CN1660155A - 一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法，属于中药现代化领域。一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物，其有效成分由黄芪、红景天和苦参制备而成。本发明的有益效果是：本发明提供了一种由三味中药组成的药物组合物，即现代中药复方，其成分明确，疗效可靠，质量易控，并提出该药物组合物的制备方法。同时结合病毒性心肌炎在中西医方面不同的发病机制研究结果，针对病毒性心肌炎的病理生理机制，不仅在早期起到抗病毒的重要作用，而且在病程发展过程中发挥保护心肌细胞功能、调节免疫的效果，从而起到阻止病毒性心肌炎向扩张性心肌病及心力衰竭的发展的作用，在病毒性心肌炎的急性期和慢性期都起到良好的治疗作用。

Description

一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法，属于中药现代化领域。

背景技术

病毒性心肌炎(VMC)是心血管系统的常见病和多发病，也是扩张型心肌病、心力衰竭和猝死的主要诱因之一。目前，无论在发达国家还是在发展中国家，心肌炎的发病率较10年前有显著增多，其主要原因是感染性心肌炎中病毒性心肌炎的发病率增高所致。根据世界卫生组织(WHO)全球病毒监测研究报导显示：在新生儿、儿童突发死亡病例中，20％为病毒性心肌炎所致；病毒性心肌炎在新生儿、儿童中的发病率为360/10万，死亡率为8％；病毒性心肌炎的发病率为同期心血管疾病住院病人的8.69～20.8％；病毒感染侵入心肌后，会引起局灶性或弥漫性心肌间质性渗出和心肌纤维变性、坏死。重症弥漫性心肌炎可出现严重心律不齐、心力衰竭、心源性休克、甚至猝死；也可迁延不愈，导致心脏肥大，并逐渐发展成扩张型心肌病。

病毒性心肌炎与病毒感染及免疫性心肌损害有关。从现代医学的观点出发，病毒性心肌炎的发病机制与病理生理过程主要涉及以下三个方面：一、病毒的直接侵袭造成心肌细胞破裂、溶解；二、病毒造成心肌细胞崩解后，诱发自体免疫性炎症反应；三、病毒感染后诱发机体特异性免疫反应。由此可见，病毒性心肌炎主要与病毒入侵和免疫反应有关，所以治疗病毒性心肌炎的出发点便集中在寻找抗病毒药物、调节机体免疫和对症治疗方面。

然而到现在为止，尚未有针对VMC的特效药物。世界上只报道了两种对病毒性心肌炎细胞模型有明显效果的单体化合物，他们分别是：Ribavirin和Win54954，但是这两种单体化合物在动物模型上均未显示良好的治疗作用，可见开发针对病毒性心肌炎的新药具有非常大的困难。科学家们由此将针对病毒性心肌炎的药物研究集中在了以下四个方面：一、调节病毒性心肌炎患者的免疫功能；二、开发减毒活疫苗；三、寻求基因治疗的突破口；四、针对心血管系统的改变进行对症治疗。

中药是世界上历史悠久的天然药物之一，在针对病毒性心肌炎的治疗中，具有一定的优势和特色。祖国传统医学的观点认为，病毒性心肌炎属于中医心悸怔忡，胸痹等病的范畴。该病因为正气虚弱、复受温邪热病侵袭、毒邪内滞，内含于心、血运不畅、耗气伤阳、心失所养、脉络淤阻、痰浊湿热阻滞所致。故而治疗病毒性心肌炎当以扶正祛邪治心为主，兼顾其他脏器，以益心气、养心阳、清新宁神为主。然而在我国传统的中医药治疗方面，一直没有疗效非常确切的药物，大多数医生均是在经验方的基础上进行药味加减，并结合西医的治疗措施。既没有针对疾病进行深入的研究，也没有开发出具有独特疗效的中药新药。

发明内容

本发明的目的是提供一种疗效显著的治疗病毒性心肌炎的中药组合物。

本发明的另一个目的是提供这种治疗病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物，其有效成分由黄芪、红景天和苦参制备而成。

所述黄芪、红景天和苦参的重量份数之比同时满足下列条件：

1〕红景天：黄芪为1∶2～2∶1；

2〕苦参：红景天+黄芪为1∶6～1∶2。

所述红景天与黄芪的重量份数之比以1∶1为佳。

所述中药组合物中还含有药剂学可接受的辅料，制成药剂学可接受的剂型。

所述剂型为口服剂型，包括胶囊、片剂、冲剂、丸剂和散剂等。

本发明组方简单、合理，疗效显著。其中的黄芪勃发心气而运血动，甘温益气，使气旺血行，温阳益气通脉。现代药理研究发现黄芪不但能直接抑制病毒的生长，而且能协同改善微循环，增加心肌营养血流量，有利炎症的吸收，促进损害心肌的恢复。

苦参清热燥湿，调整心律，苦寒清心，专治心经之火。药理研究证明该药不但能渗透到心肌细胞阻止病毒的繁殖，而且能降低心肌的应激性，抑制异位起搏，是较普遍认同的抗心律失常、尤其是治疗各种早搏的有效药物。在查询的290个心血管病验方中，黄芪在主方中出现的频率为57.24％(166/290)；苦参为26.6％(77/290)。所以这两种药是千百年来人们用于防病治病的有效和常用药物。

红景天在本处方中的加入是本发明不同于市场常用的抗病毒性心肌炎药物的特色之一。红景天有着与人参，刺五加等相似的滋补强壮、扶正固本之功能，有神草和不老草之称。我国最早的要典《神农本草经》中将其列为之上品，其临床应用非常广泛。现代药理研究表明红景天有明显的抗缺氧、抗病毒、强心等作用。因此黄芪、苦参、红景天组成的此方具有上调三焦之功效，可使气畅血行、痰祛正复，标本兼治，能明显增加冠状动脉的血流量、改善微循环、提高耐缺氧，因而提高了心肌细胞抗病毒能力，减轻病毒对心肌细胞的破坏，促进损害心肌细胞的修复。

一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：

1〕制备苦参浸膏：苦参加10～12倍量60～80％乙醇回流提取2～3小时，留提取液，剩余部分用60～80％乙醇再次提取2～3小时，合并两次的提取液并过滤，减压浓缩为相对密度为1.25-1.30的浸膏；

2〕制备红景天和黄芪浸膏：红景天与黄芪以6～12倍量水煎煮1～3小时，留提取液，剩余部分再以3～12倍量水煎煮0.5～2小时，合并两次提取液并过滤，浓缩至相对密度为1.25-1.30的浸膏；

3〕干燥：将苦参浸膏与红景天和黄芪浸膏合并后干燥，即得。

为实现产业化，我们对以上工艺进行了较为系统的优化研究。通过正交试验，考察了各项工艺条件，在尽量减少浸膏的量和活性成分损失前提下，对浓缩的程度、醇浓度、水提时间、提取溶液的用量等指标进行考察，得到以下优选方案：

所述步骤1〕制备苦参浸膏是指：苦参加10倍量70％乙醇回流提取3小时，留提取液，剩余部分用80％乙醇再次提取3小时，合并两次的提取液并过滤，减压浓缩为相对密度为1.25-1.30的浸膏。

所述步骤2〕制备红景天和黄芪浸膏是指：红景天与黄芪以10倍量水煎煮2小时，留提取液，剩余部分再以8倍量水煎煮1.5小时，合并两次提取液并过滤，浓缩至相对密度为1.25-1.30的浸膏。

所述步骤2〕中红景天与黄芪的重量份数比为1∶2～2∶1。

所述步骤3〕中苦参浸膏与红景天和黄芪浸膏的重量份数比为1∶6～1∶2。

将所得的中药组合物分装、包装，即可得到具有一定规格的药物制剂。此外，还可以运用本领域习知的传统或现代制药技术，添加药剂学可接受的辅料或赋型剂，将上述组合物进一步加工制成各种适于口服的剂型，如丸剂、片剂、胶囊剂、冲剂、散剂等。由于药物有效成分均为本发明提供的组合物，因此，以上各种剂型均属于本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种由三味中药组成的药物组合物，即现代中药复方，其成分明确，疗效可靠，质量易控，并提出该药物组合物的制备方法。同时结合病毒性心肌炎在中西医方面不同的发病机制研究结果，针对病毒性心肌炎的病理生理机制，不仅在早期起到抗病毒的重要作用，而且在病程发展过程中发挥保护心肌细胞功能、调节免疫的效果，从而起到阻止病毒性心肌炎向扩张性心肌病及心力衰竭的发展的作用，在病毒性心肌炎的急性期和慢性期都起到良好的治疗作用。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为CVB病毒感染Vero细胞以后进行MTT染色，根据OD值所作的结果图。

图2为CPE抑制实验结果图。

图3为病毒繁殖抑制试验中CVB₃毒力测定结果。

图4为不同时间段本发明药物刺激产生干扰素效价结果图。

图5为通过RT-PCR方法观察本发明对细胞内病毒含量的影响图。

图6为倒置显微镜下观察到的本发明对Vero细胞的保护作用图。

图7为倒置显微镜下观察到的本发明对Hela细胞的保护作用图。

图8为倒置显微镜下观察到的本发明对心肌细胞的保护作用图。

图9为通过RT-PCR方法鉴定体内模型构建成功。

图10为各个分组动物进食量的比较图。

图11为各个分组动物体温的变化情况图。

图12为各个分组动物体重的变化情况图。

图13为本发明在动物水平对死亡率的改变结果图。

图14为感染后不同分组取血，分离血清，在Vero细胞水平测量TCID₅₀值图。

图15为感染后不同分组取血，分离血清，检测血清心肌酶CK-MB含量图。

图16为感染后不同分组取血，分离血清，检测血清心肌酶LDH含量图。

具体实施方式

实施例1、药物制备

一、材料：

(一)原料来源和用量：

1.黄芪 本品为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。春、秋二季采挖，除去须根及根头，晒干。主产：山西、内蒙、甘肃、黑龙江。

2.红景天 本品为景天科植物大花红景天或大株红景天的干燥根及根茎。秋季采挖，除去粗皮，晒干。主产：西藏、甘肃、新疆、吉林等地。

3.苦参 本品为豆科植物苦参的干燥根。春、秋二季采挖，除去根头及小支根，洗净，干燥，或趁鲜切片，干燥。主产：山西、内蒙、甘肃、黑龙江。全国大部分地区均产。

不同提取方案中原料药物的用量如下：

                                  原料用量（Kg）

红景天            1     1     1     1      1     1     2     2     2

黄芪              2     2     2     1      1     1     1     1     1

苦参              0.5   1     1.5   0.33   0.5   1     0.5   1     1.5

苦参：红景天+黄芪 1∶6  1∶3  1∶2  1∶6   1∶4  1∶2  1∶6  1∶3  1∶2

(三)所使用的设备和试剂名称及来源：

Agilent 1100高效液相色谱仪

TSP-P4000-AS3000-UV1000高效液相色谱仪

Alltech蒸发光散射检测器

AS3000自动进样器

色谱柱thermoquest Hypersil

甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯

对照品：黄芪甲苷对照品和苦参碱对照品由中国药品生物制品检定所提供。

(四)该药制备过程的工艺步骤及参数：

1、制备苦参浸膏：苦参加10倍量70％乙醇回流提取3小时，留提取液，剩余部分用80％乙醇再次提取3小时，合并两次的提取液并过滤，减压浓缩为相对密度为1.25-1.30的浸膏；

2、制备红景天和黄芪浸膏：红景天与黄芪(重量比为1∶2～2∶1)以10倍量水煎煮2小时，留提取液，剩余部分再以8倍量水煎煮1.5小时，合并两次提取液并过滤，浓缩至相对密度为1.25-1.30的浸膏；

3、干燥：将苦参浸膏与红景天和黄芪浸膏按照重量比(1∶6～1∶2)合并后干燥，即得。

(五)质量标准检查结果：

黄芪为本药品的君药，目前，多以测定黄芪甲苷控制含黄芪类样品的质量，我们采用HPLC法，蒸发光散射检测器(ELSD)测定其含量，方法简单、灵敏，重现性好。

1、仪器与试药：Agilent 1100系列高效液相色谱仪。ELSD-Alltech蒸发光散射检测器，TSP-AS3000自动进样器，色谱柱：CAPCELL PAK C₁₈ 5μ；250×4.6mm(UG120)，甲醇为色谱纯(天津康科德)，正丁醇为分析醇(上海试剂公司)，黄芪甲苷对照品(购自中国药品生物制品检定所781-200210)。

2、测定条件的选择  选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(75∶25)为流动相；检测用蒸发光散射检测器，灵敏度(chain)2，检测温度115℃，载气流速2.5ml/min。黄芪甲苷为对照。保留时间约为10分钟。柱温：35℃，结果阴性对照没有干扰(见图1、2、3)。试验条件宽松，重现性好。

3、样品的提取纯化  目前黄芪甲苷的提取纯化，一般采用正丁醇从水溶液中提取，碱洗去杂质的方法。我们曾比较甲醇、水为溶剂，超声及回流提取的比较，结果以本发明的方案所采用方法最为理想。

4、线性关系的考察  精密称取黄芪甲苷对照品5.06mg，加甲醇定容至10ml，分别吸取2、4、6、8、10μl，分别注入高效液相色谱仪，测其峰面积积分值，以峰面积的自然对数为纵坐标，浓度的自然对数为横坐标，计算回归方程。结果：y＝1.7542x+5.3466  R＝0.9998。

                  表1 黄芪甲苷标准曲线

进样量（g）    峰面积      Ln(C)           Ln(A)

1.012          218         0.011929        5.384495

2.024          699         0.705076        6.549651

3.036          1471        1.110541        7.293698

4.048          2486        1.398223        7.81843

5.06           3604        1.621366        8.1898

结果表明进样量在1.012～5.06μg范围内，进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。

5、精密度试验取对照品溶液4μl，连续进样5次，结果峰面积积分值的自然对数及其平均值、RSD％见下表。试验结果显示仪器精密度良好。

                  表2精密度试验结果

编号    A LnA    平均         LnA        RSD(％)

1       721      6.581

2       699      6.550

3       695      6.544        6.563      0.323

4       696      6.545

5       732      6.596

6、稳定性试验  取供试品溶液，在8小时内分别进样5次(0、1、2、4、8小时)，测定峰面积积分值，结果峰面积积分值的自然对数及其平均值、RSD％见下表。试验结果显示供试品溶液在8小时内稳定性良好。

                 表3稳定性试验结果

测定时间                     平均LnA  RSD(％)

         A           LnA

(小时)

0       1211         7.099

1       1149         7.047

2       1141         7.040    7.084    0.493

4       1214         7.102

8       1250         7.131

7、重现性试验按正文方法对批号为030904的样品进行测定，共测定5份，测定结果见下表。试验结果表明该方法重现性良好。

          表4  重现性试验结果

编号  含量(mg/g)  含量(mg/粒)  平均含量(mg/g)  RSD(％)

1     0.652       0.294

2     0.652       0.293

3     0.654       0.294        0.295           0.420

4     0.659       0.297

5     0.655       0.295

8、加样回收率试验取批号为030904(含量见表5)的样品1g，共5份，分别加入对照品溶液(黄芪甲苷对照品7.00mg，加甲醇至10ml)1ml，按正文方法测定，计算出回收率。结果见下表，试验结果表明该方法回收率良好。

                    表5  回收率试验结果

取样量   样品中含量  加入量  测得量         平均回收率  RSD

                                    回收率(％)

(g)      (mg)        (mg)    (mg)           (％)        (％)

1.1515   0.754       0.70    1.443  98.40

1.1622   0.761       0.70    1.447  97.97

1.1787   0.772       0.70    1.466  99.18   98.65       1.108

1.1802   0.773       0.70    1.476  100.45

1.1551   0.757       0.70    1.437  97.26

实施例2、体外药效学试验1——在心肌细胞水平的CPE抑制实验

一、试验材料：

1、试验药物：本发明实施例1所述的中药组合物，生产批号为：030904；

2、试验用动物：SD乳鼠，为二级动物(合格证号为SXK-11-00-0006)，购自中国医学科学院动物所；

3、柯萨奇病毒CVB₃：毒株编号为Nancy株，由武汉协和医院病毒室提供。

二、试验方法：

(一)CVB₃病毒毒力滴定方法(TCID₅₀，50％tissue culture infective dose)：

1、实验步骤：

在96孔板中培养Vero细胞；用无血清培养基将病毒连续10倍稀释，分别为10^-1～10^-8稀释度，之后接种于96孔板(孔中为已培养24小时的单层Vero细胞)；37℃/5％CO₂孵箱培养，使病毒和细胞充分接触30min～1h后，弃病毒液，以Hanks液洗三次，然后加入细胞培养液，重新放回孵箱；每日在倒置显微镜下观察CPE，以细胞病变达“++”以上为阳性，以最高稀释度不再出现CPE时为终点，连续观察若干天；利用已经记录好的数据以Reed-Muench法计算TCID₅₀；选择100TCID₅₀作为正式实验的接种浓度。

2、CVB₃病毒毒力滴定结果：

96孔板培养Vero细胞，加入CVB₃病毒以后，在倒置显微镜下观察细胞CPE发生情况(表6)：

表6 倒置显微镜观察加入不同浓度病毒以后Vero细胞CPE发生情况

	100	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	10-8	10-9	10-10	10-11
													重复对照孔	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++	++	-	-	-
++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	+++	+	-	-	-
												++++		++++	++++	++++	++++	++++	++++	++	+++	+	-	-
++++	++++	++++	++++	++++	+++	++++	+++	+	++	-	-
												++++		++++	++++	++++	++++	++++	++	+++	+	-	-	-
++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	++	++	+	-	-
												++++		++++	++++	++++	++++	+++	++++	++++	+	-	-	-
空白	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-														-

++++：表示CPE发生率＞75％：+++：表示CPE发生率为75％-50％；

++：表示CPE发生率为25％-50％；+：表示CPE发生率＜25％。

3、所得数据应用Reed-Muench方法进行计算(表7)：

           表7 应用Reed-Muench方法计算病毒滴度

           判读结果          累计值          感染率

病毒稀释

                                                       感染百分率

        CPE      non-CPE  CPE   non-CPE    CPE数/总和

10⁰     7        0        53    0          53/53       100

10^-1    7        0        46    0          46/46       100

10^-2    7        0        39    0          39/39       100

10^-3    7        0        32    0          32/32       100

10^-4    7        0        25    0          25/25       100

10^-5    7        0        18    0          18/18       100

10^-6    6        1        11    1          11/12       91.6

10^-7    4        3        5     4          5/9         55.6

10^-8    1        6        1     10         1/11        9.1

10^-9    0        7        0     17         0/17        0

10^-10   0        7        0     24         0/24        0

10^-11   0        7        0     31         0/31        0

Reed-Muench方法计算公式为：(仅高于50％的感染百分率-50)/(仅高于50％的感染百分率-仅低于50％的感染百分率)＝(55.6-50)/(55.6-9.1)＝0.12；将0.12加到仅高于50％感染率的稀释指数(本实验中为10^-7)；最后，得出该病毒的TCID₅₀为7.12，即：能够使50％细胞发生CPE的病毒浓度是10^-7.12/ml；数据经三次重复实验验证，均值为：TCID₅₀＝7.36。在以后针对Vero细胞的实验中，涉及CVB₃的毒力，均以TCID₅₀＝7.36作为实际病毒毒力。

4、MTT染色以后，在酶标仪测量570nm处的OD值：

图1为三次重复实验中的一次实验结果，其余两次的实验结果与此类似，图中表示方式为均值±标准差。

(二)心肌细胞水平的CPE抑制实验：

1、以最高浓度为1000μg/ml进行首次实验，以1∶3系列稀释药物：

(1)为96孔板分组情况(表8)：

              表8本发明在心肌细胞水平CPE抑制实验分组设计方法

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	1000μg/mlKX药物+100TCID50病毒		300μg/mlKX药物+100TCID50病毒		100μg/mlKX药物+100TCID50病毒		30μg/mlKX药物+100TCID50病毒		10μg/mlKX药物+100TCID50病毒		3μg/ml KX药物+100TCID50病毒
B
	C
D
	E
F
	G	100TCID50病毒对照
H														正常细胞对照

(2)CPE发生情况观察记录表：本实验重复3次，表9为其中一次的观察记录：

                表9 倒置显微镜观察本发明在心肌细胞水平的CPE抑制情况

	1000μg/ml		300μg/ml		100μg/ml		30μg/ml		10μg/ml		3μg/ml
													药物+病毒	-	-	-	-	+	-	-	+	++	-	+	-
-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
												-		-	-	-	-	+	-	-	-	+	-	++
-	-	-	-	-	-	+	+	+	++	+	-
												-		-	-	-	+	-	+	-	-	-	+	+
-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	+	+
												CVB		++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++
NC	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-		-

2、在16μg/ml浓度以下进行进一步的CPE抑制实验，以1∶2系列稀释药物，浓度分别为：16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。

(1)96孔板分组情况(表10)：

                表10 本发明在心肌细胞水平CPE抑制实验分组设计方法

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	16μg/ml KX药物+100TCID50病毒		8μg/ml KX药物+100TCID50病毒		4μg/ml KX药物+100TCID50病毒		2μg/ml KX药物+100TCID50病毒		1μg/ml KX药物+100--CID50病毒		0.5μg/ml KX药物+100TCID50病毒
B
	C
D
	E
F
	G	100TCID50病毒对照
H														正常细胞对照

(2)CPE发生情况观察记录表：

本实验重复3次，下表(表11)为其中一次的观察记录：

                  表11  倒置显微镜观察本发明在心肌细胞水平的CPE抑制情况

	16μg/ml		8μg/ml		4μg/ml		2μg/ml		1μg/ml		0.5μg/ml
													药物+病毒	-	-	-	-	+	-	-	+	++	-	+	-
-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
												-		-	-	-	-	+	-	-	-	+	-	++
-	-	-	-	-	-	+	+	+	++	+	-
												-		-	-	-	+	-	+	-	-	-	+	+
-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	+	+
												CVB		++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++
NC	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-		-

(3)半数有效量(IC₅₀)及治疗指数(TI)的计算：

按Reed-Muench法计算药物对CVB₃导致CPE产生50％抑制的浓度：

                表12  Reed-Muench法计算本发明IC₅₀

              判读结果    累计值    感染率

药物浓度                                                 感染百分率

           CPE    non-CPE   CPE    non-CPE  CPE数/总和

0.5μg/ml  6      0         17      0        17/17       100

1μg/ml    6      0         11      0        11/11       100

2μg/ml    4      2         5       2        5/7         71.4

4μg/ml    1      5         1       7        1/8         12.5

8μg/ml    0      6         0       13       0/13        0

16μg/ml   0      6         0       19       0/19        0

根据计算公式：(仅高于50％的感染百分率-50)/(仅高于50％的感染百分率-仅低于50％的感染百分率)＝(71.4-50)/(71.4-12.5)＝0.36；将0.36加到仅高于50％感染率的药物浓度稀释指数；得出该药物在心肌细胞水平的IC₅₀为2.36μg/ml；按TI＝TD₅₀/IC₅₀计算治疗指数，但是因为无法测出TD₅₀，只能预测本发明的治疗指数＞1000μg/ml/2.36，即TI＞423.7。

(4)MTT染色以后在酶标仪570nm处测定OD值，见图2所示。

实施例3、体外药效学试验2——病毒繁殖抑制试验

一、试验材料：

Vero细胞、柯萨奇病毒CVB₃及试验药物：同实施例2。

二、试验方法：

1、24孔板接种Vero细胞，然后分组加入药物及病毒，实验设计如表13：

           表13 孔板接种Vero细胞后分组加入药物及病毒

分组	1	2	3	4	5	6
							A	正常细胞空白对照	100TCID50病毒对照	100TCID50病毒对照	100TCID50病毒对照	100TCID50病毒对照	100TCID50病毒对照
B
	C	100TCID50病毒+KX	100TCID50病毒+KX	100TCID50病毒+KX	100TCID50病毒+KX	100TCID50病毒+KX
D
	收获时间						120h		24h	48h	72h	96h	120h

2、按照不同收获时间，收获分组细胞，并用病毒滴定的方法滴定CVB₃毒力。

三、试验结果：

按照不同收获时间，收获分组细胞，并用病毒滴定的方法滴定CVB₃毒力，然后用Reed-Muench法计算的TCID₅₀，结果如图3所示。

在抗病毒药物的开发中，如果药物能够将病毒的滴度降低1个对数值以上，则视为有抗病毒效果，在本次实验中，本发明药物在不同的时间段对病毒滴度的下降幅度均在1以上，说明其确实具有明显的抗病毒作用。

实施例4、体外药效学试验3——干扰素效价测定

一、材料：

1、L929细胞：由军事医学科学院生命科学中心惠赠。

2、水疱性口炎病毒(VSV)：由中国医学科学院病毒所惠赠。

3、试验药物：同实施例2。

二、方法：

1、L929细胞复苏及培养：

调配37℃～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37℃～40℃；从液氮中取出L929细胞冻存管，立即投入37℃温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清液；向细胞沉淀内加入培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

2、鸡胚细胞制备方法：

取9-11天龄鸡胚，75％酒精消毒蛋壳表面；用无菌剪刀在气室上方打开蛋壳，倾倒鸡胚入一无菌平皿；取出鸡胚，去除四肢、头部及内脏；0.125％Trypsin消化10-15min，大口径吸管吹打细胞，使分散；重复消化几次，直到完全分散开为止；10％FBS·DMEM重悬细胞；计数细胞，调整到合适浓度，接种入培养瓶。

3、VSV毒种扩增：

将VSV接种于已生长成为单层的鸡胚成纤维细胞，进行培养；观察细胞病变，当CPE出现“++～+++”时停止细胞培养；反复冻融3次，以使细胞充分裂解，释放出病毒颗粒；1200rpm低速离心，留取上清，弃沉渣；以0.22微米的小滤器过滤所得上清液，即为VSV病毒液。

4、取不同时间段的细胞培养液上清，通过抑制VSV病毒在L929细胞上的毒力，测定本发明刺激脾细胞产生干扰素的效价。

5、诱生干扰素方法：

选用Balb/c小鼠15-20g，雌雄兼用，制备脾细胞悬液，浓度为1×10⁷/ml；将此脾细胞悬液等分4份，每份3ml。分组方法(表14)：

            表14  在培养瓶中诱生干扰素的分组方法

      脾细胞悬液    ConA        药物1        药物2         培养液

组别

            (ml)    (20μg/ml)  (125μg/ml)  (62.5μg/ml)  (ml)

阴性对照    3.0     -           -            -             3.0

阳性对照    3.0     0.6         -            -             2.4

药物1       3.0     -           1.2          -             1.8

药物2       3.0     -           -            1.2           1.8

之后，置孵箱中培养48小时；取培养液上清以1500rpm离心15分钟；收集上清液，冻存于-20℃待测活性。

6、干扰素效价滴定方法：

用含5％小牛血清的MEM培养基将诱生干扰素样品按2的倍次递次稀释。96孔板中每孔加入50μl干扰素样品，细胞对照和病毒对照孔内加50μl DMEM培养基。将预先培养好的L929细胞用0.25％胰酶消化下来，用含5％小牛血清的DMEM营养培基将细胞制成2×10⁵/ml的细胞悬液。用微量移液器向每孔中加入50μl细胞悬液。置CO₂孵箱中培养24小时。将各孔内干扰素倒掉，于每孔中加入100μl攻击病毒(VSV)，细胞对照孔加100μl含5％小牛血清的MEM营养培基。CO₂孵箱中孵育，直到病毒对照孔的CPE达++++为止。各孔加入20μl，1mg/ml MTT，孵育6小时后弃去液体，每孔加入100μl酸化异丙醇，置酶标仪570nm处比色。计算干扰素效价。

三、试验结果：

本发明刺激脾细胞产生干扰素的效价测定结果见表15，通过该结果作图，如图4所示。通过试验发现，本发明具有刺激脾细胞产生干扰素的能力，但是其随时间的延长，诱生能力逐渐下降，可能因为本发明在培养液中的半衰期较短有关，环胞霉素A刺激脾细胞产生干扰素的能力较强而且稳定。

            表15不同时间段本发明刺激产生干扰素效价

       CoA           本发明药物                 空白对照

12h    4.65±0.21    3.26±0.16                 0

24h    4.93±0.05    3.30±0.21                 0

48h    4.21±0.19    2.17±0.16                 0

72h    3.84±0.24    1.36±0.09                 0

实施例5、体外药效学试验4——通过RT-PCR方法观察本发明对细胞内病毒含量的影响

一、试验材料：

1、试验药物及原代乳鼠心肌细胞：同实施例2。

2、TRI_ZOL：购自GIBCO公司；引物由赛百胜生物公司负责合成。

二、试验方法：

1、引物序列为：

CX₁：5’-CCCCGGACTGAGTATCAATA-3’

CX₂：5’-GCAGTTAGGATTAGCCGCAT-3’

2、反应体系为：

RT-PCR Enzyme Mix       2μl

20×buffer(Mg²⁺free)   1.5μl

MgCl₂(25mM)            1.5μl

dNTP(10mM)              1.0μl

CX1 sense primer        1.0μl

CX1 anti-sense primer   1.0μl

RNA                     2.0μl

dH₂O                   20μl

TOTAL                   30μl

3、循环参数为：37℃/50min 94℃/5min (94℃/30sec 59℃/30sec 72℃/1min)×30 72℃/7min 4℃。

三、试验结果：

如图5所示，通过对CVB₃病毒感染的细胞扩增特异序列，可以明确在被感染的细胞中存在CVB₃病毒，同时可以观察到随着药物浓度的增高，病毒含量逐渐下降。

实施例6、体外药效学试验5——形态学观察本发明对细胞的保护作用

一、材料：

1、试验药物：同实施例2

2、心肌细胞：同实施例2

二、方法：

在25cm²培养瓶中培养Vero细胞、Hela细胞或原代心肌细胞，待细胞生长形成单层以后，接种100TCID₅₀病毒和(或)加入本发明药物溶液，分组为：正常细胞对照组、药物对照组、病毒感染对照组以及病毒+药物试验组；连续观察72小时，在倒置显微镜下对典型的细胞形态进行摄影。

三、结果：

倒置显微镜观察本发明对细胞的保护作用，如图6、7、8所示，正常细胞对照组和药物对照组(KX)在观察期内没有发生任何CPE病变，病毒感染对照组病变进展迅速，而病毒+药物试验组病变发展要明显慢于病毒对照组，但是随时间推移，也有部分细胞发生CPE病变。

实施例7、体内药效学试验1——病毒性心肌炎体内模型建立及鉴定

一、材料：

1、Balb/c小鼠：四周龄、纯系雄性Balb/c小鼠(体重为15g左右)，为二级动物，购自中国医学科学院动物所，合格证号为SXK-11-00-0006。

2、柯萨奇病毒CVB₃：同实施例2。

二、方法：

(一)模型建立方法：

实验第一天腹腔接种0.1ml浓度为100LD₅₀的CVB₃病毒；感染病毒0.5小时以后，小鼠每天腹腔注射生理盐水0.4ml，共7天；一般于第三天开始发病，之后死亡率逐渐增高。

(二)模型鉴定方法：

1、病理切片：

取感染CVB₃病毒后的小鼠心脏，固定于10％中性甲醛；制作石蜡切片；显微镜下观察心脏组织的病变情况，对明显的病灶照相记录。

2、心肌组织病毒核酸的分离、提取：以TRI_ZOL提取心肌组织总RNA，并以琼脂糖凝胶电泳鉴定CVB₃特异性条带：方法同实施例5。

三、试验结果：

电泳分析如图9所示，通过对CVB₃病毒感染的小鼠心脏组织扩增特异序列，可以明确在被感染心脏组织中存在CVB₃病毒，证明病毒性心肌炎体内模型成立。

实施例8、体内药效学试验2——对病毒性心肌炎动物模型的药效学研究

一、试验材料：

1、试验药物：如实施例2

2、动物模型：如实施例7

二、试验方法：

(一)动物实验分组及设计：

1、分组：实验动物采用随机化分组原则进行，本实验设三个本发明药物实验组，另外设五个对照组，分别是：空白对照组、假处理对照组、西医联合用药组、中医对照组和利巴韦林对照组，其中假处理对照组为腹腔注射同等量的病毒液，口服本发明药物溶酶。每组动物数安排依照预试验后的统计结果而定。

(1)本发明药物高剂量组：按照本发明药物毒性测得的LD₅₀值及最大耐受量进行设计，高剂量组为1/3 LD₅₀给药量，为0.4g/20g。

(2)本发明药物中剂量组：取高剂量组和低剂量组的几何平均数：

400×4≈40mg/20g，按照40mg/20g给药。

(3)本发明药物低剂量组：为高于或等于临床使用剂量，本发明在人的使用剂量为10g/60kg，所以在小鼠的使用剂量为：4mg/20g，

(4)中药对照组：使用中药治疗病毒性心肌炎的常用中成药“生脉饮”作为对照组，以参考本发明的药效学结果，在小鼠的使用剂量为：0.075ml/只/d。

(5)西医联合治疗对照组：其中包括：V-C、肌苷和辅酶Q10，使用剂量分别为：V-C：55mg/kg、肌苷：25mg/kg、辅酶Q10：55mg/kg。

(6)利巴韦林对照组：利巴韦林在小鼠的治疗剂量为：75mg/kg。

(7)假处理对照组：腹腔注射同等浓度的病毒悬液，口服本发明药物的溶酶——羧甲基纤维素。

2、实验安排及实验周期：

Balb/c小鼠腹腔感染CVB₃以后，灌胃给予本发明药物，每日一次，共14天，观察本发明对病毒性心肌炎动物模型的疗效。各个分组动物例数均为21只(依据预试验结果确定)。

(二)实验内容：

1、对不同分组动物的一般观察：

(1)感染动物的食欲、活动力及粪便情况：

实验前对加入的饲料进行称重，然后每天记录各组动物的饲料消耗量。观察每只动物的活动力，并作详细记录。观察动物排便情况。

(2)局部反应及全身反应情况：包括：中枢神经系统、自主神经系统、循环及血液系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、眼睛、皮肤及毛发等。

(3)动物体温及体重的情况：此项测量于每天同一时间进行，小鼠体温采用半导体温度计进行测试。

2、不同分组死亡率统计：

从实验开始以后，连续观察14天，对不同分组的动物进行死亡率统计，观察组间是否存在显著性统计学差异。

3、心肌组织悬液病毒滴度(TCID₅₀)测定：

(1)实验方法：

收集各组动物的血清；离心弃沉渣后取上清，作系列10倍稀释，共设8个梯度；将稀释后的病毒液接种于已培养好Vero细胞96孔板上；对比各个不同分组之间TCID₅₀的差别。

(2)结果分析：

以Reed-Muench法计算各组血清接种细胞后的TCID₅₀；以加药组比病毒对照组TCID₅₀降低1个对数以上作为有效。

三、结果：

(一)、对不同分组动物的一般观察结果；

1、进食量记录(表16)：

                         表16不同分组动物进食量记录表

统计结果见图10。

2、一般情况及活动力观察记录(表17)：

观察内容包括：

         表17  全身系统观察需要注意的内容列表

系统                               观察内容

中枢神经系统    是否有烦躁、易怒、或萎靡、昏迷等现象

自主神经系统    瞳孔扩大或缩小、分泌物增多、流涎、流泪、出汗等

循环及血液系统  心动过速或过缓、心律紊乱、皮肤黏膜苍白、潮红、紫绀等

呼吸系统        呼吸急促或缓慢、鼻翼扇动、张口呼吸、口鼻出血、咳嗽或喷嚏

泌尿生殖系统    尿色改变、阴部或乳腺肿胀、会阴部污浊有分泌物等

眼睛            眼睑下垂、眼球突出、角膜混浊、结膜充血、分泌物增多

皮肤及毛发      皮肤发红、松弛、皮疹、毛蓬松无光泽、污秽不洁等

其他            拒食、消瘦、体温升高或降低等

           表18  不同分组动物一般情况及活动力记录表

               1-3d      4-6d      7-9d      10-12d      13-14d

KX高剂量组     -         -         -         +           +

KX中剂量组     -         -         +         +           +

KX低剂量组     -         -         +         ++          ++

中药对照组     -         +         ++        ++          +++

西医联合对照组 -         -         +         ++          +++

利巴韦林对照组 -         -         +         +           ++

假处理对照组   +         ++        +++       ++++        ++++

正常对照组     -         -         -         -           -

3、动物体温的变化情况：

依据各组测量值求出平均值：见表19

                  表19不同分组动物体温变化情况

            1d        3d        5d        7d        9d       11d       13d

  KX高  36.5±0.2136.4±0.1236.5±0.2036.5±0.0136.6±0.3236.7±0.2436.8±0.61

  KX中  36.5±0.3336.5±0.1936.7±0.4136.7±0.2736.9±0.2236.8±0.3137.0±0.49

  KX低  36.4±0.2436.5±0.2436.8±0.1937.1±0.1437.1±0.4137.4±0.2837.5±0.21

中药对照36.6±0.4636.6±0.2537.7±0.4137.8±0.2736.8±0.1636.9±0.2437.1±0.31

西医对照36.1±0.1936.8±0.1536.5±0.2437.4±0.3537.2±0.1237.0±0.4237.4±0.21

利巴韦林36.4±0.2436.2±0.3536.1±0.3536.9±0.1637.0±0.3537.2±0.5136.9±0.47

 假处理 36.6±0.1636.6±0.1737.7±0.2138.9±0.1037.5±0.6437.6±0.8136.7±0.62

  正常  36.8±0.1437.1±0.1436.2±0.3436.5±0.2136.5±0.2436.7±0.3036.5±0.38

结果统计见图11。

4、动物体重的变化情况：

依据各组测量值求出平均值：见表20

              表20  不同分组动物体重变化情况

          1d      3d      5d      7d      9d      11d     13d

  KX高    15.6    16.5    17.1    18.2    18.3    18.5    18.7

  KX中    15.7    16.4    16.9    17.6    17.7    18.1    18.2

  KX低    15.4    16.1    16.3    16.6    16.9    17.1    17.1

中药对照  15.6    16.4    16.7    17.2    17.4    17.6    18.0

西医联合  15.5    15.7    15.9    16.1    15.7    15.1    14.6

利巴韦林  15.4    15.6    16.9    17.1    17.5    17.6    18.1

假处理    15.7    15.6    15.6    15.4    15.9    14.1    14.0

正常对照  15.3    16.2    17.4    18.3    18.6    19.2    19.4

结果统计见图12。

(二)、不同分组动物死亡率的统计结果：见表21

结果统计见图13。

                   表21  不同分组动物死亡率统计表

药效试验组                           生脉饮  西医联合 利巴韦林  假处理  正常对

          高剂量组 中剂量组 低剂量组 对照组  对照组   对照组    组      照组

  动物数  21       21       21       21      21       21        21      21

  死亡数  9        3        4        8       13       6         17      0

死亡率(％)42.8     14.2     19.0     38.1    61.9     28.6      81.0    0

  总计                               168(只)

(三)不同时间各个分组取血后分离血清检测指标：

1、病毒在Vero细胞水平的TCID₅₀值：

(1)试验材料：同实施例2；

(2)试验方法：同实施例2；

(3)试验结果：如图14所示，除正常对照组以外，其他各组均可以检测到血清中病毒的存在，服用药物的小鼠血清中病毒滴度下降，具体分析见图解。

2、血清中心肌酶含量测定：

(1)试验材料：仪器为：SABA18型生化分析仪，试剂购买自首都医科大学临床医学科技中心；

(2)试验方法：按照生化分析仪及试剂盒说明书进行试验。

(3)试验结果：如图1 5和图16所示，心肌酶CK-MB和LDH含量在3～7天均有增加，但是增幅不同，具体统计数据如下表(表22)：

                   表22  CK-MB统计数据

       高    中     低    生脉饮  西医  利巴韦林  假处理  正常

第1天  6.6   6.7    6.2   6.8     6.5   5.9       6.7     6.1

第3天  9.3   12.5   14.2  19.6    17.8  11.6      21.3    7.2

第5天  12.9  19.8   22.9  33.1    31.2  19.0      46.2    6.9

第7天  16.7  22.4   21.8  30.5    26.4  22.4      34.2    8.3

第9天  10.2  9.7    11.6  16.5    17.8  9.1       15.3    6.2

                     表23 LDH统计数据

       高    中    低      生脉饮  西医    利巴韦林  假处理  正常

第1天  26.5  25.4  28.4    23.1    26.0    25.5      28.1    22.6

第3天  31.6  42.3  62.5    68.7    57.2    37.8      78.6    23.5

第5天  68.9  52.6  111.9   126.3   98.3    59.6      132.6   29.8

第7天  102.4 132.5 123.5   117.2   153.4   104.2     168.2   22.5

第9天  41.3  79.0  98.1    96.5    126.8   71.9      154.2   26.5

本发明提供了一种由三味中药组成的药物组合物，即现代中药复方，其成分明确，疗效可靠，质量易控，并提出该药物组合物的制备方法。同时结合病毒性心肌炎在中西医方面不同的发病机制研究结果，针对病毒性心肌炎的病理生理机制，不仅在早期起到抗病毒的重要作用，而且在病程发展过程中发挥保护心肌细胞功能、调节免疫的效果，从而起到阻止病毒性心肌炎向扩张性心肌病及心力衰竭的发展的作用，在病毒性心肌炎的急性期和慢性期都起到良好的治疗作用。

Claims (10)

1、一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物，其有效成分由黄芪、红景天和苦参制备而成。

2、根据权利要求1所述的一种治疗病毒心肌炎的中药组合物，其特征在于：所述黄芪、红景天和苦参的重量份数之比同时满足下列条件：

1〕红景天∶黄芪为1∶2～2∶1；

2〕苦参∶红景天+黄芪为1∶6～1∶2。

3、根据权利要求2所述的一种治疗病毒心肌炎的中药组合物，其特征在于：所述红景天与黄芪的重量份数之比为1∶1。

4、根据权利要求1所述的一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物，其特征在于：所述中药组合物中还含有药剂学可接受的辅料，制成药剂学可接受的剂型。

5、根据权利要求4所述的一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物，其特征在于：所述剂型为口服剂型，包括胶囊、片剂、冲剂、丸剂和散剂等。

6、一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1〕制备苦参浸膏：苦参加10～12倍量60～80％乙醇回流提取2～3小时，留提取液，剩余部分用60～80％乙醇再次提取2～3小时，合并两次的提取液并过滤，减压浓缩为相对密度为1.25-1.30的浸膏；

2〕制备红景天和黄芪浸膏：红景天与黄芪以6～12倍量水煎煮1～3小时，留提取液，剩余部分再以3～12倍量水煎煮0.5～2小时，合并两次提取液并过滤，浓缩至相对密度为1.25-1.30的浸膏；

3〕干燥：将苦参浸膏与红景天和黄芪浸膏合并后干燥，即得。

7、根据权利要求6所述的一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤1〕制备苦参浸膏是指：苦参加10倍量70％乙醇回流提取3小时，留提取液，剩余部分用80％乙醇再次提取3小时，合并两次的提取液并过滤，减压浓缩为相对密度为1.25-1.30的浸膏。

8、根据权利要求6所述的一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤2〕制备红景天和黄芪浸膏是指：红景天与黄芪以10倍量水煎煮2小时，留提取液，剩余部分再以8倍量水煎煮1.5小时，合并两次提取液并过滤，浓缩至相对密度为1.25-1.30的浸膏。

9、根据权利要求6或8所述的一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤2〕中红景天与黄芪的重量份数比为1∶2～2∶1。

10、根据权利要求6所述的一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤3〕中苦参浸膏与红景天和黄芪浸膏的重量份数比为1∶6～1∶3。

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