CN1658767A - 调节生理反应或诱导免疫应答的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对动物或人口服给药后调节生理反应或诱导免疫应答的新的组合物、其用途和方法，该组合物含有至少一种增加消化系统中pH以防止变性的生理活性剂，一种基本防止酶促消化的消化酶抑制剂和至少一种增加生理活性剂、药物和/或营养物的吸收的吸收促进剂。

Description

调节生理反应或诱导免疫应答的组合物

发明背景

(a)发明领域

本发明涉及一种组合物和生理活性产物的口服给药及其肠内传递方法。通过根据本发明方法施用的生理活性产物使得可以实现更好的系统传递和免疫诱导，并且已经展示出改善的营养、营养治疗和治疗能力。

(b)现有技术描述

养鱼业的扩大以及养殖密度的增加伴随着巨大压力，其如其它圈养牲畜中的一样，已经导致恶性疾病的爆发和相关的死亡。因此，这导致作为预防性和治疗措施的抗生素的广泛使用。然而，抗生素抗性细菌的发展和环境和鱼肉中抗生素的积累加强了疫苗备选方案的必要性。实际上，近几年在疫苗开发方面已经作了大量努力并且疫苗在养鱼业中的使用已经普及。由于在所有脊椎动物中，鱼中特异免疫应答由体液免疫和细胞介导的免疫组成。在暴露于抗原时，B淋巴细胞分化成产生特异性抗体的浆细胞，和记忆细胞。T细胞分化成长命的辅助记忆细胞。与高等脊椎动物的免疫系统相比，鱼似乎产生单个优势类别的免疫球蛋白，类似于哺乳动物的IgM。

T淋巴细胞负责细胞介导的免疫。在初次抗原刺激时，它们分化成杀伤细胞、产淋巴因子细胞和抑制细胞。鱼中细胞介导的免疫应答也包含巨噬细胞，其是鱼的非特异性防御的主要防线。与陆地的牲畜相比，鱼中的接种由于它们的水生环境而变得复杂。分别注射疫苗是劳动密集的和压力大的，因为注射前必须将鱼从水中移走并麻醉。已经表明某些抗原当被导入含有鱼的水中时可在鱼中诱导免疫应答(即浸没接种)。然而，通过浸没诱导的免疫保护的程度和持续时间是多变的。弧菌病疫苗从水中向虹鳟鱼的吸收是低的，并且限于初始疫苗浴浓度的0.01-0.2％。类似地，浸在高浓度疖病疫苗中的虹鳟鱼甚至当浸没时间长达4小时也仅仅吸收非常小比例的抗原。当鱼被注射疫苗时，保护性抗原可定位于脾脏和肾脏，它们是噬菌细胞过滤的主要器官和保护性免疫的主要位点。然而，将鱼浸在疫苗后，抗原几乎只位于外表面、皮肤和鳃。实际上，尽管疫苗注射诱导系统免疫应答(脾脏和肾脏中)，但是据认为浸没技术主要诱导外皮免疫应答(在皮肤、鳃和内脏的粘膜中)。这解释了以下发现：对于所有研究的疫苗，抗原的注射比浸没方案提供了好得多的免疫保护。然而，考虑到与注射相比浸没方法的相对简单性，在工业中考虑将鱼浸没于含有高浓度疫苗的溶液中导致抗某些疾病(例如，肠红嘴疾病和某些种类中的弧菌病)的足够保护。然而，对于其它疾病(例如疖病和某些种类中的弧菌病)，必须对每条鱼注射疫苗。然而对于其它严重疾病，如细菌性肾病(BKD)，开发疫苗的努力是不成功的。近些年已经广泛研究了疫苗的口服给药。然而，尽管该方法最初有希望(即，对鱼完全无胁迫)，但是发现口服疫苗仅仅产生非常有限水平的免疫保护。在一些情况下，抗原的口服给药甚至导致免疫应答的抑制。

在鱼中疫苗的所有情况中，免疫保护的长期性是主要关心的。单次接种诱导的保护的时间长于1年的情况是很少的，而在多数养殖的鱼中到达收获的养殖时间长得多，超过2年。因此，许多可得到的鱼疫苗效率有限。需要通常通过注射对大鱼加强接种以提高保护的持续时间。这包括大量劳动、处理以及对鱼的导致死亡的胁迫。现今在鱼中没有使用传递系统以延长抗原的生物利用度。此外，许多已经增加免疫保护程度的潜在佐剂不能在商业实践中使用，因为它们导致严重感染或者是有毒的。

和在人中的情况一样，妨碍最佳免疫所有鱼抗常规疾病的主要问题是需要传递多剂疫苗以维持保护性。现在的免疫方案对免疫系统产生短暂的刺激，因为疫苗的反复应用是传递疫苗的仅有的实用方法。结果，最近在哺乳动物中进行了深入的研究，以期开发将诱导长时间的保护性初次应答的单剂量、控释制剂。基于聚合物设计，抗原的释放模式或者为连续的或者包括旨在引发免疫应答的抗原的初始延长释放，和加强免疫应答的延迟释放。载体聚合物是无毒且是生物相容的，除了它们作为传递系统在得到最佳释放速率方面的作用，还已知它们对防御机制具有强辅助性、非特异刺激作用。

尽管已经建议应用类似系统以允许对家畜动物和鱼的更有效接种，但是几乎没有相关工作评价该策略在水生种类的效果。尽管将鱼疫苗掺入聚合物系统中将可能提供持续的疫苗释放和改善的保护，物种之间的重要生理差异以及不同条件(例如水温)将可能影响聚合物功能，并且将需要物种和培养条件之间的详细鉴定。此外，聚合物介导的持续疫苗释放需要注射，因此，在实际水平上，该策略可提供比水生物种的非密封(non-encapsulated)的疫苗相对有限的益处。

尽管鱼缺少哺乳动物的内脏相关淋巴组织(GALT)的专门的细胞和组织部分，但是有大量证据证明肠上皮细胞，特别是后肠部分的肠上皮细胞能够摄取抗原并将它们转移到固有层中的巨噬细胞和淋巴细胞，并且在一定条件下，转移到系统淋巴器官，即肾和脾。来自鲤鱼的现有证据表明抗原的口服传递刺激在内脏、鳃和皮肤中但不在肾脏和血液中产生抗体，而抗原的肠胃外注射刺激系统隔室但不刺激粘膜隔室。

然而，在鲑鱼中，有人提出口服免疫仅仅在鳃、内脏和皮肤中刺激低应答，而注射刺激系统性和粘膜应答并且刺激粘膜免疫比口服免疫更有效。

从而，尽管证明在鱼中有共同粘膜免疫系统，但是似乎在其区室化的程度中存在一些物种差异。在被肠上皮细胞抗原摄取性质中也有物种差异。在鲤鱼(Cyprinus carpio)中，只有可溶抗原被吸收(通过胞饮)，而在鲑鱼中，完整细菌细胞以及可溶抗原都可以被吸收。此外，抗原暴露于前面的内脏中条件，尽管不一定防止后面内脏肠上皮细胞的吸收，但是也可以影响抗原转移到系统隔室中。本信息尽管仍然非常不完全，但是仍然表明口服传递的抗原必须受到保护防止被消化和前段小肠中其它形式的修饰和被传递到后面内脏肠上皮细胞，该抗原为可以被这些细胞吸收并以强免疫原性形式被转移到系统免疫隔室的形式。

因此，迫切需要将含有营养和治疗剂，尤其是肽(否则不适于口服给药)施用于人和动物的新的、有效的、节省成本的和非侵入性的方法。

发明概述

本发明的一个目的是提供口服给药后调节人或动物(包括哺乳动物、鸟类、昆虫、甲壳类、两栖类、爬行类和鱼类)中至少一种生理反应或者诱导免疫应答，以肠内传递生理活性剂的组合物，该组合物含有增加动物消化系统中pH以防止化学变性的中和剂、防止活性剂的酶促消化的消化酶抑制剂和增加生理活性剂的肠内吸收的吸收促进剂。本发明还基于以下发现：三种药剂的组合当同时使用时提供了加和的和协同的肠内传递和吸收。

本发明的另一个目的是提供治疗动物中肠内微生物感染的方法，该方法包括施用足量的本发明组合物，其中生理活性剂为抗微生物剂。

根据本发明，提供了口服给药于动物以肠内传递生理活性剂或抗原的组合物，本发明组合物含有至少一种浓度为约1％到60％w/w的中和剂，浓度约1％到50％w/w的酶抑制剂和浓度约0.1％到50％w/w的吸收促进剂。

根据本发明的组合物也可以含有选自但不限于治疗剂、营养品、粘多糖、脂质、糖类、类固醇、激素、生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)、表皮生长因子、血管内皮生长和渗透因子(VEGPF)、神经生长因子、细胞因子、白介素、干扰素、GMCSF、类激素产品、神经因子、神经营养因子、神经递质、神经调质、酶、抗体、肽、蛋白片段、疫苗、佐剂、抗原、免疫刺激或抑制因子、造血因子、抗癌产品、抗炎药、抗寄生虫化合物、抗微生物剂、核酸片段、质粒DNA载体、细胞增殖抑制剂或活化剂、细胞分化因子、凝血因子、免疫球蛋白、负选择性标记或“自杀”剂、毒性化合物、抗血管生成剂、多肽、抗癌剂、产酸药物，和组胺H2-受体拮抗剂的生理活性剂。

本发明组合物可含有用量足够中和宿主动物消化系统的酸降解并允许传递生理活性剂到动物肠内的中和剂，其中中和剂可选自抗酸药(anti-acid)、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸钙、碳酸钙、镁盐、碳酸镁、三硅酸镁、氢氧化镁、磷酸镁、氧化镁、碱式碳酸铋，以及它们的组合。

此外，本发明的组合物可含有由浓度为组合物的10％到20％w/w的碳酸钠和浓度为组合物的10％到20％w/w的碳酸钙中的至少一种组成的中和剂。

根据本发明，提供了一种组合物，其含有至少一种用量足够抑制人或动物消化系统中消化酶对生理活性剂的降解并允许传递该生理活性剂进入人或动物的肠内的酶抑制剂。

消化酶抑制剂可选自但不限于，抗蛋白酶，卵清蛋白，来自油籽、大豆、四季豆、蚕豆、米糠、麦麸的植物来源的抑制剂，乙二胺四乙酸，α-1-抗胰蛋白酶，白蛋白，卵清蛋白和蛋白酶体。

根据本发明的组合物可含有浓度为1％到20％w/w的胃蛋白酶抑制剂、肠肽酶抑制剂和/或白蛋白。

本发明组合物可含有可由胆汁盐、皂苷、脱氧胆酸盐、水杨酸钠、十二烷基硫酸钠、油酸、亚油酸、油酸单甘油酯、卵磷脂、溶血卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯、对叔辛基苯氧基聚氧乙烯、N-月桂基-β-D-麦芽吡喃糖苷、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-氮酮(azone)，和磷脂。

吸收促进剂可以是浓度为0.01％到10％的脱氧胆酸钠。

本发明的组合物可以还含有至少一种选自乙二胺四乙酸、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、粘合剂、示踪剂、一种或多种甜味剂、表面活性剂、除霉剂、调味剂、谷物的粗粉、豆类、酵母、酿酒酵母、矿物油、植物油、动物油、润滑剂、软膏剂、以及它们的组合的附加成分。

本发明的另一个目的是生理活性剂当被传递到人或动物肠内时可被肠吸收以系统地传递，或者对肠壁具有有效生理学作用。

而且，本发明的组合物可允许生理活性剂当被传递到人或动物肠内时对肠的内容物具有生理学作用。该应用可进一步用于刺激食物穿过内脏，或者治疗传染病。

根据本发明，生理活性剂能够在宿主人或动物中诱导抗粘膜传染病的粘膜免疫或系统免疫反应。提供了免疫宿主抗粘膜微生物的方法，该方法包括对宿主施用免疫量的、形式为被杀死的完整微生物、微生物裂解物或分离的抗原或其免疫性片段的微生物表面蛋白。

本发明还提供了口服给药于宿主，优选施用于宿主的内脏(胃、消化道)以赋予抗微生物感染的保护或引发抗微生物感染的免疫应答的组合物。

根据本发明，提供了治疗动物中肠内微生物感染的方法，该方法包括施用含有足够治疗有效量的抗微生物剂的本发明组合物。

微生物感染可由选自但不限于下面的微生物导致：细菌、真菌、蘑菇、酵母、病毒、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)、微球菌属(Micrococci)、消化球菌属(Peptococci)、消化链球菌属(Peptostreptococci)、肠球菌属(Enterococci)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、李斯特氏菌菌(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、原粘杆菌属(Propionibacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、支原体属(Mycoplasma)、尿枝原体属(Ureaplasma)、链霉菌属(Streptomyces)、嗜血杆菌属(Haemophilus)，奈瑟氏菌属(Neisseria)、艾肯氏菌属(Eikenellus)，穆尔氏菌属(Moraxellus)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacteria)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、密螺旋体属(Treponema)、光岗菌属(Mitsuokella)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、衣原体属(Chlamydia)、Furonculosis，和大肠菌(coliforms)。

用于治疗微生物感染的抗微生物剂可选自但不限于，抗生素、细菌素、羊毛硫抗生素、益生菌、抗真菌剂、抗霉菌剂、抗寄生虫剂、氨基糖苷类、万古霉素、利福平、林可霉素、氯霉素、氟喹诺(fluoroquinol)、青霉素、β-内酰胺、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、哌拉西林、替卡西林、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢噻吩、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素、奈替米星、妥布霉素、四环素、磺胺类药物、大环内酯、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、多粘菌素B、克林霉素抗生素及其组合。

本发明还提供了系统传递方法，其包括对动物口服给药治疗该动物的健康疾病的治疗剂，其可以还含有药学上可接受的载体。

本发明组合物可以用于生产药物或食品。

根据本发明还提供了增强人或动物中肠吸收的方法，其包括口服给药生理学有效量的生理活性剂。

本发明的另一个目的是提供调节人或动物中生理学反应或诱导免疫应答的方法，其包括口服给药有效量的此处定义的本发明组合物。

为了本发明的目的定义下面的术语。

术语“治疗剂”以一般意义使用，包括治疗剂、预防剂、替代剂和抗微生物剂。

术语“共同粘膜免疫系统”指在任何粘膜位置免疫可引起所有其它粘膜位置的免疫应答这一事实。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”指天然存在的化学实体和衍生自内源、外源或合成来源的结构上类似的生物活性等价物并用于指通过称为肽键的酰胺型键连接的氨基酸的聚合物。

术语“结构上类似的生物活性等价物”指氨基酸结构尽管与天然存在的肽不同但是在结构上足够类似以致对受试者产生与天然存在的肽自身产生的治疗效果基本等价的治疗效果的多肽。

术语药物的“治疗有效量”指以可应用于任何药物治疗的合理的利益/风险比，得到想要的治疗益处的足够量的化合物。然而，应该理解本发明的药物和组合物的总日剂量将由主治医师在正确的医学判断范围内确定。任何特定患者的特定治疗有效量水平将随着各种因素而变，这些因素包括所治疗的疾病和该疾病的严重性；使用的化合物的活性；所使用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和所用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间；与所使用的特定化合物联合使用或共同使用的药物；以及医学领域中熟知的类似因素。例如，本领域中技术人员熟知以低于需要达到想要的治疗效果的剂量开始并逐步增加剂量直到实现想要的效果。

附图简述

图1阐明了增加脱氧胆酸钠(g脱氧胆酸钠/kg回避混合物(bypasscocktail)对所有储水池中虹鳟鱼重量增加的影响；

图2阐明了增加脱氧胆酸钠(g脱氧胆酸钠/kg回避混合物)对extreme储水池中虹鳟鱼重量增加的影响；

图3阐明了随着脱氧胆酸钠水平的增加补加bST的回避混合物中溪红点鲑重量增加的百分数；

图4阐明了对照和被注射的鱼的重量的增加；

图5阐明了本发明组合物的冰冻干燥的卵清蛋白的抑制曲线；

图6阐明了本发明组合物的红四季豆的抑制曲线；

图7阐明了本发明组合物的大豆的抑制曲线；

图8阐明了本发明组合物的蚕豆的抑制曲线；

图9阐明了本发明组合物的EDTA的抑制曲线；

图10阐明了本发明组合物的小麦麸的抑制曲线；

图11阐明了本发明组合物的喷雾干燥的卵清蛋白的抑制曲线；

图12阐明了本发明组合物的组合成分的抑制曲线；

图13阐明了虹鳟鱼血浆中HRP的标准曲线；

图14阐明了本发明组合物对HRP吸收的影响；

图15阐明了被吸收到鱼的周身循环中的完整HRP；

图16阐明了鱼的口服免疫后抗体水平；

图17阐明了不同类型的疫苗给药后鱼的存活；

图18阐明了不同类型的疫苗给药后鱼的死亡率；

图19阐明了口服免疫后被强化的鱼的抗体水平。

发明详述

本发明证明通过使用创新的疫苗组合物，可能运输生物活性蛋白穿过鱼(例如但不限于虹鳟鱼)的胃，由此该蛋白被吸收(图1)。

使用该疫苗组合物以口服传递疫苗以便克服当前水产工业所面临的生产约束的有效性在此处被清楚地阐明。本发明涉及口服剂型的治疗性蛋白和多肽的施用。本发明提供了与现有文献制剂相比穿过胃肠道增加的吸收和蛋白/肽的极大提高的生物利用度。本发明可用于人和兽医营养、治疗和处理。如在此处和后附的权利要求书中所用的，术语“多肽”在其范围内包括蛋白质和肽以及多肽。

主题发明的化合物和组合物可用于将生物活性或化学活性剂施用于任何动物如鸟、鱼、甲壳类、两栖类、爬行类、哺乳动物(如灵长类，尤其是人类)，以及昆虫。该系统尤其利于传递生理、生物或化学活性剂，该活性剂否则将被该活性剂到达它们所施用的动物体内该活性剂的目标区(即传递组合物的活性剂将被释放的区域)之前被降解或者使得有效性降低。具体地，本发明的化合物和组合物用于口服给药活性剂，特别是不通常口服传递的那些活性剂。

本发明尤其用于施用多肽，包括蛋白质如，但不限于，治疗剂、营养品、粘多糖、类脂、糖类、类固醇、激素、生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)、表皮生长因子、血管内皮生长和渗透因子(VEGPF)、神经生长因子、细胞因子、白介素、干扰素、GMCSF、类激素产品、神经因子、神经营养因子、神经递质、神经调质、酶、抗体、肽、蛋白片段、疫苗、佐剂、抗原、免疫刺激或抑制因子、造血因子、抗癌产品、抗炎药、抗寄生虫化合物、抗微生物剂、核酸片段、质粒DNA载体、细胞增殖抑制剂或活化剂、细胞分化因子、凝血因子、免疫球蛋白、抗血管生成产品、负选择性标记或“自杀”剂、毒性化合物、抗血管生成剂、多肽、抗癌剂、核苷酸，等等，以及它们结构上类似的生物活性等价物。

根据本发明的一个实施方案，提供了口服给药和肠内传递营养化合物或治疗性多肽的组合物，该营养化合物或治疗性多肽可以与(但是对此处描述的产品没有限制)一定比例的脱氧胆酸盐和皂苷配制以提供宿主的肠对该肽的增加的吸收和系统性生物利用度。该组合物还含有pH中和剂，例如但不限于碳酸钠和碳酸钙，和至少一种消化酶抑制剂，如但不限于卵清蛋白或豆类。技术人员将理解中和剂、消化酶抑制剂和吸收促进剂的性质、数目和数量可以被修改以达到希望的传递性质。该组合物优选为固态以容易在制备口服组合物形式中操作。pH的中和旨在指增加消化道中的pH到与大多数已知的有活性的天然的或合成的生物产品相容的酸碱平衡。消化道的pH可以是但不限于5到9，优选约6.5到7.5。

应该理解上面列举的药物仅用于阐明的目的而不是作为可使用本发明的口服传递组合物优选配制或再配制的所有药物的包括一切的列表。可封装到本发明组合物中的其它生理活性化合物包括生物学活性化合物，如蛋白质、酶、抗酶、肽、儿茶酚胺、抗组胺类、镇痛剂，等等。为了本发明的目的，“生物学的”被定义为指来自生物来源的任何营养学或医学上有用的组合物和/或其合成的药学等价物，如胰岛素、血红素、血红蛋白(牛的、人的或合成的)，和激素；“酶”或“酶系统”被定义为指通过生物学产生的或合成的并且作为生物催化剂的任何蛋白或偶联的蛋白。本领域技术人员公知的其它医学上有用的组合物，例如，球蛋白，一种或多种糖蛋白，例如红血球生成素，也可以被掺入到本发明的组合物中。

治疗性多肽的量将变化较大，取决于各种因素如被传递的特定肽、所要治疗的适应症、单个患者，等等。用量将是治疗有效量，即，将提供治疗效果的量，其将按照成熟的医学实践确定。

本发明的另一个实施方案是肠溶衣的使用，肠溶衣可用于片剂和胶囊。肠溶衣将在胃中保持完整但是一旦它们到达小肠就快速溶解，之后在肠的下游位置(例如回肠和结肠)释放药物。肠溶衣是本领域中熟知的。备选地，控释的口服传递载体可用于传递本发明的制剂，该载体被设计以经过预定的时间后释放，从而在该载体进入回肠或结肠后释放。这些载体包括CHRONSET^TM传递装置(ALZA Corporation，Palo Alto，Calif.)和Pulsincap^TM传递装置(R.P.Scherer Co.)。

该组合物可以还含有离子对形成试剂，其中离子对形成试剂与药物的摩尔比为约2∶1到约10∶1。加入离子对形成试剂以增加溶解的生理学活性剂或药物的亲油性，从而增加其膜渗透性。增加药物的亲油性也可以提供对药物的保护以防止酶促失活，因为体内发生的多数肽降解在胃肠道的水性环境中被酶促失活。代表性的离子对形成试剂包括十烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠和苯甲酸钠。

在本发明的一个实施方案中，组合物可任选含有基于组合物总体积的约0.01％到约10％的肠粘膜运输增强剂，如脱氧胆酸。这种试剂促进治疗剂被吸收穿过肠粘膜中的粘膜组织并直接进入受试者的血流中。同样，适于用在本组合物中的组织运输增强剂选自香精油或挥发油，或者选自无毒的药学上可接受的有机和无机酸或其盐或酯。可用于本组合物的香精油或挥发油选自大豆油、蚕豆油、米糠油、鱼油。优选的香精油为鱼油。

在本发明的另一个实施方案中，组合物可含有附加试剂如防腐剂或抗氧化剂。典型的防腐剂包括但不限于苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的甲酯或丙酯(对羟基苯甲酸酯)。代表性抗氧化剂包括丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、去甲二氢愈创木酸、没食子酸酯如没食子酸丙酯、氢醌、丙烯基甲基guaethol和硫代丙酸烷基酯，或水溶性试剂如链烷醇胺、醇和丙二醇。最优选的抗氧化剂为Tenox^TM GT1(1∶1维生素E-大豆油)，其以基于一滴的总体积的约5％到约25％的浓度存在。

重组人GH当与脱氧胆酸盐一起传递时，鲤鱼的口服吸收增加到高达1000倍。

为了制备本发明的药物制剂，将各成分一起干燥混合，之后加入少量油。这些材料一起混合直到得到成分的均匀混合物。所得固体制剂可压制成片剂，然后可将其用合适的肠溶衣包衣。备选地，固体制剂可置于明胶等形成的胶囊中并用肠溶化合物包衣，或者置于控释传递装置如CHRONSET^TM中。固体制剂提供了简单而方便地制作剂型的方法。

本发明的一个实施方案是提供将激素和药物传递到动物或人宿主的方法。在农业生产领域中，重点指出了鱼的不同种类的生产。繁殖生理学的控制尤其重要。通过喂饲生物活性材料以操纵水生动物的繁殖的发明的首先启示由使用哺乳动物和两栖动物垂体的研究提供。从而，已经观察到使用垂体制剂的食物替代或补加可诱导苦鱼Acheilognathus inter-medium交配显色，部分成熟，和增加卵直径，在泥鳅Misgurnus anguillicaudatus中，导致排卵和在剑尾鱼Xiphophorus helleri中每窝间隔缩短10-15天，并导致卵变大和诱导雌性湖红点鲑早熟。类似地，对金鱼C.auratus口服给药鲑鱼垂体提取物诱导排卵和排精增加。这些数据的重要性涉及血浆中鲑鱼促性腺激素(sGtH)、睾酮和17-α-20β-diphydroxy-4-孕-3-酮的伴随提高，这提供了对早期研究中其它垂体制剂的观察结果的类似的基于内分泌的解释(即GtH的吸收)。

由于使用垂体制剂和部分纯化的激素的内在问题，似乎这些制剂不可能使用口服途径对养殖的种类的繁殖控制提供任何主要的益处，除非这些制剂被配制在本发明的组合物中。成熟控制中一个相对最近的创新是促性腺激素释放激素的应用。GnRH的许多类似形式在诱导排卵方面比天然形式有效50-100倍，并且包括那些掺入D氨基酸并且末端残基被乙酰胺替代的GnRH的类似形式。这些操作具有增强分子对蛋白裂解的抗性的作用。GnRH刺激GtH的天然释放，显示出广泛的物种潜能，相对易于生产并因此是经济的。此外，这些肽在宽的温度范围内是稳定的，并且表现出不变的效力。重要的是，这些肽如果保存在温度低于-20℃的无菌条件下那么可无限期地稳定。由于这种GnRHA提供了用于控制繁殖的口服途径的优秀的候选分子。实际上，已经积累了足够的实验证据，从而有或没有多巴胺拮抗剂的GnRHA的食物传递现在表现为控制鱼中成熟的最后阶段的方法。尽管比传统方法(注射、移植)更昂贵，但是食物传递提供了无胁迫这一优点。在繁殖生物技术中的该进步尤其用于易受处理伤害和/或太小而不能安全注射的物种(即观赏物种)。此外，用GnRHA的慢性处理提供了诱导早熟的方法，认为该方法对在鱼卵产生时是有利的，或者用于性别逆转的孵卵动物。

类似于繁殖控制，使用饲料补充剂的研究也提供了使用口服传递技术可能操纵硬骨鱼生长的早期启示。从而，已经观察到使用前垂体粉剂喂养孔雀鱼Lebistes reticulatus于对照相比生长能力显著增强。而且，对于从生长后仅用干燥的前垂体喂养的剑尾鱼观察到长度增加50％，而其它实验观察到每周两次用前垂体喂养的湖红点鲑体重增倍和长度为原来的三倍。对养殖的孔雀鱼用生长激素(GH)和相关肽处理提供了许多潜在的好处，并且一些研究已经证实口服传递的GH不仅进入血流，而且加速鱼的生长速度。重组GH的供应现在是稳定的并且随着需求增加产量将增加许多倍。而且，这种重组蛋白当在工业水平上生产时，是划算的并且可容易地掺入到商业饮食中。尽管GH分子的结构完整性作为翻译后修饰形式的前体是重要的，但是增强分子结构完整性或潜能的方法从口服给药的观点看可提供益处。GH分子的生长促进片段的描述也可以提供表达在腔降解下更大稳定性的产品。

本发明的一个特定实施方案是提供组合物和允许使用口服途径接种的方法，该方法提供了显著的益处，因为其减少了劳动成本，节约时间，减少了针头交叉污染的可能性并且不包括存货处理或者需要处理水的处置。

粘膜表面特异免疫性的主要抗原决定簇是分泌性IgA(S-IgA)，其在生理上和功能上与循环免疫系统的组分分开。可通过在特定粘膜位点施用适当的免疫原局部诱导S-IgA抗体应答。然而，粘膜S-IgA应答的大小是通过共同粘膜免疫系统(CMIS)产生的免疫性的结果，其中免疫原被特化的淋巴-上皮结构吸收，这些结构总称为粘膜相关淋巴组织(MALT)。最好的免疫淋巴表皮结构为内脏相关的淋巴组织(GALT)，如肠派尔斑。其它结构上和功能上类似的淋巴滤泡在其它粘膜表面出现，如呼吸道的粘膜表面。

根据本发明，可通过口服给药优选与佐剂如霍乱毒素(CT)混合的细菌蛋白免疫原免疫宿主。当然，作为佐剂，使用的霍乱毒素的量对宿主是无毒的。

如此处提供的疫苗保护不受微生物定居的能力指活性组分不仅可保护以抵抗受免疫的宿主中的疾病，而且通过消除免疫的个体中的携带，病原以及其导致的疾病可从作为一个整体的群体中消灭。

口服给药也可以防止施用微生物引起的败血症，从而疫苗可保护不受微生物定居和败血症(系统性感染)。

例如，PspA是肺粘膜感染的优选的抗原。在出版的国际专利申请WO92/14488中，其完整内容在此处被并入作为参考，其中描述了来自S.pneumoniae Rx1的PspA基因的DNA序列，通过基因工程生产截短形式的PspA并阐明了这种截短形式的PspA在小鼠中赋予抵抗活肺炎双球菌的保护性。

从PspA基因的序列表明，PspA蛋白的大小是可变的(约70kDa)。该分子的C末端37％大部分由20个氨基酸重复(repeat)组成，这些重复形成结合位点而允许PspA吸附到肺炎双球菌脂磷壁质酸的磷酸胆碱残基。PspA的中心区富含脯氨酸并被怀疑是穿过细胞壁的分子的一部分。该分子的N末端80％序列大部分是β螺旋并含有PspA区，其可引起抗败血症的抗体。虽然各PspA几乎总是至少相互间稍微不同，但是它们之间有足够的交叉反应性，抗体或者对一种PspA检测的免疫应答或者关于对于所有肺炎双球菌是有效的。此外，用一种PspA免疫可以或者保护抵抗死亡或者延迟用几乎所有不同攻击株系导致的死亡。因此，少数PspA的混合物可提供抗多数肺炎双球菌的有效免疫性。

在WO 92/1448中描述的免疫保护性截短的PspA可用于本发明中作为口服给药的上述PspA片段。

体外和体内表达重组蛋白的不同载体系统是已知的；例如细菌系统如E.coli；和病毒系统如细菌病毒、痘病毒(牛痘、鸟痘病毒，例如金丝雀痘病毒、鸡痘病毒)、杆状病毒、疱疹病毒、酵母，等等；并且，这些系统可用于使用其编码基因产生重组PspA。

如果抗原与佐剂(通常用作磷酸盐缓冲盐水中的0.001％到50％溶液)共同施用，那么可提高免疫原性。佐剂增强抗原的免疫原性但是本身不一定是免疫原性的。佐剂可通过将抗原局部保持在施用部位附近以产生储存(depot)作用而促进抗原向免疫系统细胞的缓慢的、持续的释放。佐剂也可以吸引免疫系统的细胞到达抗原储存处并刺激这些细胞而引起免疫应答。

免疫调节剂或佐剂已被使用多年以提高宿主对例如疫苗的免疫应答。内在佐剂，如脂多糖，通常是用作疫苗的被杀死的、减毒的或无毒的细菌的成分。外在佐剂是免疫调节剂，它们通常与抗原非共价相连并且被制备用以增强宿主免疫应答。氢氧化铝和磷酸铝(统称为alum)通常用作人和兽疫苗的佐剂。Alum在增强对白喉和破伤风类毒素的抗体应答的功效是成熟的，并且最近，alum已经作为HBsAg疫苗的佐剂。

各种外在佐剂可激起对抗原的强烈的免疫应答。这些外在佐剂包括与膜蛋白抗原复合的皂甙(免疫刺激复合体)、与矿物油的pluronic聚合物、矿物油中杀死的分歧杆菌、弗氏完全佐剂、细菌产物，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)、毒素以及脂质A、脂质体和核酸。为了有效诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导的免疫性(CMI)，免疫原优选在佐剂中乳化。

本发明的组合物(特别是用于口服给药)可作为液体制剂，例如等渗水性溶液、混悬剂、乳剂或可缓冲到选择的pH的粘性组合物方便地提供。然而，因为优选传递到消化道，本发明组合物可以是“固体”形式的丸剂、片剂、胶囊剂等等，包括“固体”制剂，其随时间释放或者具有液体填充剂，例如明胶包被的液体，由此明胶在胃和/或小肠中溶解以传递到内脏和/或消化系统中。

本发明组合物也可以含有药学上可接受的调味剂和/或着色剂以使得它们更有吸引力。粘性组合物可以是凝胶剂、软膏剂、霜剂等形式并通常含有足量的增稠剂，从而粘性为约2500到6500cps，尽管可以使用更粘稠的，甚至高达10,000cps的组合物。粘性组合物具有优选2500到5000cps的粘度，因为高于该范围，它们将更难于施用。然而，高于该范围，组合物可以接近固体或明胶形式，其然后可容易地作为口服摄入的可吞入的丸剂施用。

液体制剂通常比凝胶剂和其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物稍微更方便施用于特别是动物、小孩，尤其是小孩，以及吞入丸剂、片剂、胶囊剂等等有困难的其它个体，或者在多剂量情况下。另一方面，粘性组合物可在适当的粘度范围内配制以提供与粘膜，如胃或肠内层更长的接触时间。

适宜的非毒性药学上可接受的载体，尤其是口服载体，对于制药，特别是口服或口服的药物制剂领域中的技术人员将是显而易见的。显然，适宜的载体的选择将依赖于特定剂型，例如液体剂型的确切性质(例如，组合物将被配制入溶液、混悬剂、凝胶剂或另一种液体形式，或者固体剂型，或者例如，组合物将被配制到丸剂、片剂、胶囊剂、囊片、延时释放形式或液体填充的形式)。

溶液剂、混悬剂和凝胶剂除了抗原外通常还含有大量的水(优选纯化水)。也可存在少量其它成分，如pH调节剂(例如碱如NaOH)、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、胶凝剂(例如，甲基纤维素)、着色剂和/或调味剂。组合物可以是等渗的，即，其可以具有和血液和泪液相同的渗透压。

本发明组合物的期望的等渗性可使用氯化钠或者其它药学上可接受的试剂如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来实现。对于含有钠离子的缓冲液尤其优选氯化钠。

使用药学上可接受的增稠剂可以使组合物的粘度保持在所选择的水平。优选甲基纤维素因为其容易得到并且经济，并且易于使用。其它适宜的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等等。增稠剂的优选浓度将依赖于所选的试剂。重要的是使用将实现所选粘度的量。通常通过加入这种增稠剂从溶液制备粘性组合物。

可以使用药学上可接受的防腐剂增加组合物的贮存期限。苯甲醇是适宜的，尽管也可以使用包括，例如对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯铵的各种防腐剂。防腐剂的适宜的浓度将基于总重量为0.02％到2％，尽管根据所选择的试剂可以有明显的变化。

本领域技术人员将认识到所选择的本组合物的组分必须对于微生物抗原是化学惰性的。这不会给化学和药学领域的技术人员带来问题，或者可通过参考标准试验或者通过简单实验(不包括过度实验)轻易地避免来自本公开的问题。

按照通常接受的方法通过混合物各成分制备本发明的免疫学有效组合物。例如，所选的组分可在混料机或其它标准设备中简单混合以得到浓缩的混合物，其然后可被调节到终浓度和粘度，这可通过加入水或增稠剂和可能地控制pH的缓冲剂或控制张力的其它溶质来实现。通常pH可以为约3到7.5。组合物可以以剂量施用并且可通过医学和兽医领域的技术人员熟知的技术，考虑特定病人或动物的年龄、性别、体重和状况，以及用于给药的组合物的形式(例如固体vs液体)进行施用。人或其它哺乳动物的剂量可通过技术人员不用过度实验即可确定。

当CT被用作口服免疫的佐剂时，在分泌物中诱导特异IgA抗体。也可以诱导强循环免疫应答，在血清中存在IgG和IgA，在脾脏的抗体分泌细胞中存在IgG和IgA。通过口(口服、胃内)施用微生物抗原与CT引起的循环(或系统)免疫应答可以与通过胃内途径施用类似抗原引起的应答相比或者更强。因此，似乎口服免疫是刺激共同粘膜应答以及循环抗体应答的有效途径并且比其它免疫途径需要更少的抗原。

大多数可溶或非复制抗原是弱抗原(特别是通过口服途径)，可能是因为它们被消化酶降解并且对GALT的向性很少或没有。一个显著的例外是CT，其是强粘膜抗原，可能是因为该结合亚单位CTB的G.sub.M1神经节苷脂结合性质使得其被派尔斑的M细胞吸收并穿过免疫感受态细胞。除了是良好的粘膜抗原，CT还是强力佐剂。当以微克剂量施用时，CT极大地与其共同施用的其它可溶抗原的免疫原性。

在一个实施方案中，根据本发明，提供了通过口服施用后对宿主传递治疗剂以治疗宿主的疾病或病症(disorder)的方法。

在另一个实施方案中，可以按照本发明治疗的癌细胞包括恶性肿瘤。可以被治疗的恶性(包括原发性和转移的)肿瘤包括但不限于，发生在肾上腺、膀胱、骨、乳腺、子宫颈、内分泌腺(包括甲状腺、垂体腺和胰脏)、结肠、直肠、心脏、造血组织、肾、肝、肺、肌肉、神经系统、脑、眼、口腔、咽、喉、卵巢、前列腺、皮肤(包括黑素瘤)、睾丸、胸腺和子宫中的肿瘤。然而，应该理解本发明的范围不被任何特定肿瘤限制。

然而，应该理解本发明的范围不被特定生物学活性成分，如治疗剂所限制。

根据本发明的另一个优选的实施方案，在传递药剂时能够抑制、防止或破坏癌细胞的该药剂是负选择标记；即，与化学治疗剂或相互作用剂联合抑制、防止或破坏癌肿瘤细胞的生长的物质。

从而，在系统性传递负选择标记时，将相互作用剂施用于动物或人宿主。相互作用剂与负选择标记相互作用以防止、抑制或破坏癌的生长。可使用的负选择标记为例如，但不限于胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶。

相互作用剂以抑制、防止或破坏癌细胞的生长有效的量被施用。例如，根据对患者的总毒性，相互作用剂可以以约5mg到约15mg/kg体重，优选约10mg/kg施用。

通过参考下面的实施例将更容易理解本发明，这些实施例用于阐明本发明而不是限制其范围。

                         实施例1

虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)和溪红点鲑(Salvelinus fontinalis)的生长加强

世界范围的水产工业在过去20年里已经经历了快速扩张，并且现在代表最快增长的农业部分。该部分自从1984年已经以年百分数速度10.9增长，相比陆地牲畜肉产量为3.1。在相同期间内最快的牲畜增长部分为鸡肉生长，其APR为5.3，然后是猪肉3.4，羊和小羊肉1.4，以及牛和小牛肉0.9。水产对世界总的食用鱼起货(landing)的贡献从1984年的11.5％到1995年的25.6％(按重量计)增加了2倍多。对海产品需求的计划的增加以及从野生储备的渔业起货的减少，已经并将继续促使水产工业的增长。

水产工业，像农业的其它部分，面临着伴随着传统牲畜生产的许多生产挑战。鲑亚目生产成本的40％到50％用于喂养。饲料含有高百分含量的昂贵的鱼蛋白并且鲑亚目的鱼需要相对长的饲养期以达到上市重量。在快速生长的鱼中，过多脂肪积累是生产者和消费者都关心的。

食用动物工业的目标是通过最小化饲料、劳力和资本投资的投入而最大化高质量蛋白质的产出来优化生产效率。过去，已经通过遗传选择或营养更改改变了经济学重要的参数。最近，已经出现了包括内分泌系统操纵的各种方法以影响家畜的生长和身体组成。外源化合物能够成功地改变家畜的生长性能并潜在地节约生产成本，已经促使研究这些化合物在鱼中的用途。

来自各种来源的生长激素(GH)的施用证明该激素在刺激鱼中肉的生长和减少脂肪沉积起着关键作用。天然的和重组的鱼GH已经被应用于几种鱼类并且是当注射到完整鲑亚目中时等效的。而且，已经报导来自哺乳动物和鸟类来源的GH在改变幼年鲑亚目的生长性能方面是有效的。对鲑亚目施用牛GH(bGH)导致生长速度增加2-3倍，胃口和饲养效率增加以及脂肪组织减少。外源GH对较大(接近成体)的鱼也有效，并且在低水温(此时生长速度被抑制)时也有效。

口服施用GH是一种实用的方法。对于口服施用后将完整蛋白运输到硬骨鱼循环系统中的机理提供了组织化学和生物学证据。现在表明口服给药的辣根过氧化物酶在1h内被运输到循环系统中。

据报导在bGH被导入消化道的内腔后，该激素被运输到一岁虹鳟鱼的循环系统中。类似地表明口服施用的重组鲑鱼生长激素(rsGH)显著提高了血浆rsGH浓度。该同样的结果表明与对照鱼相比每周胃内施用rsGH导致重量和鱼的长度增加50％。

上面的研究支持：口服给药的来自各种来源的GH通过被保护而不被胃肠消化从而其保持完整和生物学活性而可以影响几种硬骨鱼的生长性能。这已经引起了对开发保护生物活性蛋白(生长激素、抗原，等)防止胃的酸性环境的系统的尝试。鱼的口服或直肠插管法是传递生物活性蛋白穿过胃的有效方法，然而，它们对于商业应用是不可行的。已经尝试将生物活性蛋白与去污剂和抗酸物质共同施用以降低胃中的酸性环境。然而，这些研究已经表明减少蛋白质降解，但是使用的治疗可影响其它重要食物因子的吸收。另一个选择是使用pH敏感的聚合物，其包被并保护肽防止胃中的酸分解并允许在小肠中一次释放。

从本发明的方法清楚地表明化合物(激素、疫苗、抗体等)被口服传递经过单胃动物(包括人)的胃以便绕过胃消化而到达小肠和/或大肠中的吸收位点。到此为止，该工作的大部分集中在使用各种制剂和目的形式开发封装策略。这些制剂和形式可简单地调节特定化合物以预定方式释放，或者可使用特定生理决定因素(例如pH、温度等)以引发被封装材料的传递。

在其它形式的传递系统中使用的复杂聚合物有时难于表征。而且，一般不认为安全(GRAS)的某些聚合物的应用使得这些系统的规章性批准称为漫长而危险的过程。而且，许多聚合物系统相对昂贵，使得大规模应用不现实。

当前的实验着重于允许生物活性肽(在该情况中为bST)的口服传递的新策略。通过对目标生物活性化合物添加暂时抑制消化酶功能的各种抗营养因子和增加肠吸收的产品的混合物(称为“回避混合物”)。我们已经表明我们可有效绕过酶促过程，并增强上面提到的化合物的肠吸收以实现想要的生物学效果。

材料和方法

回避混合物制剂

回避混合物的配制如表1所示。未处理的油籽和种子成分从本地供应商得到并机械去壳。鱼粉、米糠、酿酒酵母、碳酸钠、碳酸钙和EDTA都是饲料级并购自本地供应商。脱氧胆酸钠和粗卵清蛋白从Sigma ChemicalCo.(St Louis MO)购买。如所示混合食物并用1mm筛目碾磨。

      表1 回避混合物配方

成分	包含率(g/kg)
		鱼粉卵清蛋白豆类碳酸钠碳酸钙鱼油米糠EDTA酿酒酵母脱氧胆酸钠	1501003001001001005050454-401

¹浓度在实验中可变，见材料和方法部分

鱼和饲料

采取使用两个鲑亚目种的一系列实验(实验1：虹鳟鱼；实验2：溪红点鲑)。之所以选择这些种是因为它们代表研究较多的实验模型以及经济上重要的养殖种类。

对于实验1，开始实验前将虹鳟鱼(n＝20；最初重量＝52g)存放在封闭水再循环系统中的6-60升圆筒-圆锥形储水池中。水温保持在15℃，光周期设为12hL:12hD周期。在实验2中，开始实验前将溪红点鲑(n＝400；最初重量＝38g)存放在封闭水再循环系统中的8-800升圆筒-圆锥形储水池中。在实验中水温保持在11℃。鱼处于天然光周期(约14hL:10hD)中。在两个实验中每周监视水质量(氨、亚硝酸盐)并每天测量氧浓度。鱼在适应期和非处理期用商业饲料(Corey Feed Mills Ltd.Fredericton，NB)饲养。

实验操作

在实验1中，包含重组牛生长激素((rbST；Monsanto Co.St Louis MO)以为鱼提供20μg/g鱼。对三个一式两份的组喂养不同水平的0(对照)、4或40g脱氧胆酸钠/kg回避混合物。在第二个实验中，4个一式两份处理组接受补加0、1、5或10mg脱氧胆酸钠/kg回避混合物的食物，每g鱼20μg rbST。

在实验1和2中，每周监控鱼的重量和饲料消耗。在含有bST的回避混合物给食前对鱼称重并禁食36小时。给食后，抑制给食12小时。从这点开始，每天喂鱼两次到接近饱足。

结果

在两个实验中，没有观察到处理相关的死亡，表明bST或回避混合物对虹鳟鱼和溪红点鲑没有不利的健康影响。和对照相比用回避混合物中的bST喂养的鱼显著提高了生长速度。在实验1中，处理的鱼的生长速度平均增加25％；最快的生长储水池生长比对照大40％以上(图1和2)。在实验2中，bST处理的组显示出与对照相比增加的生长速度，然而用含有5g/kg脱氧胆酸盐的回避混合物喂养的鱼显示出最高的生长速度，其与对照相比生长速度增加90％(图3)。

                      实施例II

         虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的生长加强

方法

每条鱼每周的腹膜内(IP)施用剂量为20μg bST/g活体重，施用6周。

结果

图4表明腹膜内注射的重组bST明显诱导了虹鳟鱼体重增长的增加。

                      实施例III

         饲料成分中存在的蛋白裂解酶抑制剂的评定

提取酶方案

材料

1.离心Sorvall型

2.Bench-top搅拌机

3.解剖材料(剪刀)

4.离心瓶

5.分光光度计的一次性比色皿

6.微离心管1.5ml

7.分光光度计

8.Vortexer

9.来自Biorad的微板读出器

10.50mM Tris-HCl pH＝7.5

11.考马斯蓝染色溶液

12.BSA(1mg\ml)标准溶液

13.TCA20％

14.虹鳟鱼胰腺和十二指肠组织

15.溶于50mM Tris-HCl pH＝9的5％酪蛋白

16.50mM Tris-HCl+CaCl₂ 10mM pH＝7.5

酶提取物

1.将虹鳟鱼称重并处死。

2.进行解剖以除去鱼的近端小肠。

3.称重后，将组织在50mM Tris-HCl ph＝7.5中匀浆(1∶10w\v)。

4.4℃下以16000×g离心30分钟。

5.保留上清液，等分并将它们在-20℃保存备用。

6.进行考马斯分析以测量酶提取物中蛋白的量。

考马斯亮蓝染色方案

1.称量160mg BSA溶于10ml 50ml Tris-HCl pH＝7.5。

2.制备BSA的标准曲线(0μg/ml到1600μg/ml)。

3.在96孔板的每孔加入4μl BSA、酶提取物和稀释(1∶1)提取酶。

4.加入200μl考马斯蓝。

5.用来自Biorad的微板读出器在655nm读数。

酶促方案：

实验以一式两份进行。

空白：

1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl₂ pH＝7.5溶液。

2.加入500μl TCA 20％(蒸馏水)溶液。

3.加入20μl酶提取物。

4.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。

5.在4℃(冰)温育15分钟。12000×g离心5分钟并在280nm读数。

试验：

1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl₂ pH＝7.5溶液。

2.加入20μl酶提取物。

3.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。

4.室温下温育0、5、10、15和30分钟。

5.通过加入500μl TCA 20％中止反应。4℃(冰)温育15分钟。12000×g离心5分钟并在280nm读数。

抑制剂提取

1.用工业粉碎机将商业途径买到的食物碾磨成细粉。

2.称取250mg粉末并置于10ml 50mM Tris-HCl pH＝7.5(终浓度应该是25mg/ml)中。

3.用手动组织粉碎机将溶液匀浆。

4.室温下*以2000×g离心10分钟。

5.保留上清液。其将是酶促方案的抑制剂提取物。

酶促方案：

实验以一式两份进行。

空白：

1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl₂ pH＝7.5溶液。

2.加入500μl TCA 20％(蒸馏水)溶液。

3.加入可变体积的抑制剂提取物或者50mM Tris-HCl pH＝7.5溶液。

4.加入10μl酶提取物。

5.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。

6.在4℃(冰)温育15分钟。12000×g离心5分钟并在280nm读数。

对照：

1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl₂ pH＝7.5溶液。

2.加入可变体积的50mM Tris-HCl pH＝7.5溶液。

3.加入10μl酶提取物。

4.室温下温育60分钟。

5.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。

6.室温下温育30分钟。

7.通过加入500μl TCA20％中止反应。在4℃(冰)温育15分钟。12000×g离心5分钟并在280nm读数。

试验：

1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl₂ pH＝7.5溶液。

2.加入可变体积的抑制剂提取物。

3.加入10μl酶提取物。

4.室温下温育60分钟。

5.加入500μl TCA 20％(蒸馏水)溶液。

6.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。

7.通过加入500μl TCA20％中止反应。在4℃(冰)温育15分钟。

8.12000×g离心5分钟并在280nm读数。

结果：

图5-12阐明了Oralject^TM混合物的各种蛋白酶抑制剂组分体外对蛋白裂解抑制的效果，以及Oralject^TM混合物的总抑制。这些数据以蛋白裂解酶抑制的程度对抑制剂内含物增加的水平给出。该数据揭示Oraject^TM混合物的各种组分(图5-12分别为冻干的卵清蛋白、红四季豆、大豆、蚕豆、EDTA、小麦麸、喷雾干燥的卵清蛋白)影响体外蛋白裂解酶活性的不同程度的抑制。此外，总混合物对诱导总的蛋白裂解酶抑制有效。最后，使用图5到12产生的曲线，外推了最大抑制点以及提供50％最大抑制的抑制剂浓度。

                        实施例IV

        虹鳟鱼血液中辣根过氧化物酶的定量的酶学分析

材料

1.96孔板(来自VWR的Immulon^TM II)

2.来自Biorad^TM的微板读出器

3. 1.5ml微离心管

4. 15ml或50ml离心管

5.TMB片剂

6. 1型辣根过氧化物酶(Sigma)

7.来自山羊IgG(ICN)的抗辣根过氧化物酶

8. 0.1M碳酸氢钠pH＝9.6缓冲液

9. 0.1M磷酸-柠檬酸pH＝5缓冲液

10.PBS 1X+BSA 1％+0.5％吐温20缓冲液

11.PBS 1X pH＝7.4缓冲液

12.过氧化氢30％

13.Saran包装

14.37℃培养箱

15.蒸馏水

16.虹鳟鱼(血浆)

方法

用抗原包被板

1.将200μl来自山羊IgG 1∶1000稀释的抗HRP溶液(0.1M碳酸盐-碳酸氢盐pH＝9.6缓冲液中)分装于96孔板中。

2.将包被的板封装于saran^TM包装中并密封，在4℃温育过夜或者37℃2小时。

3.用PBS 1X pH＝7.4漂洗包被的板3次。每次将磷酸盐缓冲盐水轻弹入水槽中并用蒸馏水再漂洗3次。

4.将板抖干并在4℃保存备用。

封闭板的残留结合能力

1.用200μl PBS 1X+BSA 1％+0.5％吐温20缓冲液填充每孔。

2.在室温下温育30分钟。

3.在一些孔中加入100μl 1∶10稀释的含有HRP的样品。

4.在另一些孔中加入100μl标准曲线血浆。

5.将板在saran包装中包装并在37℃下温育1小时。

6.用PBS 1X+BSA 1％+0.5％吐温20缓冲液洗涤3次。

标准曲线方法

1.用PBS 1X pH＝7.4将虹鳟鱼血浆以1∶10稀释。

2.加入HRP以得到终浓度0.5到8ng/ml。

酶测定法

1.在每个管中加入200μl TMB(50mM柠檬酸盐-磷酸盐pH＝5缓冲液+30％过氧化氢)。

2.等待30分钟并加入50μl硫酸以固定显色。

3.用来自Biorad^TM的微板读出器在415nm读数。

结果

为辣根过氧化物酶(HRP)进行ELISA显色，允许其作为口服给药后血浆吸收研究的追踪剂。该方法提供了记录HRP吸收的非常灵敏的方法，其较低检测范围为约2.5ng HRP/ml血浆，并且线性部分高达8ng/ml(图13)。

使用该方法跟踪HRP吸收，对虹鳟鱼强饲基于鱼粉的对照基质和含有HRP(2.5ng/g)的Oralject^TM混合物并在施用后选择的时间点采集血样。如在图14中所阐明的，本发明组合物中口服传递的HRP的血浆吸收显著高于鱼粉对照的血浆吸收。此外，施用后6小时检测HRP的循环浓度。

                         实施例V

                       口服疫苗传递

材料和方法

对于每种疫苗，将虹鳟鱼(n＝50；关在12℃再循环水系统中)分成5组。两组鱼接受Oralject制剂1(A.salmonicida：40mg/鱼)中的疫苗每两周一次持续6周，或者每两周连续3天持续6周。Oralject制剂2的处理类似。对V.salmonicida使用相同的方案，只是鱼以10mg/鱼口服喂养。对于每种疫苗，额外组包括注射对照(对于A.salmonicida和V.salmonicida为200μl/鱼0.6×10¹⁰细胞/ml)。实验开始后再2、4和6周取血并收集血浆并保存在-80℃直到需要分析。实验设计方案如下：

Oralject^TM制剂1->每两周施用1次(0、2、4周)

Oralject^TM制剂1->每两周施用3次(0、2、4周)

Oraject^TM制剂2->每周施用1次(0、2、4周)

Oraject^TM制剂2->每周施用3次(0、2、4周)

ELISA分析

使用ALPharma^TM提供的ELISA方案测定抗体水平。该方法使用小鼠抗鲑鱼IG单克隆抗体(4C10)和适当稀释的过氧化物酶标记的兔抗小鼠二抗。将鱼血清样品以1∶2连续稀释(6倍；最初稀释：1∶10)，虽然为了比较，来自口服接种的鱼的所得光密度表达为从选择的高滴定度、注射的对照鱼第6组收集的鱼血清(都以1∶100稀释)的合并血清的百分OD。

结果

HRP的口服施用

图15揭示完整HRP在处理后30分钟内被吸收到周身循环，HRP浓度在1小时处达到最大，之后下降。在基于鱼粉的对照食物中有可忽略的HRP吸收，表明Oralject^TM诱导了完整生物活性蛋白吸收的增加。

口服疫苗传递

图16表明Oralject^TM制剂型和应用频率对抗体水平的影响(表达为OD的百分数对选自高滴定注射对照的血清库)。没有Oralject^TM制剂类型的影响，然而，应用频率显著影响抗体水平，多次施用提供了增加的抗体水平。

在图16中所示为在虹鳟鱼中使用不同(a，b在施用频率内，不同上标显著不同(P＜0.05)，x，y在Oralject制剂内，不同上标显著不同(P＜0.05))口服施用A.salmonicida疫苗开始实验后4周相对抗体水平(在1∶100的血清稀释液的注射对照的％OD)。

                        实施例VI

                   大规模口服疫苗传递

材料和方法

在资源和生产力委员会(弗雷德里克顿NB)，使用表1中描述的回避混合物的改进进行外部口服疫苗研究。将溪红点鲑(Salvelinus fontinalis；n＝1600，平均质量65g)分到8个储水池(使用脱氯城市用水的流动系统，11℃)。对一式两份组饲以Oralject^TM系统(OR)或商业喂饲基质(FA)中的冻干的商业疖病疫苗(ALPharma)。阳性对照鱼用疫苗(0.2ml；ip)注射，而阴性对照不作处理。最初接种后250度-天时重复口服处理(加强施用)。每两周收集血清并在最初接种后450度-天时启动体内同居攻击(cohabitationchallenge)。

结果

图17清除地表明用Oralject^TM-疫苗口服处理的鱼对保护动物抵抗Aeromonas salmonicida的感染与注射处理一样有效。而且，在Oralject^TM组中的抗体滴定度比在未处理组中或者用含有相同浓度疫苗的商业饲料喂养的鱼中观察到的抗体滴定度高(结果未显示)。

                         实施例VII

                     大规模口服疫苗传递

在该研究中，我们评价了使用口服传递系统Oralject^TM施用疖病疫苗的效率，该传递系统是对表1中描述的回避混合物的改进。从而，丸状Oraject^TM系统施用疫苗，并监控体液应答和抗Aeromonas salmonicida的保护，并与注射疫苗比较。

材料和方法

溪红点鲑，最初质量88g，185条鱼/组。

INJ：AS疫苗腹膜内注射

OR8：Oraject^TM+AS疫苗(8％w∶w)(一剂)

CTRL：未处理

在第28天，所有处理组接受疫苗的加强(B)剂量处理。

接种步骤

如供应商所推荐的，第一次注射和加强注射时注射的鱼(INJ)都接受0.2ml含有1.25％(w/v)疖病疫苗(Alpharma，Oslo，挪威)的PBS。加强注射在第28天施用。

对于第一次免疫，来自鱼组或Oralject组的鱼接受口服给药的其净重的1％。第二次接种在第一次接种后28天以相同方式进行。来自对照组(CTRL)的鱼未被处理。

时间表

第0天   第一次免疫

第14天  抗体剂量

第28天  再次免疫(加强；所有组)，抗体剂量

第42天  抗体剂量

第70天  抗体剂量，攻击(同居)

第84天  报导

抗体应答剂量

通过ELISA分析抗体应答，ELISA是我们实验室常规使用的。

攻击试验

对于体内攻击方法，通过同居攻击鱼。该方法为将以前感染的鱼和处理的鱼放置在一起，并跟踪死亡率到预定的范围一对照鱼死亡率的给定百分数(根据文献30-40％)。

结果

抗体应答

在所有处理中第一次免疫后6周抗体应答达到峰值。

攻击

攻击时，通过同居攻击鱼。虽然除了注射处理的，抗体水平和未处理的水平基本相同，但是发生了抵抗保护。

               表2：同居攻击结果

处理	死亡率	死亡率百分数	RPS
				INJ-BOR8-BCTRL	7/15913/16458/180	4.47.940.6	89.280.50

存活的相对百分数，RPS：

(1-％处理的死亡率/％未处理的死亡率)×100

图18清楚地表明用Oralject^TM疫苗对鱼口服处理对于保护鱼免受同居攻击后Aeromonas salmonicida的感染和注射处理一样有效。

此外，在Oralject^TM组中的抗体滴定度比在未处理组中或者用含有相同浓度疫苗的商业饲料喂养的鱼中观察到的抗体滴定度高(图19)。

结论

使用Oraject^TM系统，生物活性蛋白(在该情况下，HRP)可口服传递到虹鳟鱼，随后在周身循环中出现完整蛋白。使用该策略，对基于鱼粉制剂中口服传递测得循环HRP增加约18倍。用Oraject^TM系统中A.salmonidicida喂养的虹鳟鱼的水平高达注射的对照鱼的75％。而且，这些结果表明Oralject^TM处理提供了类似注射方法学的保护。

尽管本发明本发明根据其具体实施方案描述，但应该理解可以进一步修改并且该应用旨在覆盖一般按照本发明的原理的任何改变、使用或对本发明的修改并且包括如通过本发明所述领域中的公知或常规操作得到和可应用于前面提出的基本特征，以及依照所附权利要求书范围内的对本公开的背离。

Claims (24)

1.口服给药后在人或动物中调节生理反应或诱导免疫应答的组合物，所述组合物含有：

a)至少一种生理活性剂；

b)至少一种有效增加所述人或动物的消化系统中pH以防止所述生理活性剂变性的中和剂；

c)至少一种防止所述生理活性剂酶促消化的消化酶抑制剂，所述抑制剂选自匀浆的豆类、油籽或豆粉；和

d)至少一种能够增加所述生理活性剂的肠吸收的吸收促进剂。

2.权利要求1的组合物，其中所述中和剂浓度为约1％到60％w/w，所述抑制剂浓度约1％到50％w/w，所述吸收促进剂浓度约0.1％到50％w/w。

3.权利要求1的组合物，其中所述生理活性剂选自治疗剂、营养品、粘多糖、脂质、糖类、类固醇、激素、生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)、表皮生长因子、血管内皮生长和渗透因子(VEGPF)、神经生长因子、细胞因子、白介素、干扰素、GMCSF、类激素产品、神经因子、神经营养因子、神经递质、神经调质、酶、抗体、肽、蛋白片段、疫苗、佐剂、抗原、免疫刺激或抑制因子、造血因子、抗癌产品、抗炎药、抗寄生虫化合物、抗微生物剂、核酸片段、质粒DNA载体、细胞增殖抑制剂或活化剂、细胞分化因子、凝血因子、免疫球蛋白、负选择性标记或“自杀”剂、毒性化合物、抗血管生成剂、多肽、抗癌剂、产酸药物，和组胺H2-受体拮抗剂。

4.权利要求1的组合物，其中所述中和剂用量足够中和所述人或动物消化系统中的酸降解并允许传递所述生理活性剂到所述人或动物的肠内。

5.权利要求1的组合物，其中所述中和剂选自抗酸、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸钙、碳酸钙、镁盐、碳酸镁、三硅酸镁、氢氧化镁、磷酸镁、氧化镁、碱式碳酸铋，以及它们的组合。

6.权利要求1的组合物，其中所述中和剂是浓度为组合物的10％到20％w/w的碳酸钠和浓度为组合物的10％到20％w/w的碳酸钙中的至少一种。

7.权利要求1的组合物，其中所述抑制剂用量足够抑制所述人或动物消化系统中消化酶对所述生理活性剂的降解并允许传递所述生理活性剂到所述人或动物的肠内。

8.权利要求1的组合物，其中所述消化酶的抑制剂选自抗蛋白酶，卵清蛋白，来自油籽、大豆、四季豆、蚕豆、米糠、麦麸的植物来源的抑制剂，乙二胺四乙酸，α-1-抗胰蛋白酶，白蛋白，卵清蛋白和蛋白酶体。

9.权利要求1的组合物，其中所述抑制剂含有至少一种胃蛋白酶抑制剂和一种肠肽酶抑制剂。

10.权利要求1的组合物，其中所述抑制剂为浓度为1％到20％w/w的白蛋白。

11.权利要求1的组合物，其中所述吸收促进剂选自胆汁盐、皂苷、脱氧胆酸盐、水杨酸钠、十二烷基硫酸钠、油酸、亚油酸、油酸单甘油酯、卵磷脂、溶血卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯、对叔辛基苯氧基聚氧乙烯、N-月桂基-β-D-麦芽吡喃糖苷、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-氮酮，和磷脂。

12.权利要求11的组合物，其中所述吸收促进剂为浓度为0.01％到10％的脱氧胆酸盐。

13.权利要求1的组合物，其含有至少一种选自乙二胺四乙酸、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、粘合剂、示踪剂、甜味剂、表面活性剂、除霉剂、调味剂、谷物的粗粉、豆类、酵母、酿酒酵母、矿物油、植物油、动物油、润滑剂、软膏剂、以及它们的组合的附加成分。

14.权利要求1的组合物，其中所述生理活性剂当被传递到所述人或动物的肠内时被所述肠吸收以系统传递。

15.权利要求1的组合物，其中所述生理活性剂当被传递到所述人或动物的肠内时对肠壁具有有效生理作用。

16.权利要求1的组合物，其中所述生理活性剂当被传递到所述人或动物的肠内时对肠的内容物具有生理作用。

17.权利要求1的组合物，其中所述动物为鸟、哺乳动物、昆虫、甲壳类、两栖类、爬行类或鱼类。

18.权利要求1的组合物，其中所述生理活性剂在所述人或动物中能够诱导抗粘膜传染病的免疫应答。

19.权利要求1的组合物，其中所述调节包括增加或减少生理反应速率。

20.一种调节人或动物中生理反应或诱导免疫应答的方法，其包括对所述人或动物口服给药足量的如权利要求1中定义的组合物。

21.权利要求20的方法，其中所述生理反应为身体生长、免疫反应、脂肪代谢或肌肉合成中的至少一种。

22.一种系统传递生理活性剂到人或动物的方法，所述方法包括对所述人或动物口服给药如权利要求1中定义的组合物。

23.一种增强人或动物中生理活性剂或抗原的身体吸收的方法，该方法包括对所述人或动物口服给药生理学有效量的如权利要求1中定义的组合物。

24.根据权利要求1的组合物在制备用于调节人或动物中生理反应或诱导免疫应答的药物或食物中的应用。

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