CN1689559A - 藜芦胺作为信号转导抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了藜芦胺及其药学上可接受的盐在治疗肿瘤方面的用途以及相应的用于治疗肿瘤的药物组合物。藜芦胺可以是人工合成的或从中草药藜芦中提取的单体化合物，也可以是含藜芦胺的提取物。用藜芦胺制成的药物对肿瘤具有明显的治疗作用。

Description

藜芦胺作为信号转导抑制剂的用途

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地涉及藜芦胺作为信号转导抑制剂的用途，以及藜芦胺及其药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

背景技术

随着后基因时代的到来，人们对抗肿瘤药物的研发注意力，正从一般的细胞毒药物，转向从肿瘤发病机制出发，筛选对特异靶点有作用的高效、低毒药物。筛选与肿瘤发生有关的信号转导通路抑制剂是重要方面之一。

Hedgehog(Hh)信号转导通路，最早发现于果蝇，它是引发果蝇幼虫发育的信号通路。后来发现这是一种涉及到很多动物胚胎发育和许多脏器、组织发育的信号通路。该通路的关键因素是Hh蛋白，当它分泌到胞外后，能与附近细胞的受体结合，以此传递信息，调节相关基因的表达。Hh信号通路的另外两个主要蛋白是Patched(Ptc)蛋白和Smoothened(Smo)蛋白，前者是Hh的受体；后者是一种胞外蛋白，能激活相关基因对Hh信号的反应。当Hh缺乏时，Ptc抑制Smo活性，当Hh分泌并与Ptc结合时，Smo也随着释放，并激活一系列基因，使Hh信号通路表达，从而影响机体的生长和发育。

对Hh信号通路深入研究后发现，动物发育成为成体后，一般各器官和组织细胞中Hh信号信号通路不再表达，只有极少数细胞(例如干细胞)还保留该通路的表达。

最近的研究又发现，如果在成体组织和器官的细胞中Hh信号通路的错误表达将会引起肿瘤(Pasca，M.et al.Nature Review 1 Cancer 3，903-911(2003.12))。

Berman等人报道儿童神经胶质母细胞瘤的发生需要Hh信号通路的表达(Berman，D.M.et al，Science 297，1559-1561(2002))。

Watkins报导Hh信号通路的激活将引起小细胞肺癌(Watkins，D.N.et al，Nature 422，313-317(2003))。

更值得注意的是Thayer报导，Hh信号通路的错误调控会诱发胰腺癌，而且胰腺癌细胞的存活和生长需要该通路的表达(Thayer，S.P.et al，Nature 425，851-855(2003))。

Berman等人检测了一系列消化道肿瘤后发现，在食道癌、胃癌、胰腺癌、胆道肿瘤都有Hh通路异常表达(Berman，D，M，et al，Nature 425，846-850(2003))。

归结起来有以下几个特点：

1)Hh信号转导在动物胚胎发育中起重要作用，但成体中不表达。

2)在成体中Hh信号通路的不正常表达将导致肿瘤发生

3)不仅肿瘤的发生需要Hh信号通路而且它的生长和存活也需要。

以上特点为此类肿瘤的治疗和药物开发的生物学基础。

信号转导抑制剂是研究信号转导机制的重要工具，不同抑制剂可在不同水平和不同阶段抑制信号通路，从而搞清整个通路。现有的Hh信号通路抑制剂，主要有Hh通路抗体、Hh通路中有关蛋白的反义核酸和天然化合物。

由于整个通路有若干蛋白质，相互之间的作用也尚未完全搞清，而天然化合物环杷明(Cyclopamine)特异地作用于smo蛋白，抑制十分有效，所以人们对它最感兴趣。该化合物是一种存在于美国加州野草中的甾体生物碱。在上世纪60年代人们发现怀孕牛、羊误食后，会引起畸胎。到最近才发现它是一种Hh信号转导抑制剂，它能与Hh通路中smo蛋白结合而改变smo构型，从而阻断Hh通路的表达。

由于Hh不恰当表达，会引起肿瘤，因此人们就考虑是否可利用这种抑制剂来治疗肿瘤呢。研究结果对此回答是肯定的，Johns Hopkings大学的Berman等人将髓母细胞瘤细胞移植至大鼠，并用环杷明处理，结果发现环杷明能有效抑制细胞生长，而且能使移植的肿瘤缩小(Berman，D.M.et al，Science 297，1559-1561(2002))。Hutchinson癌症研究中心的Olson还通过手术从七名患者体内取得的髓母细胞瘤样品进行体外实验，结果发现环杷明能杀灭99.9％的肿瘤细胞(Berman，D.M.et al，Science 297，1559-1561(2002))。

Thayer等人试验环杷明对胰腺癌细胞株的作用，发现28株胰腺癌细胞株中，凡是Hh信号通路表达的对环杷明都是敏感的(Thayer，S.P.et al，Nature425，851-855(2003))。这说明凡是Hh信号通路表达异常所引起的胰腺癌，对环杷明都是敏感的。

这些结果看出环杷明对作用非常特异，只对Hh信号通路表达的肿瘤细胞有作用，而且据早先的毒理研究，它对正常细胞没有毒性，对实验动物的毒副作用很小。这是开发药物最大的优点。所以许多专家认为该发现开辟了一条治疗癌症的新途径。但是，环杷明在植物中含量很低，仅占它的万分之一，目前化学合成也还不可能，所以该领域的权威美国Johns Hopkings大学教授P.A.Beachy称：从现有的试验看，环杷明杀死肿瘤细胞的速度比任何试过的药物快得多，而且对实验动物看不出有任何副反应(Beachy，P.A.et al，Nature411，349-354(2001))。但它在植物中含量极低，以及化学合成十分困难，这是使它成为药品的最大障碍。由此看来在找到可大量制备该化合物的技术前，还不可能把它开发成新药。

鉴于目前临床上缺乏有效的治疗肿瘤的药物，以及Hh信号转导通路抑制剂在治疗肿瘤方面的巨大潜力，因此，本领域迫切需要开发新的可作为Hh信号转导通路抑制剂且有效治疗肿瘤的化合物和药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种有效治疗肿瘤的药物，所述的药物含有藜芦胺或其药学上可接受的盐或提取物作为治疗肿瘤的主要活性成分。

在本发明的第一方面，提供了一种藜芦胺及其药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述药物的剂型是片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒剂、悬浮液、糖浆、酊剂，注射剂。

在另一优选例中，所述的药物以口服或静脉内方式给药。

在另一优选例中，所述药物以0.05-500mg/kg体重给药。更佳地，所述药物以0.1-100mg/kg体重给药。

在另一优选例中，所述的肿瘤是Hh信号通路表达的肿瘤，如胰腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆道肿瘤。

在另一优选例中，所述药物还含有选自下组的治疗剂：TNFα、环磷酰胺、顺铂。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物中含有(a)0.5-99.5wt％(较佳地1-90％，更佳地2-80％，最佳地5-50％)藜芦胺或其药学上可接受的盐和(b)药学上可接受的载体。

在本发明的第三方面，提供了藜芦胺及其药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备治疗肿瘤的保健品。

在另一优选例中，所述保健品中含有0.01-99wt％(较佳地1-90％，更佳地2-80％，最佳地5-50％)藜芦胺或其药学上可接受的盐。

在本发明的第四方面，提供了藜芦胺及其药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备抑制Hedgehog(Hh)信号转导通路的抑制剂。

附图说明

图1显示了本发明化合物对肿瘤细胞株的抑制作用。

图2显示了本发明化合物的分子量测定图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，从大量中草药的提取物中筛选Hh信号转导通路的抑制剂，结果首次发现从一种治疗高血压的传统中草药藜芦中筛选到了一种能抑制表达Hh信号通路的化合物。证实该化合物对肿瘤细胞增殖抑制作用。经质谱和核磁共振等方法鉴定，该化合物是藜芦胺。并在此基础上制备了抗癌药物的方法。

活性成分

如本文所用，术语“本发明化合物”或“活性成分”指藜芦胺。藜芦胺可以是从中草药藜芦(Veratram)的根中提取的单体化合物，也可以是含藜芦胺的提取物。藜芦胺可以从天然植物中提取的藜芦胺，也可以用化学合成的藜芦胺。

本发明中所用藜芦胺是由中药藜芦中提取，具体提取方法没有特别限制，例如，将粉碎的根用非极性溶剂(如苯、甲苯等)浸泡1-20天，过滤浸泡液获得滤液，减压浓缩至1/2-1/6体积后，用酸水萃取，取酸水液，经碱化后即可获得总生物碱(藜芦胺提取物)。

本发明中所用的藜芦胺可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸和马来酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。

药物组合物

本发明还包括含有藜芦胺及其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的藜芦胺及其药物组合物可用于抑制Hh信号转导通路，进而用于治疗相关肿瘤，即给哺乳动物施用安全有效量的藜芦胺。

当藜芦胺或其药学上可接受的盐用于治疗肿瘤时，它可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，从而形成药物组合物。

液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，而固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)和叔丁基羟基茴香醚(BHA)。

通常，本发明的药物组合物包括以下剂型：如下口服给药：片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(混悬剂)(含有如约0.05-5％悬浮剂(助溶剂))、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酊剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或混悬剂形式(在等渗介质中含有约0.05-5％助溶剂)进行非肠胃给药。这些药物制剂通常可含有与载体混合的约0.5-99.5wt％，较佳地2.5-90wt％，更佳地5％-60wt％(重量)的活性成分(藜芦胺或其药学上可接受的盐)，按组合物的总重量计。

本发明所用的藜芦胺可通过静脉内、肌内或皮下以及口服途径给药。优选静脉给药方式。

本发明所用的藜芦胺可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物生长。

适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。

在使用本发明所述的藜芦胺时，还可与其他肿瘤治疗手段(如放疗)或其他治疗剂(如TNFα等)联用。

所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明化合物每天以约0.05-500mg/kg动物体重(较佳地0.1-100mg/kg体重，更佳地0.5-50mg/kg体重给药)的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-4次的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为1-1000mg或更高，较佳地5-500mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体混合的约0.5-500mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物。藜芦胺的局部给药和静脉给药是优选的。

保健品或食品补充剂

除了制备药物组合物用于治疗肿瘤之外，在本发明中，还可将藜芦胺或其药学上可接受的盐或提取物用于制备保健品或饮食补充剂(或食品添加剂)，从而用于预防肿瘤或改善癌症病人生存质量。

所谓饮食补充剂(dietary supplement)是利用植物制成的制品，它也与化学药物一样经过严格的科学和临床研究，一般讲比较廉价、比较安全，治疗慢性病比西药更有效，而且在美国不需经FDA批准就能上市。

在本发明中，保健品和饮食补充剂可互换使用，它们含有安全有效量(如0.01-99wt％)的藜芦胺或其药学上可接受的盐或提取物和药学上可接受(或保健品上可接受)的载体。

本发明的保健品或饮食补充剂可与药物组合物一样含有相同含量的藜芦胺或其药学上可接受的盐或提取物。通常，保健品或饮食补充剂中藜芦胺的含量(纯度)可略低一些，例如含0.01-50wt％藜芦胺或其药学上可接受的盐。

本发明的保健品或饮食补充剂，可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式，优选的是片剂、口服液、颗粒剂和胶囊制剂。

本发明的主要优点在于，

(a)藜芦胺对肿瘤具有明显的治疗作用；

(b)藜芦胺是已知的，在中药上早已广泛使用的活性成分，因此安全性好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

藜芦提取物的制备和纯化

l、提取：

将干的藜芦根粉碎成粗粉，取粗粉2kg加1N氨水1.1升润湿，2小时后加苯7.73升，萃取5天。每天摇动7次，过滤得4升苯萃取液。然后再加苯2.75升，再提取2次，过滤与第一次苯提取液合并得苯萃取液7升。加350ml 5％酒石酸于苯萃取液，分层，取酸水液在12℃以下加20％碳酸钠水溶液，调节pH至9析出总生物碱。然后过滤、水洗、干燥后生成20克总生物碱。

2、CRT003的分离纯化：

1)取如上制备的总生物碱20克，用100ml乙醇溶解，拌入中性氧化铝150克，水浴蒸干。

2)取2公斤柱层析用中性氧化铝2kg，拌匀后装柱，轻敲柱壁使中性氧化铝紧密均匀，并盖上园形过滤纸片，然后，将拌入中性氧化铝的总生物碱样品装入柱顶，然后用100∶2的苯∶甲醇流动相洗脱，并收集第10-15馏份，各收集100ml。

3)将收集的10-15馏分放置过夜，使析出淡黄白色针状结晶。然后过滤、干燥。再经乙醇重结晶得无色针状结晶，干燥即为成品(命名为CRT003)，得率15％。经HPLC作纯度测定，其含量达98％以上。

实施例2

提取物CRT003对胰腺癌细胞增殖抑制

Smo是Hh信号转导途径的效应子，它的激活即启动这一途径，它的表达可作为该途径发生和对该途径抑制剂反应的指示者。BxPC3为Smo低表达细胞，在国外的研究中被用作对抑制剂反应的阴性对照，已知SW1990为Smo高表达细胞。在本实施例中，测定CRT003对胰腺癌细胞BXPC3，SW1990的生长抑制作用。

材料：

CRT003为白色固体粉状物，临用前用DMSO溶解；DMEM培养基为sigma公司产品。人胰腺癌细胞株BXPC3，SW1990购自长海医院(上海，中国)，培养于DMEM培养液中。

原理：

采用噻唑蓝还原法(MTT法)测定CRT003对胰腺癌细胞的增殖抑制活性。活肿瘤细胞能氧化MTT，使其形成兰色的不溶颗粒，存在于细胞质内。该颗粒可溶于DMSO，形成兰色透明溶液。死亡肿瘤细胞则无这种氧化还原能力，在540mm波长下，测定吸光度A值计算出细胞存活率。

方法：

取对数生长期的人癌细胞分装于96孔培养板中，0.2ml/孔。实验设DMSO溶剂对照组，3个不同浓度CRT003组。药物与细胞培养96小时，第48小时时换液，在实验结束前4小每孔加入20ullMTT液(5ug/ml)，4小时后吸弃培养液，加入100ulDMSO/孔，待结晶溶解后置酶联检测仪，用540nm波长测各孔的吸光度值(A)。

结果：见图1所示。这表明胰腺癌细胞SW1990对CRT003的反应有显著的量效关系，CRT003对细胞的生长抑制作用呈浓度依赖性，提示在体外具有抗瘤作用。

此外，CRT003对SW1990的抑制作用明显强于对BxPC3的抑制作用，这表明它是一种Hh信号转导通路抑制剂。

实施例3

提取物CRT003对胃癌细胞等其他肿瘤细胞的增殖抑制

重复实施例2的步骤，不同点仅在于使用不同的肿瘤细胞进行测试。

结果表明，CRT003对胃癌细胞株(AGS)的增殖也有较好的抑制作用。此外，CRT003对胰腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆道肿瘤的细胞也有抑制作用。

实施例4

化合物的鉴定

对实施例2中的CRT003样品，经柱层析得到的白色针状结晶，经HPLC纯度测定含量为98％，熔点测定为125-128℃。

经HPLC-MS检测其分子量为409.32(图2)。M⁺+1＝410.3058，与理论值的偏差为0.1mDa，精度为0.3ppm。与藜芦胺的分子量相同。

NMR氢谱、碳谱测定结果如下，

NO	1H化学位移ppm(Hz)	13C化学位移ppm
			1	*	38.34
2	*	31.93
			3	3.93m	71.08
4	*	42.74
			5	5.35	142.57
6	*	121.34
			7	*	45.09
8	*	41.37
			9	*	57.38
10	*	35.63
			11	*	30.57
12	*	141.12
			13	*	132.94
14	*	143.56
			15	6.98d(7.7)	119.69
16	7.53d(7.7)	126.50
			17	*	143.48
18	2.44s	15.93
			19	0.97s	20.87
20	3.41m	37.04
			21	1.50d(7.2)	19.10
22	*	68.15
			23	3.71m	70.59
24	*	30.66
			25	*	32.38
26	*	54.46
			27	0.60d(6.4)	18.83

*：没有归属

根据¹H NMR和¹³C NMR的结果，化学位移与文献W.Gaffield et al.NaturalProduct，49，286(1986)中相同，表明其分子式为C₂₇H₄₀NO₂，与藜芦胺相同。

综上所述，测定结果表明CRT003是藜芦胺。虽然藜芦胺为已知化合物，但国内外尚未报导过具有抑制肿瘤细胞的作用，更没有特异地抑制表达Hh信号转导通路的肿瘤细胞的报导。

实施例5

药物的制备

取实施例1中制备的CRT003(即藜芦胺)纯品，加入辅料(用量见下表)，按常规方法用胶囊填充机装入胶囊，作为口服制剂。

	CRT003	淀粉	注
				配方1(胶囊)	250	50mg	300mg/胶囊
配方2(胶囊)	150	150mg	300mg/胶囊

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.藜芦胺及其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型是片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒剂、悬浮液、糖浆、酊剂，注射剂。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物以口服或静脉内方式给药。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物以0.05-500mg/kg体重给药。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物以0.1-100mg/kg体重给药。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤是Hh信号通路表达的肿瘤。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还含有选自下组的治疗剂：TNFα、环磷酰胺、顺铂。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物中含有(a)0.5-99.5wt％藜芦胺或其药学上可接受的盐和(b)药学上可接受的载体。

9.藜芦胺及其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的保健品。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述保健品中含有0.01-99wt％藜芦胺或其药学上可接受的盐。

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