CN1660302A - 藏红花球茎提取物及制备方法和应用 - Google Patents

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吴平
刘非燕
胡汛
莫肖蓉
陈云龙
刘晓月
潘杰
吴世华
蒋欣杭
王国强
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Abstract

本发明提供藏红花球茎提取物及制备方法，以及在制备抗肿瘤活性药物中的应用。本发明是从传统中药材藏红花(saffron，Crocus sativus L.)中提取药用部位——球茎，用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液或甲醇、乙醇等极性溶剂或水浸提，浸膏具有广谱抗肿瘤活性，体外抗肿瘤活性检测对六种不同类型的实体瘤或白血病均有强烈的抑制效应，半数致死率IC50基本在25－50ug/ml之间，其半数致死率IC50约25－50ug/ml，而对人的正常细胞的半数致死率IC50约250/ml，毒性较肿瘤细胞低5－10倍，因此与药用赋形剂组合，可在制备治疗抗肿瘤活性药物中应用。

Description

藏红花球茎提取物及制备方法和应用
技术领域
本发明属从天然药用植物中提取有效成分，尤其是从藏红花球茎中提取有效成分及制备方法，并在制备抗肿瘤活性药物中的应用。
背景技术
藏红花(saffron，Crocus sativus L.)为鸢尾科(Iridaceae)番红花属多年生草本植物，又名番红花，西红花，原产于西班牙、希腊、南欧各国以及伊朗等地，印度日本也有栽培，经印度传入我国西藏，因此在我国称为藏红花，目前在我国浙江、江苏、山东、北京等地也有栽培。自古以来，藏红花就作为药材、香料、染料在东西方广泛应用，其柱头强烈的活血化淤、散郁开结功效使其成为传统的妇科良药。由于其药用部位柱头的产量极低，采收耗时费力，在我国被列为珍稀名贵中药材。近年来，科学家发现藏红花柱头中的一些化学物质，如藏红花素、藏红花苦素、藏红花醛及藏红花酸具有明显的抗癌作用，可以从分子水平抑制原癌基因的启动及癌细胞DNA和RNA的合成，且对正常组织无明显的毒副作用，因此藏红花成为新型抗癌药物再次引起人们的重视，但其球茎中所含的生化成分和药用功能却一直被忽视。
发明内容
本发明的目的是从藏红花球茎中提取有效成分，本发明将藏红花(saffron，Crocus sativus L.)鲜球茎或冻干后球茎，用溶剂浸提，获得藏红花球茎提取物，浸提用溶剂选用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液或极性溶剂或水，极性溶剂常用乙醇、甲醇等。
本发明的另一个目的是将藏红花球茎提取物作为有效成分与药用赋形剂组合在制备抗肿瘤活性药物中的应用。抗肿瘤活性药物包括治疗白血病药物、治疗实体瘤药物，治疗实体瘤药物主要包括治疗肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺腺癌等药物。
本发明提供的含藏红花球茎提取物的药物，其制剂形式主要包括液体制剂和固体制剂。固体制剂包括颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或气雾剂。
本发明提供含藏红花球茎提取物的药物，制剂的给药形式主要包括口服给药或非肠道给药，优选口服给药。非肠道给药形式主要包括口含或喷雾。
本发明藏红花球茎浸提部份具有广谱抗肿瘤活性，在进行中药抗肿瘤药效的体外筛选过程中发现，藏红花球茎提取物对人的肝癌SMMC7721、宫颈癌HeLa、红白血病K562、乳腺癌BCAP37、乳腺癌MCF-7、肺腺癌SPC-A1等肿瘤细胞株系具有强烈的细胞毒活性，其半数致死率IC50约25-50ug/ml，而对人的正常细胞的半数致死率IC50约250/ml，毒性较肿瘤细胞低5-10倍，因此与药用敷料组合，可在制备治疗恶性肿瘤药物中应用。本发明有效利用了长期不被利用的藏红花球茎，开拓了藏红花的综合利用；为临床治疗恶性肿瘤提供有效治疗途径。本发明方法简便，制备成本低廉，具有实用价值。
附图说明
图1为不同浓度藏红花球茎提取物杀伤红白血病K562的显微照片图；
图2为流式细胞仪检测藏红花球茎提取物对红白血病K562的杀伤效果；
图3为藏红花球茎提取物抗红白血病K562的IC50图；
图4为不同浓度藏红花球茎提取物杀伤肝癌SMMC7721的显微照片图；
图5为流式细胞仪检测藏红花球茎提取物对肝癌SMMC7721的杀伤效果；
图6为藏红花球茎提取物抗肝癌SMMC7721的IC50图；
图7为不同浓度藏红花球茎提取物杀伤乳腺癌BCAP37的显微照片图；
图8为流式细胞仪检测藏红花球茎提取物对乳腺癌BCAP37杀伤效果；
图9为藏红花球茎提取物抗乳腺癌BCAP37的IC50图；
图10为不同浓度藏红花球茎提取物杀伤宫颈癌HeLa的显微照片图；
图11为流式细胞仪检测藏红花球茎提取物对宫颈癌HeLa的杀伤效果；
图12为藏红花球茎提取物抗宫颈癌HeLa的IC50图；
图13为不同浓度藏红花球茎提取物杀伤乳腺癌MCF-7的显微照片图；
图14为流式细胞仪检测藏红花球茎提取物对乳腺癌MCF-7的杀伤效果；
图15为藏红花球茎提取物抗乳腺癌MCF-7的IC50图；
图16为不同浓度藏红花球茎提取物杀伤肺腺癌SPC-A1的显微照片图；
图17为流式细胞仪检测藏红花球茎提取物对肺腺癌SPC-A1杀伤效果；
图18为藏红花球茎提取物抗肺腺癌SPC-A1的IC50图；
图19为藏红花球茎提取物杀伤正常人外周血淋巴细胞的显微照片图；
图20为藏红花球茎提取物对人正常和肿瘤细胞的抑制趋势图。
具体实施方式
本发明将结合具体实施例和附图作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1    藏红花球茎提取物的制备方法
取藏红花鲜球茎或冻干后的球茎，按重量比1∶10-30加入乙醇溶液浸提，浸提液浓缩后得浸膏，于-20℃冰箱保存备用。可用甲醇、丙醇、异丙醇、正丁醇溶液替换乙醇溶液浸提。
实施例2    藏红花球茎提取物的制备方法
取藏红花鲜球茎或冻干后的球茎，按重量比1∶10-30加入水溶液浸提，浸提液浓缩后得浸膏，将浸膏保存于-20℃冰箱备用。
实施例3    藏红花球茎提取物的制备方法
取藏红花鲜球茎或冻干后的球茎，按重量比1∶10-30加入Tris缓冲液，浸提液浓缩后得浸膏，将浸膏保存于-20℃冰箱备用。
实施例4    藏红花球茎提取物的制备方法(四步法)
参照实施例1的方法，取藏红花球茎，依次用石油醚、乙酸乙酯、乙醇(或甲醇)、水浸提，浸提液浓缩后得浸膏，将浸膏保存于-20℃冰箱备用。
实施例5    不同方法所得浸膏的抗肿瘤活性比较
将实施例1-4方法获得的浸提液，作抗肿瘤活性比较，结果参见表1。
                     表1不同提取方法所得浸膏的抗肿瘤活性比较
  浸提溶剂                        不同肿瘤株系及浸膏浓度(ug/ml)
      肝癌SMMC7721      乳腺癌Bcap-37        宫颈癌HeLa
0 25 50 250 0 25 50 250 0 25 50 250
  石油醚乙酸乙酯乙醇(或甲醇)水(四步法)水(一步法)Tris缓冲液 ------ ----+++ --+-+++ --+++++ ------ ----+++ --+-+++ --+++++ ------ ----+++ --+-+++ --+++++
从表1可以看出，依次用石油醚、乙酸乙酯、乙醇(或甲醇)、水四步法浸提所得浸膏中，只有乙醇(或甲醇)部份有抗肿瘤活性，其余部分无活性或活性很低；而用水或缓冲液直接浸提，其抗肿瘤活性更高。
实施例6    藏红花球茎提取物对红白血病K562的作用效应
方法：
1.株系及来源：共做六个肿瘤株系分别是红白血病K562，肝癌SMMC7721，乳腺癌BCAP37，宫颈癌HeLa，乳腺癌MCF-7，肺腺癌SPC-A1，来自于浙江大学肿瘤研究所，正常人外周血淋巴细胞来自浙江省血液中心捐赠者。
2.细胞培养：所有细胞均培养于RPMI 1640完全培养液，(SIGMA)，加10％体积的新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，100U/ml链霉素和100U/ml青霉素，选择对数生长期细胞，按200000个细胞/孔接种于六孔板中按浓度加入药物，置37℃，5％CO2培养箱中，培养48小时后用OlympusIX70万能显微镜(penguin 600CL CCD，Pixera)拍照记录，用FCM检测计数并检测死亡细胞％，实验分上午、下午及晚上重复三次。
3.取藏红花球茎Tris缓冲液提取物浸膏溶解在Tris缓冲液中，用培养液稀释成终浓度分别为0、5、10、25、50ug/ml。
4、细胞死亡率检测：流式细胞仪BD-FACS CALIBUR
结果：参见附图1、图2，图2中从左到右、从上到下依次代表药物浓度为0、5、10、25、50ug/ml及不加荧光染色剂的对照，从图中所列数据可以清楚地看到，随着药物浓度的增加，死亡细胞百分比急剧增加，分别是2.16％、1.64％、5.56％、32.79％、41.41％，不加荧光染色剂PI的对照为0.13％。重复三次的实验结果例于表2(另两次流式细胞仪检测图略)：
表2、不同浓度藏红花球茎提取物对红白血病K562的杀伤效果
        细胞计数(15秒FCM)                    死亡细胞％
药物浓度(ug/ml) 1次 2次 3次 平均 1次 2次 3次 平均
    05102550 1188311054684323782163 1195411078687123412149  1191411138689623792225  1191711090687023662179  2.151.605.4632.0141.25   2.161.645.5632.7941.41     2.151.635.5432.6841.07     2.151.625.5232.4941.24
以药物浓度(ug/ml)为横坐标，实际存活细胞百分率为纵坐标作图3，可知，藏红花球茎提取物对红白血病K562的半数致死浓度IC50约为50ug/ml，表明藏红花球茎提取物有很强的抗红白血病K562活性。
实施例7    藏红花球茎提取物对肝癌SMMC7721的作用效应
实验方法同实施例6，结果参见附图4、图5、图6和表3，结论：藏红花球茎提取物对肝癌SMMC7721的半数致死浓度IC5025-50ug/ml，表明藏红花球茎提取物有很强的抗肝癌SMMC7721活性。
表3、不同浓度藏红花球茎提取物对肝癌SMMC7721的杀伤效果
          细胞计数(15秒FCM)                   死亡细胞％
药物浓度(ug/ml) 1次 2次 3次 平均 1次 2次 3次 平均
    05102550  1370311363921025051965  1370011361920125081960  1369811358922625061913  1370011361921225061946  2.022.275.6132.6770.35     1.902.124.2438.1775.80     1.892.124.3036.7175.50     1.942.174.7235.8573.88
实施例8    藏红花球茎提取物对乳腺癌BCAP37的作用效应
实验方法同实施例6，结果参见附图7、图8、图9和表4，结论：藏红花球茎提取物对乳腺癌BCAP37的半数杀伤浓度IC5010-25ug/ml，表明藏红花球茎提取物有很强的抗乳腺癌BCAP37活性。
表4、不同浓度藏红花球茎提取物对乳腺癌BCAP37的杀伤效果
         细胞计数(15秒FCM)                  死亡细胞％
药物浓度(ug/ml) 1次 2次 3次 平均 1次 2次 3次 平均
    05102550 1830912768244719481119  1830812768244619471118  1830912767244719431118  1830912768244719461118   0.871.9144.8860.8976.22  0.841.8644.4963.9679.66  0.801.8345.0767.2481.42  0.841.8744.8164.0379.1
实施例9    藏红花球茎提取物对宫颈癌HeLa的作用效应
实验方法同实施例6，结果参见附图10、图11、图12和表5，结论：藏红花球茎提取物对宫颈癌HeLa的半数杀伤浓度IC5025-50ug/ml，表明藏红花球茎提取物有很强的抗宫颈癌HeLa活性。
表5、不同浓度藏红花球茎提取物对宫颈癌宫颈癌HeLa的杀伤效果
         细胞计数(30秒FCM)                死亡细胞％
药物浓度(ug/ml) 1次 2次 3次 平均 1次 2次 3次 平均
    05102550  12356103621174934795  12355103611175934794  12354103501172930798  12355103581175932796  0.493.6035.8434.5454.39  0.483.5234.7936.1958.89  0.493.5634.4735.0664.91  0.493.5635.0335.2659.40
实施例10    藏红花球茎提取物对乳腺癌MCF-7的作用效应
实验方法同实施例6，结果参见附图13、图14、图15和表6，结论：藏红花球茎提取物对乳腺癌MCF-7的半数杀伤浓度IC50约为25ug/ml，表明藏红花球茎提取物有很强的抗乳腺癌MCF-7活性。
表6、不同浓度松胞菌素D对乳腺癌MCF-7的杀伤效果
          细胞计数(30秒FCM)               死亡细胞％
药物浓度(ug/ml) 1次 2次 3次 平均 1次 2次 3次 平均
    05102550  1220611910802551782288  1220511905802351652289  1220011900800851632285  1220311905801951692287  14.9927.7928.5548.6772.24  14.5926.6827.0047.9171.91  14.4426.2726.6445.0771.86  14.6726.9127.4047.2272.00
实施例11    藏红花球茎提取物对肺腺癌SPC-A1的作用效应
实验方法同实施例6，结果参见附图16、图17、图18和表7，结论：藏红花球茎提取物对肺腺癌SPC-A1的半数杀伤浓度IC50约为50ug/ml，表明藏红花球茎提取物有很强的抗肺腺癌SPC-A1活性。
表7、不同浓度藏红花球茎提取物对肺腺癌SPC-A1的杀伤效果
          细胞计数(30秒FCM)                   死亡细胞％
药物浓度(ug/ml) 1次 2次 3次 平均 1次 2次 3次 平均
    05102550  4243841393921073205835  4242541390921573215830  4243341394921073105815  1414413797307024361942   0.662.2329.6423.5347.92   0.652.2130.3724.3148.15   0.632.1927.4921.8945.05  0.652.2129.1723.2447.04
实施例12    藏红花球茎提取物对正常人外周血淋巴细胞作用效应
实验方法同实施例6，结果参见附图19、图20，结论：藏红花球茎提取物对正常人外周血淋巴细胞的半数杀伤浓度IC50约为250ug/ml，表明藏红花球茎提取物对正常人外周血淋巴细胞的毒性较肿瘤细胞低5-10倍。
藏红花球茎提取物直接杀死人的不同肿瘤细胞株系的效果例于表8，证明其是一个很好的治疗恶性肿瘤的有效部位，可在制备抗肿瘤活性药物中应用。
表8藏红花球茎提取物直接杀死人的不同肿瘤细胞株系的效果
    肿瘤株系   半数致死浓度IC50(ug/ml)
    红白血病K562肝癌SMMC7721乳腺癌BCAP37宫颈癌HeLa乳腺MCF-7肺腺癌SPC-A1            5025-5010-2525-502550
无需再进一步详细阐述，类似的结果还有对急性髓系白血病NB4、急性髓系白血病M3型HL-60、急性髓系白血病单核型U937、急性髓系白血病慢粒型KU812、口腔鳞癌SK、前列腺癌DU145等不同肿瘤株系的抑制效果，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献：
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Claims (12)

1.藏红花球茎提取物，其特征是通过以下方法制备：以藏红花球茎为原料，用溶剂浸提，浸提液浓缩后得浸膏，-20℃冰箱保存。
2.根据权利要求1所述的藏红花球茎提取物的制备方法，其特征是选用藏红花鲜球茎或冻干后的藏红花球茎为原料。
3.根据权利要求1或2所述的藏红花球茎提取物的制备方法，其特征是浸提用溶剂选自极性溶剂或水或盐溶液中任一种。
4.藏红花球茎提取物，其特征是作为有效成分与药用赋形剂组合在制备抗肿瘤活性药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的藏红花球茎提取物在制备治疗白血病药物中的应用。
6.根据权利要求4所述的藏红花球茎提取物在制备治疗实体瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的藏红花球茎提取物在制备治疗肝癌药物中的应用。
8.根据权利要求6所述的藏红花球茎提取物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
9.根据权利要求6所述的藏红花球茎提取物在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
10.根据权利要求6所述的藏红花球茎提取物在制备治疗肺腺癌药物中的应用。
11.根据权利要求1-10任一所述的藏红花球茎提取物制备的药物，其特征是：制剂形式有液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或气雾剂。
12.根据权利要求1-10任一所述的藏红花球茎提取物制备的药物，其制剂的给药形式主要包括口服给药或非肠道给药，优选口服给药。
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