CN1674889A - 黄酮类化合物对gabaa受体疗效预报方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了采用GABA比率作为预报黄酮类化合物的体内特性，和应用5，7－dihydroxy－6－methoxyflavone或在适当生理盐中的有效成分来治疗BDZ－S联系综合症的方法。

Description

黄酮类化合物对GABAA受体疗效预报方法及其应用
技术领域
本发明涉及黄酮类化合物对GABAA受体疗效预报方法及其应用。
背景技术
某些黄酮类化合物，如5，7-dihydroxyflavone(亦称chrysin)和若干chrysin衍生物可跟GABAA受体上苯二氮卓位址(BDZ-S)结合，对中枢神经系统(CNS)的影响包括抗惊厥及抗焦虑(美国专利编號5,756,538，Cassels et al.(1998))。此外，Scutellaria baicalensis Georgi(中文俗称黄芩，日文为Ougon)是用于治疗焦虑症的传统中草药，内含chrysin和其他天然黄酮类化合物。
可是，黄酮类化合物对BDZ-S的结合亲和力变化很广，而少数带有亲和力的化合物能比得上普遍用作BDZ-S标准的处方苯二氮卓(BDZ)抗焦虑药。因此，尽管它们对CNS具潜在性疗效，但仍没被广泛地应用。
发明内容
本发明的基础是基于黄酮类化合物的GABA比率与其对GABAA受体疗效之间的密切关系的鉴定。GABA比率大过一可被预测为具激动特性，比率接近一则具拮抗特性，而少于一为带有反激动特性。估计部分激动药和部分反激动药的GABA比率分别地介乎激动药和拮抗药之間与及拮抗药和反激动药之間。
这关系鉴定可扩展至CNS活性黄酮的潜在性疗效，过往有报导从BDZ-S抗焦虑激动药/部分激动药到其他GABAA受体拮抗药、部分反激动药和反激动药的效用。例如因某些部分激动药已被报道为认知增效剂，可应用于治疗各种痴呆症、昏迷、睡眠失调和一些神经及精神失调，拮抗药亦有治疗那些失调症的可能性。
应用此处所描述的方法显示出5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)带有GABAA受体上苯二氮卓位址拮抗药类似的功能(见例一)，不但能阻塞苯二氮卓的效用，还可以舒缓小鼠肝性脑病的症状。依它为一GABA拮抗药，K7能有望作临床治疗如各种痴呆症、昏迷和睡眠失调症。一般而言，K7能适用于因GABA能系统(GABAergic system)不平衡而引起的状况，尤其是GABA多动症。K7的GABAA拮抗性还可用于其他研究上。
本发明采用了一套方法，能识别具预防及治疗BDZ-S联系综合症的黄酮，包括透过对大量黄酮类化合物进行分析和GABA比率测定，并依据预测GABAA受体疗效分类及对BDZ-S联系综合症相配，从而鉴定出适当具疗效的黄酮类化合物。被挑选的黄酮可以是激动药、部分激动药、拮抗药、部分反激动药和反激动药，而可作挑选的BDZ-S联系综合症症状有焦虑、惊厥、痴呆症、昏迷、睡眠失调和肝性脑病等。
本发明还为着研创一种能预防及治疗BDZ-S联系综合症的方法，其症状有焦虑、惊厥、痴呆症、昏迷、睡眠失调和肝性脑病等。給病者服用含5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)成分或于适当生理盐中的有效无毒剂量，服用时可以单剂分或单剂多份或多剂多份給药。
本发明采用了5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)来研制可预防或治疗如痴呆症、昏迷、睡眠失调或肝性脑等病的药剂。药剂会以一瓶或多瓶化合物包装，并内附使用说明书。
本发明把分离5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)的方法研制出来，采用溶剂从靶植物中提取化合物，将提取物过滤、浓缩和净化，接着是鉴定及收集含K7成分的分馏物，进行浓缩后结晶。
本发明亦针对以上述的方法配制的产物。产物会包装成一瓶或多瓶的合适药剂，并内附产物说明书，阐明如何服用能有效预防或治疗痴呆症、昏迷、睡眠失调或肝性脑。
附图说明
图1是表示K7处理小鼠于四孔板实验(hole-board test)行为模型的评估结果的条状图，它把不同剂量的K7(15、30、60mg/kg)和安定(diazepam，3mg/kg)，或对照组(10％dimethylsulfoxide，DMSO)同时以腹腔注射入小鼠，比较它们探头和后腿直立的次数。经多样本均值推论(One-way ANOVA)分析后选用Dunnettt检验，数据以均数±标准差表示，*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001显示实验组跟对照组有显著差异。
图2是表示K7的抗焦虑作用的条状图，它采用小鼠高架十字迷宫(elevated plus-maze)行为模型，把不同剂量的K7(3.25、7.5、15、30、60mg/kg)、安定(1mg/kg)，或对照组(水，pH7.4)分别以腹腔注射入小鼠，把其进入开放臂次数和停留时间百分比跟进入封闭臂次数作比较。数据以均数±标准差表示，与对照组比较的P值为*P＜0.05、**P＜0.001。
图3是表示K7预处理在小鼠高架十字迷宫行为模型中的拮抗作用的条状图，它把不同剂量的K7(7.5、15、30、60mg/kg)、安定(1mg/kg)，或对照组(10％DMSO)同时以腹腔注射入小鼠，把其进入开放臂次数和停留时间百分比跟进入封闭臂次数作比较。数据以均数±标准差表示，与对照组比较的P值为*P＜0.05、**P＜0.001。
图4是表示K7预处理令安定的抗焦虑作用废止的条状图，它采用小鼠高架十字迷宫行为模型，把不同剂量的K7(15、30、60mg/kg)、安定(3mg/kg)，或对照组(10％DMSO)同时以腹腔注射入小鼠，把其进入开放臂次数和停留时间百分比跟进入封闭臂次数作比较。数据以均数±标准差表示，与对照组比较的P值为*P＜0.01、**P＜0.001。
图5是表示小鼠于水平金属线实验(horizontal wire test)行为模型的表现的条状图，即其抓紧线的百分率。把不同剂量的K7(3.25、7.5、15、30、60mg/kg)、安定(1mg/kg)，或对照组(水，pH7.4)分别以腹腔注射入小鼠。括弧内是每组小鼠的数目。
图6是表示K7预处理使安定诱导的肌肉松弛反向的条状图，它采用horizontal wire test行为模型，比较小鼠抓紧线的百分率。把不同剂量的K7(15、30、60mg/kg)、安定(3mg/kg)，或对照组(10％DMSO)同时以腹腔注射入小鼠。括弧内每组小鼠均以X2test及P值*P＜0.05、**P＜0.001与对照组作比较。
图7是表示TAA或对照组处理小鼠运动活性(locomotor activities)的评估A-D的条状图。图7A显示给小鼠腹腔注射首剂TAA(500mg/kg)或對照組(盐水)后的运动活性测试，数据以均数±标准差表示。图7B显示给小鼠腹腔注射第二剂TAA(500mg/kg)或对照组(盐水)后的运动活性测试，经One-way ANOVA分析后选用Dunnett t检验，数据以均数±标准差表示，与对照组比较的P值为*P＜0.001。图7C显示给小鼠腹腔注射第三剂TAA(500mg/kg)或对照组(盐水)后的运动活性测试，经One-way ANOVA分析后选用Dunnett t检验，数据以均数±标准差表示，与对照组比较的P值为*P＜0.001。图7D显示给小鼠腹腔注射第三剂TAA(500mg/kg)或对照组(盐水)后两小时的运动活性测试，数据以均数±标准差表示。
图8A和图8B是表示TAA处理小鼠于第三天的运动活性评估的条状图。图8A显示TAA处理小鼠于第三天接受氟马西林(flumazenil)处理后的运动活性评估。小鼠腹腔注射第三剂TAA(500mg/kg)后两小时进行运动活性测试，在测试前十五分钟，再给小鼠腹腔注射flumazenil(10mg/kg)。数据以均数±标准差表示，选用pair t检验，与对照组比较的P值为*P＜0.05。图8B显示TAA处理小鼠于第三天接受K7处理后的运动活性评估。小鼠腹腔注射第三剂TAA(500mg/kg)后两小时进行运动活性测试，在测试前一小时，再给小鼠腹腔注射K7(60mg/kg)。数据以均数±标准差表示，选用pair t检验，与对照组比较的P值为*P＜0.01。
图9A表示diazepam在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9B表示flunitrazepam在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9C表示beta-CCB在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9D表示beta-CCM在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9E表示Ro15-4513在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9F表示Ro15-1788在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9G表示FG-7142在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9H表示5，7，2′-trihydroxy-6，8-dimethoxyflavone(K36)在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9I表示6，2′-dihydroxyflavone在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9J表示7，8，2′-trihydroxyflavone在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9K表示5，7-dihydroxy-8-methoxyflavone(K38)在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9L表示2′-hydroxyflavone在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
图9M表示5，7-dihydroxy-8-methoxyflavone(Wogonin)(汉黄芩素)在加入/缺乏1μM GABA后的剂量反应曲线。
图9N表示5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)在加入/缺乏10μMGABA后的剂量反应曲线。
图9O表示2′-hydroxy-β-naphthoflavone在加入/缺乏10μM GABA后的剂量反应曲线。
具体实施方式
以下的分别具体说明，将使本发明的目的、特征及优点更为显而易见。
本发明的一部分是基于黄酮类化合物的GABA比率与其对GABAA受体疗效密切关系的鉴定。GABA比率大过一可被预测为具激动特性，比率接近一则具拮抗特性，而少于一为带有反激动特性。估计部分激动药和部分反激动药的GABA比率分别地介乎激动药和拮抗药之間与及拮抗药和反激动药之間。
这种关系鉴定可扩展至CNS活性黄酮的潜在性疗效，过往有报导从BDZ-S抗焦虑激动药/部分激动药到其他GABAA受体拮抗药、部分反激动药和反激动药的效用。例如因某些部分激动药已被报道为认知增效剂，可应用于治疗各种痴呆症、昏迷、睡眠失调和一些神经及精神失调，拮抗药亦有治疗那些失调症的可能性。
采用GABA shift实验把受试化合物的体外(in vitro)特性和体内(invivo)作用相互关联。是项研究证明了黄酮类激动药在加入GABA之后能增加与BDZ受体的结合亲和力，拮抗药则没有显著的增强，而反激动药跟激动药的反应是彼此相反的(见图九A-O)。
试验黄酮类跟BDZ受体的结合亲和力，计算其IC50和Ki值。要测定某一黄酮的GABA比率，把黄酮在缺乏GABA情况下的IC50除以加入10μM GABA后的IC50。术语结合“亲和力”在此处意指配体与受体的结合强度。
测定黄酮类化合物的GABA比率能预报其对GABAA受体的效能。术语受体“效能”在此处意指配体结合对受体产生的效果，如激动或拮抗效能。像GABA比率大过一可被预测为具激动效能，比率接近一则具拮抗效能，而少于一为带有反激动效能。估计部分激动药和部分反激动药的GABA比率分别地介乎激动药和拮抗药之間与及拮抗药和反激动药之間。利用这预测方法能识别具预防及治疗BDZ-S联系综合症的黄酮，如某一黄酮GABA比率测定为接近一，它将被预测为具拮抗效能，可用于预防及治疗各种痴呆症、昏迷、睡眠失调、肝性脑和一些神经及精神失调症，而显示其他受体效能的黄酮类化合物在治疗其他BDZ-S联系综合症状方面(如焦虑和惊厥)很有用。
此项研究显示5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)的GABA比率是接近1，与它在in vivo中的拮抗性表现一致。专利申请案AttorneyDocket No.3053.1002-000内，GABA比率大过一的黄酮类化合物如5，7，2′-trihydroxy-6，8-dimethoxyflavone(K36)在in vivo中显示其激动特性。因此，GABA比率可用于预报黄酮类化合物的in vivo特性，具激动、部分激动、拮抗、部分反激动和反激动的候选黄酮会被鉴定作进一步研究。
术语“黄酮”或“黄酮类化合物”在此处意指任何带有以下一般结构的化合物。黄酮类化合物中，任何未被氧原子占领的位置都可被各样地取代。
                   一般结构
表1提供了若干黄酮类化合物及它们的各自的IC50值和Ki值。
                        表1  挑选的类黄酮的IC50和Ki值
化合物                     名称       [3H]-氟硝安定的抑制(μM)
    IC50     Ki
  1    5，7，2′-三羟基-6，8-二甲氧基黄酮(K36)(5，7，2′-trihydroxy-6，8-dimethoxyflavone)     0.0015     0.0011
  2    5，7，2′-三羟基-6-甲氧基黄酮(K38)(5，7，2′-trihydroxy-6-methoxyflavone)     0.0096     0.0076
  3    6，2′-二羟基黄酮(6，2′-dihydroxyflavone)     0.017     0.013
  4    2′-羟基-β-黄酮(2′-hydroxy-β-naphthoflavone)     0.055     0.044
  5    2′-羟基黄酮(2′-hydroxyflavone)     0.19     0.15
  6    5，7-二羟基-6，8-二甲氧基黄酮(5，7-dihydroxy-6，8-dimethoxyflavone)     0.36     0.29
  7    5，7-二羟基-6-甲氧基黄酮(K7)(5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone)     1.61     1.28
  8    5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮(汉黄芩素)(5，7-dihydroxy-8-methoxyflavone)     2.76     2.19
  9    黄酮(flavone)     6.86     5.44
  10    5，6，7-三羟基黄酮(黄芩素)(5，6，7-trihydroxyflavone)     10.11     8.03
  11    6-羟基-2′-甲氧基黄酮(6-hydroxy-2′-methoxyflavone)     14.51     11.52
  12    2′-甲氧基黄酮(2′-methoxyflavone)     15.13     12.01
  13    5，7，2′-三羟基黄酮(5，7，2′-trihydroxyflavone)     0.14     0.11
  14    7，2′-二羟基黄酮(7，2′-dihydroxyflavone)     1.02     0.81
  15    5，7-二羟基黄酮(5，7-dihydroxyflavone)     1.16     0.92
  16    6-羟基黄酮(6-hydroxyflavone)     4.79     3.80
  17    7-羟基黄酮(7-hydroxyflavone)     7.61     6.04
剂量抑制曲线由九到十二种药浓度产生。采用Sprague-Dawley大鼠(大约250g)大脑所提取的突触膜皮蛋白(synaptosomal membraneprotein)，不同化合物的IC50值可从[3H]-flunitrazepam换置结合法估算。Ki值则根据方程式：Ki＝IC50/[1+(3H)/Kd]计算，[3H]代表[3H]-flunitrazepam浓度(1nM)，而Kd代表具高亲和力结合位点的[3H]-flunitrazepam分解常数(3.86nM)。
                    表2  测试黄酮类的GABA比率
 化合物                     名称  GABA比率
   1     5，7，2′-三羟基-6，8-二甲氧基黄酮(K36)    1.20
   2     5，7，2′-三羟基-6-甲氧基黄酮(K38)    1.27
   3     6，2′-二羟基黄酮    0.89
   4     2′-羟基-β-黄酮    1.06
   5     2′-羟基黄酮    1.17
   6     5，7-二羟基-6，8-二甲氧基黄酮    N/A
   7     5，7-二羟基-6-甲氧基黄酮(K7)    1.09
   8     5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮(Wogonin)    1.03
   9     黄酮    1.05*
   10     5，7，2′-三羟基黄酮    0.90
   11     7，2′-二羟基黄酮    0.99
   12     5，7-二羟基黄酮    0.90*
   13     6-羟基黄酮    0.90
   14     7-羟基黄酮    1.14*
加*记号的GABA比率引用了Dekermendjian K.，et al文章内的数据。IC50值会随着使用不同放射配体而改变，因此这里所得的IC50值只用作计算各测试黄酮的GABA比率。(Dekermendjian K.，et al(1999)“Structure-activity relationships and molecular modeling analysisof flavonoids binding to the benzodiazepine site of the rat brain GABA(A)receptor complex.”J Med Chem 42(21)：4343-4350.)
如此，将某一黄酮于缺乏GABA情况下的IC50除以加入10MGABA后的IC50，计算其GABA比率，IC50可使用不同放射配体计算，例如[3H]-Ro15-1788。
黄酮类化合物可用于预防及治疗各种BDZ-S受体联系的CNS疾病。术语“BDZ-S联系综合症”在此处意指GABAA受体上BDZ-S结合状态调制对哺乳动物CNS的影响，症状包括焦虑与惊厥、各种痴呆症、昏迷、睡眠失调、肝性脑和一些神经及精神失调症。
显示拮抗特性的黄酮类化合物可用于预防及治疗痴呆症、昏迷、睡眠失调和肝性脑。应用此处所描述的方法显示出5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)带有GABAA受体上BDZ-S拮抗功能(见例一)，不但能阻塞BDZ的效用，还可以舒缓小鼠肝性脑病的症状。依它为一GABA拮抗药，K7能有望作临床治疗如各种痴呆症、昏迷和睡眠失调症。一般而言，K7能适用于因GABA能系统不平衡而引起的状况，尤其是GABA多动症。K7的GABAA拮抗性还可用于其他研究上。
基于例二中in vivo研究结果，K7或其活性代谢物显示了跟BDZ-S拮抗药flumazenil同样有效能使肝性脑病(HE)小鼠运动活性不足(HE主要症状)反向。
大致上，黄酮类化合物能以有效无毒剂量给予BDZ-S联系综合症病人。虽然给药途径有口服、直肠、吸入、阴道和非肠胃给药等，口服给药仍是首选。
术语“有效无毒剂量”在此处意指具疗效的化合物量，或是以其作为生理或制药成分的效量。不但没有中毒副作用，更可同时治疗痴呆症、昏迷、睡眠失调、肝性脑病和一些神经及精神失调症。有效无毒剂量会受病者的大小和年龄与及病情而改变，对这些因素的研究有助决定给药时剂量。
这些化合物可单独服用或与各种生理或制药合适的成分混合。片语“生理或制药合适的”在此处意指化合物本身、其成分或剂量形式均适合作药用。
本发明中的化合物以游离或盐型存在，能增加可溶性的盐型就更为理想，而生理或制药合适的盐类及其配制方法已是众所周知的了。适合制药的包括传统无毒盐类如钠、钙、镁或季铵盐化合物，都由无机或有机酸碱组成。
本发明并叙述了构成制药或生理成分的化合物效量及其载体或赋形剂。一般使用的载体有盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它们的混和物，当中可加进微量的润湿剂、乳化剂或pH缓冲液，组成液体溶液、悬浮剂、乳剂、药片、胶囊、药丸、缓释制剂或粉剂，更可与传统稠合剂及载体(如三酸甘油脂)制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，例如药用甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁和其他类似物质。药用载体可以是固体或液体。
代表性固体载体有乳糖、纯白生石膏、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、树胶、硬脂酸镁、硬脂酸和类似物，当中可加进其他物质作为调味剂、润滑剂、溶解剂、悬浮剂、塡充剂、助流剂、压锭辅助剂、稠合剂或药片崩解剂，更可作为胶囊密封剂。于粉剂中，细颗粒固体载体与细颗粒活性成分混和。而在药片中，化合物与具有压锭性质的载体以适当比例混和，且压缩成理想的形状和大小。
代表性液体载体有糖浆、花生油、橄榄油、水和类似物，用作调配溶液、悬浮剂、乳剂、锭剂或药糖块。化合物可溶解或悬浮于药用液体载体中，例如水、有机溶剂、它们的混和物或药用油脂当中可加进其他添加剂如溶解剂、乳剂、缓冲液、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、色素、粘滞调整剂和稳定剂。
药物能以不同的剂形配制。如应用固体载体，药物可调配成药片、以粉状或小丸放进硬明胶胶囊或制成口含锭。如使用液体载体的话，药物可调配成糖浆、乳剂或软明胶胶囊。
化合物会以标准药用包装供给，并附有使用药物与预防及治疗惊厥或焦虑说明书。
本发明提供了从植物中提取高纯度黄酮类化合物的有效方法，方法是从药草Scutellaria baicalensis Georgi根部，而其他部分或其他含此化合物的植物亦可使用此提取程序。
                         表3
    黄芩属类植物
    黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)
    S.amonea C.H.Wright
    S.barbata D.Don(S.rivularis Wall)
    S.hypericifolia Levl.
    S.indica L.
    S.likiangensis Diels
    S.planipes
    S.rehderiana Diels.
    S.strigillosa Hemsl.
    S.tenax W.W.Smith var.patentipilosa
    S.viscidula Bunge
    Sorbaria sorbifolia
    Tetracera indica
先把药草用压碎、磨碎或其他方法变成粉状，采用氯化溶剂(如二氯甲烷、氯仿)或醇类(如甲醇、乙醇或正丁醇)进行提取。乙醚、丙酮、乙醛醋酸盐和其他溶剂均适合用于本项发明中的方法，而提取次数亦不限。
提取过程可于指定的温度与压力下进行，例如25℃和1大气压力，但其他温度和压力亦可。在个别情况下，提取会以溶剂沸腾点进行。提取物可用任何合适的方法过滤，包括使用过滤纸。继而用任何合适的方法将提取物浓缩，如利用蒸发器。
把提取物溶于溶剂中，例如乙醇，并置于室温一段合适的时间，等候化合物结晶。
将结晶过滤，再用合适的溶剂(如乙醇)洗涤。
其他制造化合物的方法，如超临界流体如CO2，亦可纳入本发明的范围之内。
此处所述的方法能获得高纯度产物，纯度一般介乎90到99％，平均为95％。预计提取量大约为5-10mg/kg Scutellaria baicalensis Georgi根部。
本发明中的黄酮类化合物能以已知的化学程序合成。合成黄酮类化合物的方法请参考下列文献：
1.Lim，S.S et al.，“Synthesis of flavonoids and their effects on aldosereductase and sorbitol accumulation in streptozotocin-induced diabetic rattissues.”Journal of Pharmacy & Pharmacology.53(5)：653-68，2001；
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4.Wolfman C.，et al.，“Pharmacological characterization of6-bromo-3’-mtroflavone，a synthetic flavonoid with high affinity for thebenzodiazepine receptors.”，Pharmacology，Biochemistry & Behavior.61(3)：239-46，1998；
5.Brzozowski T.，et al.，“SU-840，a novel synthetic flavonoid derivativeof sophoradin，with potent gastroprotective and ulcer healing activity.”，Journal of Physiology & Pharmacology.49(1)：83-89，1998；
6.Kim Dekermendjian，et al.，“Structure-Activity Relationships andMolecular Modeling Analysis of Flavonoids Binding to theBenzodiazepine Site of the Rat Brain GABAA Receptor Complex”，Journal of Medicinal Chemistry.42(21)：4343-4350，1999；
7.Jackson，Kenneth A.，“Synthesis and Biological Activities ofFlavonoid Derivatives as A3 Adenosine Receptor Antagonists”，Journal ofMedicinal Chemistry.39(12)：2293-2301，1996.
另外，某些在发明中采用的黄酮类化合物于市面上有提供，例如：6，2′-dihydroxyflavone、2′-hydroxy-β-naphthoflavone、2′-hydroxyflavone、flavone、6-hydroxy-2′-methoxyflavone和2′-methoxyflavone是从IndofineChemical Company Inc.，Somerville，N.J.购买。而5，7，2′-trihydroxy-6，8-dimethoxyflavone(K36)、5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)、5，7-dihydroxy-6，8-dimethoxyflavone、5，7-dihydroxy-8-methoxyflavone(Wogonin)和5，6，7-trihydroxyflavone(Baicalein)则可应用此处所述的方法(见例三)于实验室内进行纯化，而以上及发明中的其他类黄酮都能从Scutellaria baicalensis Georgi和其他药草(列表三)分离。
另外，可应用此处所教授的方法或其他已知的技术来鉴定具预防及治疗BDZ-S联系综合症的化合物，分析不同化学结构的化合物，测定它们对BDZ-S的结合亲和力。那些化合物的结构可以是非常不同，又或是高度关联，而其来源可以是天然或化学合成。除采用IC50、Ki、GABA比率值测定或合并测试来鉴定个别化合物外，亦会应用其他测试结合亲和力的方法。因GABA比率能预报黄酮类化合物的体内特性(即激动、部分激动、拮抗、部分反激动和反激动特性)，所以可作为量度化合物BDZ-S亲和力的方法，其数值会与疗效配对，并作进一步的体内验证。
以下例子将进一步说明此发明，参考目录内会列出文中所引用的专利、专利申请和参考标题。
                        例一
5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)拮抗作用的体内研究
雄性ICR小鼠(体重16-20克)由香港科技大学动物中心提供，将它们随机分组，四到五只小鼠一组，以常规饲养，水和食物任取，室光照12小时。实验进行时间由0830到1200。
四孔板实验(Hole-board test)
整个Hole-board装置为一60×60×30厘米木箱，地板铸有四个等距离小孔(3厘米直径)，并漆上白色。将小鼠个别地放于地板中间位置，计算它们五分钟内的探头和后腿直立次数(File and Pellow，1985)，每次测试后均会以纸巾擦干地板上小鼠走过的踪迹。探头和后腿直立次数的增加反映了探险活动的加强，相反地次数比对照组少则显示其镇静行为(Nolan and Parkes，1973；File and Wardill，1975；File and Pellow，1986)。
见表四，单次给予小鼠K7(3.25-60mg/kg)后一小时，探头和后腿直立次数并没有显著改变。明显地diazepam是一激动药，高剂量(3mg/kg)会引发镇静效果，减低小鼠探头和后腿直立的次数(图一)。K7预处理并不能使diazepam的镇静效果反向。
                               表四
服用不同剂量5，7-二羟基-6-甲氧基黄酮(K7)的小鼠于四孔板实验的探察行为
 药量(mg/kg)     探头次数     后腿直立次数
 对照组DZ 1K7 3.25K7 7.5K7 15K7 30K7 60     20.23±3.3622.78±1.7722.58±3.6224.44±5.1419.50±3.1812.33±4.0919.30±3.27     26.00±2.9924.22±1.1522.08±4.4522.11±4.2120.63±4.2423.00±2.2826.00±3.37
给予K7(3.25、7.5、15、30、60mg/kg)、diazepam(DZ，1mg/kg)，或对照组(水，pH7.4)后，小鼠探头和后腿直立的次数。数据以均数±标准差表示。
高架十字迷宫(Elevated plus-maze)
迷宫以两副开放臂(25×10厘米)跟两副同等尺寸的封闭臂交叉组成，并附有20厘米高墙，所有臂均连接到中央平台(5×5厘米)，成一十字形。迷宫放于暗房内，离地40厘米。在完成hole-board test后，小鼠会被个别地置于平台中央，面向封闭臂，并记录小鼠于五分钟内进入开放臂和封闭臂的次数和停留时间。臂进入定义为全部四只脚爪均进入迷宫臂中。此方法可辩别导向性探险活动(探头和后腿直立)和运动活性(File and Wardill，1975)与及增加了迷宫的整体活动(Pellow，et al.，1985；Lister，1987)。臂进入次数可用作一般活动量具，选择性开放臂进入次数的增加显示了药物的抗焦虑效果(Pellow，et al.，1985；Lister，1975)。
口服K7(3.25-60mg/kg)后一小时，进入开放臂和封闭臂的次数和停留时间均不没有显著改变(图二)。而给予1和3mg/kg剂量Diazepam的小鼠跟对照组比较，两组数据均有明显增加。如与K7(30和60mg/kg)一起给予，Diazepam诱导的抗焦虑反应会给废止，从进入开放臂的次数和停留时间降低便可得知(图三和四)。
水平金属线实验(Horizontal wire test)
先提起小鼠尾巴，让它用前爪抓紧金属线(1毫米直径，15厘米长和离地25厘米)，然后松手(Bonetti et al.，1982)。用药前，均会测试及评估每只小鼠能否用后肢成功抓紧金属线。肌肉松弛药会削弱小鼠抓紧金属线的能力，而肌肉松弛与镇静是有著密切关联的。
K7(3.25-60mg/kg)处理小鼠跟对照组比较，显示并没有削弱其抓紧线的能力(图五)。3mg/kg剂量Diazepam能引发肌肉松弛，这点可从用药后一小时小鼠抓紧线的成功百分率降低得知。如与K7一起给予，会使Diazepam诱导的肌肉松弛部分地反向，从其数据降低可知一二(图六)。
统计分析
每受试组的数据是以均数±标准差表示，经One-way ANOVA分析和采用Dunnett t检验对有显著成效结果作多组别比较。
从上述针对BDZ-S配体动物模型的结果，我们可以推断K7并不能诱导任何药理上的变化。但当与特定Diazepam剂量一起给予，便能分别引发抗焦虑和肌肉肉松弛作用，其药效与BDZ-S拮抗药类似。
                           例二
5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)对治疗肝性脑病的体内研究
肝性脑(Hepatic encephalopathy，HE)是一种复杂的神经精神综合症，跟急性和慢性肝功能损害有关联。HE病者会产生精神错乱、性格改变和识知能力减退、神经肌肉活动改变与及脑电图异常(Hoyumpa，A.M.，etal.，(1982)J Lab Clin Med 100：477-487；Zieve，L.(1985)Hepatology1：360-365)。虽已进行了大量的研究，但其精确机理尚待探索。还有，HE病者会呈现门体分流增加及多种代谢变化，引致体内生理平衡烦乱，令病者对镇静剂更敏感，如苯二氮和巴比妥酸盐(Sherlock，S.(1985)Oxford Blackwell Scientific Publications，7th Edition 99-116；Conn，H.O.et al.，(1978)Baltimore：Williams & Wilkins 1-419)。因γ-氨基丁酸(GABAA)受体结构物是哺乳动物的中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质系统，可通过其多聚体蛋白运作而产生不同的神经递质反应。
一些研究显示GABAA受体跟HE病有关，并发现GABA能活动的增加，是因通过激动性BDZ-S配体对苯二氮卓受体的斡旋(Basile，A.S.(1991)Synapse 7：141-150)。
经过动物模型对暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failures，FHF)的测试及激动性BDZ-S配体水平增加的报到，已经证明给予BDZ-S拮抗药和部分反激动药均能短暂改善啮齿动物与兔子的HE症状(Gammal S.H.，et al.(1990)Hepatology 11：371-378；Burke，D.A.，et al.，(1998)Lancet2：505-506；Meier，R.，et al.(1998)Eur J Anaesthesiol Suppl 2：139-146；Bassett，M.J.，et al.(1987)Gastroenterology 93：1069-1077)。
虽然flumazenil对HE具一定的治疗成效，亦是唯一处方临床用的BDZ-S拮抗药，但长期使用会引致焦慮/抗焦慮反应。Flumazenil于大鼠特定重组BDZ-S次类型显示了本身的活动，因此纯拮抗药的发掘，不但对治疗HE且对BDZ-S药效基团的理解及BDZ-S配体的功效都很重要。
在BDZ-S配体的筛选中，Scutellaria baicalensis Georgi显示了其BDZ-S亲和力。将具BDZ-S互为作用化合物分离，可助识别带有不同亲和力的黄酮类衍生物。并测定它们的GABA比率值，当中5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)的GABA比率值是1.09，跟BDZ-S部分反激动药和拮抗药接近。
采用elevated plus-maze、hole-board test和horizontal wire test等动物模型，进行K7药理作用的研究，结果显示K7跟BDZ-S拮抗药相类似，能选择性地废止Diazepam诱导的抗焦虑和肌肉松弛作用。因BDZ-S拮抗药能应用于HE治疗上，诱过使用thioacetamide(TAA，硫代乙川胺)-诱导HE小鼠可对K7的潜在性疗效作更深入的探索。
方法
ICR小鼠(体重22-25克)由香港科技大学动物中心提供，将它们随机分为四组。连续三天给小鼠腹腔注射TAA(500mg/kg in 10ml/kg盐水)使诱发FHF，而对照组小鼠亦给予同等容量的赋形剂。首剂TAA注射后12小时，再给予TAA处理动物皮下注射5％葡萄糖/0.45％氯化钠/20mEq/L氯化钾。每次TAA注射后，监督小鼠的运动活性。当注射第三剂TAA后，分别给予小鼠flumazenil、K7或赋形剂，研究它们对缓和运动活性不足的成效。
结果
从第一天到第三天，TAA处理小鼠的运动活性数目不断下降，与运动活性数目没有改变的对照组有着显著的差异(图七A-D)。
于第三天，选用paired t-test比较各组小鼠在第三剂TAA处理后两小时，给予flumazenil(10mg/kg)或K7(60mg/kg)前和后的运动活性数目。Flumazenil作为BDZ-S拮抗药能使HE小鼠的运动活性不足现象逆转(图八A)。另外，K7处理小鼠的运动活性不足现象亦有显著改善。
摘要
从以上结果，我们得知K7能逆转HE小鼠运动活性不足现象(HE主要症状)，其作用跟BDZ-S拮抗药flumazenil一样。但是，要应用于结合治疗HE上，其疗效、最佳给药方式和长期服用反应仍有待研究。
                      例三
5，7，2′-Trihydroxy-6，8-dimethoxyflavone(K36)的配制
将2kg黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)根部磨成粉状，于室温下用二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)分别提取三次，每次5L。提取物用Whatman No.1过滤纸过滤，把残渣用5L甲醇(Methanol，CH3OH)提取三次，而过滤后提取物会采用60℃蒸发器浓缩，然后经过硅胶柱子(Merck，Silica gel，70-230mesh，80g)，分别以1.5L 20∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1和1∶1己烷/丙酮混合液接连地洗涤。经TLC(Merck，Silica gel 60)制导分析，可把所收集到的馏出物分为十五份，每份约100ml。经苯二氮卓受体(BDZ-R)测试，馏出物份十到十二显示出结合活动。把份十和十一聚合，经过100g硅胶柱子，以1.0L DCM和氯仿(Chloroform)洗涤，馏出物(每份20ml)分成五十份。然后把馏出物份三十六到三十八聚合，用甲醇结晶，取得10mg 5，7，2′-trihydroxy-6，8-dimethoxyflavone。纯化后，以电离子质谱(EI-mass)和核磁共振技术(1H-NMR，400Hz)分析其结构如下：
而其物理与化学性规格如下：
化学公式：5，7，2′-trihydroxy-6，8-dimethoxyflavone
物理形态：甲醇结晶呈黄针状，熔点262～263℃，加入镁(Mg)和监酸(HCL)
后呈橙黄色
图谱：
MS m/e 330(M+).Anal.Calcd.C17H14O7：C，61.82；H，4.27.Found：C，61.70；H，4.38.UVλmaxnm(log∈)：(MeOH)275(4.14)，336(4.18).IR(KBr)vmaxcm-1：3456(OH)，1658(conjugated CO)，1610，1578(arom.C＝C).
1H-NMR(DMSO-d6)：3.77(3H，s，6-OCH3)，3.84(3H，s，8-OCH3)，7.04(1H，br t，J＝8.0Hz，4′-H)，7.06(1H，s，3-H)，7.07(1H，br d，J＝8.0Hz，3′-H)，7.42(1H，dt，J＝1.5，8.0Hz，5′-H)，7.86(1H，dd，J＝1.5，8.0Hz，6′-H)，12.74(1H，s，5-OH).
13C-NMR(DMSO-d6)：161.2(C-2)，108.6(C-3)，182.4(C-4)，148.2(C-5)，131.4(C-6)，151.0(C-7)，127.9(C-8)，145.6(C-9)，103.0(C-10)，117.4(C-1′)，156.8(C-2′)，117.1(C-3′)，132.9(C-4′)，119.6(C-5′)，128.2(C-6′)，61.2(C-6-OCH3)，60.2(C-8-OCH3).
                              例四
应用超临界流体提取(Supercritical Fluid Extraction，SFE)方法配制
5，7，2′-Trihydroxy-6，8-dimethoxyflavone
把100克粉状样品装进1000ml样品筒内，分别用100ml、200ml和300ml甲醇或70％乙醇与及2000ml液体二氧化碳作为提取溶剂，提取温度分别为40、50、60和70℃。高压下(200、300和400bar)的液体二氧化碳会流入样品筒内，当压力达200、300和400bar，提取器的排气口活门会即时小心地打开，将可溶解的馏出物用装有1000ml甲醇的容器收集。提取过程达十到十五分钟，并重覆三次，采用减压蒸发法获得粗糙提取物，再经过硅胶柱子和氯仿/甲醇洗涤。
浓缩后提取物会经硅胶柱子(Merck，New Jersey，Silica gel 60)分别以1.5L 20∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1和1∶1己烷/丙酮混合液接连地洗涤。经TLC(Merck，Silica gel 60)制导分析，可把所收集到的馏出物分为十五份，每份约100ml。经苯二氮卓受体(BDZ-R)测试，馏出物份十到十二显示出结合活动。把份十和十一聚合，经过100g硅胶柱子，以1.0L DCM和氯仿(Chloroform)洗涤，馏出物(每份20ml)分成五十份。然后把馏出物份三十六到三十八聚合，用甲醇结晶，取得10mg5，7，2′-trihydroxy-6，8-dimethoxyflavone(K36)。
本发明已连同参考资料详细地说明和描述了所推荐的实例，其形式及细节可能会有所改变，但不会脱离本发明的范畴(见所附权利要求)。

Claims (15)

1.一套能识别具预防及治疗BDZ-S联系综合症的黄酮的方法，这种方法包括下列步骤：
-对大量黄酮类化合物进行分析和测定每黄酮类成员的GABA比率
-依据所预报GABAA受体疗效将黄酮类化合物分类
-把预报GABAA受体疗效与BDZ-S联系综合症相配，从而鉴定出适当具疗效的黄酮类化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，被挑选的黄酮可以是激动药、部分激动药、拮抗药、部分反激动药和反激动药。
3.如权利要求2所述的方法，被挑选的BDZ-S联系综合症症状为焦虑、惊厥、痴呆症、昏迷、睡眠失调和肝性脑病。
4.一种能预防及治疗BDZ-S联系综合症的方法，其特征在于，給患者服用含5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone(K7)成分或于适当生理盐中的有效无毒剂量。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的综合症是肝性脑病。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，給药时是以单剂份服用。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，給药时可以二剂份或多剂份服用。
8.一种治疗和预防肝性脑病的药剂，其特征在于，制备这种药剂应用了5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone化合物。
9.如权利要求8所述的药剂，其特征在于，可采用一瓶或多瓶化合物包装。
10.如权利要求9所述的包装的药剂，其特征在于，内附预防及治疗肝性脑病的使用说明书。
11.一种制备5，7-dihydroxy-6-methoxyflavone的方法，其特征在于，它包括下列步骤：
1.用溶剂从含此类化合物的植物中提取此类化合物；
2.过滤提取物；
3.浓缩提取物；
4.然后，纯化提取物；
5.鉴定及收集含此类化合物的馏出物份，将其浓缩结晶。
12.一种利用权利要求11中所述的方法所获得的产物。
13.一种在药剂配方中含有权利要求12中所述的产物的药剂。
14.一种药剂，其特征在于，在包装中含有一瓶或多瓶如权利要求13中所述的产物。
15.如权利要求14所述的包装，其特征在于，内附预防及治疗肝性脑病的药物的使用说明书。
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