CN1679634A - 一种含有大豆异黄酮的组合物及其应用 - Google Patents
一种含有大豆异黄酮的组合物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1679634A CN1679634A CNA2005100492948A CN200510049294A CN1679634A CN 1679634 A CN1679634 A CN 1679634A CN A2005100492948 A CNA2005100492948 A CN A2005100492948A CN 200510049294 A CN200510049294 A CN 200510049294A CN 1679634 A CN1679634 A CN 1679634A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- soybean isoflavone
- compositions
- rat
- dosage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及一种含有大豆异黄酮的组合物及其应用,所述的组合物包含大豆异黄酮、珍珠粉和维生素D。本发明所述组合物具有增加骨密度的保健功能,特别适合骨密度低下者及患有更年期综合症的中老年妇女服用,是一种组方合理,疗效确切,可用于预防骨质疏松症,增加骨密度的保健食品和药品。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种含有大豆异黄酮的组合物及其应用。
(二)背景技术
骨质疏松症是以低骨量和骨组织微结构破坏为特征的疾病,是老年人特别是中老年女性面临的主要健康问题之一。骨质疏松症的治疗比较困难,主要靠预防,骨密度测定是目前诊断和预测骨质疏松症的重要手段,对骨质疏松症预防主要是使骨代谢正常从而稳定骨密度。
在人体骨代谢过程中,有两种细胞起决定性作用。一种是成骨细胞,它能填补新骨(骨形成)。另一种是破骨细胞,它能消除旧骨(骨吸收),在年轻时,女性分泌的雌激素能维持这两种细胞在人体中处于平衡状态,使骨代谢正常进行,随着年龄的增大,特别在女性绝经后雌激素分泌量逐渐下降,同时破骨细胞的活性随之提高,骨吸收加快,虽然骨形成也代偿性加速,仍达不到平衡状态,致骨吸收加重,从而使骨量降低,以致慢慢形成骨质疏松症。
(三)发明内容
本发明目的在于提供一种含有大豆异黄酮的组合物和所述组合物在治备治疗骨质疏松症药物中的应用。
所述的含有大豆异黄酮的组合物包含大豆异黄酮、珍珠粉和维生素D。
优选的含有大豆异黄酮的组合物包含如下重量含量的组分:
大豆异黄酮 40~50份;
珍珠粉 50~60份;
维生素D 0.01~0.10份。
更优选的组合物由如下重量含量的组分组成:
大豆异黄酮 44~46份;
珍珠粉 54~56份;
维生素D 0.04~0.06份。
所述的组合物可以用于胶囊剂的内容物,所述的内容物还包含人体可接受的药用辅料。所述的药用辅料如润滑剂硬脂酸镁等,按重量计其用量一般为4~6份。上述胶囊的内容物推荐由如下重量含量的组分组成:
大豆异黄酮 44.2%;
珍珠粉 55.3%;
维生素D 0.05%;
硬脂酸镁 0.45%。
本发明所述的大豆异黄酮是一种自大豆中提取的纯天然物质,具有改善骨代谢,因为它的化学结构与女性雌激素相似,具有弱雌激素作用,可以抑制破骨细胞的活性,从而抑制骨吸收,防止骨质疏松症的发生,是一种改善骨代谢的有效成分。骨代谢的基础物质是钙和微量元素,本方中的珍珠粉含有大量的钙和微量元素,可促进骨的矿化,从而促进骨的形成,因此是一种改善骨代谢,提高骨密度必需营养成分。而本发明中另一重要成分是维生素D,它是一种脂溶性维生素,它的主要功能是能够促进钙元素在人体肠道内的充分吸收,促使骨骼正常钙化,提高骨密度,因此它既是骨代谢的必需营养成分,也是一种促进钙元素在肠道中吸收的有效成分。
由于大豆异黄酮有弱雌激素作用,抑制破骨细胞的机能,从而使骨代谢能保持正常进行,珍珠粉能提供骨代谢的基础物质——钙元素和微量元素,维生素D能促进钙元素在人体肠道内的充分吸收,三者配伍能保证骨代谢的正常进行,稳定骨密度,预防骨质疏松症的发生。
所述的含有大豆异黄酮的组合物用于制备治疗骨质疏松症药物,所述的药物可以是胶囊剂、片剂或其它剂型。成人每天推荐量为1.8克左右,相当于0.030g/kgBW/d。
经功能试验证明,本发明所述组合物具有增加骨密度的保健功能,特别适合骨密度低下者及患有更年期综合症的中老年妇女服用,是一种组方合理,疗效确切,可用于预防骨质疏松症,增加骨密度的保健食品和药品。
(四)附图说明
图1是本发明所述含有大豆异黄酮的组合物胶囊剂的生产工艺图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
参照图1,称取444.5g大豆异黄酮,555g珍珠粉分别经消毒的60目筛网过筛,混匀,然后与0.5g维生素D用等量递增法混合均匀,过筛,用胶囊机填充胶囊,规格为0.45g/粒。
实施例2
参照图1,称取460g大豆异黄酮,510g珍珠粉分别经消毒的60目筛网过筛,混匀,然后与0.8g维生素D用等量递增法混合均匀,过筛,加0.5g硬脂酸镁作为润滑剂,用胶囊机填充胶囊,,规格为0.45g/粒。
实施例3 功效成分检验
1 大豆异黄酮的含量测定
1.1 仪器与试剂
岛津10A系列液相色谱系统(SPD-10Avp,LC-10ATvp×2,Z0rbaxExtend C.185um 250×4.6mm,7725型手动进样器,N-2000双通道色谱工作站);大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素标准品(美国Fluka、Sigma公司提供);乙腈(色谱纯);磷酸(分析纯);水(重蒸水)。
1.2 操作步骤
1.2.1 标准品溶液的制备
精密称取大豆甙、染料木甙标准品各3.0mg,置100ml量瓶中,用30%乙醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,取5ml置10ml量瓶中,用30%乙醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml中含大豆甙、染料木甙各15ug)。
1.2.2 供试品溶液的制备
取实施例1和2制得胶囊剂内容物各10粒,研匀,取40mg,精密称定,置50ml量瓶中,加30%乙醇溶液30ml,超声助溶15分钟,放冷,加30%乙醇溶液至刻度,摇匀,离心(3000r/min,5min),取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤,作为供试品溶液。
1.2.3 测定
精密吸取上述标准品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,进行测定,即得。
1.3 计算
X-样品中大豆甙/染料木甙/大豆甙元/染料木素的含量(g/100g);
S1-样品峰面积;
S2-标准品溶液峰面积;
M-称取样品的量(g);
C-标准品溶液的浓度(μg/ml)。
样品中大豆异黄酮含量X(g/100g=Xa+Xb+Xc+Xd(Xa、Xb、Xc、Xd分别为样品中大豆甙、染料木甙、大豆甙元及染料木素的含量),结果如表1所示。
2 钙的含量测定
按GB12398-1990食品中钙的测定方法测定实施例1和2制得胶囊剂内容物的含钙量。结果如表1所示。
表1 大豆异黄酮和钙含量测定
胶囊剂内容物 | 大豆异黄酮含量测定(g/100g) | 钙含量测定(g/100g) |
实施例1 | 4.0 | 7.5 |
实施例2 | 4.3 | 6.8 |
实施例4 毒理学试验
1 材料和方法
1.1 样品:实施例1制得胶囊内容物(黄色粉末),每粒内容物净重为0.45克。
1.2 试验动物:选用中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供的健康昆明种小鼠(二级)(合格证号:SCXK11-00-0006)和北京市实验动物研究中心提供的SD大鼠(二级)(合格证号:SCXK11-00-0008)。
1.3 仪器:BECKMAN GS15R离心机;日立7060型自动生化仪;NIKONKOHDEN日本光电6138K血液检测仪;NIKON生物显微镜;试剂除注明外均为分析纯。
1.4 方法
1.4.1 急性毒性试验:
1.4.1.1 小鼠急性毒性试验:选用健康昆明种小白鼠20只(雌雄各10只),进行试验。小鼠体重为18-22克。用蒸馏水配至所需浓度,以10g/kgBW的剂量进行灌胃,灌胃量为0.4ml/20gBW,连续观察14天。记录动物中毒表现及死亡情况。
1.4.1.2 大鼠急性毒性试验:选用健康SD大白鼠20只(雌雄各10只),进行试验。大鼠体重为180-220克。用蒸馏水配至所需浓度,以10g/kgBW的剂量进行灌胃,灌胃量为2.0ml/100gBW,连续观察14天。记录动物中毒表现及死亡情况。
1.4.2 遗传毒性试验:
1.4.2.1 Ames试验:采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株进行试验。采用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆S-9作为体外代谢活化系统。根据毒性测定结果,试验设0.008、0.04、0.2、1.0、5.0mg/皿5个剂量,将1.0g受试物加无菌水20ml制成混悬液,每皿加100μl作为最高剂量为最高浓度5.0mg/皿(100μl/皿);其余剂量以无菌水5倍比稀释。同时设未处理对照、溶剂对照和阳性对照皿。在顶层琼脂中加入0.1ml试验菌株增菌液、0.1ml受试物溶液和0.5mlS-9混合液(当需要代谢活化时),混匀后倒入底层培养基平板上。在37℃培养48h,计数每皿回变菌落数。如果受试物的回变菌落数是阴性对照菌落数2倍以上,并具有剂量-反应关系者则定为阳性。整个试验在相同条件下重复做一次。
1.4.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验:采用间隔24h两次经口灌胃法进行试验。选用体重25-30克小白鼠50只,按体重随机分为5组,每组10只,雌雄各半。以40mg/kgBW剂量的环磷酰胺为阳性对照,以蒸馏水做为阴性对照,所述组合物剂量为1.11、3.33、10.00g/kgBW,用蒸馏水配至所需浓度。末次给所述组合物后6h,颈椎脱臼处死动物,取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片,甲醇固定,Giemsa染色。在生物学显微镜下,每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PRC),微核发生率以含微核的PRC千分率计,并进行统计处理。
1.4.2.3 小鼠精子畸形试验:选用体重25-30克的性成熟雄性小鼠25只,随机分为5组。以40mg/kgBW剂量的环磷酰胺为阳性对照,以蒸馏水为阴性对照,所述组合物剂量为1.11、3.33、10.00g/kgBW,用蒸馏水配至所需浓度。每日灌胃一次,连续5天,末次灌胃后30天颈椎脱臼处死动物,取两侧附睾,去脂肪,在生理盐水中剪碎,离心,1000转/分离心7分钟、去上清、留少许混匀滴于玻片上涂片、甲醇固定、1.5%伊红染色并镜检。每只动物计数1000个精子,计算畸变精子发生率(以百分率计),并进行统计处理。
1.4.3 30天喂养试验:用体重60-80克断乳大鼠80只,随机分为4组,即对照组,3个受试物组(0.75、1.50、3.0g/kgBW,分别相当于人体推荐量的25、50、100倍)。用蒸馏水配至所需浓度,每日经口一次灌胃给予受试物,灌胃量为1.0ml/100gBW,饲料为普通块料。动物单笼喂养,自由饮食,每周称两次体重,调整灌胃剂量,记录大鼠每周进食量,连续观察30天。实验结束采血测各项血液学及血生化指标。
1.4.3.1 观察指标:
1.4.3.1.1 动物的一般表现、体重、食物利用率。
1.4.3.1.2 血常规及生化指标:白细胞计数及其分类、红细胞计数、血红蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三脂、血糖、总蛋白、白蛋白。
1.4.3.1.3 脏体比:实验结束处死动物取肝、肾、脾和睾丸称重,计算相应的脏体比(以百克体重计算)。
1.4.3.1.4 病理组织学:解剖进行大体观察及病理组织学检查(肝、肾、胃及十二指肠,睾丸及卵巢)
1.4.3.2 统计方法:数据经EXCEL计算均数和标准差,经PEMS统计软件包进行方差分析,方差不齐者采用非参数分析。
2 结果
2.1 急性毒性试验:
2.1.1 小鼠急性毒性试验:由表2可见,经口灌胃雌雄小鼠10g/kgBW剂量的所述组合物,观察14天后,未见明显的中毒症状,也无死亡。结果表明该受试物对雌雄小鼠的急性毒性L,Ds0均大于rb g/kgBW。根据急性毒性分级标准,所述组合物属实际无毒。
2.1.2 大鼠急性毒性试验:由表3可见,经口灌胃雌雄大鼠10g/kgBW剂量的所述组合物,观察14天后,未见明显的中毒症状,也无死亡。结果表明该受试物对雌雄SD大鼠的急性毒性LDs0均大于10g/kgBW。根据急性毒性分级标准,所述组合物属实际无毒。
表2 小鼠急性毒性试验结果
动物品种 | 性别 | 途径 | LD50(g/kgBW) |
小鼠 | 雄 | 经口 | >10 |
雌 | 经口 | >10 |
表3 大鼠急性毒性试验结果
动物品种 | 性别 | 途径 | LD50(g/kgBW) |
大鼠 | 雄 | 经口 | >10 |
雌 | 经口 | >10 |
2.2 遗传毒性试验:
2.2.1 Ames试验:由表4和表5可见,对照皿回变菌落数在正常范围,所述组合物各剂量组回变菌落数均未超过阴性对照菌落数2倍,亦无剂量-反应关系,故对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株,在加与不加S-9时,均未见所述组合物致突变作用。
表4 Ames试验第1次结果
剂量(mg/皿) | TA97 | TA98 | TA100 | TA102 | |||||
-S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | ||
受试物未处理对照溶剂对照 | 0.008 | 144.0±7.5 | 148.0±7.96 | 44.0±8.0 | 41.0±16.5 | 144.3±8.0 | 147.7±34.3 | 281.7±14.6 | 291.7±26.3 |
0.04 | 148.3±13.6 | 155.7±4.7 | 37.7±1.5 | 32.3±7.6 | 155.3±21.2 | 144.0±8.5 | 296.0±23.8 | 303.0±24.6 | |
0.2 | 155.7±11.8 | 154.0±6.6 | 35.0±1.0 | 37.7±3.1 | 136.3±10.7 | 156.7±3.8 | 282.0±15.9 | 276.7±9.3 | |
1.0 | 149.7±14.6 | 152.7±17.2 | 38.7±6.8 | 51.0±11.1 | 140.3±14.0 | 153.3±15.6 | 284.3±16.2 | 297.7±21.8 | |
5.0 | 153.3±11.0150.0±11.0153.0±14.5 | 144.7±15.9140.7±5.7137.7±10.5 | 39.7±3.240.3±6.036.0±3.5 | 35.0±7.540.7±9.340.0±10.4 | 169.7±18.0125.7±10.0136.0±26.9 | 160.0±5.6149.0±29.3135.0±8.9 | 283.7±26.1279.0±9.6281.0±7.0 | 301.0±23.3288.0±6.1291.3±14.2 | |
阳性对照NaN32-AF4-硝基-O-次苯二胺MMC1,8-二羟蒽醌 | (μg/皿)1.510.020.02.550.0 | 1769.3±112.0 | 1328.0±191.1 | 2610.0±166.1 | 3086.7±192.2 | 1890.7±238.0 | 1912.7±208.5 | 2514.0±166.2 | 791.7±103.6 |
注:以上结果为三皿平均值
表5 Ames试验第2次结果
剂量(mg/皿) | TA97 | TA98 | TA100 | TA102 | |||||
-S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | ||
受试物未处理对照溶剂对照 | 0.008 | 159.3±4.0 | 141.3±9.7 | 35.0±2.6 | 41.3±8.1 | 130.0±11.4 | 164.7±30.1 | 284.0±23.4 | 287.3±10.4 |
0.04 | 158.7±4.2 | 144.7±18.4 | 36.0±10.6 | 36.0±9.0 | 136.0±11.5 | 139.7±22.9 | 279.7±12.1 | 289.3±28.9 | |
0.2 | 148.7±18.6 | 159.0±6.2 | 41.7±5.9 | 44.3±7.5 | 144.7±8.7 | 143.7±17.0 | 295.3±18.8 | 318.3±21.2 | |
1.0 | 137.0±8.5 | 142.7±23.7 | 44.3±15.8 | 40.7±4.5 | 152.7±10.1 | 129.7±5.5 | 308.0±6.9 | 289.3±18.4 | |
5.0 | 162.0±22.3161.7±11.1155.3±15.2 | 159.3±8.1151.7±23.3145.7±5.9 | 36.7±2.552.7±8.141.7±2.5 | 46.3±15.038.0±8.741.3±6.0 | 153.0±19.7145.0±18.2154.3±23.2 | 126.0±7.2138.0±22.5160.7±13.0 | 296.3±12.9285.0±9.5280.3±10.0 | 281.3±13.0294.0±8.0292.7±6.4 | |
阳性对照NaN32-AF4-硝基-O-次苯二胺MMC1,8-二羟蒽醌 | (μg/皿)1.510.020.02.550.0 | 1884.7±107.2 | 1264.7±51.2 | 2206.7±201.4 | 2868.7±186.7 | 1614.0±130.7 | 1696.7±289.9 | 2829.3±161.7 | 817.3±46.1 |
2.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验:由表6可见,无论雄性还是雌性小鼠环磷酰胺阳性对照组微核发生率均明显高于阴性对照组和受试物各剂量组(泊松分布检验P<0.01),而受试物各剂量所述组合物组与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05),说明该受试物对小鼠体细胞染色体无致突变作用。
表6 对小鼠骨髓微核发生率的影响
性别 | 剂量(g/kgBW) | 动物数(只) | 检查细胞数(个) | 微核数(个) | 微核率(‰) |
雄 | 0.00a1.113.3310.0040mg/kgBW(CP)b | 55555 | 50005000500050005000 | 9989154 | 1.81.81.61.830.8 |
雌 | 0.00a1.113.3310.0040mg/kgBW(CP)b | 55555 | 50005000500050005000 | 91087163 | 1.82.01.61.432.6 |
a:示与各受试物物处理组比较,泊松分布统计P>0.05
b:示与各受试物处理组和阴性对照组比较,泊松分布统计P<0.01
2.2.3 小鼠精子畸形试验:由表7可见,阳性组精子畸变发生率明显高于阴性对照组和受试物各剂量组(X2检验P<0.01),受试物各剂量组与阴性对照组畸变率比较无显著性差异(X2检验P>0.05),说明该受试物无致小鼠生殖细胞畸变作用。
表7 对小鼠精子畸形发生率的影响
剂量(g/kgBW) | 动物数(只) | 受检精子数(个) | 精子畸形数(个) | 精子畸形率(%) |
0.00a1.113.3310.0040mg/kgBW(CP)b | 55555 | 50005000500050005000 | 11198108105306 | 2.221.962.162.106.12 |
a:示与各受试物处理组比较,X2检验统计P>0.05
b:示与各受试物处理组和阴性对照组比较,X2检验统计P<0.01
2.3 30天喂养试验:
2.3.1 生长状况及食物利用率:
各组动物活动生长正常,被毛浓密有光泽。由表8和表9可见,以0.75、1.50、3.0g/kgBW剂量的所述组合物经口灌胃给予大鼠30天,各剂量组第4周动物体重、食物利用率与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
表8 30天喂养试验对大鼠体重的影响
性别 | 剂量(g/kgBW) | 动物数(只) | 始重(g) | 第1周(g) | 第2周(g) | 第3周(g) | 第4周 | |
(g) | 统计值 | |||||||
雄 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 64.6±4.264.1±5.964.1±4.364.2±3.7 | 113.4±11.1116.7±4.4114.2±10.6107.5±6.3 | 164.4±16.2168.2±14.3168.4±17.2152.8±7.0 | 218.2±17.5214.8±25.9222.6±16.4201.4±14.3 | 256.8±15.9249.6±29.1264.0±23.4245.9±14.7 | F=1.3795P=0.2647 |
雌 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 63.6±6.063.3±6.563.1±5.463.5±5.3 | 109.7±7.0105.8±7.7106.3±8.8105.8±8.0 | 149.8±7.5140.7±5.8148.1±9.9142.9±7.3 | 177.9±8.6173.9±15.4175.8±12.0170.0±7.7 | 199.9±7.4194.6±14.5196.1±14.9194.9±8.3 | F=0.4275P=0.7345 |
表9 30天喂养试验对大鼠食物利用率的影响
性别 | 剂量(g/kgBW) | 动物数(只) | 体重增重(g) | 进食量(g) | 食物利用率 | ||
F值 | P值 | ||||||
雄 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 192.2±17.4185.5±33.0199.9±25.8181.7±15.4 | 578.5±17.7563.8±24.1580.4±28.9554.0±16.8 | 33.3±3.332.8±5.034.5±4.932.8±2.3 | 0.3948 | 0.7575 |
雌 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 136.3±8.8131.3±16.5133.0±13.4131.4±10.0 | 529.7±41.2541.5±26.8544.9±21.4530.2±18.6 | 25.9±2.724.3±3.124.4±2.224.8±2.3 | 0.8070 | 0.4983 |
食物利用率:摄入每百克饲料所增长体重的克数
2.3.2 血常规及血生化指标:
由表10和表11可见,以0.75、1.50、3.0g/kgBW剂量的所述组合物经口灌胃给予大鼠30天,除雄性0.75g/kgBW和3.0g/kgBW剂量组血红蛋白与对照组比较升高(F=4.9732,P=0.0055,0.75g/kgBW剂量组q’=3.6397、P<0.01,1.5g/kgBW剂量组q’=2.4628、P>0.05、3.0g/kgBW剂量组q’=2.8979、P<0.05)外,其余雌雄各剂量组的白细胞计数及分类、红细胞、血红蛋白各项血液学指标与对照组比较无显著性差异。雄性0.75g/kgBW、3.0g/kgBW剂量组血红蛋白检测值均在本检测单位历史对照检测范围内,且又高于对照组,故认为无生物学意义。
表10 30天喂养试验血液学检查结果
性别 | 剂量(g/kgBW) | 动物数(只) | 白细胞计数(×109/L) | 红细胞计数(×1012/L) | 血红蛋白(g/L) |
雄 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 14.8±5.613.6±5.110.9±4.610.6±3.2 | 6.92±1.077.57±0.307.13±0.347.36±0.49 | 127.6±17.5144.3±6.1**138.9±6.8140.9±5.6* |
雌 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 11.2±2.610.7±4.29.9±3.49.5±4.2 | 8.12±0.397.69±0.467.72±0.407.76±0.43 | 148.5±4.4143.5±6.0145.6±8.9145.9±6.2 |
*P<0.05 **P<0.01
表11 30天喂养试验对大鼠WBC分类的影响
性别 | 剂量(g/kgBW) | 动物数(只) | 淋巴细胞(%) | 中性细胞(%) | 其它细胞(%) |
雄 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 78.4±4.080.3±3.076.4±5.579.9±5.4 | 16.6±3.814.4±2.917.9±4.914.7±4.8 | 5.0±0.95.3±0.75.7±1.25.4±0.9 |
雌 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 74.6±3.370.1±8.274.0±3.972.9±3.7 | 19.4±3.323.0±7.419.2±3.520.0±3.4 | 6.0±0.96.9±1.36.8±1.77.1±1.0 |
由表12和表13可见,以0.75、1.50、3.0g/kgBW剂量的所述组合物经口灌胃给予大鼠30天,除雌性3.0g/kgBW剂量组胆固醇降低(F=8.9016,P=0.0002,3.0g/kgBW剂量组q’=4.4611、P<0.01)外,其余雌雄各剂量组谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三脂、血糖、总蛋白、白蛋白与对照组比较无显著性差异(P>0.05),雌鼠3.0g/kgBW剂量组胆固醇检测值均在对照检测值范围内,故认为无生物学意义。
表12 30天喂养试验末期生化检验结果(1)
性别 | 剂量(g/kgBW) | 动物数(只) | 谷草转氨酶(U/L) | 谷丙转氨酶(U/L) | 尿素氮(mmol/L) | 肌酐(umol/L) |
雄 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 167.7±33.4163.9±40.4152.4±21.7141.3±29.1 | 40.1±7.339.9±6.238.7±6.533.9±10.1 | 4.44±0.715.05±0.734.19±0.945.22±1.16 | 61.7±4.962.0±5.160.1±6.061.0±4.6 |
雌 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 125.9±14.1131.6±18.2124.3±17.6120.9±9.7 | 32.6±3.530.3±5.428.4±4.626.4±7.2 | 5.43±0.765.40±0.655.30±0.655.72±0.91 | 66.8±5.664.5±6.166.0±4.065.9±4.4 |
表13 30天喂养试验末期生化检验结果(2)
性别 | 剂量(g/kgBW) | 动物数(只) | 胆固醇(mmol/L) | 甘油三脂(mmol/L) | 血糖(mmol/L) | 总蛋白(g/L) | 白蛋白(g/L) |
雄 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 1.64±0.191.73±0.401.56±0.311.34±0.36 | 0.42±0.110.35±0.080.45±0.140.44±0.12 | 4.19±0.364.13±0.774.29±0.634.70±0.89 | 64.1±2.964.8±3.263.8±2.665.0±2.3 | 35.2±0.635.6±1.235.3±1.136.3±1.0 |
雌 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 1.91±0.271.75±0.271.91±0.311.29±0.38** | 0.39±0.040.40±0.060.37±0.080.36±0.10 | 5.11±0.614.98±0.615.04±0.415.26±0.58 | 66.8±5.065.3±2.766.4±3.168.5±3.0 | 36.4±1.235.5±0.836.7±1.137.1±1.1 |
2.3.3 大体及病理组织学检查:大体解剖观察均未发现各脏器异常,各剂量组的肝、肾、脾和睾丸脏体比与对照组比较均无显著性差异(表14,P>0.05)。
大鼠肝、肾、胃及十二指肠、睾丸(或卵巢)脏器的组织学检查结果为:肝脏:各组肝小叶结构完整,肝细胞排列规整,对照组16/20例、3.0g/kgBW剂量组9/20例动物肝细胞浆内出现轻度空泡变性;对照组7/20例、3.0g/kgBW剂量组13/20例肝细胞动物小血管周围可见少量淋巴细胞浸润,各组动物均未见肝细胞坏死,淤血、淤胆。肾脏:对照组雌鼠4/10例可见一些肾小管内钙盐沉积和管腔扩张,其余动物未见异常。睾丸:生精活跃,可见各级生精细胞及成熟精子,间质未见异常。对照组6/10例、3.0g/kgBW剂量组4/10例大鼠睾丸边缘部个别曲细精管内生精细胞玻璃样变性。卵巢:各组卵巢结构正常,可见各级卵泡和成熟黄体,胃和十二指肠:粘膜上皮完整,未见明显炎症和增生。肝、睾丸各剂量组与对照组相比,病变无明显差异,推测可能与动物质量有关,而与受试物无关。故未见由该受试物引起的肝、肾、胃及十二指肠、睾丸(或卵巢)脏器的毒性病理学改变。
表14 30天喂养试验对大鼠脏体比的影响
性别 | 剂量(g/kgBW) | 动物数(只) | 肝/体(%) | 肾/体(%) | 脾/体(%) | 性腺/体(%) |
雄 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 2.91±0.292.87±0.432.87±0.393.05±0.23 | 0.86±0.050.83±0.090.82±0.090.84±0.06 | 0.26±0.030.26±0.060.24±0.030.26±0.04 | 1.07±0.111.04±0.141.00±0.161.10±0.10 |
雌 | 0.00.751.503.00 | 10101010 | 3.12±0.133.15±0.253.25±0.233.19±0.14 | 0.86±0.050.87±0.080.84±0.070.83±0.06 | 0.30±0.060.27±0.030.29±0.060.28±0.04 | ---- |
3 小结:
3.1 急性毒性试验:所述组合物对雌雄大、小鼠经口急性毒性,LD50均大于10g/kgBW。根据急性毒性分级标准,所述组合物属实际无毒。
3.2 遗传毒性试验:Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均未见所述组合物有致突变作用。
3.3 30天喂养试验:以0.75、1.50、3.0g/kgBW剂量的所述组合物经口灌胃给予大鼠30天,结果显示:动物活动、生长未见异常,被毛浓密有光泽。雌雄各剂量组动物体重、食物利用率与对照组比较无显著性差异(P>0.05);血液学检测,除雄性0.75g/kgBW、3.0g/kgBW剂量组血红蛋白与对照组比较升高(P<0.05)外(无生物学意义),其余各组动物血液学指标与对照组比较无显著性差异(P>0.05);血生化指标除雌性大鼠3.0g/kgBW剂量组胆固醇与对照组比较有明显降低(P<0.01)外(无生物学意义),其余各组动物的生化指标:谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐、甘油三脂、血糖、总蛋白、白蛋白与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。末期脏体比雌雄各剂量组与对照组比较无显著性差异(P>0.05):病理学观察也未见由受试物毒性引起的异常病理改变,故未见所述组合物对动物体重、食物利用率、血液学、血生化、脏体比和病理组织学有不良影响。
实施例5 含有大豆异黄酮的组合物增加骨密度动物实验
1 材料和方法
1.1 样品:实施例1制得胶囊内容物。
1.2 实验动物:选用雌性wistar大鼠,体重2 60g左右,二级,购自中国医学科学院实验动物研究所繁育场,许可证编号:SCXK11-00-0006,领取后适应性喂养3天。
1.3 剂量选择:所述组合物人体推荐量为每人每天0.03g/kg.Bw。人鼠低、中、高三个剂量分别为0.15、0.30、0.90g/kg.Bw,相当于人体推荐量的5、10、30倍,受试物按上述剂量用纯净水稀释成适当浓度,均以每日10ml/kg.Bw灌胃量给予。
1.4 主要仪器与试剂:手术剪、止血钳、持针器、缝合针、缝合线、手术刀、眼科镊;灌胃针、注射器、电子天平(0.1g)、直尺、游标卡尺、电子天平(0.0001g,FISHER)、LG100B抽风干燥箱(上海市实验仪器总厂)、SD-1000型骨矿物质测量仪(麦孚新技术有限公司)、从200型原子吸收分光光度计统。无水乙醇、碘酊、戊巴比妥钠、阿仑膦酸钠片(石家庄制药集团有限公司)、GBW(E)080118钙元素标准液(国家标准物质中心)、氯化镧(北京化学试剂公司)、硝酸。
1.5 实验方法:
1.5.1 卵巢切除:大鼠以30mg/kg.Bw腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液,麻醉后进行双侧卵巢切除术,术后肌肉注射2万单位的青霉素,连续3天。假手术组打开腹腔后仅切除0.5g左右的脂肪,保留双侧卵巢。
1.5.2 饲料配制:参照美国营养研究所(AIN)半成品饲料配方和实验大鼠全价营养饲料国家标准(GB14924-94)自行配制不含雌激素活性成分的饲料。
1.5.3 动物分组:雌性wistar大鼠按体重随机分为假手术组、模型对照组、阳性对照组和所述组合物低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组10只大鼠。术后第3天开始给予受试物,假手术组和模型对照组以去离子水灌胃,阳性对照组经口给予1.0mg/kg.Bw的阿仑膦酸钠,所述组合物低、中、高剂量组分别经口给予0.15、0.30、0.90g/kg.Bw的受试物,每日各组大鼠灌胃量均为10ml/kg.Bw。实验期间每只大鼠均单笼饲养,喂饲自制饲料,自由饮用去离子水,实验期为三个月。
1.5.4 指标测定:
1.5.4.1 体重和身长测量及食物利用率计算:实验期间,定期观察大鼠一般状况,记录大鼠进食量,称体重和量身长;按下式计算食物利用率:
1.5.4.2 股骨湿重、干重和长度测定:未次灌胃24h后处死大鼠,迅速剥离右侧股骨,去除肌肉和软组织,用万分之一电子天平称量股骨湿重,用游标卡尺测量其长度。将股骨置于105℃烘烤48h,称量股骨于重,继续烘烤2h,再次称量股骨干重,两次差重小于0.3mg,即可认为达到恒重。
1.5.4.3 骨密度测定:去除软组纵的股骨烘烤至恒重后,在同一条件下利用经标准骨模型校准的SD-1000型骨矿物质测量仪分别测定股骨中点和干骺端的骨矿物质含量(BMC)和骨宽度(BW),按下式计算各测定点的骨密度(BMD):
每点重复测定两次。
1.5.4.4 骨钙测定:依据中华人民共和国国家标准GB12398-90进行测定。将烘干的股骨放入微波消解管中,加入5ml硝酸,于微波炉内消解至透明溶液:消解后的样品溶液经赶酸后,用双蒸水定量转移并定容至10.0ml:适当稀释后加人0.1g/L氯化镧溶液作基体改进液,双蒸水定容后待测。将GBW(E)080118钙元素标准液用1%硝酸(v/v)溶液稀释至0.0、5.0、10.0、15.0和20.0mg/L标准系列。用Z-5000型原子吸收分光光度计在422.7nm处测定各标准管和样品管中的该浓度,按下式计算骨钙含量:
公式中:C,C0-分别为测得的样品和空白溶液中的钙浓度(mg/L):
v-样品定容体积(ml):B-稀释倍数:m-骨样干重(g)。
1.6 数据统计:实验所得数据用SPSS统计软件包中独立样本t-检验方法进行统计学分析,p<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 所述组合物对大鼠体重的影响,见表15。
表15 组合物对大鼠体重的影响
组别 | 0月体重(克) | 1月体重(克) | 2月体重(克) | 3月体重(克) |
假手术组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组 | 259.9±10.0260.9±9.6258.8±7.7258.3±9.2257.9±9.0259.4±8.5 | 306.6±11.8345.8±13.9**340.1±15.0342.5±16.0340.9±16.9343.9±14.6 | 325.7±8.1371.2±12.9**365.7±13.3369.0±14.2365.5±20.6367.6±10.1 | 339.7±10.6392.0±14.9**383.5±14.8389.8±20.5388.0±22.5385.9±15.2 |
与假手术组比较,**P<0.01
由表15可见,模型对照组1、2、3月体重明显高于假手术组(P<0.01),属正常现象,阳性对照组和所述组合物低、中、高剂量组各时期体重与模型对照组比无显著差异(P>0.05)。
2.2 组合物对火鼠身长的影响,见表16,
表16 组合物对大鼠身长的影响
组别 | 动物(只) | 0月身长(cm) | 1月身长(cm) | 2月身长(cm) | 3月身长(cm) |
假手术组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组 | 101010101010 | 22.5±0.322.4±0.222.5±0.322.4±0.222.5±0.222.4±0.2 | 23.1±0.223.2±0.223.2±0.323.1±0.323.2±0.223.1±0.2 | 23.7±0.323.7±0.223.8±0.223.7±0.323.8±0.323.8±0.2 | 24.2±0.324.3±0.324.1±0.324.1±0.324.2±0.424.2±0.3 |
由表16可见,各组大鼠各时期的身长均无明显差异(P>0.05)。
2.3 组合物对大鼠体重增重、总摄食量和食物利用率的影响,见表17。
表17 组合物对大鼠体重增重、总摄食量和食物利用率的影响
组别 | 动物(只) | 增重(g) | 总摄食量(g) | 食物利用率(%) |
假手术组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组 | 101010101010 | 79.8±13.5131.2±11.7**124.8±17.2131.5±22.5130.1±16.8126.5±14.6 | 1469.1±77.01524.0±57.31502.1±89.71512.1±102.91526.5±99.11537.4±89.6 | 5.42±0.738.61±0.71**8.28±0.778.65±1.018.50±0.708.21±0.58 |
与假手术组比较,**P<0.01
由表17可见,模型对照组与假手术组比较体重增重明显,食物利用率明显提高(P<0.01),其余各组大鼠体重增重、总摄食量、食物利用率与模型对照组比较无显著差异(P>0.05)。
2.4 所述组合物对大鼠股骨湿重、干重和骨长的影响,见表18。
表18 组合物对大鼠股骨湿重、干重和骨长的影响
组别 | 动物(只) | 湿重(g) | 干重(g) | 骨长(cm) |
假手术组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组 | 101010101010 | 0.77±0.040.70±0.02**0.74±0.04#0.75±0.05##0.76±0.04##0.76±0.04## | 0.571±0.0500.508±0.038**0.545±0.036#0.557±0.044##0.552±0.028##0.563±0.038## | 3.59±0.093.58±0.073.59±0.073.62±0.053.62±0.053.61±0.06 |
与假手术组比较,**P<0.01:与模型对照组比较,#P<0.05;##P<0.01
由表18可见,模型对照组大鼠股骨湿重、干重与假手术组比较有显著降低.并有统计学上的差异(P<0.01);阳性对照组与模型对照组比较股骨湿重、干重有增加,并有显著性差异(P<0.01);所述组合物低、中、高剂量组股骨湿重、股骨干重与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01),各剂量组大鼠股骨长度无显著差异(P>0.05)。
2.5 所述组合物对大鼠骨矿物含量(BMC)和骨密度(BMD)的影响,见表19。
表19 组合物对大鼠股骨中点和股骨干骺端骨矿物含量(BMC)和骨密度(BMD)的影响
组别 | BMC | BMD | ||
中点 | 干骺端 | 中点 | 干骺端 | |
假手术组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组 | 0.145±0.0190.121±0.010##0.135±0.013#0.138±0.014#0.141±0.014##0.143±0.017## | 0.263±0.0390.220±0.023**0.249±0.0380.255±0.040#0.253±0.030#0.264±0.03## | 0.406±0.0530.323±0.038**0.374±0.058#0.382±0.067#0.390±0.039##0.395±0.046## | 0.509±0.0440.459±0.026**0.501±0.028##0.501±0.029##0.502±0.026##0.507±0.042## |
与假手术组比较,**P<0.01;与模型对照组比较,#P<0.05;##P<0.01
由表19可见,假手术组大鼠股骨中点和股骨干骺端骨密度(BMD)、骨矿物含量(BMC)与模型对照组比有显著差异(P<0.01):阳性对照组大鼠股骨中点和股骨于骺端骨密度(BMD)、骨矿物含量(BMC)与模型对照组比较有显著差异(P<0.01):所述组合物低、中、高剂量组大鼠股骨中点和股骨干骺端骨密度(BMD)、股骨中点骨矿物含量(BMC)与模型对照组比较有显著差异(P<0.05或P<0.011.中、高剂量组大鼠股骨干骺端骨矿物含量(BMC)与模型时照组比较有显著差异(P<0.05)。
2.6 所述组合物对大鼠骨钙含量的影响,见表20。
表20 组合物对大鼠骨钙含量的影响
与假手术组比较,**P<0.01;与模型对照组比较,#P<0.05;##P<0.01
组别 | 剂量(g/kg.b.w) | 动物(只) | 骨钙含量(mg/g) |
假手术组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组 | 0.00.00.150.300.900.001 | 101010101010 | 344.5±39.4288.0±41.8**324.4±34.0#333.1±28.5##339.8±18.3##342.2±28.9## |
由表20可见,假手术组大鼠骨钙含量与模型对照组比较有显著差异(P<0.01).阳性对照组和所述组合物低、中、高剂量组大鼠骨钙含量与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。
3.小结
经口给予不同剂量的所述组合物实验结果表明,模型对照组1、2、3月体重明显高于假手术组(P<0.01),属正常现象,阳性对照组和所述组合物低、中、高剂量组各时期体重与模型对照组比无显著差异(P>0.05),各组大鼠同一时期的身长均无显著差异(P>0.05):模型对照组与假手术组比较体重增重明显,食物利用率明显提高(P<0.01),其余各组大鼠体重增重、总摄食量、食物利用率与模型对照组比较无显著差异(P>0.05);模型对照组大鼠股骨湿重、干重与假手术组比较有显著降低,并有统计学上的差异(P<0.01);阳性对照组与模型对照组比较股骨湿重、干重有增加,并有显著性差异(P<0.01);所述组合物低、中、高剂量组股骨湿重、股骨干重与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01),各剂量组大鼠股骨长度无显著差异(P>0.05):假手术组大鼠股骨中点和股骨干骺端骨密度(BMD)、骨矿物含量(BMC)与模型对照组比有显著差异(P<0.01):阳性对照组大鼠股骨中点和股骨干骺端骨密度(BMD)、骨矿物含量(BMC)与模型对照组比较有显著差异(P<0.01);所述组合物低、中、高剂量组大鼠股骨中点和股骨干骺端骨密度(BMD)、股绀中点骨矿物含量(BMC)与模型对照组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01),中、高剂量组大鼠股骨干骺端骨矿物含量(BMC)与模型对照组比较有显著差异(P<0.05);假手术组大鼠骨钙含量与模型对照组比较有显著差差异(P<0.01),阳性对照组和所述组合物低、中,高剂量组大鼠骨钙含量与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。依据《保健食品功能学评价程序和检验方法》中判定标准,可认为所述组合物有增加大鼠骨密度的作用。
Claims (7)
1、一种含有大豆异黄酮的组合物,其特征在于所述组合物主要成份包含大豆异黄酮、珍珠粉和维生素D。
2、如权利要求1所述的含有大豆异黄酮的组合物,其特征在于包含如下重量含量的组分:
大豆异黄酮 40~50份;
珍珠粉 50~60份;
维生素D 0.01~0.10份。
3、如权利要求2所述的含有大豆异黄酮的组合物,其特征在于所述药物组合物由如下重量含量的组分组成:
大豆异黄酮 44~46份;
珍珠粉 54~56份;
维生素D 0.04~0.06份。
4、如权利要求1所述的含有大豆异黄酮的组合物,其特征在于所述的组合物为胶囊剂的内容物,所述的内容物还包含人体可接受的药用辅料。
5、如权利要求4所述的含有大豆异黄酮的组合物,其特征在于所述的药用辅料为硬脂酸镁,用量为4~6份。
6、如权利要求5所述的含有大豆异黄酮的组合物,,其特征在于所述胶囊的内容物由如下重量含量的组分组成:
大豆异黄酮 44.2%;
珍珠粉 55.3%;
维生素D 0.05%;
硬脂酸镁 0.45%。
7、如权利要求1~6所述的含有大豆异黄酮的组合物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2005100492948A CN1679634A (zh) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | 一种含有大豆异黄酮的组合物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2005100492948A CN1679634A (zh) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | 一种含有大豆异黄酮的组合物及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1679634A true CN1679634A (zh) | 2005-10-12 |
Family
ID=35066640
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2005100492948A Pending CN1679634A (zh) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | 一种含有大豆异黄酮的组合物及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1679634A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100398012C (zh) * | 2006-03-31 | 2008-07-02 | 杨长辉 | 一种抗氧化和改善睡眠的保健食品 |
CN110897152A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-03-24 | 安徽萨普丽生物医药有限公司 | 增加骨密度的组合物、胶囊及其制备方法 |
-
2005
- 2005-01-31 CN CNA2005100492948A patent/CN1679634A/zh active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100398012C (zh) * | 2006-03-31 | 2008-07-02 | 杨长辉 | 一种抗氧化和改善睡眠的保健食品 |
CN110897152A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-03-24 | 安徽萨普丽生物医药有限公司 | 增加骨密度的组合物、胶囊及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1887101A (zh) | 一种减肥茶及其制备方法 | |
CN1646093A (zh) | 治疗炎症和与aids关联的神经紊乱的方法和组合物 | |
CN1420777A (zh) | 用于治疗代谢性骨疾病的药物组合物及其制备方法 | |
CN1876139A (zh) | 治疗小儿厌食症的药物制剂及其制备方法和质量控制方法 | |
CN1857642A (zh) | 一种解郁安神制剂的质量控制方法 | |
CN1920049A (zh) | 小分子生物活性肽及其制法、组合物和应用 | |
CN1383426A (zh) | 肥胖抑制材料 | |
CN1883527A (zh) | 一种灵芝保健品及其制备方法 | |
CN1679634A (zh) | 一种含有大豆异黄酮的组合物及其应用 | |
CN1476830A (zh) | 茶多酚软胶囊及其制备工艺 | |
CN1420782A (zh) | 新型免疫增强组合物 | |
CN1167459C (zh) | 具有降血脂、延缓衰老功能的营养保健食品及其制备方法 | |
CN1957956A (zh) | 一种具抗肿瘤和免疫调节作用的多菌组合物及其制备方法与用途 | |
CN1850146A (zh) | 猴耳环提取物的新用途 | |
CN1240647A (zh) | L-苏糖酸钙预防、抑制和治疗骨质疏松和佝偻病的用途 | |
CN1231255C (zh) | 以南瓜为主要原料制备的治疗便秘的胶囊配方及配制方法 | |
CN1240297C (zh) | 肽奶及其制备工艺 | |
CN1048879C (zh) | 一种治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物及其制备方法 | |
Hessein et al. | Aflatoxin B 1 toxicity and its reduction by using coumarine and vitamin E in Nile tilapia | |
CN1240414C (zh) | 提高女性卵巢功能的中成药及其制作方法以及在制药中的应用 | |
CN109805390A (zh) | 一种神经酸钙、神经酸锌及维生素k2复合物软胶囊 | |
CN1102061C (zh) | 红豆杉甘露茶 | |
CN1517026A (zh) | 一种具有调节血压作用的奶粉-压乐奶粉 | |
CN1190394C (zh) | 菠萝叶提取物及其制备方法和用途 | |
CN1257736C (zh) | 一种预防化学性肝损伤的解酒护肝药物组合物及制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |