CN1685811A - 一种大车前的体外繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大车前的一种体外繁殖方法。该方法包括以下步骤：1)以种子为外植体，将其接种于直接再生培养基上诱导不定芽；直接再生培养基是在MS基本培养基的基础上添加了噻二唑苯基脲和吲哚乙酸；2)将不定芽置于生根培养基上进行生根培养；生根培养基为MS基本培养基。本发明为筛选具有高生物量的大车前抗盐突变体和基因转化建立了高效的体外再生系统和实验平台体系，同时，可在保持高生物量产出的基础上筛选出有价值的细胞系，以获得能够大量积累有效药用成分的突变体及大车前的耐盐突变体；此外，还可在此基础上建立基因转化体系，把有利的农艺性状以及相关抗性基因转入大车前，从而提高大车前的品质和抗逆性。
Description
技术领域
本发明涉及植物的体外繁殖方法，特别是涉及大车前的一种体外繁殖方法。
背景技术
车前属(Plantago)植物全世界有190余种，多数分布于受人为干扰强烈的环境中，该属中的许多种类属于典型的杂草，是理论生态学、生理生态学和进化生物学研究的理想材料。该属植物的药用价值也较高，其中，车前(Plantago.asiatica)、大车前(Plantago.major)和平车前(Plantago.depressa)等历来被列为中药中的上品，全草及种子皆可入药。传统医学认为，车前子有利水通淋、清肝明目的功效，可用于治疗小便不利、水肿等病症(Ji DH(季大洪)，Xiao ZY(肖振宇).Study andapplication of chinese traditional medicine Plantain.The Journal ofPharmaceutical Practice(药学实践杂志)，2001，19(6)：361-362)。目前，对车前属植物的现代药理学研究也在不断地深入进行当中。
车前属中包括大约20种盐生植物，例如：Plantago maritima L.能够耐受环境中250-300mM NaCl浓度；Plantago.coronopus L.能够在150mM NaCl环境中生存(Oscar V.，Monica B.，Miguel Angel N.，et al.Responses to salt stress in thehalophyte Plantago crassifolia(Plantaginaceae).Journal of AridEnvironments，2004，58：463-481)，它们都可作为盐碱滩涂的先锋植物加以应用，对滩涂盐碱地的改造、防风固沙、水土保持、环境温度调节等方面具有积极作用，同时又是固碳、供氧和转化能量的良好材料的植物，但它们均存在生物量小的缺陷。与车前属其它种类植物相比，大车前(Plantago major L.)具有生物量大的特点，其园艺品种除可作为药用和观赏植物外，现正致力于将其开发为蔬菜品种。研究表明，大车前对盐分比较敏感：在68.4mM(0.4％)NaCl浓度下，其生长便受到抑制，在111.2mM(0.65％)NaCl浓度下，相对生长量只达到正常生长条件下对照植株的一半。基于大车前具有上述优点，迫切需要一种大车前的体外培养和再生方法，以期获得能够大量积累有效药用成分的突变体及大车前的耐盐突变体。
有关车前属植物的组织培养研究的报道较少，涂艺声(Tu YS(涂艺声).Cultivation of Plantago asiatica in vitro and plantlet regeneration..JiangxiScience(江西科学)，1995，13(3)：149-152)和王秀芝(Wang XZ(王秀芝)，Wang L(王琳)，Hon XY(侯信营).Tissue culture and plantlet regeneration of Plantagoasiatica.Plant physiology Communications(植物生理学通讯)，1998，34(3)：204)等分别用不同的外植体实现了国内常见野生种车前(Plantago asiatica L.)愈伤组织诱导及其植株再生；王秀芝等对平车前(Plantago depressa Willd.)的组织培养工作也有过报道(Wang XZ(王秀芝)，Zhang QP(张谦鹏)，Guo SL(郭善利).Tissueculture of Plantago depressa Willd.Jounal of Liaocheng Teachers College(Nat.Sci.)(聊城师院学报自然科学版)，1997，10(2)：82-85)。Mederos等对大车前(Plantago major L.)的微繁(micropropagation)作了相关研究，取12mm长的顶芽在补充葡萄糖和0.5μM BAP(6-benzylaminopurine)的改良MS培养基上培养，25天后观察到芽的增殖，平均每个顶芽可得到7个增殖芽(Mederos S.，MartinC.，Navarro E.，et al.Micropropagation of a medicinal plant，Plantago majorL..Biologia Plantarum，1997/98；40(3)：465-468)。但以顶芽为外植体，可取的材料不多，并受植物生长阶段的限制，迄今未得到培养细胞系。上述研究工作为大车前的组织培养方法的建立提供了参考，但同属不同种的植物尽管进化关系相近，但基因型不同，对组培条件的要求也相差甚远。
发明内容
本发明的目的是提供大车前的培育周期较短、产率较高的一种体外繁殖方法。
本发明所提供的大车前的体外繁殖方法，包括以下步骤：
1)以种子为外植体，将其接种于直接再生培养基上诱导不定芽；直接再生培养基是在MS基本培养基的基础上添加了噻二唑苯基脲(TDZ)和吲哚乙酸(IAA)；
2)将不定芽置于生根培养基上进行生根培养；生根培养基为MS基本培养基。
直接再生培养基中TDZ的浓度为0.5-4.0mg/L，优选为1.0mg/L；IAA的浓度为0.1-0.3mg/L，优选为0.2mg/L。
所述培养条件为：温度(25±1)℃，光照时间10-14h/天，光照强度2500-3500lux；优选的培养条件为：温度(25±1)℃，光照时间12h/天，光照强度3000lux。
所述不定芽的诱导时间为28-42天，优选为35天。
本发明所提供的大车前(Plantago major L.″Giant Turkish.″)的体外培养方法，是以大车前种子作为外植体，通过诱导不定芽的产生、得到再生株系，从种子到再生株系只需要4-5周时间，平均每个外植体得到14.6个丛生芽，提高了培养效率，也为在植物组织水平进行相关研究提供了前提和保障。本发明为筛选具有高生物量的大车前抗盐突变体和基因转化建立了高效的体外再生系统和实验平台体系，同时，可在保持高生物量产出的基础上筛选出有价值的细胞系，以获得能够大量积累有效药用成分的突变体及大车前的耐盐突变体；此外，还可在此基础上建立基因转化体系，把有利的农艺性状以及相关抗性基因转入大车前，从而提高大车前的品质和抗逆性。
附图说明
图1为叶片外植体在培养基DRM-1上生长5周后不定芽的再生情况
图2为种子外植体在培养基DRM-1上生长3周后不定芽的再生情况
图3为种子外植体在培养基DRM-1上生长5周后不定芽的再生情况
图4为在引物S252引导下的再生植株进行RADP分析的琼脂糖凝胶电泳检测结果
图5为在引物S256引导下的再生植株进行RADP分析的琼脂糖凝胶电泳检测结果
图6为在引物S405引导下的再生植株进行RADP分析的琼脂糖凝胶电泳检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、大车前的体外繁殖
植物材料：大车前的园艺品种(Plantago major L.″Giant Turkish.″)，种子购自Horizon Herbs公司(Oregon，USA)。
一、不同浓度的TDZ对不定芽再生的影响
将大车前的园艺品种(Plantago major L.″Giant Turkish.″)的种子50℃催芽1h后，用常规方法进行消毒(用70％酒精消毒30s后，用10％NaClO消毒15min，最后用无菌水冲洗4次)，将其作为外植体接种于表1所列的含不同浓度激素的外植体直接再生培养基(DRM1-DRM4，在MS基本培养基(参照文献Murashige T，Skoog F.Arevised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant，1962，15：473-497配制)的基础上添加TDZ和IAA)上，DRM1-DRM4培养基中TDZ浓度形成梯度，依次为0.5、1.0、2.0、4.0mg/L，IAA的浓度为0.2mg/L。培养条件为：温度(25±1)℃，光照12h/天，光照强度3,000lux。观察并记录数据，分别于第四周和第五周统计不定芽的再生数量及再生频率，结果如表1所示，种子外植体在DRM-1、DRM-3培养基上培养4周后的再生率比在DRM-2、DRM-4培养基上的再生率高，5周后再生率均达到100％，但在DRM-1、DRM-2培养基上得到的再生苗比DRM-3、DRM-4上长出的再生苗的生活力强，外植体在DRM-1培养基上培养5周后的丛生芽数目最多。因此，将含1.0mg/L TDZ和0.2mg/L IAA的MS培养基(DRM-1)作为本发明所用的优选的外植体直接再生培养基。
表1 不同培养基上不定芽再生频率
| 直接不定芽再生培养基(DRM) | 激素(mg/L) | 4周 | 5周 |
| 产生不定芽的外植体比率 | 每块外植体产生不定芽数量 | 产生不定芽的外植体比率 | 每块外植体产生不定芽数量 | ||
| DRM-1 | TDZ1.0+IAA0.2 | 0.88±0.04 | 2.4±0.3 | 1.00 | 14.6±0.2 |
| DRM-2 | TDZ2.0+IAA0.2 | 0.81±0.06 | 2.6±0.2 | 1.00 | 13.8±0.4 |
| DRM-3 | TDZ0.5+IAA0.2 | 0.87±0.04 | 2.7±0.1 | 1.00 | 11.6±0.5 |
| DRM-4 | TDZ4.0+IAA0.2 | 0.63±0.07 | 2.5±0.3 | 1.00 | 8.7±0.3 |
*上述不同激素组合添加于MS基本培养基中；数据为两次独立实验结果的平均值
二、不同外植体直接再生不定芽的比较及再生植株的获得
用与步骤一相同的方法对大车前(Plantago major L.″Giant Turkish.″)的种子进行催芽及消毒处理，在无菌条件下，将其接种于MS固体培养基上，(25±1)℃下暗培养，2天后转移至光下培养，约6周后成苗。分别取上述6周无菌苗的叶片和发芽4周无菌苗的下胚轴作为外植体，接种于直接再生培养基DRM-1上，4周后有近半数外植体褐化死亡，生长5周后的叶片外植体的不定芽再生情况如图1所示；存活的外植体在伤口处产生小团绿色愈伤，直接出现再生芽的频率很低。可见用叶片和下胚轴作为外植体来产生不定芽的效率很低。
将用步骤一方法处理得到的种子外植体接种于外植体再生培养基DRM-1上，4-5天后发芽，3周后(如图2所示)可观察到下胚轴部分膨大、长出小芽，同时根不再向下伸展。此后，苗与培养基接触的部分持续膨大、丛生多个小芽。5周后(如图3所示)每个外植体再生芽的平均数目为10个以上，最多可达20个。5-6周后扦插丛生芽到MS培养基上，正常生根，并长成完整植株。
实施例2、再生植株的RAPD分析
植物体细胞无性系变异是植物组织培养中的普遍现象。选用20条随机引物引物序列如表2所示，对实施例1由不定芽发生形成的大车前再生植株进行RAPD分析以确定再生植株的变异情况，具体方法为：采用CTAB法提取再生植株的基因组DNA，并以此为模板进行RAPD分析，20uL RAPD反应体系(不加矿物油)为：引物(8pmol/L，Sangon公司)2uL，Taq DNA聚合酶(2.5U/uL，北京天为时代生物技术公司)0.5uL，10×缓冲液2uL，基因组DNA 1.5uL，dNTP(10mmol/L，Sangon公司)0.5uL，超纯水13.5uL。扩增程序为：先94℃( 4min；再94℃ 1min，36℃ 1min，72℃ 2min，共40个循环；最后72℃ 10min。反应在同一PCR仪(Whatman BiometraT-gradient PCR仪)中完成。反应结束后，取10uL反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，Alphaimager凝胶成像系统观察并记录结果。其中，在引物S252、S256、S405引导下的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4-6所示(泳道M为DL2000 Ladder DNAMarker，泳道1-9为再生植株，泳道10为亲本对照)，图4为以引物S252对再生植株进行RAPD分析的琼脂糖凝胶电泳检测结果，再生植株4扩增出了一条特异条带(箭头所指)，图5为以引物S256对再生植株进行RAPD分析的琼脂糖凝胶电泳检测结果，再生植株5扩增出了一条特异条带(箭头所指)，图6为以引物S405对再生植株进行RAPD分析的琼脂糖凝胶电泳检测结果，再生植株5扩增出了一条特异条带(箭头所指)，表明用引物S252、S256、S405扩增可检测到对照亲本和再生植株在DNA水平上有差异。20条随机引物的RAPD分析结果如表2所示，每条引物分别扩增出4-8条带，20条引物在基因组DNA中扩增共得到115条电泳条带，绝大多数扩增条带大小在200-2000bp之间。其中有3条引物(S252、S256、S405)检测到了对照亲本和再生植株在DNA水平上的差异，表明用本发明的繁殖方法得到再生植株在分子水平上有变异的发生，变异频率约为2.6％。
表2 再生植株的RAPD结果统计
| 引物名称 | 引物序列 | 扩增条带数 | 多核苷酸多态性片段 | |
| 数量 | ％ | |||
| S251 | AGACCCAGAG | 8 | 0 | 0 |
| S252 | TCACCAGCCA | 6 | 1 | 16.7 |
| S253 | GGCTGGTTCC | 5 | 0 | 0 |
| S254 | TGGGTCCCTC | 6 | 0 | 0 |
| S255 | ACGGGCCAGT | 5 | 0 | 0 |
| S256 | CTGCGCTGGA | 8 | 1 | 12.5 |
| S257 | ACCTGGGGAG | 8 | 0 | 0 |
| S258 | GAGGTCCACA | 5 | 0 | 0 |
| S259 | GTCAGTGCGG | 5 | 0 | 0 |
| S260 | ACAGCCCCCA | 4 | 0 | 0 |
| S401 | GTTGGTGGCT | 6 | 0 | 0 |
| S402 | ACAACGCCTC | 5 | 0 | 0 |
| S403 | GGGGGATGAG | 7 | 0 | 0 |
| S404 | GGCGGTTGTC | 6 | 0 | 0 |
| S405 | GGGAACGTGT | 8 | 1 | 12.5 |
| S406 | CTGGGCAACT | 5 | 0 | 0 |
| S407 | CCGTGACTCA | 5 | 0 | 0 |
| S408 | TCTGTTCCCC | 4 | 0 | 0 |
| S409 | GTCTTGCGGA | 5 | 0 | 0 |
| S410 | TCTGGCGCAC | 4 | 0 | 0 |
| 总共 | 115 | 3 | 2.6 | |
Claims (7)
1、大车前的一种体外繁殖方法，包括以下步骤：
1)以种子为外植体，将其接种于直接再生培养基上诱导不定芽；直接再生培养基是在MS基本培养基的基础上添加了噻二唑苯基脲和吲哚乙酸；
2)将不定芽置于生根培养基上进行生根培养；生根培养基为MS基本培养基。
2、根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于：所述直接再生培养基中噻二唑苯基脲的浓度为0.5-4.0mg/L，吲哚乙酸的浓度为0.1-0.3mg/L。
3、根据权利要求2所述的繁殖方法，其特征在于：所述直接再生培养基中噻二唑苯基脲的浓度为1.0mg/L，吲哚乙酸的浓度为0.2mg/L。
4、根据权利要求1或2或3所述的繁殖方法，其特征在于：所述培养条件为：温度24-26℃，光照时间10-14h/天，光照强度2500-3500lux。
5、根据权利要求4所述的繁殖方法，其特征在于：所述培养条件为：温度25℃，光照时间12h/天，光照强度3000lux。
6、根据权利要求1或2或3所述的繁殖方法，其特征在于：所述不定芽的诱导时间为28-42天。
7、根据权利要求6所述的繁殖方法，其特征在于：所述不定芽的诱导时间为35天。
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-
2005
- 2005-06-03 CN CNB2005100749020A patent/CN1327762C/zh not_active Expired - Fee Related
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