开经后半规管施用到内耳中。
iv)施用到内淋巴囊。
至今，一些病毒载体例如腺病毒载体、疱疹病毒载体和腺伴随病毒已经采用上述的4种技术中的任何一种直接注射到内耳中。
然而，从创伤性给药的性质和有效性的观点看，相应的技术都有其优点和缺点。
在这个研究中，为了避免直接注射到耳蜗所造成的对内耳的侵入，本发明人将HVJ-E载体注射到蛛网膜下腔脑脊液中。
通过这个方法，用酶活性和免疫染色证实所引入的基因在脑脊液中的表达，并且对脑和耳组织无明显损害。这个事实提示将HVJ-E载体注射到脑脊液中后，HVJ-E载体本身到达了内耳的螺旋神经节细胞，因此说明了一些从蛛网膜下腔脑脊液到内耳的可能途径。
当载体被注射到膜内时，在其他器官中没有观察到萤光素酶活性，因此对于载体从蛛网膜下腔脑脊液到达内耳的最可能的途径被认为是经耳蜗管。
在静脉内注射后将在脾脏中最先观察到萤光素酶活性，因此如果载体经血流进入整个人体时，在其他器官例如脾脏和肺内可以检测到所引入的基因的表达。
一般地，神经营养因子例如NGF、BDNF、GDNF和NT-3已经被用于听觉的治疗。
但是，HGF没有被用于这个目的。已经发现HGF不仅作用于肝脏，同时在海马、大脑皮质、感觉神经元、运动神经元等等也有嗜神经活性。现在，本发明人显示在蛛网膜下腔脑脊液和螺旋神经节细胞内都证实有人HGF，且人HGF在大鼠中诱导了内源性HGF。
与利用Neutrophin的传统基因治疗比较，听觉系统的HGF基因治疗被认为具有一些优点。
另外，人工内耳和HGF基因治疗的联合应用，即在人工内耳手术期间施用HGF基因也将是有效的。
听觉损害都伴随有毛细胞和螺旋神经节细胞的丢失，通过HGF对凋亡所造成的细胞死亡的保护作用可以预防这种细胞的丢失。甚至在用卡那霉素治疗诱发听觉损害后，HGF的表达可有效地恢复听觉功能。
因此，HGF基因治疗是一种治疗感觉神经性听觉损害的十分有前途的方法。
本研究提供了通过联合HGF基因和HVJ-E载体转运系统治疗听觉损害的新发现和新技术。
本发明的用于听觉损害的药物制剂是适合作为用于基因治疗的药物制剂，特别是用于例如耳聋的预防和治疗等等的目的。
附图说明
图1显示的是在实施例的听觉功能测定中听功能每日的变化。
图2显示的是在实施例的听觉功能测定中听功能每日的变化。
图3a是完整的螺旋神经节细胞的显微照片，图3b是用卡那霉素处理组的显微照片，而图3c是用卡那霉素+HGF处理组的显微照片。
图4显示的是卡那霉素+HGF处理组和卡那霉素+载体处理组的螺旋神经节细胞密度。
图5显示的是卡那霉素+HGF处理组和卡那霉素处理组的螺旋神经节细胞密度。
实施例
以下将通过实施例更详细地描述本发明，但是本发明并不限于这些
实施例的范围。
质粒DNA的制备
通过将pSV-β-半乳糖苷酶的HindIII-BamHI片段(Promega Corp.，Madison，WI，USA)插入到pcDNA3(5.4千碱基)(Invitrogen，San Diego，CA，USA)的HindIII和BamHI位点可以构建出pCMV-lacZ(9.2千碱基)。
通过将pGL3-basic载体(Promega)的萤光素酶基因克隆到pcDNA3(Invitrogen)中可以构建出pCMV-萤光素酶-GL3(pcLuc-GL3：7.4千碱基)。
通过将人HGF cDNA插入到pVAX1(3.0千碱基)(Invitrogen)的BamHI和NotI位点可以构建出pVAX1-hHGF(5.2千碱基)。
用QIANGEN质粒分离试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化质粒。HVJ-包膜载体的制备
根据WO-A01/27204的实施例8，通过将质粒DNA包囊化进灭活的HVJ颗粒内可以构建出日本血凝素病毒(HVJ，仙台病毒)包膜载体(HVJ-E)，不同之处在于用离心纯化HVJ以及用UV射线照射灭活病毒。HVJ-E悬浮液(本发明的用于听觉损害的药物制剂)的制备
将10000血凝素单位的UV灭活的HVJ(Z株)与200μg质粒DNA以及0.3％Triton X混合，用平衡盐溶液(BSS：137mM NaCl、5.4mMKCl、10mM Tris-HCl、pH7.6)洗涤，并用BSS调整到100μl，将其用于鞘内注射。在本实施例中使用包囊化pCMV-lacZ、pcLuc-GL3、pVAX1-hHGF、pcDNA3或pVAX1质粒DNA的HVJ-E。
实验动物和处理组
从日本Charles River(Atsugi，日本)得到具有正常Preyer反射的雄性斯普拉-道来大鼠(6周大：200-210g)。根据大阪大学动物委员会的指南进行所有操作。
动物被分成5个组：预防组、解救组、预防/解救组、载体对照组和非治疗组。用氨基糖甙中毒使得所有组的动物双侧耳聋：连续14天每日皮下注射施用硫酸卡那霉素((Meiji Seika，东京，日本)(400mg/kg/d)。
在卡那霉素治疗的第一天，将包囊化hHGF基因(pVAX1-hHGF)的HVJ-E鞘内注射到预防组和预防/解救组中。
以与上述的相同的方法通过鞘内注射将包囊化对照载体(pVAX1)的HVJ-E悬浮液注射到对照载体组中。
在卡那霉素治疗的最后一天(第14天)，将包囊化pVAX1-hHGF的HVJ-E注射到解救组和预防/解救组中。
另外，将包囊化pCMV-lacZ或pcLuc-GL3的HVJ-E施用于动物，用于进行组织化学分析和萤光素酶检测。
在这个步骤后，在转染7天后观察β-半乳糖苷酶的表达，以及在转染1天后测定萤光素酶活性。
基因体内转移到蛛网膜下腔
在本研究中，利用HVJ-E输注将基因转移到大脑池的方法被采用作为将基因体内转移到CNS和内耳的方法。
对于蛛网膜下腔内的输注，用氯胺酮(三共，日本)和甲苯噻嗪(拜耳)将动物麻醉后，将每只动物的头部固定于俯卧位，通过枕脑中线切口暴露出寰枕膜。
将不锈钢套管(27号，Beckton Dikinson)插入到大脑池中(蛛网膜下腔)。在抽出脑脊液(100μl)以证实套管的位置并避免增加颅内压力后，以50μl/min的速度输入包囊化标记基因、HGF基因或对照载体的HVJ-E(100μl)。
之后，将动物头朝下放置30分钟。所有大鼠在给药后没有出现体重下降、活动丧失或行为改变。
萤光素酶活性的检测
转染24小时后，在麻醉下杀死用萤光素酶基因所转染的大鼠。收集器官(脑、肺、脾脏、肝脏和耳蜗)并分别放置于50ml FALCON管中。
如前面所描述的，用萤光素酶检测试剂盒(Promega)测定萤光素酶活性(HVJ-E44)。通过测定组织提取物的蛋白浓度将萤光素酶水平标准化(HVJ-E44)。萤光素酶蛋白被表达为每克组织蛋白的相对光单位(RLU)。
酶免疫检测脑脊液中的人HGF
在注射包囊化hHGF基因的HVJ-E的5和14天后，取出大鼠的脑脊液(CSF)(100μL)用于本实验。
根据厂家的说明书(日本东京免疫学研究所)，利用抗人和抗大鼠HGF抗体通过酶免疫检测测定出CSF的人HGF和鼠HGF的浓度。
抗人HGF的抗体只与人HGF相互作用，而不与鼠HGF相互作用。抗鼠HGF抗体与人和鼠HGF都有相互作用。
逆转录聚合酶链反应
用乙醚将鼠深度麻醉后，断头，并将颞骨放置于冷的无RNase的生理盐水中。取出耳囊，在解剖显微镜下分离出整个耳蜗。将鼠组织浸泡在裂解缓冲液中，用匀浆器将其匀浆化，用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)分离出总RNA。使用用于RT-PCR的SuperScript第一链合成系统逆转录RNA。
用针对人HGF和GAPDH的特异性引物扩增第一链cDNA：
HGF：
上游引物5’-TTCACAAGCAATCCAGAGGTACGC-3’；
下游引物5’-GAGGGTCAAGAGTATAGCACCATG-3’；
GADPH：
上游引物5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3’；
下游引物5’-GATGGCATGGACTGTGGTCA-3’
(它们分别是序列表中的SEQ ID NOS：3、4、5和6)。
将每组引物的PCR条件最佳化。PCR反应混合物含有5μl cDNA、5μl10xPCR缓冲液、4μl 2.5mM dNTP、2.5μl20pM上游和下游引物、以及1.5U Taq聚合酶，加入无菌水直到45μl。
热循环条件：HGF，94℃45s，70℃2min和72℃2min；GAPDH，94℃45s，58℃1min和72℃2min。
听功能的评估
为了评估听功能的生理状况，我们进行了听觉脑干诱发反应(ABR)听觉测定法。
在给予卡那霉素第一天的前一天测定ABR以确定出基础水平，并在开始卡那霉素治疗的第7、14、21、28和56天再次记录ABR。
在每次测定听功能之前，肌肉内注射氯胺酮(50mg/kg)-甲苯噻嗪(10mg/kg)溶液将动物麻醉。将针头电极皮下放置于同侧耳廓处(参考电极)、对侧耳廓处(接地电极)和头顶处(活性电极)。在隔音室内用Nihon-Kohden Neuropack IV(MEM-4104)系统进行所有记录。
用单波100μs卡嗒音(10/s)诱发电位，用扩音器将这些单耳刺激传送到右耳。回应被数字化过滤(通带：50-3000Hz)、扩增并平均化(500个回应)。
通过与每个研究前的数值比较，测定并计算出P1波的听阈和潜伏期。2dB逐步增加刺激的强度以测定出阈值。阈值被定义为在连续两次实验中仍可记录到回应以证实回应的可重复性的最小强度水平。在图1和2中显示了这些结果。
图1显示了从第0天到第56天的阈值(dB)，图2显示了I波的潜伏时间。图中的HGF代表预防组、预防/解救组和解救组，图中的Vec代表对照载体组，以及图中的KM代表非治疗组。
从图1和2中可看出，在预防组、预防/解救组和解救组的听觉改变(阈值和I波潜伏时间的改变)甚至在56天后都是轻微的，然而对照载体组和非治疗组的听觉改变(阈值和I波潜伏时间的改变)是明显的。
图3显示了耳蜗(螺旋tact)的螺旋神经节细胞(SGC)的光学显微照片：图3a显示了完整耳蜗的SGC；图3b显示了卡那霉素处理组(非治疗组)的SGC；图3c显示了卡那霉素+HGF处理组(预防组、预防/解救组和解救组)的SGC。
从图3a到图3c可以看出，卡那霉素+HGF处理组的螺旋神经节细胞比卡那霉素处理组的细胞更完整。
图4显示了卡那霉素+HGF处理组(预防组、预防/解救组和解救组)和卡那霉素+载体处理组(对照载体组)的螺旋神经节细胞的密度(每10,000平方毫米内的细胞数目)。
图5显示了卡那霉素+HGF处理组(预防组、预防/解救组和解救组)和卡那霉素处理组(非治疗组)的螺旋神经节细胞的密度(每10,000平方毫米内的细胞数目)。
从图4和5中可以看出，卡那霉素+HGF处理组中的螺旋神经节细胞的密度比其他处理组更高。
估计上述的结果是因为所施用的HVJ-E悬浮液对听神经元的保护或再生。
                    序列表
<110>安琪士多摩奇 株式会社
<120>用于听觉损害的药物制剂
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<211>728
<212>PRT
<213>Homo Sapiens
<400>1
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
  1               5                  10                  15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala  Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
             20                  25                   30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
         35                  40                  45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
     50                  55                  60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65                   70                  75                  80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
                 85                  90                  95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
            100                 105                 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
        115                 120                 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
    130                 135                 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145                 150                 155                 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
                165                 170                 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
            180                 185                 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
        195                 200                 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
    210                 215                 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225                 230                 235                 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
                245                 250                 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
            260                 265                 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
        275                 280                 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
    290                 295                 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305                 310                 315                 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
                325                 330                 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
            340                 345                 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
        355                 360                 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
    370                 375                 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385                 390                 395                 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
                405                 410                 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
            420                 425                 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
        435                 440                 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
    450                 455                 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465                 470                 475                 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
                485                 490                 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
            500                 505                 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
        515                 520                 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
    530                 535                 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545                 550                 555                 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
                565                 570                 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
            580                 585                 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
        595                 600                 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
    610                 615                 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625                 630                 635                 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
                645                 650                 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
            660                 665                 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
        675                 680                 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
    690                 695                 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705                 710                 715                 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
                725
<210>2
<211>2187
<212>DNA
<213>Homo Sapiens
<400>2
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc  60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat  120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa  180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt  240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc  300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa  360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta  420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac  480
agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct  540
cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc  600
tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga  660
ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca  720
caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc  780
cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg  840
gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg  900
gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt  960
tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact  1020
cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct  1080
gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt  1140
ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg  1200
ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa  1260
gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc  1320
cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct  1380
tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta  1440
gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca  1500
acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga  1560
ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac  1620
ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa  1680
tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt  1740
ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct  1800
aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact  1860
ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag  1920
aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg  1980
gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag  2040
caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca  2100
aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt  2160
ttaacatata aggtaccaca gtcatag                                      2187
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>ORGANISM：Artificial Sequence
<220>FEATURE：
<223>OTHER INFORMATION：Description of Artificial Sequence Synthetic DNA
<400>3
TTCACAAGCA ATCCAGAGGT ACGC
                   20
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>ORGANISM：Artificial Sequence
<220>FEATURE：
<223>OTHER INFORMATION：Description of Artificial Sequence Synthetic DNA
<400>4
GAGGGTCAAG AGTATAGCAC CATG
                   20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>ORGANISM：Artificial Sequence
<220>FEATURE：
<223>OTHER INFORMATION：Description of Artificial Sequence Synthetic DNA
<400>5
TGAAGGTCGG AGTCAACGGA
                   20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>ORGANISM：Artificial Sequence
<220>FEATURE：
<223>OTHER INFORMATION：Description of Artificial Sequence Synthetic DNA
<400>6
GATGGCATGG ACTGTGGTCA
                   20

Claims (9)

1.一种用于听觉损害的药物制剂，其包括作为活性成分的肝细胞生长因子(HGF)基因。
2.一种用于听觉损害的药物制剂，其包括作为活性成分的肝细胞生长因子(HGF)基因的质粒。
3.一种用于听觉损害的药物制剂，其包括作为活性成分的包囊化肝细胞生长因子(HGF)基因或其质粒的病毒包膜载体。
4.权利要求3的用于听觉损害的药物制剂，其中所述病毒是一种选自由仙台病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒和流感病毒所构成的组的病毒。
5.权利要求1到4中任一项的用于听觉损害的药物制剂，其中听觉损害是耳聋。
6.权利要求1到5中任一项的用于听觉损害的药物制剂，其是一种预防听觉损害的药物。
7.权利要求1到5中任一项的用于听觉损害的药物制剂，其是一种用于听觉损害的治疗性或改善性药物。
8.肝细胞生长因子(HGF)基因或肝细胞生长因子(HGF)基因的质粒在生产一种用于听觉损害的药物制剂中的用途。
9.一种治疗听觉损害的方法，其包括给听觉损害的患者施用治疗有效量的肝细胞生长因子(HGF)基因或肝细胞生长因子(HGF)基因的质粒。
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